NO173297B - Fremgangsmaate for detektering eller bestemmelse av en analytt - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av en analytt av en partikkelforsterket immunologisk reaksjon ved en nefelometrisk, turbidimetrisk eller partikkeltellefremgangsmåte ved anvendelse av antiserum med en fra den immunologiske reaksjon avvikende spesifitet i en slik fremgangsmåte.

Det er kjent å øke følsomheten av serologiske eller immunologiske bestemmelsesfremgangsmåter ved anvendelse av indikator- eller baererpartikler som er ladet med det tilsvarende immunologiske reagens (et antistoff eller antigen). Som bærer kan det for eksempel anvendes røde blodlegemer eller celler av en cellekultur. Også latekspartikler med en diamter på 0,02 til 5 pm kan anvendes.

En slik "partikkelforsterket" nefelometrisk eller turbidimetrisk prøve kan på sikker måte påvise protein inntil konsentrasjoner på ca. 5 ng/ml. Ved en slik partlkkelforsterket prøve anvendes til partikulære polymere bundne antistoffer eller antigener ("fastfase"). Til bestemmelse av et antigen anvendes et fastfasebundet antistoff, til bestemmelse av et antistoff et fastfasebundet antigen. I begge tilfeller foregår ved immunreaksjonen en agglutinering av polymerpartiklene. Derved skjer det en størrelsesøkning av agglutinatene og sprednlngslyssignalet eller uklarheten i reaksjonsblandingen øker.

Fra EP 0 087 728 er det kjent en latex-agglutineringsfrem-gangsmåte under anvendelse av -y -globuliner uten antistoffspesifitet med hensyn til en i omsetningen deltagende reaksjonspartner. Denne gjennomføres ved blanding av et lateksreagens med prøven som skal påvises i en dråpe på en liten glass- eller kunststoffplate. En positiv reaksjon bevirker en sammenklumping og fnokking av lateksreagenset og det melkeaktige utseendet av latekssuspensjonen forsvinner. Slike fremgangsmåter muliggjør et kvalitativt utsagn. De er subjektivt vurderbare ved hjelp av øyet, men ikke ved hjelp av et optisk system. Dessuten er de ikke automatiserbare.

Fra EP-A-0080 614 er det kjent latekspartikler som inneholder over syreamidgrupper bundne acetalfunksjoner. Slike partikler lar seg anvende til nefelometrisk bestemmelse av C-reaktivt protein. Dertil fortynnes serumprøver med buffere, normalt 1:100, hvorved innvirkningen av forstyrrende serumproteiner som ellers ville føre til falske resultater, settes tilbake. Denne arbeidsmåte er mulig, fordi for diagnostiske formål må det vanligvis foreligge konsentrasjoner av C-reaktivt protein på mer enn 5 mg/l. Vil man imidlertid måle konsentrasjonen av sporeproteiner i området på 1 pm/l til 5 >ig/l, bør prøvene ikke fortynnes tilsvarende med buffer, fordi konsentrasjonen av proteinet som skal påvises blir så liten at påvisningsfølsomheten ikke er tilstrekkelig.

En økning av påvisningsfølsomheten ved latekspreparater ifølge teknikkens stand fra bare for eksempel 1:5 fortynnede sera er imidlertid ikke uten videre mulig og gir for eksempel ingen tilfredsstillende funksjonerende prøve for bestemmelse av a-fetoprotein (AFP) eller immunglobulin E.

Ved den partikkelforsterkede nefelometriske eller turbidimetriske prøve finner immunreaksjoner sted på fastfaser. Det er en egenskap hos disse fastfaser, å adsorbere uspesi-fikke proteiner fra de undersøkte kroppsvæsker som kan forstyrre. En annen vanskelighet som kan opptre i en slik metode består i, at det menneskelige serum inneholder proteinet Clq og reumafaktoren (RF). Disse binder seg til antistoffer. Dessuten kan mengden av reumafaktorer og Clq i menneskelig sera variere innen vide grenser, hvorfor det normalt er nødvendig på forhånd å underkaste sera en behandling til inaktivering av Clq eller fjerning av reumafaktoren. Ellers fremkommer falske konsentrasjonsver-dier for sporeproteiner i kroppsvæsker. En sikker bestemmelse ved hjelp av nefelometriske eller turbidimetriske fremgangsmåter er derfor ikke mulig.

