CN108120839A - 一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒及其制备、使用方法 - Google Patents

一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒及其制备、使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种稳定的免疫球蛋白IgG检测试剂盒,其用于对血清或血浆中的免疫球蛋白IgG含量的检测；免疫比浊法IgG检测试剂盒在试剂稳定性能上存在很大缺陷，本发明提供一种稳定的IgG检测试剂盒通过更换缓冲体系，使抗体在此环境中更加稳定，从而增强试剂的稳定性。

Description

一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒及其制备、使用方法
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒及其制备、使用方法,其用于对血清或血浆中的免疫球蛋白IgG含量的检测。
背景技术
人体血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，它占总的免疫球蛋白的70-75%，人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用。此外，IgG 还具有调理吞噬和结合SPA等作用。
现有技术中通用的免疫球蛋白IgG检测诊断方法是免疫比浊法。该方法使用的缓冲体系是Tris-HCl。Tris-HCl缓冲液的优点是：①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。
Tris-HCl缓冲液的缺点是：温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，并在配置和使用温度下保存。这点体现在免疫球蛋白IgG检测试剂盒中就是，室温下配制的Tris-HCl缓冲液试剂盒在0℃～4℃下保存3个月以内可用，检测结果稳定性很好，但放置3个月后会发现试剂浑浊有沉淀，检测结果稳定性不好，不能再使用，需要重新配置，造成资源浪费。同时R2试剂盒中的抗体也易在温度降低时或长时间放置后出现沉淀。
因此，提供一种能够对温度变化不敏感的稳定的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，是现有技术中亟需解决的问题。
PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广，而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl2和0.5 mmol/LMgCl2，以提供双价阳离子。PBS缓冲液(pH7.2-7.4)的组分为:NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO4 2mmol/L。
含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为:称取磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、吐温-20，加水。PBS 1L的配方为:磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
不仅伪狂犬病毒要用PBS稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。
PBS也不是万能的，一般认为其不适用血液检测试剂盒的缓冲，原因是血液中含有钙、铁、镁、锌等金属元素，这些金属的磷酸盐是难溶的沉淀物，而可溶的磷酸盐的溶解度同样具有随温度的下降而降低的特点，因此尤其不适于配置对温度稳定的免疫球蛋白IgG检测试剂盒。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于解决免疫球蛋白IgG检测试剂盒出现沉淀的现象和不稳定因素，提供一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒；本发明的另一目的在于提供其制备和使用方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种稳定的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，所述试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
上述免疫球蛋白IgG检测试剂盒的制备方法，试剂R1的制备方法为：按照重量份，首先，取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠1.2份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠0.87份加入90份去离子水中，溶解均匀；然后，加入聚乙二醇辛基苯基醚5份，溶解均匀；再加入乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5份，溶解均匀；最后加入去离子水至总重量为100份。
试剂R2的制备方法为：按照重量份，首先，取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠1.2份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠0.87份加入70份去离子水中，溶解均匀；然后，加入聚乙二醇辛基苯基醚2.5份，溶解均匀；再加入乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5份，溶解均匀；再加入抗体20份，溶解均匀；最后加入去离子水至总重量为100份。
上述免疫球蛋白IgG检测试剂盒的使用方法，试剂Ｒ１和试剂Ｒ２的使用比例为5:1。
优化的，检测波长为700nm，样本量：试剂R1：试剂R2=5ul：200ul：40ul
该检测基于IgG抗体与IgG抗原间的反应，形成免疫复合物，在700nm波长处检测其浊度变化，其变化程度与样本中的IgG含量成正比。
应用本发明试剂盒测定血清中IgG含量方法如下：检测波长为700nm，样本量：试剂R1：试剂R2=5ul：200ul：40ul。
本发明试剂盒一种稳定的免疫比浊法IgG检测试剂盒，试剂R1和R2各物质的选择依据是：
乙二胺四乙酸二钠是一种离子螯合剂，它能有效的螯合金属离子，防止一些杂质离子对检测反应引起不必要的干扰。
磷酸盐缓冲液主要是缓冲作用，保证反应时外环境的稳定，致使检测结果不会受到波动和影响。
氯化钠用于模拟人体内血液环境，保证反应的进行是在体外相同条件下进行的，从而保证检测的真实性和可靠性。
聚乙二醇辛基苯基醚在此用作表面活性剂，其是非离子型表面活性剂即表面活性剂是Triton X-100。
在制备试剂R1的方法中，首先取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠使其充分均匀的溶解在离子水，由于三者均为可溶性盐，因此易于溶解，能够制得均匀的水溶液体系；然后加入聚乙二醇辛基苯基醚，该表面活性剂可溶于水，因此可以制得均匀的水溶液体系；再加入乙二胺四乙酸二钠，该螯合剂易溶于水，同样可以制得均匀的水溶解体系；最后加入去离子水至总重量为100份，制得R1。
该制备方法的顺序不仅保证最终得到均匀的溶液体系，而且聚乙二醇辛基苯基醚设置在中间步骤加入，可以充分分散到整个溶液中，充分起到表面活性剂的作用；乙二胺四乙酸二钠最后加入，一方面其分子中的氢离子可以与溶液中已经存在的钠离子、钾离子进行离子交换，另一方面其分子中的胺基还可以与溶液中已经存在的聚乙二醇辛基苯基醚中的羟基形成共轭，从而进一步稳定整个溶液体系，即使温度变化时，试剂仍然为稳定的均匀体系，稳定的离子交换和共轭也保证了整个体系pH值稳定；最后当使用中加入样本后，R1中的乙二胺四乙酸二钠还可以螯合钙、铁、镁、锌等金属元素防止其形成沉淀，影响检测结果。
在制备试剂R2的方法中，首先取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠使其充分均匀的溶解在离子水，由于三者均为可溶性盐，因此易于溶解，能够制得均匀的水溶液体系；然后加入聚乙二醇辛基苯基醚，该表面活性剂可溶于水，因此可以制得均匀的水溶液体系；再加入乙二胺四乙酸二钠，该螯合剂易溶于水，同样可以制得均匀的水溶解体系；最后加入抗体，去离子水至总重量为100份，制得R1。
