FI89539C - Foerfarande foer paovisning eller bestaemning av en part i en partikelfoerstaerkt immunologisk reaktion med ett nefelometriskt, turbidimetriskt eller partikelraekningsfoerfarande - Google Patents

Description

1 89539

Menetelmä hiukkasten avulla vahvistetun immunologisen reaktion osapuolen osoittamiseksi tai määrittämiseksi nefe-lometrisella, turbidimetrisella tai hiukkastenlaskenta-menetelmällä ja menetelmän suorittamiseen soveltuva rea-5 genssi

Keksintö koskee menetelmää hiukkasten avulla vahvistetun immunologisen reaktion osapuolen osoittamiseksi tai määrittämiseksi nefelometrisella, turbidimetrisella tai hiuk-10 kastenlaskentamenetelmällä ja reagenssia, joka soveltuu käytettäväksi tässä menetelmässä. Kuvataan myös spesifisyydeltään immunologisesta reaktiosta poikkeavan antiseerumin käyttöä tällaisessa menetelmässä.

On tunnettua parantaa serologisten tai immunologis-15 ten määritysmenetelmien herkkyyttä käyttämällä indikaatto ri- tai kantajaosasia, jotka on kuormattu asianmukaisella immunologisella reagenssilla (vasta-aineella tai antigeenillä) . Kantajamateriaalina voidaan käyttää esimerkiksi punaisia verisoluja tai soluviljelmän soluja. Tähän tar-20 koitukseen käytetään myös lateksihiukkasia, joiden läpimitta on 0,02 - 5 μιη.

Sellaisen "hiukkasten avulla vahvistetun" nefelo-metrisen tai turbidimetrisen kokeen avulla voidaan proteiineja osoittaa varmasti noin konsentraatioihin 5 ng/ml 25 saakka. Hiukkasten avulla vahvistetussa kokeessa käytetään polymeerihiukkasiin sidottuja vastaaineita tai antigeenejä ("kiinteä faasi"). Määritettäessä antigeeniä käytetään kiinteään faasiin sidottua vastaainetta, vasta-ainetta määritettäessä käytetään kiinteään faasiin sidottua anti-30 geeniä. Kummassakin tapauksessa tapahtuu immuunireaktion johdosta polymeerihiukkasten agglutinaatio. Siitä on tuloksena agglutinaalin koon suureneminen ja hajavalosignaa-li tai reaktioseoksen sameus suurenee.

Julkaisusta EP 0 087 728 tunnetaan lateksiaggluti-35 naatiomenetelmä, jossa käytetään gammaglobuliineja, joilla 2 89539 ei ole vasta-ainespesifisyyttä reaktion reagoivia osapuolia kohtaan. Tämä suoritetaan sekoittamalla lateksirea-genssi tutkittavan näytteen kanssa pisarassa lasi- tai muovilevyllä. Positivinen reaktio aiheuttaa lateksirea-5 genssin yhteenkasautumista ja saostumista hiutaleina, ja lateksisuspension maitomainen ulkonäkö katoaa. Näiden menetelmien avulla on mahdollista saada kvalitatiivinen tulos. Niitä voidaan käyttää arvioimalla subjektiivisesti silmin, mutta ei optisen systeemin avulla. Sitä paitsi 10 niitä ei voida automatisoida.

Julkaisun EP-A-0 080 614 perusteella tunnetaan la-teksihiukkaset, jotka sisältävät happoamidiryhmiin sidottuja asetaalifunktioita. Sellaisia hiukkasia voidaan käyttää C-reaktiivisen proteiinin nefelometriseen määrittämi-15 seen. Sitä varten laimennetaan seeruminäytteet puskuriliuoksella, yleensä 1:100, jolloin sellaisten häiritsevien seerumin proteiinien vaikutus, jotka muuten aiheuttaisivat vääriä tuloksia, saadaan merkityksettömäksi. Tämä menettelytapa on mahdollinen, koska C-reaktiivista proteiinia 20 täytyy diagnostisia tarkoituksia varten yleensä olla läsnä suurempia konsentraatioita kuin 5 mg/1. Mutta jos halutaan määrittää hivenproteiinien konsentraatio alueelta 1 Mg/l -5 Mg/l, niin silloin ei näytteitä voida vastaavasti laimentaa puskuriliuoksella, koska osoitettavan proteiinin 25 konsentraatio tulee muuten niin pieneksi, että toteamis-herkkyys ei riitä.

