CN105682689B - 用于检测疾病相关靶结构的诊断装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供允许高特异性且有效地在体内和/或体外检测广泛范围的体液或组织中的生物标记物的诊断装置。该诊断装置由通过连接子化合物或层连接到基底上的结合剂组成，所述结合剂与存在于体液中的生物标记物特异性结合，所述基底包括金属、半导体或聚合物载体。本发明进一步提供使用所述装置用于检测生物标记物的方法，和包含所述装置和合适的成分、用于检测体液中生物标记物的套件。此外，本发明提供所述结合剂的合适的体内和体外应用，用于检测特定的疾病相关的靶结构。

Description

用于检测疾病相关靶结构的诊断装置
技术领域
本发明涉及一种用于在体内和/或体外检测流体或组织中的生物标记物的诊断装置，所述诊断装置包含特异地结合所述生物标记物的结合剂、连接子化合物和由金属、半导体或聚合物载体组成的基底，其中所述结合剂是酶抑制剂。本发明进一步涉及一种使用本发明的诊断装置检测在流体或组织中的生物标记物的方法，以及包含本发明的诊断装置的用于检测疾病相关生物标记物的套件(kit)。
背景技术
许多生物标记物，例如特定的细胞类型、小分子、细菌和病毒存在于人类体液中。然而，由于它们的低浓度，通过使用已知的富集方法不能有效地检测它们，因此所述已知的富集方法不能用于传统的诊断方法，例如在临床化学、病理学和细胞学中确立的检测方法。
通过使用免疫细胞化学方法的商购方法体外检测存在于血液样品中的生物标记物例如循环肿瘤细胞。特异性针对上皮抗原例如CK或EpCAM的抗体通常是最广泛使用的用于上皮肿瘤细胞检测的标记物，尽管存在假阳性和假阴性染色的变异率。例如，在非肿瘤细胞的非特异性结合的实例中或在特异性结合至循环上皮细胞的实例中，正常对照中的CK-阳性细胞的百分比在0-20％范围内，其由于体内的创伤或炎症而存在。由于非特异性结合，特异性是有限的，且用于检测生物标记物必需的样品体积非常高。此外，基于抗体的技术涉及用于制备检测所需抗体的高成本。
基于抗体的技术的进一步的缺点是，所述抗体只能在对细胞非常有害的强条件下(关于高盐条件、热、pH值)从抗原中去除。与此相反，本发明的结合剂可在正常条件下很容易地以高浓度被溶解，从而释放结合到连接子的结合剂。因此，这些技术较不适合生物标志物的体外检测。
因此，需要不具有本领域中已知检测装置和方法的缺点的供选择的诊断装置。
本发明的目的是提供如下的检测装置，其不仅检测体液中稀有的生物标记物，也提供在适合诊断疾病例如感染或癌症特异性的多种靶结构的基底上结合和/或富集生物标记物的有效方法。
与基于抗体的检测方法形成对照，包含通过有机合成制备的结合剂的本发明的诊断装置，费用认为是较低的。特别地，可更加有效地以工业规模制备本发明的结合剂。此外，由于通过连接子提供的单个结合位点，本发明的体系的特异性得到改进。小分子例如抑制剂不能被免疫系统检测，并因此当应用于身体时具有较低的副作用的风险。
发明内容
通过以下面内容和附加权利要求中内容为特征的实施方案实现上述技术问题的解决方案。
在第一实施方案中，本发明涉及用于在体内和/或在体外检测流体或组织中的生物标记物的诊断装置，其包含具有下式的组合物：
A-L-B，
其中A为特异性结合所述生物标记物的结合剂；L是连接子；并且B是包含金属、半导体或聚合物载体的基底。在一个优选的实施方案中，A是如本文下面所定义的酶抑制剂。
在另一个实施方案中，本文描述的生物标记物可具有存在于蛋白质、群体感应分子、毒素、脂质、碳水化合物、核酸、小分子、药物、细菌、病毒或真核细胞上的靶结构。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中本文所述的生物标记物具有存在于体液中的循环肿瘤细胞(CTC)上的靶结构。
在另一个实施方案中，所述靶结构是谷氨酸羧肽酶II。
本发明进一步涉及本文描述的诊断装置，其中所述结合剂A具有与疾病相关的靶结构。优选地，所述疾病是癌症或感染。
在本发明的诊断装置的另一个实施方案中，A是谷氨酸羧肽酶II的酶活性抑制剂。优选地，谷氨酸羧肽酶II的酶活性的抑制是可逆的。
在另一实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中A具有下面式II的结构：
其中X是键、NH或O，
