MX2013010925A

MX2013010925A - Metodo y equipo para determinar el tiempo de seroconversion de un paciente infectado con un virus.

Info

Publication number: MX2013010925A
Application number: MX2013010925A
Authority: MX
Inventors: Tamar Jehuda-Cohen
Original assignee: Smart Biotech Ltd
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2014-11-10
Also published as: BR112013024317A2; US20140087364A1; WO2012127474A1

Abstract

La presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de infección, y un método para determinar si una infección microbiana está en las primeras etapas, que comprende el paso de determinar a relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en muestras de sangre de dicho sujeto, y equipos relacionados.

Description

METODO Y EQUIPO PARA ESTIMAR INCIDENCIA DE VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método para determinar la incidencia por infecciones de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende comparar los niveles de anticuerpo de anti-VIH de muestras de tejido estimulado in vitro con aquellas de muestras de tejido no estimulado de miembros individuales de dicha población y equipos correlacionados. La presente invención también proporciona un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende comparar la inmunoreactividad anti-VIH estimulada in vitro e inmunoreactividad anti-VIH no estimulada en muestras de tejido de miembros individuales de dicha población y equipos correlacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La incidencia (la velocidad a la cual ocurren nuevas infecciones en una población) proporciona una indicación más directa y actual del estado de la epidemia de VIH de lo que lo hace la prevalencia (la fracción de una población en un estado infectado en un punto en el tiempo). Las medidas incidencia proporcionan información invaluable para valorar brotes, planear estudios y dirigir y apuntar intervenciones.

En el pasado, la medición de incidencia a través de la observación directa de nuevas infecciones en una población durante el seguimiento eventual de una corte de individuos inicialmente seronegativos se ha considerado el "estándar de oro" para la estimación de incidencia. Sin embargo, los estudios de cohorte son costosos, y log ísticamente d ifíciles de establecer y mantener, y los resultados son propensos a desviación de reclutamiento no representativo y agotamiento de sujetos.

Por lo tanto las Pruebas para Infección Reciente (TRI) proporcionan un medio atractivo para estimar incidencias sin la necesidad de seguimiento eventual. Las TRI clasifican infecciones como recientemente o no recientemente adquiridas, basándose en los resultados de pruebas de laboratorio que cuantifican biomarcadores que evolucionan con el tiempo después de infección, algunas veces complementados por información clínica. La prevalencia de las 'infecciones recientes' definidas por TRI se estima al aplicar la TRI en una encuesta transversal de la población de interés. Sin embargo, las pruebas para infección por VIH reciente se han basado tradicionalmente en avidez de anticuerpo, proporción o título, para lo cual índices recientes falsos altos (e) o duraciones de recencia bajas (?) han impedido estimación de incidencia. Por lo tanto, es necesaria una nueva y mejor forma para calcular la incidencia de nuevas infecciones por VIH en la técnica.

La clasificación de infecciones por una TRI usualmente se basa en biomarcadores medidos. Un reto es que la evolución de estos biomarcadores dentro de virus infectados exhiba variabilidad inter-sujeto. En algunos casos, el estado de infección reciente es demasiado transitorio para la proporción de población que se va a estimar con energía estadística en estudios con tamaños de muestra factibles. Además, frecuentemente existen muchos individuos que permanecen clasificados como recientemente infectados indefinidamente o durante períodos muy prolongados, o que revierten a una clasificación reciente durante enfermedad de etapa final o bajo la influencia de Tratamiento Anti-retroviral. Incluso aunque este fenómeno de infecciones 'falsamente recientes' puede considerarse explícitamente sin introducir desviación en principio, existe una pérdida considerable de energía estadística cuando se estima la proporción de infecciones 'verdaderamente recientes' para la estimación de incidencia.

Las TRI hasta ahora propuestas (tal como ELISA desintonizada, el ensayo BED y e nsayos de avidez) todos confían crucialmente en medidas de título de anticuerpo, avidez o proporción específica de VIH. Sin embargo, estas TRI parecen estar plagadas por transferencia no satisfactoria entre el estado transitorio de infección reciente e infecciones recientes falsas. En resumen, para que una TRI sea de utilidad en la estimación de incidencia, la Duración de Recencia Media (tiempo medio pasado en el estado de infección reciente) debe ser grande, mientras el índice Reciente Falso (la proporción de individuos infectados por mucho tiempo que permanecen en el estado definido por TRI de infección reciente) debe ser pequeño. Esta invención dirige la necesidad de una TRI que satisfaga esos criterios.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de: a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación posterior del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso c) y el valor que representa el nivel anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; f) determinar si el SI o btenido en el paso (e) para cada muestra está sobre un valor de umbral predeterminado, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no se infectó recientemente y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra se infectó recientemente; y g) calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto del número de muestras y la Duración de Recencia Media para dicho umbral, determinando con ello la incidencia de infecciones por VIH en dicha población.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia en infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de específico de VIH, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende los pasos de: a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación subsecuente del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; f) graficar los valores del SI obtenido en el paso (e) para todas las muestras para determinar la distribución de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía, en donde las muestras con un valor SI sobre un valor de umbral predeterminado tienen una infección reciente, las muestras con un valor en SI d e dicho valor de umbral predeterminado aproximadamente tienen una infección no reciente, y las muestras seropositivas con un valor SI menor que dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección tardía, por lo cual se determina la distribución de infecciones por VIH recientes, no reciente, y tardías en dicha población.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1: niveles de anticuerpo estimulado y no estimulado.

Los especímenes de sangre incubados en medios de estimulación (estimulado) tienen niveles de anticuerpos superiores comparados con especímenes de sangre de control (no estimulado) después de seroconversiones. Los niveles de anticuerpo aumentados en la muestra estimulada se desvanecen con el tiempo después de seroconversión , y se invierten en etapas tardías de la infección.

Figura 2: gráfica del índice de estimulación en una población de alto riesgo, con altos índices de incidencia. Una alta proporción de las muestras tiene un índice de estimulación (SI) mayor que 1.5, que es consistente con reportes independientes de altos índices de incidencia en esta población.

Figuras 3A y 3B: gráfica del índice de estimulación en dos poblaciones de alta prevalencia, sin nuevas infecciones. Ninguna de las muestras en cualquier población A(A) o población B(B) tienen un índice de Estimulación (SI) mayor que 1.2, que es consistente con reportes independientes de todas las infecciones en estas poblaciones que no son recientes (es decir, de largo plazo). También, ningún caso tuvo un SI aumentado en las etapas finales como sucede con otros ensayos, en donde las etapas tardías tienen valores similares a las tempranas, causando de esa forma altos niveles de 'recientes falsos'. De hecho, el SI en etapa tardía disminuye, como se muestra en la Figura 1.

Figura 4: Distribución de Indice de Estimulación (SI). Una distribución de muestra de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía una población en la cual la infección está caracterizada por un período asintomático prolongado.

Figura 5: Distribución de Indice de Estimulación (SI) para Población de Alta incidencia. Una distribución de muestra de infecciones recientes y no recientes en una población con una alta incidencia de infecciones recientes.

Figura 6: Distribución de Indice de Estimulación (SI) para una población con Infecciones a largo plazo. Una distribución de muestra de infecciones de etapa no reciente y tardía en una población.

Figura 7: Distribución de Indice de Estimulación (SI). Una distribución de muestra de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población en donde la infección está caracterizada por un período asintomático breve.

Figura 8: Distribución de Indice de Estimulación Real (SI) para una población con infecciones a largo plazo. Una distribución de valores SI de datos transversales de todos los seropositivos, de una primera población china con infecciones excesivamente a largo plazo.

Figura 9: Distribución de Indice de Estimulación Real (SI) para una población con infecciones a largo plazo. Una distribución de valores SI de datos transversales de todos los seropositivos de una segunda población china con infecciones exclusivamente a largo plazo.

Figura 10: Distribución de Indice de Estimulación Real (SI) para población de alta incidencia. Una distribución de valores SI de datos transversales de todos los seropositivos, de una tercera población china con un índice de incidencia muy alto.

Figura 11: Distribución de Indice de Estimulación (SI) real para Población de Alta Incidencia. Una distribución de valores SI de datos transversales de todos los seropositivos, de una población húngara con un índice de incidencia muy alto.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCION En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende comparar los niveles de anticuerpo anti-VIH de muestras de tejido estimulado in vitro con aquellas de muestras de tejido no estimulado de miembros individuales de dicha población y equipos relacionados. La presente invención también proporciona un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende comparar la inmunoreactividad anti-VIH estimulada in vitro e inmunoreactividad anti-VIH no estimulada en muestras de tejido de miembros individuales de dicha población y equipos relacionados.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infecciones de virus de ¡nmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido de un miembro representativo de sujetos en dicha población; (b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación posterior del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; (d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; (e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; (f) determinar el SI obtenida en el paso (e) para cada muestra está sobre un valor de umbral predeterminado, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no se infectó recientemente y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra se infectó recientemente; y (g) calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto de número de muestras y la Duración de Recencia Media para dicho umbral, con lo cual se determina la incidencia de infecciones por VIH en dicha población.

