CN101864289A - 游离四碘甲状腺素检测微粒、其制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甲状腺疾病的辅助诊断试剂,公开了一种用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,为三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒。本发明还公开了上述游离四碘甲状腺素的检测微粒的制备及应用。此外,本发明又进一步公开了一种测定样品中游离四碘甲状腺素的体外诊断试剂盒,同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。
Description
技术领域
本发明涉及游离四碘甲状腺素的诊断试剂,具体涉及基于光激化学发光原理的游离四碘甲状腺素检测微粒、其制备及应用。
背景技术
甲状腺疾病是一组较常见的内分泌疾病,包括缺碘性甲状腺肿、其他原因引起的甲状腺肿、甲亢、甲状腺瘤、甲状腺炎、甲状腺功能减退等。甲状腺病的发生率比较高。
甲亢也就是甲状腺功能亢进症,它是一种临床上十分常见的内分泌疾病。是指由各种原因导致甲状腺功能增强,甲状腺激素分泌过多或因甲腺原氨酸(T4)在血液中水平增高所导致的机体神经系统、循环系统、消化系统心血管系统等多系统的一系列高代谢症候群以及高兴奋症状和眼部症状。
甲状腺机能减退症系甲状腺激素TSH合成与分泌不足,或甲状腺激素生理效应不好、生物效应不足而致的全身性疾病。临床上可分为呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能减退始于胎儿或新生儿期,称为克汀病;始于性发育前儿童称幼年型甲减;始于成人称成年型甲减。
甲状腺瘤是临床常见病,其中绝大多数为良性病变,少数为癌,肉瘤、恶性淋巴瘤等。该病女性发病率明显高于男性,男女发病比例约1∶2~3。
甲状腺炎是以炎症为主要表现的甲状腺疾病,包括感染性和非感染性。不少见。临床权威上所说的急性、亚急性及已经慢性甲状腺炎,只表明青年疾病过程的长短,它们之间无内在联系,也不互相转变,每种具有发表不同的病因、有着临床特点、病理过程及固有的结局。
四碘甲状腺素3,5,3′,5′-tetraiodo-L-thyronine缩写T4,是从甲状腺滤泡上皮分泌产生的激素,释放入血后,T4绝大部分都与TBG结合,通过与细胞核内特异受体蛋白结合,诱导该蛋白产生活性构象,使其DNA结合部位与DNA的特定部位有效结合,从而激活DNA的转写过程,达到调节基因表达的生物功能。其中约0.03%的总血清T4呈游离状态(FT4),是T4的生理活性形式,是甲状腺代谢的真实反映,与结合激素动态平衡,维持正常的生理功能。FT4比T4更灵敏,更有意义。FT4测定是临床常规诊断的重要部分,可作为甲状腺抑制治疗的检测手段,当怀疑甲状腺功能紊乱时,常作TSH、FT3和FT4三项联检,确认甲状腺疾病以及追踪疗效。因此,检测血清FT4对于甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低及甲状腺肿瘤的诊断或鉴别诊断,对甲状腺功能相关疾病的发展过程、疗效及预后评估中具有十分重要的意义。
血清中FT4浓度高于正常值,可能是:(1)甲状腺机能亢进;(2)甲状腺激素不敏感综合症;(3)低T3综合症;(4)某些药物影响(如乙胺碘呋酮等)。
血清中浓度低于正常值,可能是:(1)甲状腺疾病:原发性甲状腺功能低下症、亚临床甲减、新生儿甲减;(2)药物影响:抗甲状腺药物;(3)甲亢治疗过量可导致下降。
免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段,由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示,因此常被用于检测蛋白质,激素等微量生物活性物质。
我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代,现仍普遍使用于县级以上医院);酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代,各临床机构普遍使用);以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用,产品步入成长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度,检测范围宽等优点,已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者,是免疫学检测重要的发展方向。
但目前国内自行研制的化学发光检测试剂,大多为非均相反应,采用化学底物直接标记,通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似,需反复清洗与分离,检测耗时长,自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott,Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发,即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免疫测定。最常用的为吖啶酯,在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP,金钢脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光(electrochemiluminescence,ECL),发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂,将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌,随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行,不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗,自动化设计复杂,仪器相当昂贵。此外,发光基质的稳定性也是一大问题。
光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术,成功地解决了上述不足。因反应在均相中进行,既加快了反应速度,又避免了反复分离与清洗步骤,能有效降低检测背景值,减少反应时间,并可实现自动化操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于定量检测血清中游离四碘甲状腺素的检测微粒,其制备、检测条件及应用。