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由如下物质组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤代、氟代、氯代、溴代、碘代、羟基、羰基、醛、卤代甲酰、碳酸酯、羧酸酯、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、缩醛、缩酮、原酸酯、原碳酸酯、羧酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵离子、初级氯胺酮、次级氯胺酮、初级醛亚胺、次级醛亚胺、酰亚胺、叠氮、偶氮(二酰亚胺)、氰酸盐/酯、异氰酸盐/酯、硝酸盐/酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫化物、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸盐/酯、异硫氰酸盐/酯、羰硫基(carbonothioyl)、膦、膦酰基、磷酸盐/酯、二羟硼基、硼酸盐/酯(boronate)、硼烷基(borino)和硼酸(borinate)。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中如本文定义的R1或R2为与L共价结合或非共价结合的基团。
本发明一个优选的实施方案涉及本文描述的诊断装置，其中A具有下面的结构式III：
在进一步优选的实施方案中，本发明的诊断装置的连接子化合物L是聚合物、蛋白质，优选藻酸盐或水凝胶。
根据本发明的进一步的实施方案，结合剂A与可检测的标记物优选荧光染料或化学发光染料或放射性示踪剂共轭，或所述结合剂A与药物共轭。优选地，所述药物是抗癌药物。
在另一个实施方案中，本发明的诊断装置包含基底(本文表示为B)，其中所述基底包含金属载体。优选地，所述金属载体由不锈钢组成。
在进一步的实施方案中，本发明的诊断装置包含装配在基底B上的隔层。优选地，所述隔层由如金、铂或银的贵金属组成。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种用于检测流体或组织中的生物标记物的方法，包含如下步骤：a)使式II或III的结合剂或本发明的诊断装置与体液样品或组织接触；b)使A与体液或组织中的生物标记物结合；和c)检测A的存在。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于检测流体或组织中的疾病相关的生物标记物的套件，包含：a)本发明的诊断装置，和b)其使用的说明书。
在进一步的实施方案中，本发明涉及式II或III的结合剂或本发明的诊断装置用于检测特定疾病相关的靶结构的用途。
附图说明
图1示出了酶的可能的抑制剂与竞争性抑制之间的相互作用的示意图。
图2示出了示例性抑制剂的合成方案的概图。
图3示出了与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的结合剂的实例。
图4示出了本发明的诊断装置的示意图。
具体实施方式
在第一实施方案中，本发明涉及用于在体内和/或在体外检测流体或组织中的生物标记物的诊断装置，其包含具有下式I的组合物：
A-L-B，
其中A为特异性结合所述生物标记物的结合剂，其中所述结合剂是酶抑制剂；L是连接子；以及B是包含金属、半导体或聚合物载体的基底。
本文所用的术语“诊断装置”指的是用于诊断或检测生物标记物的装置；例如，在临床化学、病理学和细胞学中。例如，本发明的诊断装置可用于一级风险评估(预测和早期疾病鉴定)、预后、治疗选择、疾病或病况的监控和管理、群体遗传学筛查和监测、药物基因组学诊断、流行病学研究和监测、临床试验监测和症状监测，包括临床分析仪、便携式电池驱动仪表、自实施试验装置、床旁分析仪(point of care analyzer)、床旁仪表(point ofcare meter)、当前点分析仪(point of present analyzer)、当前点仪表(point ofpresent meter)等。
本文所用的术语“生物标记物”指的是具有靶结构的物质，优选存在于患者体液中的生物分子或物质。生物标记物的实例为多肽、蛋白质、群体感应分子、毒素、脂质、碳水化合物、核酸、小分子、药物、细菌、病毒、真核细胞。
本文所用的术语“靶结构”指的是微观或亚微观结构，例如，在患者体液中，希望依附于本发明的诊断装置的结合剂与其结合。本文所用的术语“靶结构”可指定整个细胞，但更特别地表示细胞状结构，即，有机分子例如蛋白质、核苷酸链、碳水化合物或脂质，其位于生物细胞的内部，或细胞膜上，在细胞间隙中，或在体液例如血液或淋巴液中。术语“细胞状结构”还伴随地表示较大的结构如细胞或病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中所述生物标记物具有一种存在于如下物质上的靶结构：多肽、蛋白质、群体感应分子、毒素、脂质、碳水化合物、核酸、小分子、药物、细菌、病毒或真核细胞，例如醇脱氢酶(ADH)、上皮生长因子受体(EGFR)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，假单胞菌属(spec.)、乳头状瘤病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、高丝氨酸内酯、四氢大麻酚(THC)、循环肿瘤细胞(CTC)。