En una modalidad, el nivel de anticuerpo antimicrobiano detectable en dicha primera alícuota es una indicación que un sujeto es seropositivo. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para determinar la incidencia de nuevas infecciones microbianas en una población. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para determinar la incidencia de infecciones microbianas recientes en una población. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para determinar la frecuencia de infecciones microbianas nuevas en una población.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infecciones microbianas nuevas en una población que comprende los pasos de a) determinar el nivel de anticuerpo anti-microbiano en una primera alícuota de un grupo de muestras de tejido de dicha población, en donde un nivel de anticuerpo antimicrobiano detectable indica que una muestra es seropositiva; b) determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en una segunda alícuota de dichas muestras de tejido, dicha segunda alícuota ha sido estimulada para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro; y c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano obtenido en el paso (a) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano estimulado obtenido en el paso (b) para cada muestra, en donde el número medio de muestras con un valor del paso (c) que es superior a un umbral predeterminado dividido por el número total de muestras que tienen un nivel detectable de anticuerpo antimicrobiano en el paso (b) y multiplicado por la Duración de Recencia Media para dicho umbral proporciona una medida de la incidencia de nuevas infecciones microbianas en dicha población.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de nuevas infecciones microbianas en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; (b) determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido, en donde un nivel de anticuerpo antimicrobiano detectable indica que una muestra es seropositiva; (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido de muestras seropositivas para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en dicha segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido; (d) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano estimulado obtenido en el paso (c) entre u n valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano obtenido en el paso (b) para cada muestra; (e) determinar si el cociente obtenido en el paso (d) para cada muestra está sobre un valor de umbral predeterminado, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no se infectó recientemente y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra se infectó recientemente; (f) calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto del número de muestras seropositivas y la Duración de Recencia Media para dicho umbral, con lo cual se determina la incidencia de nuevas infecciones microbianas en dicha población.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; (b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación subsecuente del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; (d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; (e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; (f) graficar los valores del SI obtenido en el paso (e) para todas las muestras para determinar la distribución de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía en dicha población, en donde las muestras con un valor de SI sobre un valor de umbral predeterminado tienen una infección reciente, las muestras con un valor SI de aproximadamente dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección no reciente, y las muestras seropositivas con un valor SI menor que dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección tardía, por lo cual se determina la distribución de infecciones de VIH de etapa reciente, no reciente, y tardía en dicha población.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la etapa epidemiológica de infecciones por virus de inmunodeficíencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; (b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación subsecuente del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial, (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH i n vitro; (d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas d e cada una de dichas muestras de tejido; (e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; (f) graficar los valores del SI obtenido en el paso (e) para todas las muestras para determinar la distribución de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía en dicha población, en donde las muestras con un valor SI sobre un valor de umbral predeterminado tienen una infección reciente, las muestras con un valor SI de aproximadamente dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección no reciente, y las muestras seropositivas con un valores SI menor que dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección tardía, por lo cual se determina la distribución de infecciones por VIH de etapa reciente, no reciente, y tardía en muchas poblaciones y de esa forma el estado epidemiológico de la infección por VIH en dicha población.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para determinar el estado epidemiológico de una infección en una población. En una modalidad, el estado epidemiológico es la relación entre las diferentes etapas de la infección en una población especificada.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la distribución de infecciones microbianas de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido en un número representativo de sujetos en dicha población; (b) determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido, en donde un nivel de anticuerpo antimicrobiano detectable indica que una muestra es seropositiva; (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido de muestras seropositivas para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en dicha segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido; (d) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano estimulado obtenido en el paso (c) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano obtenido en el paso (b) para cada muestra; (e) graficar los valores del cociente obtenidos en el paso (d) para todas las dichas muestras seropositivas para determinar la distribución de infecciones recientes, no recientes y de etapa tardía en dicha población, en donde las muestra seropositivas con un valor del cociente mayor que un valor de umbral predeterminado tienen una infección reciente, las muestras seropositivas con un valor de cociente de aproximadamente el valor de umbral predeterminado tienen una infección no reciente, y las muestras seropositivas con un valor de cociente inferior que el valor de umbral predeterminado tienen una infección tardía, por lo cual se determina la distribución de infecciones microbianas de etapa reciente, no reciente, y tardía en dicha población.

En una modalidad, el método además comprende el paso de calcular la relación de infecciones por VIH de etapa reciente, no reciente, y tardía a infecciones por VIH totales en dicha población. En otra modalidad, el método además comprende el paso de calcular el área bajo la curva (AUC) de la gráfica obtenida en el paso (f), en donde una AUC mayor sobre el umbral indica infecciones por VIH más recientes y una AUC mayor bajo el umbral indica más infecciones por VIH de etapa tardía por la población. En una modalidad, la medida de AUC toma en cuenta que tan reciente es una infección, es decir que tan alto es el SI en lugar de considerar únicamente si el SI excede un umbral predeterminado.

En una modalidad, la presente invención proporciona una muestra de tejido de uno o más sujetos para evaluación. En una modalidad, la muestra d e tejido es una muestra de sangre. En otra modalidad, la muestra de tejido es una muestra de sangre entera. En otra modalidad, la muestra comprende células en sangre o saliva de dicho sujeto. En otra modalidad, la muestra de tejido es una muestra de una mejilla o lengua. En otra modalidad, la muestra de tejido es una biopsia (por ejemplo nodo linfático, hígado, etc.).

Como se utiliza aquí, el término "sangre entera" significa sangre recolectada con heparina, EDTA, citrato, o cualquier otra substancia que previene la coagulación y formación de coágulo. El término sangre entera como se utiliza aquí también incluye sangre recolectada de un animal o ser humano con heparina, etilenodiaminatetraacetato, citrato, o cualquier otra sustancia que previene la coagulación y formación de coágulo. "Sangre entera" también puede significar sangre en donde los glóbulos rojos han sido lisados mientras mantienen la viabilidad de los glóbulos blancos restantes.

El término "muestra" incluye muestras presentes en un individuo así como muestras obtenidas o derivadas del individuo.

En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden el paso de determinar si el SI de cada muestra está sobre un valor de umbral. En una modalidad, un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no fue infectada recientemente y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra fue infectada recientemente. En otra modalidad, un valor bajo dicho umbral indica que la muestra es de una fuente o sujeto que no fue recientemente infectado y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra es de una fuente o sujeto que fue recientemente infectado.

En una modalidad, un valor de cociente mayor que 1.2 indica una infección reciente. En una modalidad, un valor de cociente inferior a 1.0 indica una infección tardía. En otra modalidad, un valor de cociente inferior a 0.9 indica una infección tardía. En otra modalidad, un valor de cociente inferior a 0.8 indica una infección tardía. En otra modalidad, un valor de cociente de aproximadamente 1.0 indica una infección no reciente. En otra modalidad, un valor de cociente de entre 0.9 y 1.1 indica una infección no reciente. En otra modalidad, un valor de cociente de entre 0.8 y 1.2 indica una infección no reciente.

En una modalidad, una distribución predispuesta a valores de cociente sobre el umbral predeterminado es una indicación de una población con una alta incidencia o, en otra modalidad, una población que tiene muchas infecciones recientes. En otra modalidad, una distribución predispuesta hacia valores de cociente bajo el umbral predeterminado es una indicación de una población que tiene muchas infecciones de etapa tardía.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia de una estrategia de la prevención de la dispersión de infección en una población que comprende el paso de comparar la distribución de infecciones recientes, infecciones no recientes, e infecciones de etapa tardía en una población particular con una distribución previa de infecciones en dicha población, en donde un desplazamiento de la distribución lejos de nuevas infecciones en una población indica una estrategia de prevención exitosa. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia de una estrategia de tratamiento para una infección en una población que comprende el paso de comparar la distribución de infecciones recientes, infecciones no recientes, e infecciones de etapa tardía en una población particular con una distribución previa de infecciones en dicha población, en donde un desplazamiento de la distribución lejos de infecciones de etapa tardía y al rango no reciente (a largo plazo) indica una estrategia de tratamiento exitosa para la población. En otra modalidad una estrategia de tratamiento exitosa además está caracterizada por una disminución en muestras con nuevas infecciones en la población, que puede determinarse como se describe aquí. En una modalidad, la distribución previa de infecciones en la población fue de un año antes. En otra modalidad, la distribución previa de infecciones en la población fue desde dos años antes. En otra modalidad, la distribución previa de infecciones en la población fue desde cinco años antes.