Toteamisherkkyyden parantaminen käyttämällä la-teksivalmisteita tekniikan tason mukaisesti esim. vain 1:5 laimennettujen seerumien kanssa ei kuitenkaan ole ilman 30 muuta mahdollista ja esimerkiksi alfa-fetoproteiinin (AFP) tai immunoglobuliini E:n määrittämistä varten ei täten saada aikaan tyydyttävästi toimivaa koetta.

Hiukkasten avulla vahvistetussa nefelometrisessa tai turbidimetrisessa kokeessa tapahtuvat immuunireaktiot 35 kiinteän faasin pinnalla. Näiden kiinteiden faasien omi- 3 9 519 naisuuksiin kuuluu adsorboida tutkittavista ruumiinnesteistä epäspesifisesti proteiineja, jotka voivat häiritä. Eräs toinen vaikeus, joka voi esiintyä sellaisissa menetelmissä, aiheutuu siitä, että ihmisen seerumi sisältää 5 proteiinia Clq ja reumatekijöitä (RF). Nämä sitoutuvat vasta-aineisiin. Sitä paitsi voivat reumatekijän ja Clq: n määrät vaihdella ihmisten seerumeissa suuresti, minkä johdosta on yleensä välttämätöntä suorittaa seerumeille etukäteen käsittely Clq:n inaktivoimiseksi tai reumatekijöi-10 den poistamiseksi. Muussa tapauksessa saadaan tuloksiksi vääriä konsentraatioarvoja ruumiinnesteissä oleville hi-venproteiineille. Nefelometristen tai turbidimetristen menetelmien avulla ei sen vuoksi ole mahdollista suorittaa varmaa määritystä.

15 Julkaisussa EP 0 087 728 silmämääräisesti luettavia lateksiagglutinaatiomenetelmiä varten ehdotettu sellaisten gammaglobuliinien lisääminen, joilla ei ole vasta-aine-spesifisyyttä reaktion reagoivia osapuolia kohtaan, ei ole nefelometrisiä ja turbidimetrisiä määrityksiä varten riit-20 tävän tehokas estääkseen häirinnän myös suuren reumateki-jäpitoisuuden omaavissa seerumeissa.

Yllättäen havaittiin, että edellä mainitut vaikeudet, jotka aiheutuvat hiukkasten epäspesifisestä aggluti-naatiosta koesysteemissä, voidaan estää suorittamalla koe 25 sellaisen laimennetun antiseerumin läsnä ollessa joka, tai jotka, ei reagoi määritettävän antigeenin tai vasta-aineen eikä hiukkaseen sidotun osapuolen kanssa, sekä ''Tween 20:n läsnäollessa.

Keksinnön kohteena on menetelmä hiukkasten avulla 30 vahvistetun immunologisen reaktion osapuolen osoittamiseksi tai määrittämiseksi nefelometrisella, turbidimetrisella tai hiukkasten laskentamenetelmällä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että osoittaminen tai määrittäminen suoritetaan sellaisen antiseerumin läsnäollessa, joka ei sisäl-35 lä immunologisen reaktion reaktio-osapuolille spesifisiä 4 o 9 5 ν' 9 vasta-aineita, ja siten, että läsnä on 0,05 - 2 ml/100 ml RTween 20, eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoeste-riä.

Tällaiseksi antiseerumiksi soveltuvat eläinten gam-5 maglobuliinit tai kuumuuden avulla aggregoidut ihmisen gammaglobuliinit. Eläimen gammaglobuliini on esimerkiksi nisäkkäältä saatu anti-lampaan punasoluseerumi ja erityisesti kaniineilta saatu anti-lampaan punasolu-seerumi. Tällaisia gammaglobuliineja ovat myös gammaglobuliini-10 fraktiot, jotka voidaan saada tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi ammoniumsulfaattisaostuksen tai ioninvaihto-kromatografiän avulla. Hiukkasiksi, jotka voidaan kuormata immunologisen reaktion toisella osapuolella käytettäviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä, jotta saataisiin niin 15 kutsuttuja "reagensseja" tätä tarkoitusta varten, soveltuvat esimerkiksi lateksidispersioiden hiukkaset.