在另一实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中本文描述的生物标记物具有存在于体液中循环肿瘤细胞(CTC)上的靶结构。
本文所用的术语“循环肿瘤细胞或CTC”指的是在从受试者中得到的样品中发现的任何循环癌细胞。通常，CTC已从实体肿瘤脱落。如此，CTC通常是从实体肿瘤中脱落的上皮细胞，其在具有晚期癌症的患者的循环中以非常低的浓度被发现。CTC也可是来自肉瘤的间皮细胞或来自黑素瘤的生黑色素细胞。
本文使用的术语“体液”旨在表示来自动物或人类的天然存在的流体，例如唾液、痰、血清、血浆、血液、尿、黏液、胃液、胰液、精液、哺乳或月经产物、眼泪或淋巴液。
如本文所用，“靶结构”指的是任何合理选择的序列或序列的组合，其中基于在折叠靶基序(motif)时形成的三维结构选择所述序列。在本领域中具有多个已知的靶基序。蛋白质靶基序包括但不限于酶活性位点和信号序列。核酸靶基序包括但不限于启动子序列、顺式元件、发夹结构和诱导型表达元件(蛋白质结合序列)。
在另一个实施方案中，所述靶结构是谷氨酸羧肽酶II或其片段。优选地，所述靶结构是EC 3.4.17.21-谷氨酸羧肽酶II或其片段。EC 3.4.17.21-谷氨酸羧肽酶II的核苷酸和氨基酸序列显示为SEQ ID NO：1和2。
本发明进一步涉及如本文描述的诊断装置，其中所述结合剂A具有与疾病相关的靶结构。在一个优选的实施方案中，所述疾病是癌症或感染。
本文所用的术语“癌症”指的是在受试者中的转移性和/或非转移性癌症，特别是实体瘤癌症，并且包括原发性和继发性癌症。对癌症的提及包括对癌细胞的提及。如本文所用的术语“实体瘤癌症”指的是导致由癌细胞组成的一个或多个实体瘤的癌症，包括，例如，肺癌、脑(成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤)、肝、甲状腺、骨、肾上腺、脾脏、肾脏、淋巴结、小肠、胰腺、结肠、胃、乳房、子宫内膜、前列腺、睾丸、卵巢、皮肤、头和颈和食道。
本文所用的术语“感染”是指入侵受试者。所述术语包括通常存在于受试者的身体内或上的微生物的过度增长。更一般地，微生物感染可以是其中微生物种群的存在对宿主有机体(受试者)造成损害的任何情况。因此，当有机体的身体内或上存在过多数目的微生物种群时，或当微生物种群存在的作用是损害有机体的细胞或其他组织时，有机体“经受”微生物感染。
如本文所用，“受试者”是旨在用于诊断，例如预测或早期疾病鉴定的个体。本文感兴趣的受试者包括植物、动物或人类；优选人类。
在另一个实施方案中，本发明的结合剂A是一种抑制剂，优选酶抑制剂。本文所用的“抑制剂”是指结合到生物标记物的活性位点或生物标记物内或表面上的其它地方，从而阻断其活性的化合物。
本文使用的术语“酶抑制剂”是指通过与酶结合降低酶活性的分子。所述酶抑制剂与酶的活性位点结合和结合在酶内或表面上的其它地方，从而阻断酶与基底的相互作用且可以可逆方式或不可逆方式与酶结合。优选地，本发明的抑制剂以可逆方式结合。
本文所用的术语“可逆”是指能够回到原始(“未结合”)的状态。本文所用的术语“可逆抑制”是指抑制效果是这样的以使结合剂保持抑制靶分子(生物标志物)的活性的能力。
图1简单示出了酶的可能抑制剂与竞争性抑制(左)分别地变构抑制(右)的结合可能性，其中E＝酶，I＝抑制剂，S＝天然基底。
本发明的结合剂A可为如下面定义的任何类型的酶活性的可逆或不可逆抑制剂。优选地，本发明的结合剂以可逆方式抑制酶的活性。
可逆抑制剂类型
可逆抑制剂使用非共价相互作用例如如氢键、疏水相互作用和离子键与酶结合。抑制剂和活性位点之间的多个弱键结合以产生强的和特异性的结合。与基底和不可逆抑制剂形成对比，当与酶结合时可逆抑制剂通常不经历化学反应，并且可以通过稀释或透析容易地除去。
具有四种类型的可逆的酶抑制剂。根据改变酶基底的浓度对抑制剂的效果将它们分类。
a.在竞争性抑制中，基底和抑制剂不能同时与酶结合，如在图的左侧所示。这通常是由于对其中基底也结合的酶的活性位点具有亲合力的抑制剂；基底和抑制剂竞争接近酶的活性位点。可通过充分高浓度的基底(Vmax保持不变)，即，通过竞争超过抑制剂来克服该类型的抑制。然而，由于这需要较高浓度的基底以达到Km点或Vmax的一半，表观Km将增加。竞争性抑制剂通常在结构上与实际的基底相似(参见下面的实施例)。
