CN111308080A - 一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法，包括采用纳米金颗粒，在纳米金颗粒中加入水溶性光敏剂，得到纳米金‑光敏剂复合物，然后再将纳米金‑光敏剂复合物再与肌酸激酶单克隆抗体进行偶联，通过纳米金颗粒所具有的电荷性将肌酸激酶单克隆抗体在其等电点环境条件下使两者产生静电吸附，从而使肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面。按本发明的制备方法得到的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，提高了光敏剂的利用率，简化生产工艺，降低生产成本，使用时采用夹心法检测原理对检测物进行检测，提高了照射的有效光剂量，使得更多的光敏剂被激活并产生更强的光敏效果，且使激发光波长与发射波长的差距加大，提高检测的辨识度。

Description

一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法。
背景技术
肌酸激酶CK是一个大的二聚体蛋白质，其中M亚基具有一个小的N-末端结构和一个大的C-末端结构；M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43kDa左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶是一个紧密的球状结构，近来关于肌酸激酶构象变化和活力变化关系的研究显示了酶分子活性部位构象的柔性，即酶分子活性部位的微区构象在变性剂作用下易发生改变而导致酶分子快速失活，此时酶分子整体构象尚未发生明显变化。
对于肌酸激酶的检测法，现有光激化学发光方法需采用非水溶性光敏剂(卟啉、叶绿素和酞菁及其衍生物等)，未经修饰的光敏剂的单线态氧量子产率较低，影响检测性能；而衍生化的光敏剂，化学合成困难、工艺复杂。
现有光激发光系统使用的光敏剂需在有机相中包埋入聚苯乙烯微球，需要经过复杂的离心、超滤等纯化方式，且需再恢复到水相基质中，光敏剂在包埋、纯化等处理过程中易产生损耗，降低感光效应。
现有光激化学发光技术激发波长与检测波长差异不大，易受干扰，荧光背景影响较大。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供的一种增强检测精密度、准确度和灵敏度且不易受激发光的干扰的均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法。
为了实现上述目的，本发明所设计的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，它包含有光敏剂成份，其特征在于它是一种纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
本发明所设计的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，包括采用纳米金颗粒，获得纳米金颗粒后进行纳米金-光敏剂复合，所述纳米金-光敏剂的复合是在纳米金颗粒中加入水溶性光敏剂，并在室温下暗室中搅拌过夜，然后通过离心最后得到沉淀的纳米金-光敏剂复合物，然后再用缓冲液将纳米金-光敏剂复合物复溶；复溶后的纳米金-光敏剂复合物再与肌酸激酶单克隆抗体进行偶联，所述纳米金-光敏剂与肌酸激酶单克隆抗体的偶联是在复溶后的纳米金-光敏剂复合物的溶液中加入肌酸激酶单克隆抗体，调整反应pH值至肌酸激酶单克隆抗体的等电点(通常为等电点值的正负0.5之间)，通过纳米金颗粒所具有的电荷性将肌酸激酶单克隆抗体在其等电点环境条件下使两者产生静电吸附，从而使肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，再通过离心方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，然后再加入复溶缓冲液进行复溶，获得悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
本发明所提供的纳米金-光敏剂复合物，使光敏剂利用率更高，检测灵敏度更高。
为了使纳米金颗粒与光敏剂能够获得良好的复合以及纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体具有更好的偶联效果，所述纳米金颗粒与光敏剂的摩尔比可以是2:1-10，所述水溶性光敏剂可以是卟啉衍生物、酞菁衍生物或叶绿素衍生物，如铜酞菁-3,4',4”,4”'-四磺酸四钠盐或叶绿素铜钠盐，所述的静电吸附时间可以是1小时至2小时。
为了使纳米金-光敏剂复合物在缓冲液中的复溶效果更显著，所述的缓冲液可以是PBS、HEPES、硼酸盐、碳酸盐、Tris-HCl、柠檬酸中的一种；为了使纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶的偶联体在复溶缓冲液中的复溶效果更显著，所述的复溶缓冲液可以是PBS、HEPES、碳酸盐、Tris-HCl中的一种；为了提高悬浮于复溶缓冲液中的纳米金光敏颗粒悬浮液的稳定性，在复溶缓冲液中可以含有确定比例的稳定剂、表面活性剂、盐离子和防腐成份，所述的稳定剂可以是BSA、Blockmaster、吐温等；所述的表面活性剂可以是曲拉通、吐温、SDS等，如Tween-20、曲拉通-X100；所述的盐离子可以是氯化钠、氯化钾等；所述的防腐成分可以是Proclin300、叠氮钠、硫柳汞等。
本发明得到的一种的制备方法，提高光敏剂的利用率，简化生产工艺，降低生产成本，提高了照射的有效光剂量，使得更多的光敏剂被激活并产生更强的光敏效果，且使激发光波长与发射波长的差距加大，提高检测的辨识度。
按本发明的制备方法得到的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，提高了光敏剂的利用率，简化生产工艺，降低生产成本，使用时，将市售的发光微球制成发光微粒，并与本发明提供的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体组成试剂盒，并采用夹心法检测原理对检测物进行检测，使之在检测过程中提高了照射的有效光剂量，使得更多的光敏剂被激活并产生更强的光敏效果，且使激发光波长与发射波长的差距加大，提高检测的辨识度。