本发明的技术原理:
本发明的游离四碘甲状腺素检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关,光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整合了高分子微粒技术,有机合成,蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。
本发明之所以能检测血清中的游离四碘甲状腺素的水平,是由于在均相条件下,将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有三碘甲腺原氨酸(T3)。并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。T3又名三碘甲腺原氨酸,是一种从甲状腺分泌出来的激素,是一组含碘的酪氨酸,以碘和酪氨酸为原料在甲状腺腺细胞内合成。T3分泌量较少,但其活性大,是T4的5倍。T3在甲状腺外,可以由甲状腺素的脱碘化形成,两者在结构上极为相似。血液中的T3绝大部分与TBG结合,约0.4%的游离T3作用于靶细胞,维持正常的生理功能。约20%循环中T3由甲状腺产生,其余80%主要来自肝脏,由T4的外环脱碘(5′D-I)转换产生。
T3分子式为C15H12I3NO4,结构如下所示:
T4分子式为C15H11I4NO4,结构如下所示:
由于T4和T3分子结构十分相似,因此T3可和针对T4的抗体发生微弱的结合。当血清中存在FT4时,这一脆弱的结合即被破坏,被FT4和T4抗体的结合取代。
此时纳米感光微粒和包被有表面抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉游离四碘甲状腺素(FT4),在近距离内,三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后,纳米感光微粒中的染料被诱导激活,并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获,从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后,发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子,并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度,光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含游离四碘甲状腺素(FT4)时,无法在近距离形成免疫夹心复合物,活性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减,检测时则无高能级红光产生。具体原理参见图1及图2。
基于上述原理,本发明第一方面提供了一种用于检测游离四碘甲状腺素(FT4)的检测微粒,为三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒。
本发明第二方面提供了一种游离四碘甲状腺素(FT4)的检测试剂盒,包括上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒。试剂盒中,还可包括生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)和亲和素包被的感光微粒。
在试剂盒中,上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)和亲和素包被的感光微粒分别独立包装,且均为混悬液。上述含有三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系,如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒的溶剂优选pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES缓冲液,生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)的溶剂优选pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris缓冲液,亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES缓冲液,上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20,出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂,防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。
在用于定量检测游离四碘甲状腺素(FT4)时,上述试剂盒中还可包括含有多种已知四碘甲状腺素浓度的溶液。上述不同四碘甲状腺素浓度的溶液分别独立包装。
上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等,镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等,该微粒可由市场上购得。
研究发现,由于最终的检测反应是均相反应,发光微粒的粒径(微粒的平均直径)太大(>400nm)会自然沉降,影响检测效果,微粒的粒径太小(<100nm),会使制备过程中的清洗工作比较困难,对抗体连接工作不利,因此发光微粒的粒径范围应在100-400nm之间,较好为150-300nm之间,优选250nm。
发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团,但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团,连接抗体的反应方式和条件也不相同。
鉴于获得更好的三碘甲腺原氨酸(T3)的连接效率,试剂稳定性和连接重复性,经试验优选醛基表面官能团的微粒,并应用了NaBH3CN的还原胺化反应作为抗体的连接方法。
发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量一般会在150,000——350,000光子数/100μg发光微粒范围内,优选中等强度偏上的水平(≥250,000光子数/100ug)发光微粒。