该制备方法的顺序不仅保证最终得到均匀的溶液体系，而且聚乙二醇辛基苯基醚设置在中间步骤加入，可以充分分散到整个溶液中，充分起到表面活性剂的作用；乙二胺四乙酸二钠最后加入，一方面其分子中的氢离子可以与溶液中已经存在的钠离子、钾离子进行离子交换，另一方面其分子中的胺基还可以与溶液中已经存在的聚乙二醇辛基苯基醚中的羟基形成共轭，从而进一步稳定整个溶液体系，即使温度变化时，试剂仍然为稳定的均匀体系，稳定的离子交换和共轭也保证了整个体系pH值稳定；最后当使用中加入样本后，R1中的乙二胺四乙酸二钠还可以螯合钙、铁、镁、锌等金属元素防止其形成沉淀，影响检测结果。
试剂盒配置好后密封在4℃保存一年，不出现沉淀。
本发明可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。
应用本发明进行体外样本诊断检测时，操作方法如下，设置波长为700nm，终点法，样本量：试剂R1：试剂R2=5ul：200ul：40ul。样本针吸取样本后于试剂R1中进行孵育，以保证反应环境外界条件的稳定，然后读取吸光光度值为ΔA1，进而加入试剂R2， IgG抗体与IgG抗原间的反应，形成免疫复合物，在700nm波长处检测其浊度变化，其变化程度与样本中的IgG含量成正比。
在恒温下反应5-10分钟左右读取吸光光度值为ΔA2，通过计算吸光光度值的变化，进而计算出IgG的含量。计算公式如下
IgG含量=标准液浓度*吸光光度值（ΔA2-ΔA1）
相对于市场上目前流通的免疫比浊法IgG检测试剂盒，本发明试剂盒，稳定性较好，无沉淀。适用于全自动生化分析仪，临床使用价值较大。
综上所述，本发明提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒的有益效果在于：能够为检测提供稳定的环境，包括整个试剂pH值稳定和温度变化时，试剂仍然为稳定的均匀体系，省去因为试剂不稳定而反复配制试剂的麻烦，确保整个检测过程的及时性、稳定性和检测结果的准确性。本发明提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，具有延长试剂稳定，增强试剂在运输及储存过程中对环境因素的稳定性,长时间（至少一年）放置不会出现沉淀现象，从而为IgG检测方法学提供新的资料。
具体实施方式
以下结具体实施方式具体说明本发明。
实施例
本实施例提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
对比例1
本对比例提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 1.5%
磷酸二氢钾 0.2%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 1.5%
磷酸二氢钾 0.2%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
对比例2
本对比例提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 0.5%
磷酸二氢钾 1.0%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
磷酸氢二钠 0.5%
磷酸二氢钾 1.0%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
对比例3
本对比例提供的免疫球蛋白IgG检测试剂盒，是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
三羟甲基氨基甲烷 1.21%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.3%
三羟甲基氨基甲烷 1.21%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
对比例4
现有技术中，目前市场上流通的受到客户认可的免疫球蛋白IgG检测试剂盒。
首先通过表1对比说明本发明提供的实施例与4个对比例的不同之处。
表1实施例与4个对比例对比表
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
磷酸氢二钠 1.2% 1.5% 0.5% —— ——
磷酸二氢钾 0.5% 0.2% 1.0% —— ——
三羟甲基氨基甲烷 —— —— —— 1.21% ——
本实施方式对实施例和对比例提供的试剂盒进行了稳定性试验检测，具体方案为，本发明实实施例和对比例进行对比，校准液和质控品批号分别是20160421ET和朗道特种蛋白质控454LPC，质控品454LPC靶值为14.5。
试剂盒保存温度为4℃，使用仪器为全自动生化分析仪BS-800，参数设置如下，波长为7000nm，反应方向为正方向，读数点设置为14-16点和31-33点，样本量：试剂R1：试剂R2=5ul：200ul：40ul。分别对比实施例和对比例在4℃保存一年的时期内，分别在4℃、37℃、45℃时检测，结果如表2-5所示：
表2 4℃稳定性检测结果
时间 实施例 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
第1天 14.5 14.2 14.2 14.2 14.4
第2天 14.3 14.0 14.2 14.3 14.1
第3天 14.2 14.1 14.3 14.1 14.3
第4天 14.0 14.0 14.2 14.2 14.1
第5天 14.4 14.0 14.3 14.4 14.1
第6天 14.2 13.7 14.2 14.2 14.0
第7天 14.1 13.7 14.1 14.1 14.0
第9天 14.2 13.8 14.2 14.2 14.0
第11天 14.3 13.5 14.3 14.3 14.2
第15天 14.0 13.0 14.0 14.0 14.3
第30天 13.9 12.8 13.7 12.7 12.6
第60天 13.4 12.4 12.0 11.0 11.2
第120天 13.3 10.5 11.5 10.0 10.9
第240天 13.0 10.3 9.8 7.9 10.3
第365天 12.9 9.6 8.8 6.8 8.0
由上表可知，实施例在1-15天检测数值稳定在14.0以上，第365天为12.9与靶值相差1.6；对比例1-4分别在1-5、1-15、1-15、1-15天检测数值稳定在14.0以上，第365天分别为9.6、8.8、6.8、8.0，与靶值分别相差4.9、5.7、7.7、6.5。
表3 37℃稳定性检测结果
时间 实施例 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
第1天 14.1 14.2 14.2 14.3 14.3
第2天 14.3 14.0 14.1 14.2 14.4
第3天 14.4 14.1 14.1 14.4 14.1
第4天 14.0 14.1 14.0 14.3 14.0
第5天 13.7 14.0 14.0 13.2 14.0
第6天 13.8 12.7 14.0 12.6 13.6
第7天 13.8 12.0 13.2 12.2 13.5
第9天 13.7 11.8 13.3 11.8 13.3
第11天 13.6 8.2 12.6 11.4 13.1
第15天 13.4 7.5 12.0 11.0 13.0
第30天 13.4 6.2 9.8 7.3 9.5
由上表可知，在第30天，实施例的检测数值仍稳定在13.4，与靶值相差1.1；对比例1-4在第30天分别为6.2、9.8、7.3、9.5，与靶值分别相差8.3、4.7、7.2、5.0。
表4 45℃稳定性检测结果
时间 实施例 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
第1天 14.1 14.3 14.3 14.2 14.4
第2天 14.4 14.0 13.9 14.3 14.2
第3天 14.2 14.3 13.6 14.2 14.3
第4天 14.1 13.5 12.8 13.1 14.2
第5天 13.9 13.0 12.1 12.2 14.3
第6天 13.9 12.1 11.2 12.1 13.0
第7天 13.8 10.2 9.9 11.6 11.2
第9天 13.9 8.8 4.2 10.2 10.1
第11天 13.7 6.0 3.5 9.2 9.5
第15天 13.8 6.4 3.3 8.8 9.0
第30天 13.6 5.9 3.0 4.2 6.8
由上表可知，实施例在第30天检测数据为13.6与靶值相差0.9；对比例1-4在第30天分别为5.9、3.0、4.2、6.8，与靶值分别相差8.6、11.5、10.3、7.7。
通过以上对比可知，在相同的存储和测试条件下，实施例与靶值差别较小，最大相差1.6，偏差在20%以内，说明本发明提供的实施例还可以使用，具有一定的准确性；而对比例最大相差11.5，最小相差4.7，偏差超出20%，已经无法使用。因此本发明的稳定性明显优于对比例的稳定性，因此本发明试剂盒检测中，其稳定性有了很大程度的提高，为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。