b.在非竞争性抑制中，抑制剂仅与基底-酶复合物结合，其不应与非竞争性抑制剂混淆。该类型的抑制导致Vmax降低(由于移除活化复合物，最大速度下降)和Km降低(由于较好的结合效率，这是因为Le Chatelier原理和ES复合物的有效消除从而降低Km，表明较高的结合亲和力)。
c.在混合的抑制中，抑制剂可与酶基底同时与酶结合。然而，抑制剂的结合影响基底的结合，反之亦然。可通过增加基底的浓度降低但不能克服该类型的抑制。虽然混合型抑制剂在活性位点结合是可能的，然而该类型的抑制通常是由于变构效应，其中抑制剂与酶上的不同位点结合。抑制剂与该变构位点的结合改变了酶的构象(即，三级结构或三维形状)以使基底与活性位点的亲合力下降。
d.非竞争性抑制是混合抑制的一种形式，其中抑制剂与酶的结合降低了其活性但不影响基底的结合。因此，抑制的程度仅依赖于抑制剂的浓度。由于不能反应以有效地开始，Vmax将下降，但Km将保持不变；因为通过定义，基底的真实结合将仍然适当运行。
不可逆抑制的类型
不可逆抑制剂通常共价修饰酶，且因此抑制是不可逆的。不可逆抑制剂通常包含活性官能团例如氮芥、醛、卤代烷、烯烃、Michael受体、苯基磺酸根、或氟代膦酸根。这些亲电子基团与氨基酸侧链反应以形成共价加合物。改性的残留物是具有含亲核物质如羟基或巯基的侧链的那些；这些包括氨基酸丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
不可逆抑制不同于不可逆酶失活。不可逆抑制剂通常是特异于一种类型酶且不使所有的蛋白质失活；它们不通过破坏蛋白质的结构起作用，而是通过特异性改变它们的靶的活性位点。例如，pH或温度的极端条件通常会导致所有蛋白质结构的变性，但是这是非特异性作用。类似地，一些非特异性的化学处理破坏蛋白质的结构：例如，在浓盐酸中加热将使将蛋白质保持在一起的肽键水解，释放游离氨基酸。
不可逆抑制剂显示时间依赖的抑制且因此它们的效能不能由IC 50值来表征。这是因为，在给定浓度的不可逆抑制剂下活性酶的量将是不同的，取决于抑制剂与酶预孵化多长时间。
抑制剂的实例见下面的表1：
表1:
半最大抑制浓度(IC50)用于测量在抑制生物活性方面化合物的效力。为了评估可逆抑制潜能，IC50值取自抑制剂候选物且实施本领域周知的竞争结合测试。对于任何培养时间，IC50值应该基本相同。
在本发明的诊断装置的进一步实施方案中，结合剂A是谷氨酸羧肽酶Ⅱ的酶活性抑制剂。优选地，谷氨酸羧肽酶Ⅱ的酶活性抑制是可逆的。
在另一实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中A具有下面式II的结构：
其中X是键、NH或O，
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由如下物质组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤代、氟代、氯代、溴代、碘代、羟基、羰基、醛、卤代甲酰、碳酸酯、羧酸酯、羧基、酯、甲氧基、氢过氧基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、缩醛、缩酮、原酸酯、原碳酸酯、羧酰胺、伯胺、仲胺、叔胺、4°铵离子、初级氯胺酮、次级氯胺酮、初级醛亚胺、次级醛亚胺、酰亚胺、叠氮、偶氮(二酰亚胺)、氰酸盐/酯、异氰酸盐/酯、硝酸盐/酯、腈、异腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、吡啶基、巯基、硫化物、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酸盐/酯、异硫氰酸盐/酯、羰硫基、膦、膦酰基、磷酸盐/酯、二羟硼基、硼酸盐/酯、硼烷基和硼酸。
R1、R2、R3、R4和R5可以是未取代的或可被一个或多个化学基团例如烷基、烯基、炔基或卤素取代，只要其对抑制活性没有负面影响。
优选地，式II中的R1和/或R2被连接分子L取代或与连接分子L结合。
如本文所用，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”在它们范围内包括直链、支化的链和环状部分。术语“烯基”和“炔基”旨在包括一个或多个不饱和键。优选地，“烷基”、“烯基”和“炔基”为“C1-6-烷基”、“C2-6-烯基”和“C2-6-炔基”基团。
在另一实施方案中，本发明涉及如本文描述的诊断装置，其中如本文定义的R1或R2为与L共价或非共价键合的基团。
本发明优选的实施方案涉及本文描述的诊断装置，其中A具有下面的结构式III：
本文描述的结合剂A可通过使用多种策略的连接技术直接或间接地与基底结合。优选地，在式III中与氮结合的氢可被连接分子L取代或与连接分子L结合。