上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒中,发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)的质量比例较佳为10∶(0.01-0.1),优选10∶0.05。
上述生物素标记的抗体(T4Ab)中,生物素与抗体的分子比例较佳为(10-50)∶1,优选30∶1。
上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下,可以产生单线态氧离子,当其与发光微粒距离足够近的情况下,单线氧离子传递到发光微粒,与发光微粒中的发光化合物反应,产生紫外光,紫外光再进一步激发镧系元素化合物,产生520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等,该微粒也可由市场上购得。
上述亲和素包被的感光微粒中,亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制,较佳为1∶(3-10),优选1∶5。
市售感光微粒均适用于本发明,微粒粒径较佳为180-260nm,优选220nm。
三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备,反应步骤如下:
1)混合:将发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)按质量比例为10∶(0.1-0.5)混合于缓冲液中;
2)反应:加入缓冲液配制的NaBH3CN溶液混合并反应;
3)封闭:加入缓冲液配制的Gly及NaBH3CN溶液,混匀反应后,再加入BSA溶液封闭;
4)清洗产物,获得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒。
其中,混合步骤中,发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)的质量比例为10∶(0.1-0.5),优选10∶0.2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液,优选MES缓冲液,浓度优选0.05M,反应步骤中,反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml,优选20mg/ml。
改进的,三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒可采用下述方法制得:
1)混合:将发光微粒与三碘甲腺原氨酸混合于缓冲液中。较佳的,缓冲液为MES缓冲液,发光微粒与三碘甲腺原氨酸的质量比例为10∶(0.01-0.1),优选10∶0.05。
2)反应:加入缓冲液配制的EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液混合并反应。较佳的,缓冲液为MES缓冲液,混合溶液中,发光微粒与EDAC的优选质量比为25∶1混合。反应条件为37℃旋转反应。一般约48小时反应充分。
3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应。较佳的,缓冲液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为5∶8。反应条件为37℃旋转反应。一般约16小时反应充分。
4)清洗产物,获得三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒。
清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。
透析法清洗步骤:采用反应缓冲液透析,每次4-5小时,更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长,且微粒损失较多,造成收率降低。
离心法清洗步骤包括离心去上清,加入反应缓冲液洗涤,超声处理打开沉淀,如此反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起,但经过超声处理可以很容易再次分散打开,此法操作时间短,且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。
上述改进的制备方法与NaBH3CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂NaBH3CN替换成了EDAC,该试剂的替换,不仅使得反应时间与NaBH3CN的还原胺化反应法相比缩短了10个多小时,而且发光微粒与三碘甲腺原氨酸的交联效率获得了提高,节省了三碘甲腺原氨酸用量,此外,试验表明,该方法制得的检测微粒与NaBH3CN的还原胺化反应法制得的检测微粒相比,在相同条件下反应信号更强,灵敏度更高,检测范围也更广。
亲和素包被的感光微粒可采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备。
本发明第三方面,公开了上述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,游离四碘甲状腺素的检测试剂盒利用光激化学发光原理,采用双抗体夹心法,可定量检测血清中的游离四碘甲状腺素。
游离四碘甲状腺素(FT4)的检测试剂盒的使用方法包括下列步骤:
将样品与试剂盒中用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)和亲和素包被的感光微粒混合反应,而后用激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。
具体包括下列步骤:
1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒和生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab),获得初始反应溶液,混合反应;
2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应;
3)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。
上述激发光光源波长范围为600-700nm,优选640-680nm;反应孔发光的发射光光源波长范围为600-680nm,优选610-620nm;发射光延迟时间范围为100ms-1000ms;激发光光源的功率范围为5-100mw,优选40-60w。
上述游离四碘甲状腺素(FT4)的检测试剂盒在应用在定量检测游离四碘甲状腺素(FT4)时,需根据标准曲线计算待测样品中FT4含量。