附图说明
图1是夹心法检测原理图；
图2是校准曲线图；
图3是实施例1线性范围图；
图4是实施例2线性范围图；
图5是实施例3线性范围图。
图中：激发光1、纳米金颗粒2、水溶性光敏剂3、肌酸激酶单克隆抗体4、检测物5、发光微粒6。
具体实施方式
下面结合实施例及对应的检测数据图表对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例提供的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，它包含有光敏剂成份，它是一种纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
本实施例提供的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，包括采用纳米金颗粒，获得纳米金颗粒后进行纳米金-光敏剂复合，所述纳米金-光敏剂的复合是在纳米金颗粒中加入水溶性光敏剂，并在室温下暗室中搅拌过夜，然后通过离心最后得到沉淀的纳米金-光敏剂复合物，然后再用缓冲液将纳米金-光敏剂复合物复溶；复溶后的纳米金-光敏剂复合物再与肌酸激酶单克隆抗体进行偶联，所述纳米金-光敏剂与肌酸激酶单克隆抗体的偶联是在复溶后的纳米金-光敏剂复合物的溶液中加入肌酸激酶单克隆抗体，调整反应pH值至肌酸激酶单克隆抗体的等电点，在实施过程中，通常为等电点的pH值控制在其等电点的正负0.5之间，通过纳米金颗粒所具有的电荷性将肌酸激酶单克隆抗体在其等电点环境条件下使两者产生静电吸附，从而使肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，再通过离心方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，然后再加入复溶缓冲液进行复溶，获得悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
在本实施例中，其具体操作步骤可以是：
(1)纳米金颗粒的制备
取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，搅动下准确加入l％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，获得10纳米-50纳米的纳米金颗粒溶液。
(2)纳米金-光敏剂复合物的合成
在纳米金颗粒溶液里面加入5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐)，纳米金颗粒与5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐)摩尔比为2:1。在室温下暗室中搅拌过夜，用12000rpm离心得到最后的复合物沉淀，用50ml Tris-HCl复溶。
(3)纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联
在纳米金颗粒-光敏剂中加入肌酸激酶单克隆抗体50μg，调整反应pH至8.0，通过静电吸附将肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，2h后通过15000rpm离心15min的方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，加入50ml Tris-HCl缓冲液进行复溶，缓冲液中含有0.5％的BSA，0.1％的Tween-20，0.9％的氯化钠，0.02％的proclin300。
(4)发光微粒的制备
发光微球购买PE公司生产销售的Alpha Acceptor beads，采用共价偶联的方式包被肌酸激酶单克隆抗体。在1ml发光微球中加入Buffer A 0.5-1mL混匀，用0.2-0.5mL EDC活化10-30min，加入0.3-1ml抗体震荡反应2小时-5小时，封闭5分钟-30分钟，加入Buffer B至终体积50mL，搅拌均匀即制成发光微粒。
其中：Buffer A：pH值5-6，含MES，HEPES等成份提供一定的缓冲能力，含KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2等盐离子浓度1-10％，提供一定的离子强度以促进胶乳微球的活化反应。
Buffer B：pH值6-8，含MES，HEPES、PBS、Tris等其中一种缓冲溶液提供反应的缓冲能力，含KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2等其中一种的盐离子浓度1-10％(提供抗体-微球偶联反应所需的离子强度)，含稳定性物质如牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、海藻糖、甘油等其中一种物质浓度0.1％-0.5％(对未结合抗体的微球表面进行封闭，维持免疫胶乳的稳定)，防腐成分可以是是Proclin300、叠氮钠等0.01％-0.05％(抑制细菌等繁殖)。
本实施例提供的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，使用时，由悬浮于复溶缓冲液中的悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体和发光微粒组成试剂盒，可以按如图1所示的夹心法检测原理进行对检测物的检测，经检测，其试剂盒性能如下：
校准曲线：
试剂盒使用前平衡至环境温度，采用仪器自带校准程序，在校准孔中分别加入梯度校准品20μl，依次加入30μl纳米金光敏微粒和30μl发光微粒，进行定标测试。
表1-1：校准品的检测结果
Figure BDA0002398063290000051