En otra modalidad, el éxito de un tratamiento o estrategia de prevención para retener la dispersión de infección en una población se evalúa al determinar una distribución actual de infecciones a una distribución esperada de infecciones, que en una modalidad, confía en datos epidemiológicos de otras poblaciones con características en común que son relevantes para la dispersión de infección en una población. En otra modalidad, los datos epidemiológicos recolectados en un punto de tiempo individual al graficar la distribución de índices de estimulación son suficientes para proporcionar datos epidemiológicos en la población.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de nuevas infecciones virales en la población que comprende los pasos de a) determinar el nivel de anticuerpo anti-virus en una primera alícuota de un grupo de muestras de sangre de dicha población, en donde un nivel de anticuerpo antiviral detectable indica que una muestra es seropositiva; b) determinar el nivel de anticuerpo antivirus en una segunda alícuota de dichas muestras de sangre, dicha segunda alícuota ha sido estimulada para producir anticuerpos antivirales in vitro; y c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo de antivirus obtenido en el paso (a) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo de antivirus estimulado obtenido en el paso un (b) para cada muestra, en donde el número medio de muestras con valor del paso (c) que es superior a un umbral predeterminado dividido entre el número total de muestras que tienen un nivel detectable de anticuerpo de antivirus en el paso (b) y multiplicado por la Duración de Recencia Media para dicho umbral proporciona una medición de la incidencia de nuevas infecciones virales en dicha población.

En una modalidad, el método además comprende el paso de obtener o recolectar una muestra de sangre de dicha población antes del paso (a).

En una modalidad, la infección viral es una infección retroviral. En una modalidad, el retrovirus es VIH. En otra modalidad, es un retrovirus. En una modalidad, el retrovirus es alfa-retrovirus, que en una modalidad es un virus de leucosis aviar o un virus del sarcoma de Rous. En otra modalidad, el retrovirus es un betaretrovirus, que en una modalidad, es un virus de tumor mamario d e ratón. En otra modalidad, el retrovirus es un gammaretrovirus, que en una modalidad, es un virus de leucemia murina o virus de leucemia felina. En otra modalidad, el retrovirus es un deltaretrovirus que en una modalidad, es un virus de leucemia bobina o el virus T-linfotrópico humano que causa cáncer (HTLV), que en una modalidad, es HTLV-1, y en otra modalidad, es HTLV-2. En otra modalidad, el retrovirus es un epsilonretrovirus, que en una modalidad, es un virus de sarcoma dérmico de Waleye. En otra modalidad, el retrovirus es un lentivirus, que en una modalidad, es un virus de inmunodeficiencia humana 1, virus de inmunodeficiencia de simio, o virus de inmunodeficiencia felina. En otra modalidad, el retrovirus es un espumavirus, que en otra modalidad, es un virus espumoso de simio. En otra modalidad, el retrovirus es un virus de hepatitis C (HCV). En otra modalidad, el retrovirus es un virus de hepatitis E (HEV). En otra modalidad, el retrovirus un virus de hepatitis D (HDV).

En una modalidad, un virus relacionado con los métodos y equipos de la presente invención es un virus de leucemia murina xenotrópico (XMRV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis A (HAV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis B (HBV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis C (HCV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis D (HDV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis E (HEV). En otra modalidad, el virus es virus T -linfotrópico humano-1 (HTLV-1). En otra modalidad, el virus es c ualquier combinación de los virus descritos aquí anteriormente. En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis B (HBV), virus de Hepatitis C (HCV), o virus de Hepatitis D (HDV).

En otra modalidad, el virus es virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En una modalidad, el VIH es VIH-1. En otra modalidad, el VIH es VIH-2. En otra modalidad, el VIH es VIH-0.

En una modalidad, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para determinar la incidencia de nuevas infecciones. En una modalidad, "incidencia" es la frecuencia con la cual aparecen nuevas infecciones en una población o área particular. En una modalidad, la incidencia es el número de casos recientemente diagnosticados durante un periodo de tiempo específico.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la prevalencia de una infección microbiana en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; (b) estimular una alícuota de cada una de dichas nuestras de tejido para producir anticuerpos antimicrobianos 1n vitro; (c) determinar el nivel de anticuerpo antimicrobiano en dichas muestras de tejido; (d) comparar el número de muestras con niveles de anticuerpo antimicrobiano detectables con el número de muestras con niveles de anticuerpo antimicrobiano no detectables, por lo cual se determina la prevalencia de una infección microbiana en dicha población.

En una modalidad, la infección es una infección crónica. En una modalidad, una infección crónica está caracterizada por la presencia continua del microbio infeccioso siguiendo la infección inicial y puede incluir enfermedad crónica o recurrente. En una modalidad, un microbio es un organismo viviente microscópico, tal como bacteria, hongo, protozoario o virus.

En una modalidad, la infección crónica es una infección microbiana. En otra modalidad, la infección crónica es una infección viral, que en una modalidad, es una infección retroviral. En otra modalidad, la infección crónica es una infección bacteriana, que en una modalidad es una infección de tuberculosis (TB). En una modalidad, la infección viral crónica es sarampión (paramyxovirus), hepatitis, o infección de mononucleosis infecciosa. En una modalidad, la infección es una infección de virus herpes, que en una modalidad, es una infección de citomegalovirus (CMV). En otra modalidad, la infección de virus herpes es una infección de virus de Epstein-Barr. En otra modalidad, la infección de virus herpes es una infección de virus simple de herpes (HSV), que en una modalidad, es una infección de HSV-1 o HSV-2, o, en otra modalidad, la infección de virus herpes es un virus de varicela zoster (VZV).

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de nuevas infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de a) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en una primera alícuota de un grupo de muestras de sangre de dicha población, en donde un nivel de anticuerpo anti-VIH detectable indica que una muestra es seropositiva; b) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en una segunda alícuota de dichas muestras de sangre, dicha segunda alícuota ha sido estimulada para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; y c) divide un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido en el paso (A) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH obtenido en el paso (b) para cada muestra, en donde el número medio de muestras con un valor del paso (c) que es superior a un valor de umbral predeterminado dividido entre el número total de muestras que tienen un nivel detectable de anticuerpo anti-VIH en el paso (B) y multiplicado por la Duración de Recencia Medía para dicho umbral proporciona una medida de la incidencia de nuevas infecciones de VIH en dicha población.

En una modalidad, los métodos de la presente invención involucran comparar un valor, tal como un valor de SI con un valor de umbral predeterminado. En una modalidad, el valor de umbral es determinado, basándose en los datos de SI de la población probada. En una modalidad, el valor de umbral se determina basándose en los datos del grupo de población específico probado, como se conoce en la técnica. En otra modalidad, el umbral valorado se determina basándose en una población diferente con características demográficas, culturales, médicas, u otras similares.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infección por VIH en una población, el método comprende determinar la relación de inmunoreactividad anti-VIH estimulada in vitro e inmunoreactividad anti-VIH no estimulada en muestras de sangre de miembros individuales de dicha población, en donde la proporción de muestras que tienen una relación que es superior a una relación de umbral preseleccionada es una medida de la incidencia de VIH en dicha población. En una modalidad, dicha relación de umbral preseleccionada es 1.1.

En una modalidad, los métodos de la presente invención se utilizan para estudios epidemiológicos. En una modalidad, los estudios epidemiológicos involucran la distribución de determinantes de estados relacionados con la salud (tales como niveles de anticuerpo comparativos con y sin estimulación) en una población y el uso de esta información para atender problemas epidemiológicos relacionados con la salud.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de nuevas infecciones por virus de inmunodeficíencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de: (a) obtener muestras de sangre de un número representativo de sujetos en dicha población; (b) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en una primera alícuota de cada una de dichas muestras de sangre, en donde un nivel de anticuerpo anti-VIH detectable indica que una muestra es seropositiva; (c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de sangre para producir anticuerpos anti-VIH in vitro y determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dicha segunda alícuota de cada una de dichas muestras de sangre; (d) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo de VIH obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo de VIH estimulado obtenido e n el paso (b) para cada muestra; (e) determinar si el cociente obtenido en el paso (d) para cada muestra está sobre un valor de umbral predeterminado, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no fue recientemente infectada y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra fue recientemente infectada; y (f) calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el número de muestras seropositivas multiplicado por la Duración de Recencia Media de dicho umbral, por lo cual se determina la incidencia de nuevas infecciones por VIH en dicha población.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de nuevas infecciones por VIH en una "población" utilizando los métodos aquí descritos. En una modalidad, la población es una población de interés. En otra modalidad, la población es una población conocida en la técnica. En una modalidad, la palabra "población" se debe tomar para significar un grupo de gente de acuerdo con su raza, país de origen, condición socioeconómica, sexo, orientación sexual, edad, religión, empleo, salud, etc. En una modalidad, la población es una población que es vulnerable para desarrollar una infección de retrovirus, que en una modalidad, es VIH. En una modalidad, la población es definida por un comportamiento particular, que en una modalidad, es uso de fármaco intravenoso, actividad homosexual, actividad bisexual, actividad sexual con múltiples compañeros, prostitución, recepción de transfusiones de sangre, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, la población es definida por vivir o haber visitado o viajado a través de una ubicación geográfica particular, que en una modalidad, es un componente, una región, un estado, o una ciudad. En otra modalidad, la población es definida por un estado médico particular, que en una modalidad es un hemofílico, un sujeto con una o más enfermedades sexualmente transmitidas, etc. En una modalidad, la población es derivada de un subgrupo particular de poblaciones descritas aquí anteriormente, tal como, en una modalidad, usuarios de fármaco intravenoso de China.