上述步骤1)的反应条件为37℃温育10-30分钟,优选20分钟,步骤2的反应条件也为37℃温育10-30分钟,优选15分钟。
上述初始反应溶液中,三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒为混悬液,三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒的浓度无特殊限制,可以为25-200μg/ml,优选50μg/ml。
初始反应溶液中,生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体也为混悬液,生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体的浓度无特殊限制,可以为0.5-1.5μg/ml,较佳为1μg/ml。
在最终反应溶液中,亲和素包被的感光微粒为混悬液,亲和素包被的感光微粒的浓度一般控制在10-100ug/ml,可以为30-60μg/ml,优选40μg/ml。
上述方法中,初始反应溶液的体积无特殊限制,可以为45-75μl,优选75μl;最终反应溶液的体积也无特殊限制,可以为105-250μl,优选250μl。
上述样品包括血清、血浆、全血或标准品。
当本发明的检测微粒及检测试剂盒用于定量检测游离四碘甲状腺素(FT4)时,还需根据标准曲线计算待测样品中游离四碘甲状腺素的含量。
本发明是采用光激化学发光检测技术,配合光激化学发光分析系统测定人血清样品中游离四碘甲状腺素(FT4)的定量体外诊断试剂盒,可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。本发明的游离四碘甲状腺素(FT4)光激化学发光检测试剂盒灵敏度高、精密性好、检测范围宽、而且操作简便、快速、成本低、稳定性好、无环境污染和放射危害,在临床上具有广泛的应用前景。
附图说明
图1:光激化学发光免疫技术原理图:微粒结合形成二聚体,产生光子信号
图2:光激化学发光免疫技术原理图:未结合微粒,无光子信号产生
图3:单线态氧随微粒间距离衰减,在大概600nm的距离,基本没有单线氧的存在,因此也不发光
FG BEAD:发光微粒,内含发光分子;
GG BEAD:感光微粒,内含感光分子;
Singlet Oxygen:单线态氧,活性氧离子;
A/B:两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中,A,B为针对靶分子C不同的表位的单克隆抗体
图4:比较试验测试结果示意图
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:试验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实验中仪器原料来源及试剂配方:
原料及试剂 厂家
Biotin-X-X-NHS Sigma TLC≥95%
BSA Equitech/protease free
T3 Biochemika
Gly Sigma ≥95%
HEPES 经科宏达
Tris 国药
NaBH3CN Acros
抗-FT4单克隆抗体 Bioventix
感光微粒 美国PentaTek公司
发光微粒 美国PentaTek公司
仪器 型号 厂家
光激化学发光分析仪 HT 上海博阳医疗仪器公司
紫外分光光度计 752P 上海光谱公司
高速冷冻离心机 CR21G HITACHI
分析天平 ALC-2100.2 ACCULAB
分析天平 AG285 METTLER
PH计 DELTA320 METTLER
粒径仪 Model 370 Nicomp
酶标仪 MultiSKAN MK3 labsystem
超声波清洗器 KQ5200E 昆山超声仪器公司
漩涡混合器 QL-901 其林贝尔
磁力搅拌器 (79-1)2003-03 国华
实施例1T3包被的发光微粒的制备
抗体与发光微粒改进的制备方法如下:
1)发光微粒混悬液处理:吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声破碎至微粒重新悬浮,加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。
2)抗体处理:T3于0.05M pH6.0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析,透析完成后测定浓度,并调节浓度至2mg/ml。
3)MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和2mg/ml的T3(MES缓冲液)以1∶10∶2.5的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液,按照与发光微粒100mg/100uL EDAC的比加入,迅速混匀,37℃旋转反应48小时。
5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5∶8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
6)用MES缓冲液离心清洗四次,最后用发光试剂缓冲液进行悬浮,测定粒径和固含量,调节浓度至10mg/ml。
将上述方法与采用NaBH3CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。
NaBH3CN还原胺化反应法的制备方法:
1)发光微粒处理:吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量pH6.00.05M MES缓冲液(以下简称MES缓冲液),超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮;
2)混合:T3用0.2N NaOH配制成1mg/ml的溶液,按照10mg发光微粒:0.2mg T3立即加入T3溶液,补加MES缓冲液至发光微粒固含量为25mg/ml,振荡混匀得到反应液;
3)反应:用MES缓冲液配制25mg/mL的NaBH3CN溶液,按照与反应液3∶250的体积比加入,37℃旋转反应68-70小时;
4)封闭:用MES缓冲液配制75mg/mL的Gly溶液以及25mg/mL的NaBH3CN溶液,按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中,37℃旋转反应2小时;
