CN104597254A - C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种C反应蛋白快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。本发明还提供了一种C反应蛋白快速检测试剂盒。采用本发明的C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒，检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广。

Description

C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及免疫测定，具体是指一种C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒。
背景技术
人类C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
CRP在临床应用领域较为广泛。其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。现将其临床意义综述如下：
1、CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变好转时，又迅速降至正常，其升高幅度与感染的程度呈正相关。
2、CRP与其它炎症因子的相关性：CRP与其它炎症因子如白细胞总数、红细胞沉降率和多形核白细胞等具有密切相关性。CRP与WBC存在正相关。在炎症反应中起着积极作用，使人体具有非特异性抵抗力。在患者疾病发作时，CRP可早于WBC而上升，回复正常也很快。故具有极高的敏感性。
3、CRP可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断：一旦发生炎症，CRP水平即升高，而病毒性感染CRP大都正常。脓毒血症CRP迅速升高，而依赖血培养则至少需要48小时，且其阳性率不高。
4、恶性肿瘤患者CRP大都升高。如CRP与AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。CRP测定用于肿瘤的治疗和预后有积极意义。手术前CRP上升，手术后则下降，且其反应不受放疗、化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床估价肿瘤的进程。
5、CRP用于评估急性胰腺炎的严重程度。当CRP高于250㎎╱L时，则可提示为广泛坏死性胰腺炎。
正常参考值：<10㎎╱L
6、可用于区分细菌还是病毒感染，10-15提示病毒感染，15以上提示细菌感染。
CRP的检测在八十年代以前作为炎症和组织损伤的非特异性标志物大量应用于临床。但由于过去CRP的检测方法较为落后，假阳性和假阴性很高，影响了它在临床上的价值，近几年来，由于检测技术的更新，测定CRP的快速、简便和可靠的方法已迅速建立。
CRP的检测方法市面上常见为免疫透射比浊法，近些年已有部分厂商引入了部分更为先进的检测方法，现有的方法存在着检测灵敏度低、精密性差等局限性。
所以需要提供一种新的CRP检测方法，以解决现有技术中的存在的问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广的C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种C反应蛋白快速检测方法，其特点在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；
步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；
步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。
较佳地，所述的活性分子为CRP抗体。
较佳地，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。
较佳地，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。
本发明第二方面提供了一种C反应蛋白快速检测的试剂盒，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。
采用本发明的C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒，在均相条件下，将内部带有染料的感光微球(纳米级)、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微球中的染料(光敏氰基化合物)被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物(稀土螯合物)。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。
附图说明
图1为本发明CRP检测方法微球结合形成二聚体的原理图。
图2为本发明CRP检测方法微球微粒未结合时的原理图。
图3为本发明单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图。
图4为本发明实施例的的检测结果与进口CRP试剂盒检测结果的平行比较图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。
在下述实施例中使用的原料、试剂、仪器来源如下：
NaHCO3溶液的配方：
原料名称 标准用量(1L)
碳酸氢钠 8.410g
纯化水 定容至1000ml
CB(pH9.6)缓冲液(0.05M)
原料名称 标准用量(1L)
碳酸钠 1.540g
碳酸氢钠 2.940g
纯化水 定容至1000ml
Tris缓冲液的配方：
MES缓冲液的配方：
试剂名称 标准用量(1L)
MES 10.660g
NaCl 2.922g
纯化水 定容至1000ml
发光微粒缓冲液配方：
试剂名称 标准用量(1L)
碳酸钠 1.540g
碳酸氢钠 2.940g
NaCl 17.532g
BSA 2.000g
Dextran 1.000g
TritronX-405 1.000g
Proclin 0.5ml
纯化水 定容至1000ml
生物素化抗体缓冲液配方：
原料名称 标准用量(1L)
EDTA-NA-2H2O 1.860g
Tris 12.110g
BSA 5.000g
Proclin 0.5ml
NaCl 17.532g
纯化水 定容至1000ml
感光微粒缓冲液配方：
试剂名称 标准用量(1L)
HEPES 11.915g
NaCl 17.532g
EDTA-Na-2H2O 9.306g
Dextran 1.000g
TritronX-405 1.000g
Proclin 0.5ml
纯化水 定容至1000ml