Den i EP 0 087 728 for visuelt avlesbare lateksagglutina-sjonsfremgangsmåter foreslåtte tilsetning av y-globuliner uten antistoffspesifitet med hensyn til en i omsetningen deltagende reaksjonspartner er ikke virksom nok for nefelometriske og turbidimetriske målinger, for også å undertrykke forstyrrelser av sera med høyt innhold av reumafaktorer.

Det ble nå overraskende funnet, at de ovenfor nevnte vanskeligheter, forårsaket ved en ikke-spesifik aggluti-neringer av partiklene i et slikt prøvesystem, kan hindres, idet prøven gjennomføres i nærvær av et fortynnet antiserum, som verken reagerer med antigenet eller antistoffet som skal bestemmes eller med den til partiklene bundne partner, det hele eventuelt i nærvær av "Tween 20".

Foreliggende oppfinnelse angår i henhold til dette en fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av en analytt og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter å bringe en prøve inneholdende en antatt analytt i kontakt med en partikkelbundet spesifikk bindingspartner for analytten i nærvær av et antiserum som ikke inneholder antistoffer som er spesifikke for analytten eller den spesifikke bindingspartner for analytten i en konsentrasjon mellom 0,05 og 50 ml/100 ml, i nærvær av 0,05 til 2 g/100 ml eicosa-oksyetylen sorbitan laurat i et reaksjonsmedium idet analytten bindes til den partikkelbundne spesifikke bindingspartner, samt bestemmelse av reduksjonen av antallet partikler ved nefelometriske, turbidimetriske eller par-tikkel-tellemetoder.

Som slik antiserum egner det seg animalske "y-globuliner eller varmeaggregerte humane 7-globuliner. Et slikt animalsk y-globulin er for eksempel et anti-saue-erytrozytt-serum fra et pattedyr og fortrinnsvis et anti-saue-erytrozytt-serum fra kaniner. Slike 7-globuliner er også 7-globulinfraksjoner som kan utvinnes ved hjelp av kjente fremgangsmåter, for eksempel ammoniumsulfatfelling eller ionebyttekromatografi. Som partikler, som kan lades med en av deltagerne av en immunologisk reaksjon til anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, for å få såkalte "reagenser" for dette formål, egner seg for eksempel partikler av lateksdispersjoner.

Slike latekspartikler skal bestå av "ikke-filmdannende" polymerisater. Med ikke filmdannede menes polymerlateks-partikler som ikke danner noen film under de her aktuelle anvendelsesbetingelser og ikke flyter sammen. Polymerisater av karbocykliske aromatiske monovinylidenmonomerer som styren, vinyltoluen eller vinylnaftalin samt blandinger av disse monomerer med hverandre og/eller med metylmetacrylat og acrylnitril, er foretrukket. Spesielt foretrukkede frødis-persjoner er polystyrenlatekser.

Eventuelt kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i nærvær av 0,05 til 2 g/100 ml "Tween" 20 og/eller 0,5 til 3 g/100 ml av et nøytralsalt, fortrinnsvis kokesalt.

En partner av en immunologisk reaksjon kan påføres på partiklene adsorbtivt eller ved hjelp av kovalent binding og "opplades" på en slik måte. Partiklenes kobling med et antigen eller antistoff kan gjennomføres efter kjente metoder.

Fortrinnsvis lades partiklene med antistoffer mot serumproteiner som a-fetoprotein (AFP), myoglobin, e-2-mikro-globulin eller immunglobulin E, humane hormoner, som human-choriogonadotropin, enzymer som pankreas-lipase eller animalske hormoner som pregnant mareserum gonadotropin.

Spesielt foretrukket er en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, hvori antistoffer mot a-fetoprotein (AFP) eller immunglobulin E (IgE) kovalent er bundet til latekspartikler.