5)清洗:向反应好的发光抗体中加入0.1M Na2CO3溶液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜0.1M Na2CO3,超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗4次,最后用少量发光试剂缓冲液进行悬浮;
6)取样测定清洗好的发光抗体的固含量、粒径,用发光试剂缓冲液调节发光抗体浓度至10mg/mL准备进行稀释。
两者制备结果的比较:
1.节省了制备时间
原有制备工艺 | 新制备工艺 | |
制备100mg交联抗体的发光微粒 | 74h | 64h |
2.提高了抗体交联效率,节省了抗体用量
原有制备工艺 | 新制备工艺 | |
1mg抗体交联微粒 | 50mg | 200mg |
3.增强了反应信号
4.提高了灵敏度
5.扩大了检测范围
参照上述的制备方法制备T3包被的发光微粒,并通过各项性能测试比较从以下几方面进行了具体工艺条件的选择研究:
本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下:
1.光信号检测方法:
在反应孔中分别加入25μl样品,再依次加入25μl发光试剂(50μg/ml)和25μl生物素化抗体试剂(1μg/ml)。然后放入仪器(光激化学发光分析系统),由仪器自动按以下步骤操作:振动,37℃温育20分钟,再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。
检测T4浓度分别为5.5pmol/l和25.0pmol/l的质控品光信号,每个浓度做10孔重复测定,代入公式,计算CV值。低浓度的精密性测定表示为QC L,高浓度的精密性测定表示为QC H。
2.灵敏度检测方法:
检测10孔标准品0pmol/L,计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD),以AVE-2SD反代入标准曲线,得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度,经检测两个批号的试剂,其分析灵敏度分别为2.90pmol/L、2.95pmol/L,均不高于3.86pmol/L。
3.工艺条件选择:
1)防腐剂的考察
出于对试剂防腐以及长期储存的考虑,选择万分之五Proclin 300作为防腐剂进行考察。
检测未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的FT4测定值≤11pmol/L的血清、正常人血清、FT4测定值≥50pmol/L的血清、1%BSA 0.01M PBS。每种条件检测两孔,取RLU检测均值。结果见下表:
RLU均值 | 极低值血清 | 正常人血清 | 高值血清 | 1%BSA 0.01MPBS |
未添加防腐剂 | 102563 | 69049 | 10152 | 114872 |
添加防腐剂 | 101558 | 67289 | 9926 | 115321 |
根据以上结果可以发现以万分之五Proclin 300作为防腐剂对试验结果没有明显影响,故选用万分之五Proclin 300作为防腐剂。
2)发光微粒与T3的反应比例
发光微粒:T3分别按10mg/0.02mg、10mg/0.05mg、10mg/0.1mg的比例包被,比较选取最佳的包被反应比例。
检测三种不同反应比例制备好的T3包被发光微粒,其灵敏度、精密性、线性。检测结果如下表:
发光微粒与T3反应比例的比较
根据以上实验结果可知,抗原加入量与发光微粒上包被的抗原量基本呈正比关系,但T3抗原继续增加时包被上的抗原达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题,选择10mg发光微粒与0.05mg T3的反应比例。
3)T3包被的发光微粒工作浓度的选取:
将T3包被的发光微粒用HEPES缓冲液分别配成25ug/ml、50ug/ml、75ug/ml的浓度,比较选取最佳工作浓度。
以三种不同浓度的T3包被的发光微粒,检测其灵敏度及线性。检测结果如下表:
T3包被的发光微粒工作浓度的选取
根据以上实验结果可知,50ug/ml的T3包被的发光微粒其灵敏度、线性更佳。
4)发光试剂缓冲液
根据相应的文献资料,并结合本发明的特点,选择pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES缓冲液,并在其中添加起封闭和蛋白保护作用的BSA以及防止微粒聚集稳定试剂的Tween20后作为发光试剂的缓冲液。
5)清洗方式的选择
透析法清洗步骤:100倍体积透析,每次4-5小时,更换缓冲液2次。透析清洗操作时间较长,且清洗不彻底。
离心法清洗步骤:12000rpm离心30分钟,清洗3次,沉淀以超声法重悬。这种方法清洗所用时间较短,效果好。
综合考虑选用离心法清洗。
最终选择250nm的粒径,发光量为≥250,000光子数/100ug的发光微粒,1%BSA的0.01M pH 7.4PBS作为稀释液,万分之五Proclin 300作为防腐剂,10∶0.05的FG-bead与T3的比例,离心法清洗作为最优制备条件。
实施例2生物素标记抗体的制备
制备方法:
1)抗体处理:将抗-T4抗体透析于0.1M NaHCO3溶液中,测定抗体浓度并调节至1mg/mL;
2)用DMSO配制16.17mg/mL的Biotin溶液;
3)标记:取处理好的1mg/mL抗-T4标记抗体与配制好的Biotin溶液,二者按照10000∶54的体积比进行混合,迅速混匀。2~8℃静置反应12~16小时;
4)透析:将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液;
5)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中,取样测定抗体浓度。用生物素标记透析缓冲液调节生物素标记抗体浓度至0.5mg/mL。
本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下:
1、生物素与抗T4抗体比例的选择:
将Biotin-X-X-NHS:抗体按照20∶1、30∶1、40∶1的不同比例进行标记,比较选取最佳的标记比例。
检测三种不同标记比例制备好的生物素标记抗T4,其灵敏度、精密性以及线性。检测结果如下表:
抗体与生物素的标记比例比较
根据以上实验结果可知,生物素∶抗T4标记比例为30∶1时,其灵敏度较好,成本也较低。故选择30∶1的比例作为生物素∶抗T4的标记比例。
2、生物素标记抗T4抗体的缓冲液的选取:
将生物素标记抗T4用Tris缓冲液、PBS缓冲液分别配成1ug/mL的浓度,比较选取最佳缓冲液。
Tris缓冲液:pH 8.0,0.1M Tris+0.3M NaCl+25mM EDTA+0.1%BSA+表面活性剂+防腐剂;