结合剂A可通过粘附、静电相互作用、化学连接或共价或非共价结合与基底结合。这些策略包括标准链霉亲和素-生物素相互作用。它还包括(单克隆的)抗体例如IgG或其片段通过粘附或静电相互作用与基底直接结合。此外，使用下面描述的连接子技术可实施靶-特异性分子结构例如酶、抗体或其片段、核酸、多肽或糖肽的共价连接。后者的技术允许靶结构与基底的精确结合，赋予纳米级空间分辨率，并因此提供精确的关于浓度和空间分布的实时信息。
优选地，A通过连接子技术例如通过聚合物或蛋白质结构例如藻酸盐、水凝胶(例如，Xantec水凝胶)或生物素/链霉亲和素间接与基底结合。
在进一步的实施方案中，本发明的诊断装置的连接子化合物L是聚合物、蛋白质，优选藻酸盐或水凝胶。
根据本发明的进一步的实施方案，结合剂A与可检测的标记物优选荧光染料或化学发光染料或放射性示踪剂共轭，或所述结合基A与药物共轭。优选地，所述药物是抗癌药物。
本文所用的术语“可检测的标记物”包括但不限于发色团、酶、其分解产物是可检测的酶反应性化合物、若丹明、生物素、链霉亲和素、荧光化合物、化学发光(chemiluminscent)化合物，及这些标记物的衍生物和/或组合。在提供的实施例中，使用生物素-亲和素。在用于得到最优的检测和结合剂的结合的条件下实施使用任何标记物的标记。
所述结合剂可与信号发送器耦合。
信号发送器的实例可来自荧光团的组。荧光团分子可单独使用，或作为一个功能系统的荧光基序。基于分子的复杂性和合成方法，荧光团分子通常可被分为四类：蛋白质和多肽，小的有机化合物，合成的低聚物和聚合物，和多组分体系。荧光蛋白可为绿色荧光蛋白(GFP)、YFP(黄色荧光蛋白)和RFP(红色荧光蛋白)。非蛋白质有机荧光团属于下列主要化学家族：氧杂蒽衍生物如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红，青色素衍生物如青色素、吲哚羰花青、含氧羰花青(oxacarbocyanine)、硫杂羰花青和部花青，萘衍生物(丹酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)，香豆素衍生物，恶二唑衍生物如吡啶基恶唑、硝基苯并恶二唑和苯并恶二唑，芘衍生物如级联蓝(cascade blue)等，恶嗪衍生物如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170等，吖啶衍生物如原黄素、吖啶橙、吖啶黄等，芳基次甲基(Arylmethine)衍生物如金胺、结晶紫、孔雀石绿，四吡咯衍生物如卟吩，酞菁和胆红素。进一步的信号发送器可来自半导体如量子点的组。
其它信号发送器可以是放射性示踪剂或高载荷磁共振成像(MRI)造影剂，其可用于非侵害性的分子成像技术如MRI、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和正电子发射断层成像术(PET)。典型的同位素包括11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb、68Ga、99mTc、111In、123I和201Tl。
此外，酶例如与粘合剂耦合的辣根过氧化物酶(HRP)可用作信号发送器。
在另一个实施方案中，本发明的诊断装置包括基低(本文表示为B)，其中所述基底包含金属载体。优选地，所述金属载体由不锈钢组成。本发明的装置的基底可为平面或非平面基底，其由金属例如不锈钢、聚合物例如硅或生物相容性聚合物或玻璃制成，且可通常是透明的、不透明的、导电的、半导电的或不导电的。所述基底可为生物相容的，用于传感器的体内应用。
在进一步的实施方案中，本发明的诊断装置包含装配在基底B上的隔层。优选地，所述隔层由如金、铂或银的贵金属组成。优选地，所述基底包含由金属，优选地元素周期表第10或11族的金属，优选地在国际公布文本WO 2006/131400 A1中提到的那些组成的隔层。然而，所述基底也可进一步包含层，例如聚合物层。
相应地，所述诊断装置可进一步包含装配在基底B上、具有下列性质的第二层：所述第二层被形成为聚合物层，优选由水凝胶组成。所述第二层有助于结合剂例如在式II或III中定义的抑制剂的结合。所述聚合物层由于增加的表面积而有助于富集靶分子或细胞。所述第二层可进一步包含官能团用于结合剂例如本文上面定义的可检测化合物的共价结合。所述第二层可进一步包含分解产物是可检测的以有助于定量检测和产生靶分子或细胞的酶反应性化合物。所述第二层可作为阻止非特定的细胞的结合和与体液的不需要的相互作用的基质。结合剂，例如在式II或III中定义的抑制剂，可与所述隔层共价结合。