Måles AFP efter fremgangsmåten ifølge teknikkens stand, for eksempel i EP-A-0 080 614, altså uten tilsetning av et antiserum, får man for sera som inneholder reumafaktorer, tydelig målbare synbare verdier av AFP (tabell 1), mens man ved prøvegjennomføringen ifølge oppfinnelsen, spesielt ved anvendelse av anti-sau-erytrozytt-serum fra kaniner, får resultater helt overensstemmelse med enzymimmunoanalysen

(EIA).

Tilsetningen av anti-sau-erytrozytt-serum fra kaniner forstyrrer ikke målingen av faktisk tilstedeværende AFP i tilsvarende serumprøver, som tabell 2 viser.

Alle sera ble undersøkt også i en enzym-Immuno-analyse (EIA) og i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I de undersøkte sera er konsentrasjonen av AFP liten og i EIA sågar ikke målbar. Som tabell 1 viser, gir en nefelometrisk bestemmelse ifølge teknikkens stand tilsynelatende konsentrasjoner av AFP (falsk positive verdier). Undersøkt med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ga alle sera verdier under måleområdet, altså i overensstemmelse med EIA ingen falsk positive verdier.

Alle sera ble også undersøkt 1 en enzym-immuno-analyse (EIA) og i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I de undersøkte sera er konsentrasjonen av AFP i begge fremgangsmåter sterkt overensstemmende innen rammen av for fagfolk vanlig svake avvik ved forskjellige prøvefremgangsmåter.

På samme måte finner man for IgE-prøven, gjennomført ifølge teknikkens stand, falskt høye IgE-verdier for sera fra reumapasienter (tabell 3). I denne tabell vises det også resultatene for prøvegjennomføringen ifølge oppfinnelsen. Her viser det seg likeledes en fordelaktig virkning av en tilsetning av anti-sau-erytrozytt-serum fra kaniner. På denne måte får man resultater som viser en god overensstemmelse med de fra enzym-immuno-analysen.

Resultat:

Nefelometrisk måling ifølge teknikkens stand gir for høye verdier. Det midlere avvik av resultatene av den nefelometriske prøve fra verdiene av enzym-immuno-analysen utgjør ca. 370$.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen finnes de mest korrekte verdiene. Det midlere avvik av resultatene av den nefelometriske prøve ifølge oppfinnelsen fra verdiene av enzymimmunoanalysen utgjør i dette tilfelle ca. 25$.

Koblingen av de nevnte reagenspartikler med antigenet eller antistoffene kan gjennomføres efter en kjente metoder.

Fortrinnsvis lades lateksen med antistoffer mot serumproteiner som a-fetoprotein, myoglobin, p<->2-mikroglobulin eller immunglobulin E, human hormoner som human-choriogonadotropin, enzymer som pankreas-lipase eller animalske hormoner som pregnant mareserum gonadotropin.

De anvendte antisera fremstilles ved immunisering av dyr, spesielt kaniner, sauer og geiter med et protein av human eller animalsk opprinnelse, som ikke behøver å inneholde proteinet som skal bestemmes i prøven.

Eksempler er: anti-human-IgG-serum fra kaniner, anti-human-IgM-serum fra kaniner, anti-saue-erytrozytt-serum fra kaniner, anti-human-IgG-serum fra sau, anti-kanin-7-globulin-serum fra sau. Spesielt egnet er anti-saue-erytrozytt-serumet fra kaniner. Immuniseringen gjennomføres efter i og for seg kjente metoder. Immuniseringsdosis og -tid fremgår av immunogeniteten og molekylvekten av proteinet.

De anvendte antistoffoppløsninger inneholder ingen antistoffer mot det til latekspartiklene bundne animalske antiserum. De er vanligvis fra samme dyreart.

Et slikt antiserum eller en slik "y-globulin-oppløsning settes til oppløsningen, hvori et antigen eller et antistoff skal bestemmes eller påvises.

Et slikt antiserum tilsettes i en slik mengde at det foreligger en konsentrasjon mellom 50 og 0,05 ml/100 ml i prøveblandingen. Fordelaktigere er en konsentrasjon mellom 10 og 0,1 ml/100 ml i prøveblandingen. Spesielt fordelaktig er en konsentrasjon mellom 2 og 0,2 ml/100 ml i prøve-blandingen .