Lateksihiukkasten tulisi olla muodostuneita "kalvoa muodostamattomista" polymeraateista. Kalvoa muodostamatto-milla tarkoitetaan polymeerilateksiosasia, jotka eivät 20 tässä kysymykseen tulevissa käyttöolosuhteissa muodosta kalvoa eivätkä yhdisty. Erityisen hyvinä pidetään polyme-raatteja, jotka ovat muodostuneet karbosyklisistä aromaattisista monovinylideenimonomeereista, kuten styreenistä, vinyylitolueenista tai vinyylinaftaliinista sekä näiden 25 monomeerien seoksista keskenään ja/tai metyylimetakrylaa-tin ja akryylinitriilin kanssa. Aivan erityisen hyvinä alkiodispersioina pidetään polystyreenilatekseja.

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan siten, että läsnä on 0,05 - 2 g/100 ml KTween 20:tä ja mahdolli-30 sesti 0,5-3 g/100 ml neutraalisuolaa, edullisesti keittosuolaa .

Immunologisen reaktion osapuoli voidaan kiinnittää hiukkaseen adsorption avulla tai kovalenttisesti sitomalla ja sillä tavalla "kuormata" hiukkanen. Antigeenin tai vas-35 ta-aineen kytkeminen hiukkaseen voidaan suorittaa jonkin tunnetun menetelmän mukaan.

5 89539

Edullisesti hiukkaset kuormataan vasta-aineilla, jotka kohdistuvat seerumin proteiineja, kuten alfa-feto-proteiinia (AFP), myoglobiinia, beeta-2-mikroglobuliinia tai immunoglobuliini-E:tä, ihmisen hormoneja, kuten ihmi-5 sen koriogonadotropiinia, entsyymejä, kuten haiman lipaa-sia, tai eläinten hormoneja, kuten kantavan tamman seerumin gonadotropiinia, vastaan.

Erityisen edullisena pidetään keksinnön mukaista menetelmää, jossa on sidottu alfa-fetoproteiinin (AFP) tai 10 immunoglobuliini-E:n (IgE) vastaisia vasta-aineita kova-lenttisesti lateksihiukkasiin.

Jos AFP määritetään tekniikan tason mukaisella menetelmällä, esimerkiksi kuten on kuvattu julkaisussa EP-A-0 080 614, siis lisäämättä antiseerumia, saadaan sel-15 laisten seerumien tapauksessa, jotka sisältävät reumateki- jöitä, selvästi mitattavia näennäisarvoja AFP:lie (taulukko 1), kun sen sijaan suoritettaessa koe keksinnön mukaisesti, erityisesti käyttäen kaniineilta peräisin olevaa anti-lampaan punasolu-seerumia, saadaan tuloksia, jotka 20 ovat täysin yhtäpitäviä entsyymi-immuunianalyysin (EIA) kanssa.

Kaniineilta peräisin olevan anti-lampaan punasolu-seerumin lisääminen ei häiritse todella läsnä olevan AFP:n määritystä vastaavissa seeruminäytteissä, kuten taulukko 2 25 osoittaa.

Taulukko I

AFP:n nefelometrinen määritys 15 seerumista, jotka sisältävät reumatekijoitä (RF) β β95;9 5 Alfa-fetoproteiinipitoisuus (lU/ml) nefelo- metrian avulla RF-Pit. EIA:ssa Näennäinen tunne- Keksinnön tulla menetelmällä mukaisesti _saatu_määriteltynä 711 * 3 a) 19 * 7 b) 10 2768 * 3 96 * 7 474 * 3 16 * 7 578 * 3 19 * 7 251 * 3 7 * 7 543 * 3 * 7 b) * 7 15 2760 * 3 13 * 7 446 * 3 23 * 7 178 * 3 20 * 7 2078 * 3 46 * 7 191 * 3 18 * 7 20 1626 * 3 50 * 7 158 * 3 31 * 7 248 * 3 10 * 7 513 * 3 57 * 7 25 * tarkoittaa "pienempi kuin" a) AFP-pitoisuus on hyvin pieni eikä siksi ole mitattavissa entsyymi-immuunianalyysin avulla b) Ei käyttökelpoinen, mutta on saatu kuten kuulukin mit- 30 tausalueen alapoulella oleva arvo