En una modalidad, las fórmulas, tablas, y cuadros de función de energía conocidos en la técnica pueden utilizarse para determinar estadísticamente que es un número representativo de sujetos para la población. Como será evidente para aquellos expertos en la técnica de epidemiología, no es necesario ensayar cada número de una población para obtener la incidencia de un carácter particular. Por consiguiente, se provee un número suficiente de individuos de la población para proporcionar un estimado estadísticamente significativo de la población, y como una consecuencia, los números reales que se van a probar se determinan fácilmente debido a experimentación indebida. En una modalidad, los individuos probados son seleccionados aleatoriamente de la población.

En una modalidad, el nivel de anticuerpo antimicrobiano o de antivirus en una muestra de sangre no activada contra una muestra de sangre activada es el valor de índice de Estimulación (SI). En una modalidad, los valores de SI se medirán con sensibilidad o amplitud variable dependiendo del sistema de detección utilizado. De esa forma, los valores de SI considerados como "elevados" de acuerdo con la presente invención dependerán del procedimiento preciso utilizado. Los valores de SI pueden probarse contra muestras obtenidas de individuos conocidos por estar recientemente infectados con VIH comparados con otras similares obtenidos de individuos que tienen una infección de VIH establecida tal como, pero no limitado a, individuos que son conocidos por haber sido infectados durante al menos un año y así sucesivamente. En comparación de los resultados, puede determinarse un valor de SI adecuado que fácilmente distingue la infección reciente como se define aquí de una infección establecida. La variación de ensayo puede controlarse al utilizar el valor de un grupo estándar de pares de muestra. Un experto en la técnica podría utilizar fácilmente técnicas estándares para determinar un valor de umbral de SI adecuado cuando utiliza cualquiera de una variedad de métodos para detectar inmunoreactividad a un antígeno retroviral. En una modalidad, los métodos de la presente invención además comprenden el paso de determinar o estimar un valor de SI de umbral, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no fue recientemente infectada y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra fue recientemente infectada. En una modalidad, el valor de SI de umbral es el umbral predeterminado utilizando en los métodos de la invención.

En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el número de muestras seropositivas y multiplicado por la Duración de Recencia Media para dicho umbral. En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto del número de muestras seropositivas y la Duración de Recencia M edia para dicho umbral. En otra modalidad, (el número medio de muestras recientemente infectadas/el número de muestras seropositivas) por la Duración de Recencia Media para el umbral igual una medida de la incidencia de nuevas infecciones virales en dicha población.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención comprenden calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el número de muestras y multiplicado por la Duración de Recencia Media para dicho umbral. En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto del número de muestras y la Duración de Recencia Media para dicho umbral. En otra modalidad, (el número medio de muestras recientemente infectadas/el número de muestras) por la duración de Recencia Media para el umbral igual a la incidencia de nuevas infecciones virales en dicha población.

En una modalidad, la "Duración de Recencia Media" es un período de tiempo predeterminado definido como reciente para dicho umbral. En una modalidad, "recencia" se describe por la "Duración de Recencia Media", que en una modalidad, es el periodo de tiempo promedio después de infección en el cual existe un SI mayor que el valor de umbral descrito aquí anteriormente. Por ejemplo, y en una modalidad, la Duración de Recencia Media puede ser un año para un valor de umbral de SI de 1.2, que significaría que los sujetos con un valor de SI de 1.2 o superior probablemente fueron infectados dentro del último año. En una modalidad, los métodos de la presente invención además comprenden el paso de determinar o estimar la Duración de Recencia Media para un umbral de SI específico.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de "nuevas" infecciones microbianas o virales en una población. En una modalidad, "nuevas" infecciones microbianas o virales se entiende que son infecciones virales "recientes". Como se describe aquí anteriormente, se determina infecciones recientes basadas en un valor de SI predeterminado y valor de Duración de Recencia Media, que a su vez se basan en análisis de una población inicial en donde la recencia de infección es conocida, como se entiende por un experto en la técnica.

En una modalidad, detectar "inmunoreactividad" comprende medir secreciones inducidas por antígeno por células B y células T, en donde en una modalidad, se secretan anticuerpos, citocinas, linfocinas, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, se obtiene una muestra de la presente invención de un fluido corporal, tal como sangre entera fresca en donde se activa una alícuota individual y no se activa el resto de la muestra, como se describe aquí, o en otra modalidad, una muestra es un par de muestras de plasma, en donde uno del par de plasma fue activado y el otro par de plasma fue de sangre no activada.

En algunas modalidades, el método comprende los pasos de: (i) recolectar una primera muestra de ensayo antes de la incubación; (ii) medir el nivel de anticuerpos en dicha primera muestra de ensayo; (¡ii) recolectar una segunda muestra de ensayo después de la incubación; (iv) medir el nivel de anticuerpos en dicha segunda muestra de ensayo; y (v) comparar la medida de los niveles de anticuerpos entre dichas primeras y segundas muestras de ensayo.

En otras modalidades, el método comprende los pasos de: (i) recolectar una primera muestra de ensayo antes del paso de incubación y almacenar dicha primera muestra de ensayo; (ii) recolectar una segunda muestra de ensayo después de dicho paso de incubación; (iii) medir el nivel de anticuerpos en dicha primera y segunda muestras de ensayo concurrentemente; y (iv) comparar las medidas de los niveles de anticuerpos entre dichas primeras y segundas muestras de ensayo.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención comprenden el paso de determinar primero el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota o muestras estimuladas, y si el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota estimulada es detectable, entonces el método comprende el paso de determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota de muestra no estimulada.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención comprenden el paso de determinar primero el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota o muestra no estimulada, y si el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota no estimulada es detectable, entonces el método comprende el paso de determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en la alícuota o muestra estimulada.

En una modalidad, "concurrentemente" se refiere a correr la primera muestra de ensayo y la segunda muestra ensayo en el mismo anticuerpo que detecta ensayo en el mismo día, que, en una modalidad, proporciona datos comparativos más directos y proporciona menos variación de ensayo que los ensayos ejecutados en días separados. En una modalidad, la primera muestra de ensayo es almacenada hasta después de la incubación y recolección de la segunda muestra. En una modalidad, las dos muestras (es decir, antes y después de incubar con el activador descrito aquí) se toman del mismo tubo. En una modalidad, la primera muestra es de tiempo de cero días y la segunda muestra es de tiempo de X días, en donde X es el número de días que se incubó la muestra con el activador o activadores como se describió aquí. En otra modalidad la muestra no activa es recolectada en "tiempo cero" y la otra, activada, es tomada después de un periodo de incubación con el activador, que en una modalidad es del tiempo 5 (es decir, después de cinco días de la activación).

En una modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante un día. En otra modalidad 2 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 3 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 4 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 5 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 6 días. En otra modalidad, la muestra tejido o de sangre es estimulada durante 7 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 3-5 días. En otra modalidad, la muestra de tejido o de sangre es estimulada durante 2-7 días.

En una modalidad, el plasma y plasma estimulado se almacenan "apropiadamente", que en una modalidad, es a una temperatura de 4°C (para almacenamiento a corto plazo de días), o en otra modalidad, a una temperatura de -20°C o -80°C (para almacenamiento a largo plazo de más de una semana), como es bien conocido en la técnica. En una modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 2 días. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 7 días. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 14 días. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 1 mes. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 6 meses. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 12 meses. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 24 meses. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 3 años. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 5 años. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 10 años. En otra modalidad, el plasma puede almacenarse durante hasta 20 años.

En una modalidad, el VIH puede ser cualquier cepa o aislado. Preferiblemente, el VIH seleccionado del grupo que consiste de VIH-1, VIH-2, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el sujeto es un mamífero, que en una modalidad, es un primate, que en una modalidad, es un ser humano.

En una modalidad, la incidencia de nuevas infecciones por VIH se determina utilizando los métodos de la presente invención. En otra modalidad, la incidencia de nuevas infecciones por VIH se estima utilizando los métodos de la presente invención. En otra modalidad, la incidencia de nuevas infecciones por VIH es aproximada utilizando los métodos de la presente invención.

En una modalidad, la incidencia de nuevas infecciones por VIH se determina utilizando los métodos de la presente invención. En otra modalidad, la prevalencia de nuevas infecciones por VIH se determina utilizando los métodos de la presente invención. En otra modalidad, el porcentaje de nuevas infecciones por VIH se determina utilizando los métodos de la presente invención. En otra modalidad, el índice de infección para infecciones por VIH se determina utilizando los métodos de la presente invención.