Claims (5)

1.一种免疫球蛋白IgG检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中按照质量分数，
试剂R1的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 5%
试剂R2的组成为：
乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%
磷酸氢二钠 1.2%
磷酸二氢钾 0.5%
氯化钠 0.87%
聚乙二醇辛基苯基醚 2.5%
抗体 20%
试剂R1和R2的余量均为去离子水。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白IgG检测试剂盒的制备方法，其特征在于：试剂R1的制备方法为：按照重量份，首先，取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠1.2份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠0.87份加入90份去离子水中，溶解均匀；然后，加入聚乙二醇辛基苯基醚5份，溶解均匀；再加入乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5份，溶解均匀；最后加入去离子水至总重量为100份。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白IgG检测试剂盒的制备方法，其特征在于：试剂R2的制备方法为：按照重量份，首先，取干燥且不含结晶水的磷酸氢二钠1.2份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠0.87份加入70份去离子水中，溶解均匀；然后，加入聚乙二醇辛基苯基醚2.5份，溶解均匀；再加入乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5份，溶解均匀；再加入抗体20份，溶解均匀；最后加入去离子水至总重量为100份。
4.根据权利要求1所述的免疫球蛋白IgG检测试剂盒的使用方法，其特征在于：试剂Ｒ1和试剂Ｒ２的使用比例为5:1。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的免疫球蛋白IgG检测试剂盒的使用方法，其特征在于：检测波长为700nm，样本量：试剂R1：试剂R2=5ul：200ul：40ul。
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