Fordelaktig er i tillegg en konsentrasjon på 0,05 til 2 ml/100 ml av en ikke-ionisk detergens som eikosa-oksyetylen-sorbitanleurylsyreester ("Tween" 20) i målekyvetten.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er anvendbar til påvisning av alle immunologisk aktive stoffer som er inneholdt i blod (serum og plasma) av pattedyr, spesielt av mennesker. Eksempler på slike immunologisk aktive stoffer er serumproteiner.

For fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen has et middel i prøvekyvetten. Dette middel innholder 90 til 0,1 ml/100 ml av et antiserum, som ikke inneholder antistoffer, som er spesifikt for en av de immunologiske reaksjonsdeltagere. Spesielt fordelaktig inneholder midlet 20 til 1 ml/100 ml av det nevnte antiserum. I tillegg inneholder midlet 50 til 0,1 ml/100 ml "Tween" 20, spesielt fordelaktig 20 til 0,5 ml/100 ml "Tween" 20.

Eksempel 1

1. Fremstilling av frøpolymerisat for lateksen

I et sylinderisk glasskår utrustet med gassinnløp- og gassutløp samt en magnetrørestav ble det fylt 310 ml nitrogenmettet dobbeltdestillert vann. Man tilsatte 500 mg natriumstearat og oppløste dette ved omrøring. Videre ble det tilsatt 1,5 ml ammoniak (25 g/100 ml). pH-verdien ble kontrollert og utgjorde 11,09. Ved flere gangers evakuering av fylling med nitrogen ble polymerisasjonskaret gjort oksygenfritt. Under stadig omrøring ble detergensoppløsningen oppvarmet ved hjelp av et vannbad til +70°C. Derefter satte man 90 ml nydestillert styren under nitrogen til polymerisasjonskaret ved hjelp av en dryppetrakt med trykkutligning. Ved +70°C ble det omrørt ytterligere 15 minutter til emulgering av styrenet. Derefter ble temperaturen hevet til 90° C og det hele omrørt ytterligere en time. Derefter ble det tilsatt 67,5 mg kaliumperoksydisulfat oppløst i 50 ml nitrogenmettet destillert vann. Man lot det hele omrøre 130 minutter ved 90°C. Polystyrenet ble ifylt gjennom et foldefilter. Det filtrerte polystyren ble dialysert 50 timer mot 10 1 ammoniumhydrogenkarbonatoppløsning (0,01 g/100 ml NH4ECO3;

0,01 g/100 g NaN3? innstilt på pH 10 med 10,5 ml ammoniak 25 g/100 ml i 10 1). Man fikk efter dialyse 410 ml polymerisat med en tørrvekt på 17,9 g/100 ml. 2. Polymerisering av 2-hydroksypropylmetacrylat (EPM) på polystyrenkjerner.

Polymerisasjonen foregikk i et kar tilsvarende det som er beskrevet i eksempel 1. Man fremstilte en blanding av 22,4 ml polystyrenlateks med et faststoffinnhold på 17,9 g/100 g og 56,7 ml destillert vann samt 50 mg natrium-dodecylsulfat. Dette ble fylt i polymerisasjonskaret og oksygenet fjernet. Videre ble det tilsatt 1 ml av en kaliumperoksydisulfatoppløsning (16 mg/ml i destillert vann) og blandingen oppvarmet til 70°C.

Man fremstilte en blanding av 0,4 ml styren, 0,4 ml metacrylamidoacetaldehyd-di-n-pentylacetal, 0,025 ml metacrylsyre og 0,2 ml 2-hydroksypropyl-metacrylat (HPM). Monomerblandingen ble langsomt dryppet til den kraftig omrørte polystyrenlatekssuspensjon ved 70°C i 60 minutter. Derefter ble det videreomrørt 4 timer ved samme tempera-tur .

Efter avkjøling til værelsestemperatur og filtrering gjennom et foldefilter får man 73 ml av polymerisatet. Man dialyserte derefter ca. 20 timer mot. NaHCC^-buffer (0,25 g/l, pH 8-8,2). Man fikk 87 ml av en lateksdisper-sjon med et faststoffinnhold på 5,1 g/100 g.