En una modalidad, una incidencia inferior de nuevas infecciones en una población después de uno o más programas de prevención, intervenciones, o estrategias es un signo que los programas de prevención, intervenciones, o estrategias para prevenir dispersión de un microbio o virus particular tal como VIH son o fueron efectivos.

En una modalidad, un método de la presente invención requiere la determinación de niveles de anticuerpo antimicrobiano en una muestra de tejido. En otra modalidad, un método de la presente invención requiere la determinación de tipos de anticuerpo antimicrobiano en una muestra de tejido. En otra modalidad, un método de la presente la invención requiere la determinación de afinidad de anticuerpo antimicrobiano en una muestra de t ejido. En otra modalidad, un método de la presente invención requiere la determinación de avidez de anticuerpo antimicrobiano en una muestra de tejido. Todo lo anterior puede determinarse en la muestra estimulada y no estimulada, y, lo anterior, o individualmente o en varias combinaciones puede compararse con otro.

En una modalidad, la muestra de tejido es una muestra de sangre. En otra modalidad, la muestra de tejido se obtiene de la encía o mejilla del sujeto.

En una modalidad, un método de la presente invención requiere determinar el nivel de anticuerpo anti-retroviral en una alícuota de una muestre de sangre. En una modalidad, una "alícuota" es una porción de la cantidad total de una muestra de sangre. En una modalidad, las alícuotas utilizadas en los métodos de la presente invención son de igual volumen o dilución. En una modalidad, se utilizan muestras de sangre duplicadas en los métodos de la presente invención. En una modalidad, las primeras y segundas alícuotas de una muestra de sangre son porciones de una muestra de sangre individual extraída de un sujeto individual en un punto de tiempo individual.

En otra modalidad, una alícuota individual de tejido o muestra de sangre puede utilizarse para determinar tanto niveles de anticuerpo de "línea base" como niveles anticuerpo estimulados, en donde una muestra de tejido, tal como sangre se extra en un contenedor que comprende el activador aquí descrito y las células son sedimentadas (por fuerza regular G, o por centrifugaciones cortas a baja velocidad). Se remueve una pequeña alícuota del sobrenadante de plasma para prueba posterior de los niveles iniciales de VI H/HCV/retrovirus/virus/patógeno/mícroorganismos. El resto es incubado con el activador durante varios días. Los niveles de los anticuerpos contra VI H/HCV/retrovirus/virus/patógeno/ microorganismo para la alícuota removida en Tiempo 0 se mide en el mismo ensayo con una alícuota de sangre o tejido removido después de la incubación. Se comparan las dos medidas. En una modalidad, se calcula la delta, en otra modalidad, se calcula la relación de señales o niveles, en otra modalidad, se calcula la relación de IgM a IgG de anticuerpos contra VI H/HCV/retrovirus/virus/patógeno/ microorganismos, etc.

De acuerdo con la presente invención, se extrae una muestra de sangre en un tubo de ensayo, que en una modalidad, es un tubo de vacío, una botella, una cavidad (como parte de una placa de cavidades múltiples o como una cavidad individual o placa) o un matraz, que contiene una concentración efectiva de una solución de un activador (tales como mitógenos, citocinas, linfocinas, y combinaciones de los mismos como se describe aquí anteriormente). La muestra de sangre que se va a aprobar se cultiva in vitro en presencia de cualquier combinación de activadores de linfocitos para lograr la misma función.

En una modalidad, el paso de determinar niveles de anticuerpo antimicrobiano comprende realizar un ensayo de anticuerpo en cada alícuota de dichas muestras de sangre. En una modalidad, un ensayo de anticuerpo comprende exponer cada una de dichas muestras de sangre a un antígeno viral para con ello permitir que un complejo inmune de antígeno-anticuerpo se forme y detecte dicho complejo inmune de antígeno de anticuerpo. En una modalidad, la detección del complejo inmune de antígeno-anticuerpo es semi-cuantitativa.

En una modalidad, se agrega el antígeno al cultivo para acortar el tiempo de incubación y proporcionar diagnóstico in situ. En otra modalidad, el complejo inmune de antígeno-anticuerpo se detecta en un soporte de fase sólida, vehículo, o base sólida, que en una modalidad, es una banda de nitrocelulosa, un grupo de perlas etiquetadas o coloreadas, o cualquier otro vehículo. En una modalidad, el portador puede comprender perlas con diferentes densidades, tamaños, etiquetas, colores, florescencia, como se conoce en la técnica.

En una modalidad, después de incubación, se toma una alícuota del sobrenadante y entonces se ensaya para la presencia de anticuerpos deseados utilizando ELISA rápida estándar, análisis de tinción Western, un flujo lateral, un sello de inmunofluorescencia, y/o cualquier otro sistema de detección anticuerpo, que en una modalidad es una quimioluminiscencia, luminiscencia, o sistema de circuito. En una modalidad, el ensayo es un inmunoensayo de enzima (EIA) que incluye ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA), ensayo de aglutinación de partícula o ensayo de inmunofluorescencia (IFA).

En una modalidad, el ensayo de anticuerpo es un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, un ensayo de quimioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, y un ensayo de inmunofluorescencia, un arreglo de péptido-circuito, o un arreglo de circuito de anticuerpo. En una modalidad, el ensayo de anticuerpo es cualquier ensayo semi-cuantitativo para anticuerpos de VIH conocidos en la técnica, total o específico.

Si se va a ensayar la muestra en una fecha posterior, puede recolectarse fluido de sobrenadante, congelarse y almacenarse.

Técnicas generales: a menos que se indique de otra forma, las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales técnica se describen y explican a través de la literatura en Fuentes tal como, Anticuerpos de E. Harlow y David Lañe (editores): un manual de laboratorio, Laboratorio de Cold Spring Harbour, (1988), y J. E. Coligan y otros (editores) Protocolos actuales en inmunología, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el día de hoy), y se incorporan aquí por referencia.

Métodos generales para detectar una infección por VIH: se han desarrollado muchas técnicas para detectar una infección por VIH. Al menos algunos de estos procedimientos están comercialmente disponibles en forma de "equipo" (kit). Muchas de las técnicas se describen generalmente en HIV: A Practical Approach (Volumen 1: Virology and Immunology. Ed. Jonathan Karn, IRL Press); AIDS Testing: A comprehensive guide to technical, medical, social, legal, and management issues (Ed. Gerald Schochetman and J. Richard George. 2.sup.nd Edición. Springer-Verlag, 1994); Gallo et al. (1986) y Mylonakis et al. (2000). Una vista general de al menos algunas de estas técnicas se proporciona a continuación. Además, al menos algunas de estas técnicas, incluyendo aquellas de la invención reclamada, pueden adaptarse fácilmente para realizarse utilizando nanocristales tal como aquellos descritos en WO 00/27365, Patente de E.U.A. No. 6,207,392, Nolan y Sklar (2002), y Han y otros (2001).

Metodología de Inmunoensayo de Enzima (EIA) o Ensayo con Inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA): se han utilizado sistemas de detección de ELISA comúnmente en EIA durante muchos años en la detección de infección de VIH al mostrar la presencia anticuerpos anti-VIH. Además, existen muchos fabricantes con licencia de EIA y ELISA para detectar anticuerpo para VIH. La sensibilidad de EIA de tercera generación está cerca de 100% cuando cualquier anticuerpo anti-VIH está presente en sangre periférica. Sin embargo, estos ensayos no pueden diferenciar entre las etapas tempranas de infección e infección establecida.

La metodología de EIA involucra los siguientes pasos. Se purifican antígenos de VIH de lisado viral, preparado por tecnología de ADN recombinante o síntesis de péptido y se revisten sobre las cavidades de placas de micro cavidad o sobre otras mezclas tales como perlas para formar la "fase sólida" del ensayo. El suero de un individuo se agrega a la cavidad. El anticuerpo, si está presente, reacciona con el antígeno, y los otros contenidos de cavidad entonces se lavan. Un reactivo indicador que consiste de un anticuerpo anti-humano unido a una enzima u otro sistema de detección se agrega a la cavidad. Si el suero contuvo anticuerpos específicos de VIH, estos permanecerán unidos al antígeno de fase sólida, y el anticuerpo anti-humano conjugado a enzima se fijará a estos anticuerpos y de esa forma la fase sólida. Continúa otro paso de lavado. Si el suero del individuo contiene anticuerpo a VIH, las enzimas permanecen unidas a través del anticuerpo a la fase sólida y está disponible para catalizar una reacción que produce color cuando se agrega un sustrato apropiado a la cavidad. Se envía el cambio de color en un espectrofotómetro. Valores de absorbancia sobre un valor recortado calculado de muestras de control se consideran reactivos. Dentro del rango lineal (o reactivo) del ensayo, los valores de absorbancia están directamente relacionados con los niveles de anticuerpos en la muestra probada.

Esta metodología básica ha sido adaptada para abarcar una amplia variedad de formatos de ensayo incluyendo, tanto ensayos de captura de antígeno como de anticuerpo así como ensayos de competencia de antígeno de anticuerpo.