Kaikki seerumit tutkittiin myös entsyymi-immuunianalyysin (EIA) ja keksinnön mukaisen menetelmän avulla. Tutkituissa seerumeissa on AFP:n konsentraatio pieni ja 7 895;9 EIA:ssa sitä suorastaan ei voitu mitata. Kuten taulukko 1 osoittaa, saadaan tekniikan tason mukaisen nefelometrisen määrityksen avulla AFP:n näennäiskonsentraatioita (vääriä positiivisia arvoja). Keksinnön mukaisella menetelmällä 5 tutkittaessa saatiin kaikille seerumeille mittausalueen alapuolella olevat arvot, siis EIA:n kanssa yhtäpitävästi ei mitään väärin positiivisia arvoja.

Taulukko 2 AFP:n nefelometrinen määritys 15 seerumista, jotka 10 sisältävät AFP:tä AFP-pitoisuus EIA:ssa AFP-pitoisuus keksinnön _mukaisesti määritettynä_ _(IU/ml)_(IU/ml)_ 50,9 53,0 15 168,2 173,0 56,4 58,1 68.8 67,9 44,6 42,0 169.0 149,0 20 46,3 41,5 27.0 25,4 19.8 14,4 11.3 11,2 29.4 26,5 25 14,6 10,0 33,2 31,4 89.4 103,0 127.0 154,0 30 Kaikki seerumit tutkittiin myös entsyymi-immuuni- analyysin (EIA) ja keksinnön mukaisen menetelmän avulla. Tutkituissa seerumeissa on AFP:n konsentraatio näiden kahden menetelmän avulla määritettynä suurin piirtein yhtäpitävä, erilaisten määritysmenetelmien pienet erot, jotka « 395?9 ovat asiantuntijalle tunnettu asia, huomioon ottaen.

Samalla tavalla saadaan tekniikan tason mukaan suoritetussa IgE-määrityksessä väärin korkeita IgE-arvoja reumapotilaiden seerumeille (taulukko 3) . Tässä taulukossa 5 on esitetty myös keksinnön mukaisessa määrityksessä saadut tulokset. Tässä käy myös ilmi kaniineilta peräisin olevan anti-lampaan punasolu-seerumin lisäämisen edullinen vaikutus. Tällä tavalla saadaan tuloksia, jotka ovat hyvin yhteensopivia entsyymi-immuunianalyysin avulla saatujen tulo losten kanssa.

Taulukko 3

IgE:n nefelometrinen määritys 15 seerumista, jotka sisältävät reumatekijöitä (RF) 15 Immunoglobuliini E (IgE)-pitoisuus (IU/ml) nefe- lometrian avulla RF-pit. EIArssa Näennäinen tek- Keksinnön mukai- niikan tason mu- sesti määritet-_kaan määritettynä tynä_ 474 44 102 47 2475 120 486 179 20 652 115 547 178 1501 342 515 293 2332 147 494 202 478 57 126 62 400 32 171 74 25 1940 124 483 176 1750 37 150 38 199 32 304 35 696 176 326 211 74 9 47 * 35 30 202 103 187 98 53 1 * 35 * 35 140 4 83 * 35 * tarkoittaa "pienempi kuin" 9 ”95 ')

Tulos:

Nefelometrian avulla tekniikan tason mukaisesti määritettynä saadaan aivan liian korkeita arvoja. Nefelo-metrisen määrityksen tulosten keskimääräinen poikkeaminen 5 entsyymi-immuunianalyysissä saaduista arvoista on noin 370 %.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla saadaan arvot useimmiten oikein. Keksinnön mukaisen nefelometrisen määrityksen tulosten keskimääräinen poikkeaminen entsyymi-10 immuunianalyysin arvoista on tässä tapauksessa noin 25 %.

Antigeenien tai vasta-aineiden kytkeminen mainittuihin reagenssihiukkasiin voidaan suorittaa jonkin tunnetun menetelmän avulla.