PBS缓冲液:pH7.4,0.02M PBS+1%BSA+表面活性剂+防腐剂;
以两种缓冲液配制的生物素标记抗T4,检测其灵敏度、37℃破坏7天稳定性、线性。
检测结果如下表:
生物素标记抗T4缓冲液比较
根据以上实验结果可知,把以两种缓冲液配制的生物素标记抗T437℃破坏7后,整体RLU都有一定程度的下降,线性无明显变化,但Tris缓冲液比PBS缓冲液灵敏度下降更小一些,因此选择Tris作为试剂2的缓冲液。
3、生物素标记抗T4工作浓度选取:
将生物素标记抗T4抗体用Tris缓冲液分别配成0.5ug/ml、1ug/ml、1.5ug/ml的浓度,比较选取最佳工作浓度。
以三种不同浓度的生物素标记抗T4的试剂2,检测其灵敏度、线性。检测结果如下表:
生物素标记抗T4工作浓度的选取
根据以上实验结果可知,生物素标记抗T4的工作浓度为1ug/ml时,其灵敏度、线性更佳。
实施例3亲和素包被的感光微粒的制备
感光微粒:采用粒径为220±40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)
制备方法:
a、感光微粒混悬液处理:吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮,加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。
b、亲和素溶液配制:称量一定量Avidin,加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
c、混合:将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液,以2∶5∶1的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
d、反应:MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液1∶25的体积比加入,迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
e、封闭:MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中,混匀,37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5∶8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
f、清洗:向反应好的溶液中加入MES缓冲液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗3次,最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮,测定固含量,用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。
实施例4标准品的制备
标准品:使用卫生部临检中心出品的游离四碘甲状腺素定量参考品,以PBS为稀释液,按照浓度0pmol/l,5pmol/l,7.5pmol/l,13.5pmol/l,30pmol/l,75pmol/l配制6个标准品。
实施例5游离四碘甲状腺素定量检测
首先向反应孔中分别加入样品,再依次加入发光试剂(抗体包被的发光微粒)和生物素标记抗体。然后放入仪器(光激化学发光分析系统),由仪器自动按以下步骤操作:振动,37℃温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37℃再次温育。温育结束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。
按上述方法检测各个标准品的发光光子量,将测得的光信号值与相应的标准品浓度采用cubic spline(三次样条)拟和作图即得,标准曲线呈线性。
在定量测定中,根据标准曲线,按样本实测光信号值计算每一个样本的FT4含量,单位是pmol/L。
检测条件的优化试验:
1、温育时间的确定:
试验材料:采用抗体包被的50μg/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和1μg/ml的生物素标记抗体试剂,及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。
检验样本:灵敏度参考品和质控品QcL,QcH。
初始反应条件:加样量为样品25μl,发光微粒试剂25μl,生物素标记抗体试剂25μl,亲和素包被的感光微粒试剂为175μl,两步温育。
1.1第一步温育时间的确定
第一步分别实验温育时间分别为10min、15min、20min、30min,第二步温育时间为15min,比较选取最适温育时间。
以四种不同温育时间检测其灵敏度、精密度、线性。检测结果如下表:
第一步温育时间的比较
根据以上实验结果可知,在其余条件相同的情况下,第一步温育时间为20min结果已经趋于稳定,延长第一步温育时间已经没有实际意义,故将第一步温育时间确定为20min。
1.2第二步温育时间的确定
第一步温育时间为20min,第二步分别实验温育时间分别为10min、15min、20min、30min,比较选取最适温育时间。
以四种不同温育时间检测其灵敏度、精密度、线性。检测结果如下表:
第二步温育时间的比较
根据以上实验结果可知,在其余条件相同的情况下,第二步温育时间为15min结果已经趋于稳定,延长第二步温育时间已经没有实际意义,故将第二步温育时间确定为15min。
2、加样模式的考察
试验材料:采用抗体包被的50μg/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)1μg/ml的生物素标记抗体试剂,及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。
检验样本:灵敏度参考品和质控品QcL,QcH。
初始反应条件:依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗体试剂、亲和素包被的感光微粒,两步温育,其中第一温育时间为20min,第二温育时间为15min。
根据关于抗原-抗体反应时间的文献资料,并结合本方法的特点设计了两种加样模式进行考察。
模式1:25ul样品+25ul试剂1+25ul试剂2+175ul亲和素包被的感光微粒试剂;
模式2:15ul样品+15ul试剂1+15ul试剂2+60ul亲和素包被的感光微粒试剂。
按照以上两种加样模式,分别考察灵敏度、精密度、线性。结果见下表:
加样模式的比较