Inmuno transferencias (tinciones Western y otras pruebas de antígeno): las pruebas son otra forma de EIA que se han utilizado comúnmente para establecer la presencia de verdaderos anticuerpos anti-VIH. Están disponibles varios equipos comercialmente producidos. Ciertas pruebas pueden utilizarse en una forma semi-cuantitativa.

Ensayo de aglutinación de partícula: partículas de látex etiquetadas de antígeno o anticuerpo, sepharose, microcápsulas de poliuretano, oro coloidal o glóbulos rojos se han empleado para producir un amplio rango de ensayos de inmuno-aglutinación. Las partículas pueden obtenerse comercialmente con un gran rango de químicas de superficie permitiendo gran flexibilidad cuando se acoplan a ellas cualquier anticuerpo o antígeno. Éstas técnicas se utilizan típicamente en formatos de ensayo rápido que usualmente se califican visualmente, pero también están adaptados a automatización y semi-cuantificación.

Ensayo de Inmunof luorescencia (IFA) El IFA para anticuerpo de VIH es técnicamente más demandante y más costoso que las tinciones Western. Debido a que todos los antígenos presentes en una célula infectada están disponibles para reacción con el espécimen de prueba, es un ensayo muy sensible. Es un procedimiento familiar para muchos laboratorios debido a que se utiliza para detectar anticuerpos para una gran variedad de antígenos virales y bacterianos.

Básicamente, la técnica involucra los siguientes pasos. Una suspensión de un cultivo de célula de linfocito infectado con VIH se coloca sobre una placa de microscopio, se seca al aire, y se fija en acetona o metanol. Se agregan células de control no infectadas a la suspensión o se colocan en puntos separados sobre la placa para proporcionar un medio para detectar reacciones no específicas (placas fijas pueden estar hechas en grandes lotes y almacenarse congeladas o desecadas). Se agregan sueros de prueba diluidos a los puntos de célula, la placa se lava, se incuba de nuevo con globulina anti-humana conjugada con fluoresceína, se lava de nuevo, y luego se inspecciona para fluorescencia de fluoresceína utilizando un microscopio ultravioleta.

La fluorescencia localizada típica de células infectadas ocurre después de reacción con suero positivo. Ocurre poca o ninguna florescencia con suero negativo. Las reacciones no específicas (tales como aquellas causadas por anticuerpo antinuclear) se reconocen debido a la fluorescencia en células de control infectadas.

Radioinmunoprecipitación. El ensayo de radioinmunoprecipitación se utiliza principalmente en investigación. En general es demasiado demandante de forma técnica utilizar por rutina en laboratorios clínicos. La radioinmunoprecipitación es típicamente sensible para anticuerpos a glicoproteínas de cubierta mayores de peso molecular superior, gp160 y gp120, que algunas técnicas de tinción Western carecen. El principio de RIPA involucra unión competitiva de antígeno radiomarcado y antígeno no marcado a un anticuerpo de alta afinidad. El antígeno es generalmente etiquetado con un isótopo que emite gama alta como 25l. El antígeno marcado es mezclado con el anticuerpo a una concentración que justo satura los sitios de unión de antígeno de la molécula de anticuerpo, y entonces aumenta cantidades de antígeno no marcado y luego se agregan cantidades crecientes de antígeno no marcado de concentración desconocida. El anticuerpo no distingue antígeno marcado de no marcado, y también las dos clases de antígeno compiten por sitios de unión disponibles en el anticuerpo. Con concentraciones crecientes de antígeno no marcado, se desplazará más antígeno marcado de los sitios de unión. Al medir la cantidad de antígeno marcado libre en solución, es posible determinar la concentración de antígeno no marcado.

En una modalidad, las pruebas de VIH aprobadas por la FDA conocidas en la técnica incluyen, entre otros, Abbott HrVAB fflV-l BHV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL; ABBOTT PRISM HTV O Plus assay, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL; ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL; HPVAB HYV-1 EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL; Abbott RealTime HP - 1 Amplification Kit, ABBOTT Molecular, Inc., Des Plaines, IL; Avioq HrV-1 Microelisa System, Avioq Inc., Rockville, MD; Human Immunodeficiency Virus, Type 1 (HTV-1) Reverse Transcription (RT) Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay, BioLife Plasma Services, L.P., Deerfield, IL; I NSTFM HrV-1 Antibody Test Kit, bioLytical Laboratories Inc., British Columbia, Canadá V6V 2X7; GS rLAV EIA, Bio-Rad Laboratories Redmond, WA; Bio-Rad GS HTV Ag/Ab Combo EIA, Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA; GS HTV-1 Western Blot, Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA; GS HIV-l/HIV-2 Plus O EIA, Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA; GS HrV-2 EIA, Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA; Multispot HP/-1/HP/-2 Rapid Test, Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA; ViroSeq HP/-1 Genotyping System with the 3700 Genetic Analyzer, Celera Diagnostics, Alameda, CA; HP 1/2 STAT-PAK ASSAY, Chembio Diagnostic Systems, Inc., Medford, NY; SURE CHECK HP 1/2 ASSAY, Chembio Diagnostic Systems, Inc., Medford, NY; APTEV1A HP/-1 RNA Qualitative Assay, Gen-Probe, Inc., San Diego, CA; Home Access HP/-1 Test System, Home Access Health Corp., Hoffman Estates, IL; Cambridge Biotech HP/-1 Western Blot Kit, Maxim Biomedical, Inc., RockvMle, MD; Maxim Biotech HP/-1 Uriñe EIA, Maxim Biomedical, Inc., Rockville, MD; Reveal Rapid HP/-1 Antibody Test, MedMira Laboratories, Inc., Halifax, Nova Scotia, Canadá B3S 1B3; UltraQual HP/-1 RT-PCR Assay, National Genetics Institute, Los Angeles, CA; OraQuick ADVANCE Rapid HP/- 1/2 Antibody Test, OraSure Technologies, Bethlehem, PA; OraSure HP/-1 Oral Specimen Collection Device, OraSure Technologies, Bethlehem, PA; OraSure HP/-1 Western Blot Kit, OraSure Technologies, Bethlehem, PA; Ortho VITROS HP/-1/HP/-2, Ortho-Clinical Diagnostics, Inc, Raritan, NJ; COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HP/-1 Test, Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA; COBAS Ampliscreen HP/-1 Testl8, Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA; Roche Amplicor HP/-1 Monitor Test, Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA; Fluorognost HP/-1 IFA, Sanochemia Pharmazeutika AG, Vienna, Austria; AD VIA Centaur HP/ 1/0/2 Enhanced ReadyPack Reagents, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.; Trugene HP/-1 Genotyping Kit and Open Gene DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.; Versant HP/-1 RNA 3.0 (bDNA), Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.; Uni-Gold Recombigen HP/, Trinity Biotech, pie, Bray Co., Wicklow, Ireland En una modalidad, los términos "anticuerpo" y "inmunoglobulina" se utilizan aquí intercambiablemente. Estos términos son bien entendidos por aquellos expertos en la técnica, y se refieren a proteína glicosilada (que comprende porciones de azúcar) que consiste de uno o más polipéptidos que se une específicamente a un antígeno. Una f orma de anticuerpo constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste de dos pares idénticos de cadenas de anticuerpo, cada par tiene una cadena ligera y una pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada son responsables juntas de unirse a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras de anticuerpo.

El término "anticuerpo" también incluye cualquier molécula que contiene proteína o péptido que compren al menos una porción de la molécula de inmunoglobulina, tal como, pero no limitado a, una región de determinación de complementariedad (CDR) de una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de estructura, o cualquier porción de la misma. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse anticuerpos intactos a diferentes "clases". Existen cinco clases mayores de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgD, IgG, e IgM, y varios de estos además pueden dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. "Cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 kDa o aproximadamente 214 aminoácidos) comprenden una región variable de aproximadamente 110 aminoácidos en el término NH2 y una región constante kappa o lambda en el término se COOH. "Cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 50 kDa o aproximadamente 446 aminoácidos), similarmente comprenden una región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos) y una de las regiones o clases constantes de cadena pesada mencionadas anteriormente, por ejemplo, gama (aproximadamente de 330 aminoácidos). Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulina son bien conocidas. Cualquiera de estas modalidades puede utilizarse en la presente invención.

En una modalidad, un "antígeno" incluye una proteína de longitud completa, un derivado de una proteína de longitud completa, tal como pero no limitado a, un fragmento de proteína o un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácido correspondiente a una parte o partes de una proteína de longitud completa, incluyendo cualquier fragmento modificado o péptido sintético que tiene un ligando unido a éste.

En una modalidad, el paso de estimulación en los métodos de la presente invención comprende incubar una segunda alícuota de las muestras de sangre de sujetos en un medio que comprende un activador de células específicas de microbio. En la modalidad, el paso de estimulación comprende inducir activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica. En una modalidad, el paso de estimulación comprende inducir activación específica de VIH de células mononucleares de sangre periférica. En otra modalidad, el paso de estimulación comprende inducir activación policlonal de linfocitos. En una modalidad, las células específicas de virus son I i nf o cito s B. En otra modalidad, las células específicas de virus son linfocitos T.