Edullisesti kuormataan lateksi vasta-aineilla, jot-15 ka kohdistuvat ihmisen seerumin proteiineja, kuten alfa-fetoproteiinia, myoglobiinia, beeta-2-mikroglobuliinia tai immunoglobuliini-E:tä, ihmisen hormoneja, kuten ihmisen koriogonadotropiinia, entsyymejä, kuten haiman lipaasia, tai eläinten hormoneja, kuten kantavan tamman seerumin 20 gonadotropiinia, vastaan.

Käytettävät antiseerumit valmistetaan immunisoimalla eläimiä, erityisesti kaniineja, lampaita ja vuohia, ihmiseltä tai eläimeltä peräisin olevalla proteiinilla, jolloin läsnä ei saa olla kokeessa määritettävää proteii-25 nia.

Esimerkkejä ovat: kaniinilta saatu anti-ihmisen

IgG-seerumi, kaniinilta saatu anti-ihmisen IgM-seerumi, kaniinilta saatu anti-lampaan punasolu-seerumi, lampaalta saatu anti-ihmisen IgG-seerumi, lampaalta saatu antikanii-30 nin gammaglobuliini-seerumi. Erityisen sopiva on kaniinil ta saatu anti-lampaan punasolu-seerumi. Immunisointi suoritetaan tunnettuja menetelmiä käyttäen. Immunisointiannos ja -aika määräytyvät proteiinin immunogeenisyyden ja mole-kyylipainon perusteella.

35 Käytettävät vasta-aineliuokset eivät sisällä vasta- 10 <9 5 9 aineita lateksihiukkaseen sidottua eläimen antiseerumia vastaan. Ne ovat tavallisesti peräisin samalta eläinlajilta .

Antiseerumi tai gammaglobuliiniliuos lisätään liu-5 okseen, josta on tarkoitus määrittää tai osoittaa antigeeni tai vasta-aine.

Antiseerumia lisätään sellainen määrä, että sen konsentraatio koeseoksessa on 50 - 0,05 ml/100 ml. Edullisempi on konsentraatio 10 - 0,1 ml/100 ml koeseoksessa. 10 Erityisen edullinen on konsentraatio 2 - 0,2 ml/100 ml koeseoksessa.

Lisäksi on edullista, että mittauskyvetissä on ei-ionista pesuainetta kuten eikosaoksietyleenisorbitaani-lauryylihappoesteriä (“Tween 20) konsentraatiossa 0,05 - 2 15 ml/100 ml

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää kaikkien immunologisesti aktiivisten aineiden määrittämiseen, joita aineita on nisäkkäiden, erityisesti ihmisen, veressä (seerumissa, plasmassa). Esimerkkejä näistä immunologises-20 ti aktiivisista aineista ovat seerumin proteiinit.

Keksinnön mukaista menetelmää varten pannaan koe-kyvettiin reagenssi. Keksinnön mukainen reagenssi sisältää 90 - 0,1 ml/100 ml, edullisesti 20-1 ml/100 ml antiseerumia, joka ei sisällä immunologisen reaktion osapuolille 25 spesifisiä vasta-aineita, sekä 50 - 0,1 ml/100 ml, edullisesti 20 - 0,5 ml/100 ml “Tween 20:tä.

Esimerkki 1 1. Alkiopolymeraatin valmistus lateksia varten

Lieriömäiseen lasiastiaan, joka oli varustettu 30 kaasun sisäänvienti- ja kaasun poistoputkella sekä magnee-ttisauvalla, pantiin 310 ml typellä kyllästettyä kaksi kertaa tislattua vettä. Lisättiin 500 mg natriumstearaat-tia ja liuotettiin tämä sekoittamalla. Lisättiin vielä 1,5 ml ammoniakkia (25 g/100 ml). pH tarkistettiin ja se oli 35 11,09. Suorittamalla useita kertoja evakuointi ja typellä 11 '95:9 täyttäminen saatiin polymerointiastiasta poistettua happi. Pesuaineliuos lämmitettiin jatkuvasti sekoittaen vesi-. hauteen avulla +70 °C:een. Polymerointiastiaan lisättiin sen jälkeen 90 ml vasta tislattua styreenä typpikaasun 5 alla tiputussuppilon avulla tasaten paine. Seosta sekoitettiin vielä 15 minuuttia +70 °C:ssa styreenin emulgoimi-seksi. Sen jälkeen lämpötila nostettiin +90 °C:seen ja seosta sekoitettiin vielä tunnin ajan. Sitten lisättiin 67,5 mg kaliumperoksisulfaattia liuotettuna 50 ml:aan ty-10 peliä kyllästettyä tislattua vettä. Seosta sekoitettiin 130 minuutin ajan +90 °C:ssa. Polystyreeni suodatettiin poimutetun suodattimen lävitse.