3. Binding av AFP-antistoffer til et polymerisat.

Til et polymerisat, fremstilt under anvendelse av 2-hydroksy-propylmetacrylat ifølge punkt 2, ble det bundet AFP-antistoffer, som angitt nedenfor. Det anvendte polymerisat ble fortynnet med destillert vann til et faststoffinnhold på 4 g/100 g. Et antiserum, fremstilt ved immunisering av kaniner med renset AFP, ble renset affinitetskromatografisk ifølge kjente fremgangsmåter. Det ble derefter konsentrert til det var oppnådd et proteininnhold på 10 mg/ml.

3,4 ml av ovennevnte polymerisat ble blandet med 0,34 ml av AFP-antistoffoppløsningen. Derefter ble det tilsatt 0,17 ml av en 20 ml/100 ml vandig oppløsning av eikosaoksyetylen-sorbitanleurylsyreester (Tween" 20) og det hele igjen blandet. Hertil satte man 0,05 ml IN HC1, så det ble oppnådd en pH-verdi på ca. 2. Efter en inkubasjonstid på 30 minutter ved værelsestemperatur tilsatte man 0,85 ml mettet vandig dinatriumhydrogenfosfatoppløsning (25 mg/ml) og gjennomblandet godt. Derefter foregikk en inkubasjon på en time ved værelsestemperatur.

Denne oppladningsblanding ble derefter sentrifugert 30 minutter med ca. 50 000 g. Supernatanten ble kassert. Resten ble resuspendert i 5 ml av en glycin-NaCl-buffer (0,1 mol/l glycin, 0,17 mol/l NaCl, 0,5 ml/100 ml eikosaoksyetylen-sorbitan-laurinsyreester ("Tween" 20), pH 8,2). Derefter foregikk en ultralydbehandling i 2 sekunder. Det således redispergerte reagens ble fortynnet i volumforhold 1:60 med det ovenfor nevnte glycin-NaCl-buffer.

Eksempel 2

Binding av anti-IgE antilegemer til et polymerisat.

Til et polymerisat, fremstilt ifølge eksempel 1 under anvendelse av 2-hydroksypropylmetacrylat, ble det bundet anti-IgE-antistoff. Det anvendte polymerisat ble fortynnet med destillert vann til et faststoffinnhold på 4 g/100 g. Et antiserum fremstilt ved immunisering av kaniner med renset IgE ble renset affinitetskromatografisk ifølge kjente fremgangsmåter. Det ble derefter konsentrert til det var oppnådd et proteininnhold på 10 mg/ml.

3,4 ml av dette polymerisat ble blandet med 0,34 ml av anti-IgE-antistof f oppløsningen . Derefter ble det tilsatt 0,17 ml av en 20 ml/100 ml vandig oppløsning av eikosa-oksyetylen-sorbitanlaurylsyreester ("Tween" 20) og det hele blandet igjen. Hertil ble det satt 0,05 ml IN HC1, slik at det ble oppnådd en pH-verdi på ca. 2. Efter en inkubasjonstid på 30 minutter ved værelsestemperatur tilsatte man 0,85 ml mettet vandig dinatriumhydrogenfosfatoppløsning (pH 6,5) og 0,85 ml vandig natriumcyanborhydridoppløsning (25 mg/ml) og gjennomblandet godt. Derefter foregikk en inkubasjon på 1 time ved værelsestemperatur.

Denne oppladningsblanding ble derefter sentrifugert 30 minutter med ca. 50 000 x g. Supernatanten ble kassert. Resten ble resuspendert i 5 ml av en glycin-NaCl-buffer (0,1 mol/l glycin, 0,17 mol/l • NaCl, 0,5 ml/100 ml eikosaoksyetylen-sorbitan-laurinsyreester ("Tween" 20), pH 8,2). Derefter foregikk en ultralydbehandling i 2 sekunder. Det således redispergerte reagens ble fortynnet i volumforhold 1:80 med den tidligere nevnte glycin-NaCl-buffer.

Eksempel 3

Måling av AFP-konsentrasjoner i serumprøver.