步骤(1)：生物素化抗体的制备
生物素标记抗CRP的制备程序
使用NaHCO3缓冲液将待标记抗体配制至1mg/ml待用。
使用DMSO将生物素配制至16.17mg/ml待用。
将以上配制好的抗体和生物素处理液按照1：30的体积比进行混合，2～8℃反应12～16小时。得到反应液。
使用PH8.0的TRIS缓冲液对以上反应液进行透析，透析完成后使用生物素化抗体缓冲液调整至终浓度0.5mg/ml。
步骤(2)：发光试剂的制备与配制
使用0.05M CB缓冲液将待包被抗体配制至1mg/ml待用。
按制备量量取醛基发光微粒(内部填充稀土螯合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加0.2mg的比例向沉淀中加入待包被抗体，37℃置于旋转混合仪混匀过夜
按每10mg微粒需要0.02ml 8mg/ml的NaBH4溶液，量取NaBH4溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应2小时。。
按每10mg微粒需要0.16ml 75mg/ml的Gly溶液，量取Gly溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应1小时。
用0.05M CB缓冲液离心清洗三次，再用发光微粒缓冲液洗一次，使用发光微粒缓冲液将已包被CRP抗体的发光微粒调整至终浓度10mg/ml。
步骤(3)亲和素标记感光微粒的制备
按制备量量取醛基感光微粒(内部填充光敏氰基化合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加20mg的比例向沉淀中加入SA，再补加一定体积的0.05M MES pH6.0，使微粒终浓度为25mg/ml。
步骤(4)杯式超声迅速混匀。
向离心管按照每10mg微粒加入16ul的比例加入NaBH3CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)混匀，37℃置于旋转混合仪反应36～48h。
封闭：按照每10mg微粒加入16ul的比例加入80ul Gly(75mg/ml,0.05M MES pH6.0配制)以及40ul NaBH3CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)37℃置于旋转混合仪反应2h。
按照每10mg微粒加入16ul的比例加入0.25ml的BSA(200mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)，37℃置于旋转混合仪反应12～16h。
用0.05M MES缓冲液清洗三次，再用GG-Buffer洗一次，使用感光微粒缓冲液将已标记亲和素的感光微粒调整至终浓度10mg/ml。
步骤(5)：试剂盒的配制与组装
使用发光微粒缓冲液将已包被CRP抗体的发光微粒按照50ug/ml的终浓度进行稀释，得到试剂1。
使用生物素化抗体缓冲液将已标记生物素的CRP抗体按照1ug/ml的终浓度进行稀释，得到试剂2。
使用感光微粒缓冲液将已包被亲和素的感光微粒按照40ug/ml的终浓度进行稀释，得到试剂3。
步骤(6)：样本的检测
将待检测样本与以上得到的试剂置于本试剂配套的快速化学发光全自动分析仪中进行检测，由仪器自动添加样品、试剂1、试剂2、试剂3后反应5分钟得到检测结果。
性能分析
检测范围
本试剂盒线性检测范围为0-200mg/L，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中CRP浓度值，样品中CRP浓度值应不超出0-200mg/L的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果。
分析灵敏度的检测
检测10孔浓度为0的空白样本，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE+2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，其分析灵敏度为0.78mg/L。
精密性的检测
分别采用不同浓度水平的质控品QC L、QC H进行1次检测，复测10次，得到如下结果：
由上述结果可知，精密性小于10％。
线性的检测
对除0值外其他5点校准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0.9943、0.9961。
Hook实验
由上述结果可知，两个批号的试剂盒其HOOK效应在1000uIU/ml均未见。
与国外同类产品的比较，收集进口CRP试剂盒检测过的临床标本250份，再以本发明CRP快速检测试剂盒(化学发光法)测定每份标本，作平行比较，结果如图4所示。
由以上结果可知，本试剂盒检测结果与国外同类产品结果相关性r＝0.9899，且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，且与国外同类产品对临床样本的符合率良好，适合于向临床推广。
本试剂盒包含主要成份为连接了活性分子发光微球的试剂1、主要成份为已标记生物素活性分子的试剂2以及主要成份为感光微球的试剂3。
采用本发明的C反应蛋白快速检测方法及检测试剂盒，在均相条件下，将内部带有染料的感光微球(纳米级)、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微球中的染料(光敏氰基化合物)被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物(稀土螯合物)。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (5)

1.一种C反应蛋白快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；
步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；
步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。
2.根据权利1所述的反应蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的活性分子为CRP抗体。
3.根据权利1所述的反应蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。
4.根据权利1所述的反应蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。
5.一种C反应蛋白快速检测的试剂盒，其特征在于，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。
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