Suodatettua polystyreeniä dialysoitiin 50 tunnin ajan 10 litraa ammoniumvetykarbonaattiliuosta vastaan 15 (0,01 g/100 ml NH^HCO,; 0,01 g/100 g NaN,; 10,5 ml:lla am moniakkia, 25 g/100 ml, 10 litraa kohden säädetty pH:hon 10) . Dialyysin jälkeen saatiin 410 ml polymeraattia, jonka kuivapaino oli 17,9 g/100 ml.

2. 2-hydroksipropyylimetakrylaatin (HPM) polyme-20 rointi polystyreeniytimien päälle

Polymerointi tapahtui samanlaisessa astiassa kuin on kuvattu esimerkissä 1. Valmistettiin seos, jossa oli 22,4 ml polystyreenilateksia, jonka kiinteän aineen pitoisuus oli 17,9 g/100 g, ja 56,7 ml tislattua vettä sekä 50 25 mg natriumdodekyylisulfaattia. Nämä pantiin polymerointiastiaan ja happi poistettiin. Lisättiin vielä 1 ml ka-liumperoksisulfaattiliuosta (16 mg/ml tislatussa vedessä) ja seos kuumennettiin +70 °C:seen. Valmistettiin seos, jossa oli 0,4 ml styreeniä, 0,4 ml metakryyliamidoasetal-30 dehydi-di-n-pentyyliasetaalia, 0,025 ml metakryylihappoa ja 0,2 ml 2-hydroksipropyylimetakrylaattia (HPM). Monomee-riseos tiputettiin hitaasti 60 minuutin aikana voimakkaasti sekoitettuun polystyreenilateksisuspensioon +70 °C:ssa. Sen jälkeen seosta sekoitettiin vielä 4 tunnin ajan samas-35 sa lämpötilassa.

Ympäristön lämpötilaan jäähdyttämisen ja poimute- 12 y 9 5 :;· 9 tun suodattimen lävitse suodattamisen jälkeen saatiin 73 ml polymeraattia. Sen jälkeen dialysoitiin noin 20 tunnin ajan NaHCO,-puskuriliuosta vastaan (0,25 g/1, pH 8-8,2) Saatiin 87 ml lateksidispersiota, jonka kiinteän aineen 5 pitoisuus oli 5,1 g/100 g.

3. AFP-vasta-aineiden sitominen polymeraattiin Polymeraattiin, joka oli valmistettu käyttäen 2-hydroksipropyylimetakrylaattia esimerkin 2 mukaan, sidottiin AFP-vasta-aineita kuten seuraavassa on esitetty. 10 Kulloinkin käytetty polymeraatti laimennettiin tislatulla vedellä kiinteän aineen pitoisuuteen 4 g/100 g. Antiseerumi, joka oli saatu immunisoimalla kaniineja puhdistetulla AFP:lla, puhdistettiin tunnettuja menetelmiä käyttäen affiniteettikromatografiän avulla. Sen jälkeen sitä kon-15 sentroitiin, kunnes saatiin proteiinipitoisuus 10 mg/ml.

3,4 ml yllä mainittua polymeraattia sekoitettiin 0,34 ml:n kanssa AFP-vasta-aineliuosta. Sitten lisättiin 0,17 ml eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoesterin («Tween 20) 20 ml/100 ml vesiliuosta ja seos sekoitettiin 20 jälleen. Tähän lisättiin 0,05 ml IN HCl:a niin että saatiin pH-arvo noin 2. Kun seosta oli inkuboitu 30 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, siihen lisättiin 0,85 ml kyllästettyä dinatriumvetyfosfaatin vesiliuosta (25 mg/ml) ja sekoitettiin hyvin. Sen jälkeen seurasi tunnin inkuboi-25 nti ympäristön lämpötilassa.