Figure BDA0002398063290000061
从表1-1和图2所获得的校准曲线可知：反应度更高，检测范围更广。
检测实施例1试剂线性范围：
将高值血清样本用阴性血清或者生理盐水梯度稀释，重复测定两次，以最小二乘法列方程，计算理论浓度与实测均值的相关性。
表1-2：本实施例所述方法制备的试剂盒的检测线性范围的表格：
Figure BDA0002398063290000062
根据表1-2可知，线性范围：将高值血清样本用阴性血清或者生理盐水梯度稀释，重复测定两次，以最小二乘法列方程，计算理论浓度与实测均值的相关性，判断线性高值可达980U/L。如图3所示，本实施例所得检测结果线性程度良好，检测试剂具有较好的相关性(R2＝0.9991)。
本实施例所述方法制备的试剂盒的检测精密度：
精密度是衡量试剂批内和批间变异的重要指标，是评价拟上市产品有效性的重要依据，通常包括批内精密度和批间精密度。
批内精密度评估方法：用低(L)、高(H)值样本，对2个批次的产品进行独立分析，每个批次重复测定10次，计算10次测量结果的平均值(x)和标准差(SD)，根据公式CV＝SD/x×100％，计算变异系数(CV)
批间精密度评估方法：用低(L)、高(H)值样本，对3个批次的产品进行独立分析，每个批次重复测定10次，计算20次测量结果的平均值(x)和标准差(SD)，根据公式CV＝SD/x×100％，计算变异系数(CV)。
批内与批间精的密度测试结果如下：
表1-3：本实施例所述方法制备的试剂盒的批内精密度与批间精密度
Figure BDA0002398063290000071
从表1-3可知，本实施例所述方法制备的试剂盒的批内精密度均<5％，批间精密度均<5％，说明采用本实施例所述方法制备的试剂盒进行检测时的重复性好、随机误差小。
本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度：
准确度是实测值与真实值的相符程度，反应试剂检测误差的大小。
用参考物质ERM AD455作为样本进行三次重复检测，计算均值X与参考物质标示值T的相对偏差B，计算公式为：B＝(X-T)/T×100％。
表1-4：本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度
参考品靶值(U/L) 212
测试值1 209.1
测试值2 210.9
测试值3 208.6
测试均值 209.5
相对偏差％ -1.2
测试结果为B＝(209.5-212)/212×100％＝-1.2％，相对偏差小于5％。-
从表1-4可知，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度偏差小，相对偏差在±5％以内，说明实测值与理论值接近，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测误差小。
表1-5灵敏度：
Figure BDA0002398063290000081
将定标品0U/L重复测定20次，计算这20次的均值(X)和标准偏差(SD)D，分析灵敏度计算公式：LOB＝X+2SD，灵敏度可达0.58U/L。
实施例2：
本实施例提供的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂制备方法包括如下步骤：
(1)纳米金颗粒的制备与实施例1相同；
(2)纳米金-光敏剂复合物的合成
在纳米金颗粒溶液里面加入铜酞菁-3,4',4”,4”'-四磺酸四钠盐，纳米金与铜酞菁-3,4',4”,4”'-四磺酸四钠盐摩尔比为2:1。在室温下暗室中搅拌过夜，用12000rpm离心得到最后的复合物沉淀，用50ml Tris-HCl复溶。
(3)纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶的偶联
在纳米金颗粒-光敏剂中加入肌酸激酶单克隆抗体100μg，调整反应pH至8.0，通过静电吸附将肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，2h后通过15000rpm离心15min的方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，加入50ml Tris-HCl缓冲液进行复溶，缓冲液中含有0.5％的BSA，0.1％的Tween-20，0.9％的氯化钠，0.02％的proclin300。
(4)发光微粒的制备同实施例1，由此获得本实施例由悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体和发光微粒组成试剂盒。
本实施例得到的试剂盒的试剂，经检测，其批内与批间精的密度测试结果如下：
表2-1：本发明所述方法制备的试剂盒的批内精密度与批间精密度：
Figure BDA0002398063290000091
从表2-1可知，本实施例所述方法制备的试剂的批内精密度均<5％，批间精密度均<5％，说明采用本实施例所述方法制备的试剂盒进行检测时的重复性好、随机误差小。
表2-2：本实施例所获得的试剂盒的检测准确度
参考品靶值(U/L) 212
测试值1 209.4
测试值2 208.7
测试值3 208.4
测试均值 208.8
相对偏差％ -1.5
从表2-2可知，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度偏差小，相对偏差在±2％以内，说明实测值与理论值接近，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测误差小。
检测实施例2试剂盒线性范围如表2-3所示：
表2-3：本实施例所述方法制备的试剂盒的检测线性范围的表格：
Figure BDA0002398063290000092
Figure BDA0002398063290000101
根据图4与表2-3可知，本实施例2所制备的检测试剂盒能保持良好的线性且具有较好的相关性(R2＝0.9994)。
实施例3：
本实施例提供的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂制备方法包括如下步骤：