根据以上实验结果可知,模式1灵敏度、精密性皆好于模式2,故选择模式1。
3、亲和素包被的感光微粒的浓度的筛选:
发光抗体浓度选用50μg/ml,生物素化抗体的浓度选用1μg/ml,亲和素包被的感光微粒浓度分别配制为30μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,在初始反应条件下,结果如下:
根据灵敏度比较,Qc L和Qc H的测定浓度,亲和素包被的感光微粒浓度在40μg/ml时结果最为理想。
实施例6评价试验
试剂:采用发光抗体试剂(50μg/ml)、生物素标记抗体试剂(1μg/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)。
检测方法:在反应孔中分别加入25μl样品,再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗体试剂。然后放入仪器,由仪器自动按以下步骤操作:振动,37℃温育20分钟,再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μl后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量,根据标准曲线可以推算样品FT4浓度,单位是pmol/L,最后打印试验报告。
1、检测范围
本试剂盒线性检测范围为3.86-75pmol/L,对其用双对数模型拟合,剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中FT4浓度值,样品中FT4浓度值应不超出3.86-75pmol/L标准品曲线的浓度范围,超出此范围的测定结果是通过标准品曲线外延得出的计算结果。经本试剂盒对大量的临床样本的检验结果可知道,大部分样本结果小于75pmol/L,因此,本试剂盒设定的检测范围为3.86-75pmol/L完全可满足临床应用要求。
2、灵敏度的检测
检测10孔标准品0pmol/L,计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD),以AVE-2SD反代入标准曲线,得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度,经检测两个批号的试剂,其分析灵敏度分别为2.90pmol/L、2.95pmol/L,均不高于3.86pmol/L。
3、精密性检测
分别采用2个批号的FT4试剂盒对质控品QC L、QC H进行1次检测,每次复测10孔,每份样品共检测20次。得到如下结果:
由上述结果可知,本产品其批内精密性小于5%,批间精密性小于10%。
4、线性的检测
对除0值外其他5点标准品用双对数或其他数学模型拟合,剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒,其线性r值分别为1.000、0.999。
5、干扰性试验
在已知浓度的临床标本1#、2#、3#中加入250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素,以本发明的试剂盒进行检测,结果如下表:
表1试剂盒1 (单位:pmol/L)
表2试剂盒2 (单位:pmol/L)
由上述结果可知,500mg/dL甘油三酯和10mg/dL胆红素对本产品无明显干扰,但250mg/dL血红蛋白对本试剂盒检测结果影响超过10%,因此尽量避免样本严重溶血。
实施例7比较试验
试剂:采用发光抗体试剂(50μg/ml)、生物素标记抗体试剂(1μg/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)。
收集经罗氏公司FT4试剂盒检测过的临床标本250份,再以本发明的CEA光激化学发光检测试剂盒测定每份标本,作平行比较,结果如图4。
由图4所示的结果可知,本试剂盒检测结果与西门子结果相关性r=0.970,且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时,适合于向临床推广。
实施例8试剂盒的组配
将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂分别独立包装,组配后获得基本试剂盒。可用于定量检测样品中FT4的浓度。
Claims (30)
1.一种用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,为三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒。
2.如权利要求1所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述发光微粒的粒径范围为100-400nm。
3.如权利要求1所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述发光微粒的表面官能团选自羧基或醛基。
4.如权利要求1所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述发光微粒的发光量为150,000-350,000光子数/100μg发光微粒。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述检测微粒经如下工艺制得:
1)混合:将发光微粒与三碘甲腺原氨酸混合于缓冲液中;
2)反应:加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应;
3)往步骤2)获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应;
4)清洗产物,获得三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒。
6.如权利要求5所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述缓冲液为MES缓冲液。
7.如权利要求5所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述步骤1)中,发光微粒与三碘甲腺原氨酸的质量比例为10∶(0.01-0.1)。
8.如权利要求7所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述步骤1)中,发光微粒与三碘甲腺原氨酸的质量比例为10∶0.05。
9.如权利要求5所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒,其特征在于,所述步骤4)的清洗的方式为离心法清洗。