En una modalidad, una muestra de sangre activada comprende tanto anticuerpos producidos en vivo como anticuerpos producidos por estimulación in vitro.

En una modalidad, un activador es un estimulante. En una modalidad, una alícuota de una muestra de tejido se estimula, mientras en otra modalidad, se activa.

En una modalidad, el activador de la presente invención estimula sangre para producir anticuerpos antimicrobianos, mientras en otra modalidad, el activador estimula sangre para secretar anticuerpos antimicrobianos.

En una modalidad, un "activador" para usarse en las composiciones y métodos de la presente invención es una sustancia o molécula que induce la activación de linfocitos, que es, en una modalidad, un linfocito pequeño, que en una modalidad, es una célula B, una célula T, o una combinación de los mismos en la muestra de tejido. En una modalidad, las células B, células T, o combinación de las mismas, se ceban in vivo. En otra modalidad, Células B o T están en el estado "blasto" en la muestra de tejido, o en o tra modalidad, las células B o T son células de memoria en la muestra de tejido. En una modalidad, la sustancia o molécula es una proteína, mientras en otra modalidad, es un péptido, una molécula de ácido nucleico, una glicoproteína, etc. En una modalidad, "activación" de células comprende inducir proliferación de células, diferenciación de células, mejora de actividad celular (en una modalidad, producción de anticuerpo), secreción de varias linfocinas y/o citocinas, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el activador para usarse en las composiciones y métodos de la presente invención activa células no secretoras, en una modalidad, o células no completamente activadas, en otra modalidad, o células no completamente diferenciadas, en otra modalidad, o células de memoria, en otra modalidad.

En una modalidad, el activador es un mitógeno. En una modalidad, un "mitógeno" es una sustancia química, o una mezcla de sustancias. En una modalidad, un mitógeno es una o más proteínas, glícoproteínas, o una combinación de varias proteínas y glicoproteínas con o sin otras porciones bioquímicas, que alienta a una célula a comenzar la división celular, activando la mitosis. En una modalidad, un mitógeno activa trayectorias de transducción de señal en donde se involucra proteína cinasa activada por mitógeno, conduciendo a mitosis. En una modalidad, los mitógenos de la presente invención se utilizan para inducir mitosis en y/o activación de células B y/o células T. En una modalidad, los mitógenos de la presente invención se utilizan para inducir la formación de células blásticas que secretan anticuerpo, o células de plasma, de células B de diferenciación inducida y/o células B de memoria.

En una modalidad, el activador de las composiciones y métodos de la presente invención inducen la activación de células B o T sin secreción que son específicas para microbios o virus de interés. En otra modalidad, el activador de la presente invención induce la expresión de anticuerpos específicos virales. En otra modalidad, el activador de la presente invención induce la transferencia de células B sin secreción para secretar células B, que en una modalidad, son células blásticas o de plasma.

En una modalidad, un activador utilizado en los métodos y equipos de la presente invención mejora la división de célula blástica, que en una modalidad, mejora la producción de anticuerpos y, en otra modalidad, mejora diferenciación de células B en células de plasma. En otra modalidad, un activador utilizado en los métodos y equipos de la presente invención mejora la división de célula blástica, mejora la producción de anticuerpos, mejora diferenciación de células B en células de plasma, o una combinación de los mismos. En una modalidad, los blastos de célula B activados secretan anticuerpos y se someten a división celular. En una modalidad, las células de plasma secretan anticuerpo y no proliferan.

En una modalidad, se utilizan antígenos virales en conjunto con activadores para inducir la activación de células B no secretoras. De esa forma, en una modalidad, las composiciones de la presente invención comprenden adicionalmente uno o más antígenos específicos para el virus de interés que, en una modalidad, ayuda o mejora la transferencia de células B y T no secretoras a células B y/o T secretoras, que en una modalidad, son células blásticas o de plasma. Similarmente, los métodos de la presente invención pueden comprender incubar una muestra de tejido en un medio que contiene un mitógeno y uno o más antígenos virales.

En un aspecto relacionado, el activador utilizado en la invención aquí proporcionada puede ser dependiente de célula T o independiente de célula T. En una modalidad, el activador utilizado en las composiciones y métodos de la presente Invención actúa en células T, Células B, o tanto células T como células B. En un aspecto relacionado, el activador utilizado para inducir activación de células B no secretoras y la expresión de anticuerpos específicos y virus es un mitógeno, que en una modalidad, es un mitógeno de la hierba de carmín, en una modalidad, estimula tanto células B, como T. Pueden utilizarse otros mitógenos para practicar la presente invención e incluyen, pero no están limitados a, lectinas, tales como, concanavalina A, que en una modalidad actúa en células T; endotoxinas b acterianas, que en una modalidad, es lipopolisacárido (LPS), que en una modalidad, actúa en células B. En otra modalidad, el mitógeno es fitohemaglutlnina (PHA), que en una modalidad, actúa en células T. En otra modalidad, el mitógeno es aglutinina (PHA-L), mientras en otra modalidad, el mitógeno es aglutinina de pisum sativum (PSA).

En otra modalidad, el activador utilizado en la composición y métodos de la presente invención es una citosina, que en una modalidad es una molécula de señalización secretada por células específicas del sistema inmune y células gliales. En una modalidad, dicha citosina es una interleucina o interferón. En una modalidad, la citosina es una linfocina. En una modalidad, dicha linfocina es Interleucina 1, Interleucina 2, Interleucina 3, Interleucina 4, Interleucina 5, Interleucina 6, Interleucina 10, Interleucina 12, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago, interferón-gamma, o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, el activador utilizado en la composición y métodos de la presente invención es un lípido A bacterialmente derivado, un péptido derivado de viral, un virus, un agente biológico, un reactivo de anti-inmunoglobulina, un anticuerpo contra una dominio celular de linfocito B y/o T, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el activador utilizado en la composición y métodos de la presente invención es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citosina, o una linfocina. En otra modalidad, el activador viral puede ser una combinación de los activadores aquí descritos.

En un aspecto relacionado, la estimulación de célula se logra al utilizar anticuerpos contra dominios de membrana celular. En otra modalidad, las células son estimuladas al utilizar anticuerpos contra un dominio celular del linfocito B, que en una modalidad es un dominio celular de linfocito B de membrana. En una modalidad, el anticuerpo es anti-lgD, que en una modalidad, se expresa por membrana por: células B ingenuas, células B inicialmente cebadas, y células de memoria. En una modalidad, las células de plasma no expresan la membrana I g D . En una modalidad, las células B cebadas que no han diferenciado completamente de células de plasma pueden estimularse o activarse al hacer contacto con IgD. En otra modalidad, el anticuerpo es anti-IgM. En otra modalidad, el anticuerpo está dirigido contra un dominio celular (CD) de célula B. En otra modalidad, el anticuerpo está dirigido contra un CD de célula T.

En una modalidad, el dominio celular de linfocito B de membrana es IgG, IgA, IgE, CD19, o cualquier otra estructura/dominio de membrana conocido en la técnica. En otra modalidad, el dominio celular de linfocito B de membrana es CD21 o CD81.

En una modalidad, el anticuerpo para usarse en los métodos y composiciones de la presente invención comprende anti-lgD, anti-IgG, anti-lgA, anti-lgE, o anti-CD19, o anti-CD10, anti-CD23, anti-CD25, y anti-CD40.

En una modalidad, la clase de anticuerpo utilizada para estimular una célula no secretara incluye, pero no está limitado a, un anticuerpo de la clase IgM, IgG (por ejemplo, I g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4,), IgD, IgA, o IgE.

En otro aspecto, la estimulación de células B no secretoras, que en una modalidad, son células de memoria, las células B secretoras, que en una modalidad, son células blásticas o de plasma resulta en la transformación de la célula a una célula blástica secretora de anticuerpo o de plasma, por lo cual la célula blásticas o de plasma secreta anticuerpos específicos de antígeno.

En un aspecto relacionado, el linfocito B de los métodos aquí proporcionados es una célula linfocítica B no secretora. En otro aspecto relacionado, el linfocito T es una célula linfocítica T no secretora. Incluso en otro aspecto relacionado, el activador aquí proporcionado activa una célula linfocítica B no completamente activada. En otra modalidad, el activador activa una célula linfocítica T no completamente activada, y en otra modalidad el activador activa tanto células T como B.

En una modalidad, la determinación de incidencia de la presente invención tiene una índice reciente falso bajo. En una modalidad, el índice reciente falso está bajo 10%. En otra modalidad, el índice reciente falso está bajo 5%. En otra modalidad, el índice reciente falso está bajo 4%. En otra modalidad, el índice reciente falso está bajo 3%. En otra modalidad, el índice reciente falso está bajo 2%. En otra modalidad, el índice reciente falso está bajo 1%.