纳米金颗粒制备如实施例1，在纳米金颗粒溶液里面加入叶绿素铜钠盐，纳米金与叶绿素铜钠盐摩尔比为1:1。在室温下暗室中搅拌过夜，用12000rpm离心得到最后的复合物沉淀，用50ml Tris-HCl复溶。在纳米金颗粒-光敏剂中加入肌酸激酶单克隆抗体50μg，调整反应pH至8.0，通过静电吸附将肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，2h后通过15000rpm离心15min的方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，加入50ml Tris-HCl缓冲液进行复溶，缓冲液中含有0.5％的BSA，0.1％的Tween-20，0.9％的氯化钠，0.02％的proclin300。
发光微粒的制备与实施例1相同，由此获得本实施例由悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体和发光微粒组成试剂盒。
经检测，批内与批间精的密度测试结果如下：
表3-1：本实施例所述方法制备的试剂盒的批内精密度与批间精密度
Figure BDA0002398063290000102
Figure BDA0002398063290000111
从表3-1可知，本实施例所述方法制备的试剂的批内精密度均<5％，批间精密度均<5％，说明采用本实施例所述方法制备的试剂盒进行检测时的重复性好、随机误差小。
本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度如下：
表3-2：本发明所述方法制备的试剂盒的检测准确度：
参考品靶值(U/L) 212
测试值1 206.4
测试值2 208.3
测试值3 210.9
测试均值 208.5
相对偏差％ -1.6
从表3-2可知，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测准确度偏差小，回收率偏差在±2％以内，说明实测值与理论值接近，本实施例所述方法制备的试剂盒的检测误差小。
检测本实施例试剂盒线性范围如下：
表3-3：本实施例所述方法制备的试剂盒的检测线性范围的表格：
Figure BDA0002398063290000112
Figure BDA0002398063290000121
根据图5与表3-3可知，本实施例3所制备的试剂盒能保持良好的线性且具有较好的相关性(R2＝0.9999)。

Claims (10)

1.一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂，它包含有光敏剂成份，其特征在于它是一种纳米金-光敏剂复合物与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
2.一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，包括采用纳米金颗粒，其特征是获得纳米金颗粒后进行纳米金-光敏剂复合，所述纳米金-光敏剂的复合是在纳米金颗粒中加入水溶性光敏剂，并在室温下暗室中搅拌过夜，然后通过离心最后得到沉淀的纳米金-光敏剂复合物，然后再用缓冲液将纳米金-光敏剂复合物复溶；复溶后的纳米金-光敏剂复合物再与肌酸激酶单克隆抗体进行偶联，所述纳米金-光敏剂与肌酸激酶单克隆抗体的偶联是在复溶后的纳米金-光敏剂复合物的溶液中加入肌酸激酶单克隆抗体，调整反应pH值至肌酸激酶单克隆抗体的等电点，通过纳米金颗粒所具有的电荷性将肌酸激酶单克隆抗体在其等电点环境条件下使两者产生静电吸附，从而使肌酸激酶单克隆抗体偶联至纳米金颗粒表面，再通过离心方式除去未结合的肌酸激酶单克隆抗体，然后再加入复溶缓冲液进行复溶，获得悬浮于复溶缓冲液中的纳米金-光敏剂与肌酸激酶单克隆抗体的偶联体。
3.根据权利要求2所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于，所述纳米金颗粒与光敏剂的摩尔比为2:1-10。
4.根据权利要求2或3所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述水溶性光敏剂为卟啉衍生物、酞菁衍生物或叶绿素衍生物。
5.根据权利要求2或3所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的静电吸附，其时间为1小时至2小时。
6.根据权利要求4所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的静电吸附，其时间为1小时至2小时。
7.根据权利要求2或3所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的缓冲液为PBS、HEPES、硼酸盐、碳酸盐、Tris-HCl、柠檬酸中的一种；所述的复溶缓冲液为PBS、HEPES、碳酸盐、Tris-HCl中的一种。
8.根据权利要求4所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的缓冲液为PBS、HEPES、硼酸盐、碳酸盐、Tris-HCl、柠檬酸中的一种；所述的复溶缓冲液为PBS、HEPES、碳酸盐、Tris-HCl中的一种。
9.根据权利要求5所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的缓冲液为PBS、HEPES、硼酸盐、碳酸盐、Tris-HCl、柠檬酸中的一种；所述的复溶缓冲液为PBS、HEPES、碳酸盐、Tris-HCl中的一种。
10.根据权利要求6所述的一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于所述的缓冲液为PBS、HEPES、硼酸盐、碳酸盐、Tris-HCl、柠檬酸中的一种；所述的复溶缓冲液为PBS、HEPES、碳酸盐、Tris-HCl中的一种。
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