Tätä kuormausseosta sentrifugoitiin sitten 30 minuutin ajan nopeudella noin 50 000 g. Saostuman yllä ollut neste heitettiin pois. Jäännös suspendoitiin 5 ml:aan glysiini-NaCl-puskuriliuosta (0,1 moolia/1 glysiiniä, 0,17 30 moolia/1 NaCl, 0,5 ml/100 ml eikosaoksietyleenisorbitaani- lauryylihappoesteriä (“Tween 20), pH 8,2). Tämän jälkeen seurasi 2 sekuntia kestänyt ultraäänikäsittely. Täten uudelleen dispergoitu reagenssi laimennettiin tilavuussuhteessa 1:60 aikaisemmin mainitulla glysiini-NaCl-puskuri-35 liuoksella.

13 ·: 9 5 ?; 9

Esimerkki 2

Anti-IgE-vasta-aineiden sitominen polymeraattiin

Polymeraattiin, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaan käyttäen 2-hydroksipropyylimetakrylaattia, sidot-5 tiin anti-IgE-vasta-aineita. Kulloinkin käytetty polyme-raatti laimennettiin tislatulla vedellä kiinteän aineen pitoisuuteen 4 g/100 g. Antiseerumi, joka oli saatu immunisoimalla kaniineja puhdistetulla IgErllä, puhdistettiin tunnettuja menetelmiä käyttäen affiniteettikromatografiän 10 avulla. Sen jälkeen sitä konsentroitiin, kunnes saavutettiin proteiinipitoisuus 10 mg/ml.

3,4 ml yllä mainittua polymeraattia sekoitettiin 0,34 ml:n kanssa anti-IgE-vasta-aineliuosta. Sitten lisättiin 0,17 ml eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoes-15 terin (RTween 20) 20 ml/100 ml vesiliuosta ja seosta sekoitettiin jälleen. Tähän lisättiin 0,05 ml IN HCl:a, niin että saatiin pH-arvo noin 2. Kun seosta oli inkuboitu 30 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, siihen lisättiin 0,85 ml kyllästettyä dinatriumvetyfosfaatin vesiliuosta 20 (pH 6,5) ja 0,85 natriumsyaaniboorihydridiliuosta (25 mg/ ml) ja sekoitettiin hyvin. Sen jälkeen seurasi tunnin in-kubaatio ympäristön lämpötilassa.

Tätä kuormausseosta sentrifugoitiin sitten 30 minuutin ajan nopeudella noin 50 000 g. Sakan yllä ollut 25 neste heitettiin pois. Jäännös suspendoitiin 5 ml:n gly-siini-NaCl-puskuriliuosta (0,1 moolia/1 glysiiniä, 0,17 moolia/1 Nacl, 0,5 ml/100 ml eikosaoksietyleenisorbitaani-lauryylihappoesteriä (“Tween 20), pH 8,2. Sen jälkeen seurasi 2 sekunnin pituinen ultraäänikäsittely. Näin uudel-30 leen dispergoitu reagenssi laimennettiin tilavuussuhteessa 1:80 aikaisemmin mainitulla glysiini-NaCl-puskuriliuoksel-la.

Esimerkki 3 AFP-konsentraatioiden määrittäminen seeruminäyt- 35 teistä 14 f, 9 b 19 AFP:n määrittämiseen seerumeista käytettiin AFP:n määrittämiseen tarkoitettua reagenssia, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti sitomalla anti-AFP-vasta-ai-neita lateksivalmisteisiin. Standardina käytettiin immuu-5 nisaostusta varten tarkoitettua alfa-fetoproteiini stan-dardiseerumia (ihmisen), jonka AFP-konsentraatio oli 322 000 ng/ml (toiminimi Behringwerke AG, Marburg, Saksan Liittotasavalta). Standardi laimennettiin AFP:tä sisältämättömällä yhdistelmäseerumilla pitoisuudeksi 1000 ng/ml. 10 Tästä laimennoksesta tehtiin AFPrtä sisältämättömällä yhdistelmäseerumilla peräkkäisiä laimennoksia kaksinkertaistaen kulloinkin tilavuus. Täten saatiin pienenevien AFP-konsentraatioiden standardisarja. Potilasseerumit, joista määritykset oli tarkoitus tehdä, laimennettiin 1:5 fosfaa-15 tti-keittosuolapuskuriliuoksella (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04) . Määrityksen suorittamiseksi inkuboitiin 80 μΐ potilasseerumin laimennosta tai standardiseerumin laimennosta 160 μ1:η kanssa reaktio-puskuriliuosta (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 20 0,2 g/100 ml NaH2P04, 5,6 g/100 ml polyetyleeniglykolia 6000) sekä 30 μ1:η kanssa kaniinilta saatua antiseerumia lampaan punasoluja vastaan laimennettuna 1:8 fosfaatti-keittosuolapuskuriliuoksella (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04) , jossa oli 5 ml/100 ml RTw-25 een 20, sekä 60 μ1:η kanssa AFP-reagenssia (esimerkki 1.3) 12 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa. Tulokset mitattiin sitten nefelometrin (esimerkiksi toiminimen Behringwerke AG laitteen) avulla. Laadittiin vertailukäyrä standardiseerumin mittaustuloksista ja sen avulla tulkittiin 30 potilasseerumeiden mittausarvot.