为了提高诊断装置的效能，可通过使用特定表面结构增加功能化的表面面积(功能化用于有效结合结合剂)或基底自身的表面面积。所述表面结构可包括脊、腔，突出、边缘或凹槽，其可以是圆柱形、球形、圆锥形或金字塔形的。
进一步的示例性基底和其制造方法可见于国际公布文本号WO 2010/145824 A1、WO 2011/113584 A1和欧洲专利EP 1811302 B1。在下面的实施例部分给出了制备本发明的装置的示例性方法。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于检测流体或组织中的生物标记物的方法，包含如下步骤：a)使式II或III的结合剂或包含所述结合剂的本发明的诊断装置与体液样品接触；b)使A与体液中的生物标记物结合；和c)检测A的存在，从而检测直接或间接结合与A结合的结合中的生物标记物的生物标记物。例如PSMA与作为结合剂(A)的抑制剂结合。考虑到PSMA是细胞的一部分的事实，细胞的其他部分(其不是PSMA)也可被检测。在下面的实施例部分也给出了用于体内应用和体外应用的用于制备本发明的基底的示例性方法。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于检测或捕获流体或组织中的疾病相关的生物标记物的套件，其包含：a)本发明的诊断装置，和b)其使用的说明书。
在进一步的实施方案中，本发明涉及式II或III的结合剂或包含所述结合剂的本发明的诊断装置用于检测特定疾病相关的靶结构的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及式II或III的结合剂用于分离特定疾病相关的靶结构的用途。
实施本发明的最佳方式
实施例1：诊断装置的制备
通过四个单独的但相关的程序实施诊断装置的制备。第一步是制备结合剂，第二步是制备基底，第三步是使用本发明的结合剂功能化所述基底，所述结合剂通过连接子技术直接或间接地与基底结合，和任选地移除与结合剂结合的生物分子。例如，通过纳米结构如纳米图案化的金属、半导体和/或磁性岛在平面或非平面、透明或不透明的表面的沉积来制备基底，其中所述纳米结构分布在所述表面上，和随后结合剂与纳米结构结合以提供在图1中示意性示出的装置。
A.结合剂的制备
图2合成方案的概图。
产物1(C20H20O4；324.36g/mol)
20g的苄基丙烯酸酯(0.12mol)在氩气氛围下加入已加热的(heated-off)烧瓶中，然后将烧瓶加热至100℃。移除热源并将0.4g(0.45ml；2.14mmol)三(二甲氨基)膦逐滴加入溶液中，由此将所述反应混合物加热至115℃。将所形成的黄色溶液冷却至室温。然后加入75ml的硅胶浆(己烷/乙酸乙酯5:1)。将所述混合物放置在干燥硅胶上并用己烷/十六烷醇乙酸酯(ethal acetate)1:1洗涤。使用蒸发器移除溶液，且减少的无色(coulourless)的液体通过冷冻干燥法干燥过夜。产物1的产量为15.97g(0.049mol)，对应于82％的产率。
(合成相似于：P.F.Jackson et al,Design and pharmacological activity ofphosphinic acid based NAALADase inhibitors,J.Med.Chem.2001,44,4170-4175)
产物2(C20H23O6P；390.29g/mol)
在加热的烧瓶中在二氯甲烷(245ml)中制备次磷酸铵(12.86g，0.155mol)的悬浮液。向该悬浮液中加入三甲基甲硅烷基氯化物(trimethylsilyldiloride)(44.54g，0,41mol，51,8ml)和三乙胺(37,64g，0,37mol，51,6ml)，由此温度保持在10℃以下。在3-9℃下搅拌该混合物30分钟。之后，在10℃以下的温度下加入产物2(10g，0.031mol，溶解在10.2mlDCM中)。将该溶液温热至室温并搅拌20.5h。之后，通过小心添加3N HCl(12ml)停止反应，由此温度保持在25℃以下。使用3N HCl(每次55ml)洗涤有机相四次并用H2O(每次55ml)洗涤有机相四次。将溶剂从旋转蒸发仪中移除并将所述混合物在冷冻干燥系统中干燥过夜。结果是9,866g(0.0253mol)的混浊的无色粘性液体，对应于81％的产率。
(按照下面文中公开的方式合成：D.Vitharana et al,Synthesis andbiological evaluation of(R)-and(S)-2-(phosphonomethyl)pentanedioic acids asinhibitors of glutamate carboxypeptidase II,Tetrahedron Assymetry 2002,13,1609-1614.)