Det ifølge eksempel 1 ved binding av anti-AFP-antilegemer til latekspreparater fremstilte reagens til bestemmelse av AFP ble anvendt til måling av AFP i sera. Som standard ble det anvendt a-fetoproteiner standardserum (human) for immunprecipitering med en AFP-konsentrasjon på 322 000 ng/ml (fa. Behringwerke AG, Marburg, Tyskland). Standarden ble fortynnet i en AFP-fritt serumpool til 1 000 ng/ml. Denne fortynning ble i det AFP-frie serumpool fortynnet trinnvis videre til det dobbelte volum. Man fikk således en standardrekke med avtagende AFP-konsentrasjoner. Pasientsera som skulle bestemmes ble fortynnet 1:5 i en fosfat-kokesaltbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04). Til målingen ble 80 jjI pasientserumfortynning, eller s tandardserumf or tynning, inkubert med 160 jjI av en reaksjonsbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04, 5,6 g/100 ml polyetylenglykol 6000) samt 30 jjI av antiserumet mot fåreerytrozytter fra kaniner 1:8 fortynnet i fosfat-kokesaltbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04) med 5 ml/100 "Tween" 20 samt 60 jjI AFP-reagens (eksempel 1.3) i 12 minutter ved værelsestemperatur. Resultatene ble derefter målt i et nefelometer (eksempel D fra Behringwerke AG).

Referansekurven for målingen av standardserumet ble opptegnet og dertil ble måleverdiene vurdert for pasientsera.

Eksempel 4

Måling av IgE-konsentrasjon i serumprøver

Det ifølge eksempel 2 fremstilte reagens ble anvendt til måling av IgE i pasientsera. Denne IgE-standard inneholdt 1 000 IU/ml. Standarden ble seriefortynnet trinnvis i en IgE-fri serumpool til det dobbelte volum. Man fikk således en standardrekke med avtagende IgE-konsentrasjoner.

De pasientsera som skulle bestemmes ble fortynnet i en fosfat-kokesaltbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04). Til målingen ble 80 pl pasientserumfortynnet eller standardserumfortynning inkubert med 150 pl av en reaksjonsbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04, 5,6 g/100 ml polyetylenglykol 6000) samt 20 pl av antiserumet mot fåreerytrozyter fra kanin 1:30, fortynnet i fosfat-kokesaltbuffer (1,2 g/100 ml NaCl, 1,3 g/100 ml Na2HP04, 0,2 g/100 ml NaH2P04) med 4 ml/100 ml "Tween" 20, samt 75 pl IgE-reagens (eksempel 3) i 12 minutter ved værelsestemperatur. Resultatene ble derefter målt med et nefelometer (eksempelvis det fra Behringwerke AG). Referansekurven for målingen av standardserumet ble opptegnet og derifra ble måleverdiene for pasientserum anslått.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av en analytt, karakterisert ved at den omfatter å bringe en prøve inneholdende en antatt analytt i kontakt med en partikkelbundet spesifikk bindingspartner for analytten i nærvær av et antiserum som ikke inneholder antistoffer som er spesifikke for analytten eller den spesifikke bindingspartner for analytten i en konsentrasjon mellom 0,05 og 50 ml/100 ml, i nærvær av 0,05 til 2 g/100 ml eicosa-oksyetylen sorbitan laurat i et reaksjonsmedium idet analytten bindes til den partikkelbundne spesifikke bindingspartner, samt bestemmelse av reduksjonen av antallet partikler ved nefelometriske, turbidimetriske eller par-tikkel-tellemetoder.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antiserumet tilsettes i en mengde slik at konsentrasjonen av antiserum i reaksjonsblandingen er 0,1 til 10 ml antiserum i 100 ml reaksjonsblanding.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som antiserum benytter en vandig -y-globulin-oppløsning.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antiserum benyttes et anti-saue-erytrozyttserum fra et pattedyr.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at man benytter et anti-saue-erytrozyttserum fra en kanin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partiklene er latex-partikler og at partneren i en immunologisk reaksjon som er kovalent bundet til partikkelen, er et antigen, et antistoff eller et hapten.