Esimerkki 4

IgE-konsentraatioiden määritys seeruminäytteistä

IgE:n määrittämiseen potilaseerumeista käytettiin esimerkin 2 mukaan valmistettua reagenssia. Käytetty IgE-35 standardi sisälsi 1000 IU/ml. Standardista tehtiin peräk- 15 o 9 519 käisiä laimennoksia IgE:tä sisältämättömällä yhdistelmä-seerumilla kaksinkertaistaen kulloinkin tilavuus. Täten . saatiin standardisarja, jossa IgE-konsentraatiot pieneni vät.

5 Potilasseerumit, joista määritykset oli tarkoitus tehdä, laimennettiin fosfaatti-keittosuolapuskuriliuoksel-la (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH>P04). Mittauksen suorittamiseksi inkuboitiin 80 μΐ poti lasseerumin laimennosta tai standardiseerumin laimennos-10 ta 150 μ1:η kanssa reaktiopuskuriliuosta (1,2 g/ 100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH,P04, 5,6 g/100 ml polyetyleeniglykolia 6000) sekä 20 μ1:η kanssa kaniinilta saatua antiseerumia lampaan punasoluja vastaan laimennettuna 1:3 fosfaatti keittosuolapuskuriliuoksella 15 (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml

NaH2P04) , jossa oli 4 ml/100 ml “Tween 20, sekä 75 μ1:η kanssa igE-reagenssia (esimerkki 3) 12 minuutin ajan ympä ristön lämpötilassa. Tulokset mitattiin sitten nefelomet-rin (esimerkiksi toiminimen Behringwerke AG laitteen) 20 avulla. Laadittiin vertailukäyrä standardiseerumin mittaustuloksista ja sen avulla tulkittiin potilasseerumien mittausarvot.

Claims (6)

16 rv 9 5 9

1. Menetelmä hiukkasten avulla vahvistetun immunologisen reaktion osapuolen osoittamiseksi tai määrittämi- 5 seksi nefelometrisella, turbidimetrisella tai hiukkasten-laskentamenetelmällä, tunnettu siitä, että osoittaminen tai määrittäminen suoritetaan sellaisen antiseerumin läsnäollessa, joka ei sisällä immunologisen reaktion reaktio-osapuolille spesifisiä vasta-aineita, ja siten, 10 että läsnä on 0,05 - 2 ml/100 ml KTween 20, eikosaoksiety-leenisorbitaanilauryylihappoesteriä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antiseerumi on gammaglobuliinin vesiliuos.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antiseerumi on nisäkkäältä saatu anti-lampaan punasolu-seerumi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antiseerumi on kaniinilta 20 saatu anti-lampaan punasolu-seerumi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan käyttäen lateksireagenssia, johon kuuluu kovalenttisesti sidottua antigeeniä, vasta-ainetta tai hapteenia.

6. Reagenssi joka soveltuu käytettäväksi patentti vaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että se sisältää 90 - 0,1 ml/100 ml, edullisesti 20-1 ml/100 ml antiseerumia, joka ei sisällä immunologisen reaktion reaktio-osapuolille spesifisiä vasta-aineita, 30 sekä 50 - 0,1 ml/100 ml, edullisesti 20 - 0,5 ml/100 ml KTween 20, eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoeste-r iä. 17 y? 5:9