10.一种游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,包括权利要求1-9中任一权利要求所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒。
11.如权利要求10所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体和亲和素包被的感光微粒中的一种或两种。
12.如权利要求11所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体中,生物素与抗体的分子比例为(10-50)∶1。
13.如权利要求11所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述亲和素包被的感光微粒中,亲和素与感光微粒的质量比例为1∶(3-10)。
14.如权利要求11所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体以及亲和素包被的感光微粒分别独立包装,且均为混悬液。
15.如权利要求14所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述混悬液的溶剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。
16.如权利要求15所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒混悬液的溶剂为pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES缓冲液。
17.如权利要求15所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体混悬液的溶剂为pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris缓冲液。
18.如权利要求15所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述亲和素包被的感光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES缓冲液。
19.如权利要求14所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述混悬液中还包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。
20.如权利要求10所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括多种浓度已知的四碘甲状腺素溶液,不同浓度的四碘甲状腺素溶液分别独立包装。
21.如权利要求10-20中任一权利要求所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,包括下列步骤:
1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒和生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体,获得初始反应溶液,混合反应;
2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应;
3)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。
22.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述激发光光源波长范围为600-700nm。
23.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述激发光光源的功率范围为5-100mw。
24.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤1)和2)的反应条件为37℃温育10-30分钟。
25.如权利要求24所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤1)的反应条件为37℃温育20分钟,步骤2)的反应条件为37℃温育15分钟。
26.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒为混悬液,用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒在混悬液中的浓度为25-200μg/ml;所述生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体为混悬液,生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体在混悬液中的浓度为0.5-1.5μg/ml;所述亲和素包被的感光微粒为混悬液,亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为10-100μg/ml。
27.如权利要求26所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述用于检测游离四碘甲状腺素的检测微粒在混悬液中的浓度为50μg/ml;所述生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体在混悬液中的浓度为1μg/ml;所述亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为40ug/ml。
28.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述初始反应溶液的体积为30-75μl;最终反应溶液的体积为100-250μl。
29.如权利要求28所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述初始反应溶液的体积为75ul;最终反应溶液的体积为250ul。
30.如权利要求21所述游离四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,还包括根据标准曲线计算待测样品中游离四碘甲状腺素的含量。
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