产物3(C23H31O5N2P；446,41g/mol)
将产物2(4,64g，11,9mmol)溶解在DMF(23,8ml(2ml/mmol))中并在冰浴中在氩气氛围下与二氨基丙烷(1,99ml,23,8mmol)一起搅拌30分钟。之后，将DMAP(0,279g,2,38mmol)和DCC(2,27g,11,9mmol)加入到所述溶液中并在氩气氛围下在RT下搅拌2,5h。从旋转蒸发仪中移除溶剂。接下来，实施使用9/1配给量的DCM/MeOH的柱色谱处理。在最终的步骤中，将产物3冷冻干燥(lyophilisied)。在此结果是4,562g(0,010mol)黄色固体油，对应于84％的产率。
产物4(C23H31O6N2P；462,47g/mol)
产物3(4,562g,9.62mmol)溶解在水/乙腈溶剂(1:1,60ml)中，之后，逐滴缓慢加入0,1mol氧化溶液(0.1M碘在THF/水/吡啶7:2:1)直至保持红棕色颜色。接下来，所述溶液被蒸干并吸附在DCM中。用5％的NaHSO4溶液和饱和的NaCl溶液摇动筛出有机相数次。用DCM提取水相。用NaSO4干燥收集的有机相并滤出。所产生的溶液从旋转蒸发仪中移出并在冷冻干燥系统中干燥。结果是2,6g(5,63mmol)呈褐色的泡沫，对应于58,5％的产率。
(按照下面文中公开的方式合成：D.Vitharana et al,Synthesis andbiological evaluation of(R)-and(S)-2-(phosphonomethyl)pentanedioic acids asinhibitors of glutamate carboxypeptidase II,Tetrahedron Assymetry 2002,13,1609-1614.)
产物5(C9H19O6N2P；282,23g/mol)
在氢气下与500mg Pd/C催化剂在水/乙腈溶液(18ml/7ml)中搅拌产物4(1g,2.04mmol)20h。之后，过滤出所述催化剂并共蒸发滤液。使用HPLC清洗离析物。(缓冲剂A：5％MeCN，缓冲剂B：30％MeCN)。
(按照下面文中公开的方式合成：D.Vitharana et al,Synthesis andbiological evaluation of(R)-and(S)-2-(phosphonomethyl)pentanedioic acids asinhibitors of glutamate carboxypeptidase II,Tetrahedron Asymmetry 2002,13,1609-1614.)
B.基底的制备
作为基底，使用检测导管。已按照在WO 2010/145824(其通过引用并入本文)中公开的方案制备所述检测导管。
C.功能化所述基底
为了功能化上述纳米颗粒基底，使用多种策略使结合分子，例如式III的抑制剂与表面结合。这些策略包括标准链霉亲和素-生物素相互作用。它还可包括(单克隆的)抗体例如IgG或其片段通过粘附或静电相互作用与阵列表面的直接结合。此外，使用连接子技术可实施靶-特异性分子结构例如抗体或其片段、由核酸形成的低聚物或多肽或糖肽的共价连接，正如在下面详细的实施例中描述的。本发明的诊断装置适用于医学应用，适用于生物和生物化学研究，以及适用于环境监测和保护和食品安全。关于医学应用，所述诊断装置被组装为用于体内或体外应用的装置。
D.结合剂的再生用于进一步应用
在已通过本发明的结合剂A分离生物标记物后，可通过添加高浓度的本发明的结合剂或连接分子的酶法分析产物将生物标记物从结合剂A中移除，因此允许体外测定生物标记物。
实施例2：体内检测
对于使用所述诊断装置的体内检测，将所述装置装配在弹性丝载体上，提供分子或细胞选择导管以通常直接从循环或身体中得到稀有分子或细胞成分。作为用于体内应用的装置，装配在例如弹性丝上的装置提供细胞或分子选择导管，其对多种应用，例如癌症诊断和慢性病如癌症、代谢疾病、传染性疾病、过敏性和炎性疾病的监测是有用的。这个装置是通过血管(静脉或动脉)的穿刺，例如，通过使用空心针，和通过空心针或通过标准静脉线将装置放入血管来应用。在适当的孵化时间(5-60分钟)后，所述装置被附着细胞和/或分子取代用于进一步处理。
作为细胞选择导管，根据本发明的诊断装置适用于从外周血中分离稀有细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)或细菌。
CTC细胞仅存在于患有癌症的人类或动物血液中。配备有针对细胞和可溶PSMA的结合剂的细胞选择导管特异性结合在PSMA阳性细胞上的PSMA蛋白质或血液中的可溶PSMA。结合至细胞选择导管的细胞的数量取决于在血液循环中的保留时间和实际细胞浓度。用于在治疗前或过程中和/或在完成癌症药物治疗的一个疗程和/或染色体畸变和/或其他遗传缺陷诊断后监测患者的适当数量的PSMA阳性细胞，可在体内在5-60分钟保留时间后收集。在更换导管后，将具有附着细胞的导管的尖端放置入收集管中用于运输至特定的实验室。
实施例3；体外检测
所述结合剂可与多种连接子和表面结合且在这个背景下用于多种体外应用。
体外应用的“诊断装置”装配在平面和透明的支撑物上以给出允许通过测定在纳米结构化的表面上的等离子体共振频率或发冷光特性或磁特性(取决于使用纳米球刻蚀沉积在所述支撑物上的材料)定量和定性测定目标物的“微型实验室(lab on a chip)”。作为用于体外应用的装置，所述“诊断装置”是用于“现场”诊断程序(例如，在床边、在手术室中、救护车上或战场中)，其用按照如下描述应用。根据量子尺寸限制效应，纳米尺寸的金属粒子根据大小显示不同的光学吸收光谱。表面等离子体带是由于粒子表面周围集体电子振荡。例如Ag(银)纳米粒子具有约390nm等离子体带，而Au纳米粒子具有约520nm等离子体带。表面等离子体吸收的选择位置、强度和带宽与粒子的尺寸、形态(形状)和表面功能性直接相关。通过用抗生物素蛋白覆盖二维组装的金纳米粒子，它们的等离子体峰向较长的波长移动且可轻易地被检测。通过下面的实施例可进一步说明本发明。
所述结合剂可与信号发送器耦合并用于检测生物标记物。例如，其可与异硫氰酸荧光素(FITC)耦合。在该实施例中所结合的结合剂可通过使用波长约480nm的光激发FITC来检测且可使用可检测约525nm波长的合适的过滤器来检测。
图3结合剂与异硫氰酸荧光素(FITC)耦合的实例
所述结合剂可与表面耦合以从流体样品例如尿液或血液中分离生物标记物。

Claims (13)

1.一种用于在体内和/或在体外检测流体或组织中的生物标记物的诊断装置，其包含具有下式的组合物：
A-L-B，
其中A为特异性结合所述生物标记物的结合剂；结合剂可与信号发送器耦合，并且其中A是酶抑制剂，其中A具有下面的结构式III：
L是连接子；以及
B是包含金属载体的基底，且所述基底上装配有隔层和作为第二层的聚合物层，所述隔层由金、铂或银的贵金属组成，所述聚合物层由水凝胶组成，且所述聚合物层包含分解产物是可检测的以有助于定量检测和产生靶分子或细胞的酶反应性化合物。
2.根据权利要求1所述的诊断装置，其中所述生物标记物具有存在于体液中的循环肿瘤细胞上的靶结构。
3.根据权利要求2所述的诊断装置，其中所述靶结构是谷氨酸羧肽酶II。
4.根据权利要求2所述的诊断装置，其中所述A具有与疾病相关的靶结构。
5.根据权利要求4所述的诊断装置，其中所述疾病是癌症或感染。
6.根据权利要求3所述的诊断装置，其中谷氨酸羧肽酶II的酶活性的抑制是可逆的。
7.根据权利要求1所述的诊断装置，其中L为聚合物。
8.根据权利要求7所述的诊断装置，其中L为蛋白质。
9.根据权利要求7所述的诊断装置，其中L为藻酸盐或水凝胶。
10.根据权利要求1-9任一项所述的诊断装置，其中A与生物标记物或药物共轭。
11.根据权利要求10所述的诊断装置，其中所述生物标记物或药物是荧光染料、化学发光染料、放射性示踪剂或抗癌药物。
12.用于检测流体或组织中的疾病相关的生物标记物的套件，其包含：
a)权利要求1-11任一项的诊断装置，和
b)其使用的说明书。
13.权利要求1-11任一项的诊断装置用于制备检测特定疾病相关的靶结构的装置的用途，且所述诊断装置装配在弹性丝载体上或装配在平面和透明的支撑物上：
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