En otra modalidad, la determinación de incidencia de la presente invención tiene una duración de recencia media alta. En una modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente un año. En otra modalidad, la duración de recencia media es de aproximadamente 11 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 10 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 9 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 8 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 7 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 6 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 5 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 4 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 3 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 2 meses. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 1 mes. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 70 días. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 60 días. En otra modalidad, la duración de recencia media e s aproximadamente 45 días. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 30 días. En otra modalidad, la duración de recencia media es aproximadamente 14 días. De esa forma, en una modalidad, se clasificará una infección como reciente para propósitos epidemiológicos-estadísticos si ocurrió dentro de uno de los marcos de tiempo descritos aquí anteriormente.

En una modalidad, el SI se calcula ú nicamente para muestras que se han sometido a seroconversión. En una modalidad, el SI se calcula únicamente para muestras en las cuales la alícuota no estimulada (en una modalidad, la primera alícuota) dio resultados sobre el recorte del ensayo de anticuerpo anti-retroviral. En otra modalidad, el SI se calcula para todas las muestras, sin importar si la alícuota no estimulada (en una modalidad, la primera alícuota) dio resultados sobre el recorte del ensayo de anticuerpo anti-retroviral.

En una modalidad, la recencia media de infección de v irus en dicha población se determina. De acuerdo con este aspecto y en una modalidad, la recencia estadística para cada muestra es días, semanas, meses, o años y se calcula con base en la relación de niveles de anticuerpo anti-retroviral estimulado y no estimulado, y la recencia media de la población se calcula como se conoce en la técnica.

En una modalidad, el índice de estimulación (SI) describe la relación de niveles de anticuerpo estimulado a no estimulado. En una modalidad, el SI medio en una población se utiliza para determinar el cambio en incidencia de nuevas infecciones de VIH en una población, en donde el SI medio en una población para un año específico se compara con el SI medio para la población en uno o más años previos, en donde, si el SI medio ha aumentado, es una indicación que ha existido un aumento en nuevas infecciones en la población, y en donde si el SI medio ha disminuido, es una indicación que ha existido una disminución de nuevas infecciones en la población.

En una modalidad, se elige un umbral de SI que proporciona un índice reciente falso bajo. En una modalidad, el umbral de SI es 1.5. En otra modalidad, el umbral de SI es 1.4. En otra modalidad, el umbral de SI es 1.3. En otra modalidad, el umbral de SI es 1.2. En otra modalidad, el umbral de SI es 1.1. En otra modalidad, el umbral de SI es 1.0. En otra modalidad, el umbral de SI es 0.95.

En una modalidad, un método de la presente invención comprende un paso de estimulación que comprende incubar dicha muestra en un dispositivo utilizando cualquier tecnología de inmuno-estimulación conocido en la técnica.

En una modalidad, el dispositivo que utiliza una tecnología de inmuno-estimulación es un tubo de cultivo de tejido comercialmente disponible con un medio especial que mejora la producción de anticuerpo in vitro en una muestra de sangre entera. Tan pronto como existen, por ejemplo, células B cebadas de VIH en la sangre, (es decir, dentro de días de infección por VIH), es posible obtener anticuerpos anti-VIH producidos por ellos in vitro, a niveles detectables por los equipos actualmente disponibles. La serología actual mide los niveles de anticuerpos específicos de VIH en la muestra de sangre. Estos niveles son anticuerpos producidos in vivo. El pre-tratamiento de la muestra de sangre en el tubo de cultivo produce una muestra de plasma que la contiene, además de anticuerpos en el plasma, los anticuerpos producidos in vitro, durante el paso de cultivo. Los anticuerpos contra VIH pueden inducirse in vitro (producirse por células B cebadas por VIH) dentro de I os días después de infección y antes de su aparición/detección en la sangre. Esto permite la detección temprana de la infección, utilizando los ensayos y equipos actualmente disponibles para la detección de anticuerpo. De esa forma, utilizando el plasma estimulado como la muestra probada da una mejor medida de prevalencia. Estudios clínicos han concluido en varios países alrededor del mundo mostrando sensibilidad de diagnóstico mejorada al utilizar plasma estimulado.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de nuevas infecciones virales en una población que comprende: un contenedor para recolectar muestras de sangre entera, en donde el contenedor comprende un medio que comprende un activador de células T y/o B específicas para dicho virus, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de virus, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de nuevas infecciones virales en una población que comprende: un contenedor para recolectar muestras de sangre entera, en donde el contenedor comprende un medio que comprende un activador de linfocitos específicos de virus o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de virus, e instrucciones para uso.

En una modalidad, el ensayo de los equipos de la presente invención comprende un medio para la detección de anticuerpos específicos de virus y anticuerpos no específicos, como se conoce en la técnica.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de nuevas infecciones por VIH en una población que comprende: un contenedor para recolectar muestras de sangre entera, en donde el contenedor contiene un medio que contiene un activador de células T y/o B específicas para dicho VIH, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de nuevas infecciones por VIH en una población que comprende: un contenedor para recolectar muestras de sangre entera, en donde el contenedor comprende un medio que comprende un a ctivador de linfocitos específicos y/o no específicos para dicho VIH, un ensayo para la semi-cuantificación de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de infecciones patogénicas en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de tejido, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos de patógeno específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de patógenos, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la distribución de infecciones patogénicas de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de tejido, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de patógeno o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de patógeno, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodef ¡ciencia humana (VIH) en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende una o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar la distribución de infecciones de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

En una modalidad, el ensayo en los equipos aquí descritos puede comprender un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de patógeno y no específicos, en donde en una modalidad, el patógeno es un virus, un retrovirus, un VIH. En una modalidad, los anticuerpos no específicos proporcionan un parámetro útil cuando se calcula el SI de los anticuerpos específicos.

En una modalidad, las instrucciones comprenden algoritmos para calcular el valor de umbral de SI, etc., como se describe aquí (por ejemplo, determinar el umbral como el valor medio de 60% o 70% u 80% o 95% de la población probada total (seropositivo)).

En una modalidad, el ensayo de los equipos de la invención además comprende un medio para la detección de anticuerpos no específicos como un control (por ejemplo IgM total o IgG total).

En una modalidad, el ensayo de los equipos de la invención además comprende muestras de tejido de una población de interés, que, en una modalidad, son muestras de sangre.

En una modalidad, los equipos de la presente invención pueden comprender una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar un método de la invención. En una modalidad, el equipo puede comprender reactivos adecuados para detectar un antígeno de VIH etiquetado. Por ejemplo, cuando la etiqueta es una enzima, el equipo incluirá sustratos o co-factores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectables). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, reguladores de pH y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan substancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

El antígeno de VIH para usarse en equipos de la presente invención puede proporcionarse/obtenerse de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, el antígeno de VIH puede producirse utilizando métodos recombinantes tales como aquellos conocidos en la técnica. Alternativamente, el antígeno de VIH puede comprarse de un proveedor comercial.

En una modalidad, el contenedor del equipo de la presente invención es para retener muestras de tejido, o en otra modalidad, retener, procesar, almacenar, mantener o recolectar muestras de tejido.

Los equipos también se proporcionan para que útiles como un control positivo para los ensayos de diagnóstico. Para aislamiento y purificación de anticuerpos antivirales, el equipo puede contener proteínas/antígenos virales acoplados a perlas (por ejemplo, perlas de sepharose o nano-perlas u otras nano-estructura-). Los equipos pueden proporcionarse y contienen los anticuerpos para la detección y cuantifícación de anticuerpos antivirales in vitro, por ejemplo en una ELISA, micro-disposición de péptido, bio-chip, o tinción Western. Como con el artículo de fabricación, el equipo comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el contenedor. El contenedor retiene una composición que comprende al menos un antígeno reconocido por los anticuerpos antivirales. Los contenedores adicionales pueden incluirse y contienen, por ejemplo, diluyentes y reguladores de pH, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de paquete puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico deseado.

En ciertas modalidades, los equipos pueden suministrarse con materiales de instrucción. Las instrucciones pueden imprimirse en papel u otro sustrato, y/o pueden suministrarse como un medio legible electrónico, tal como un disco flexible, mini-CD-ROM, CD-ROM, DVD-ROM, disco Zip, videocinta, cinta de audio, y similares. Las instrucciones detalladas pueden no estar asociadas físicamente con el equipo; más bien, puede dirigirse a un usuario a un sitio web de Internet especificado por el fabricante o distribuidor del equipo.

El método de la presente invención incluye opcionalmente separar los hematocitos de la porción de fluido de la sangre para que pueda determinarse la presencia de anticuerpos, o la presencia de células que producen anticuerpos. La separación de los hematocitos de la porción de fluido de la sangre puede hacerse mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo centrifugación o sedimentación dependiente de densidad. En una modalidad, los hematocitos no están físicamente separados del fluido. En otra modalidad, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos B y linfocitos T pueden ser separados de la sangre antes de cultivo y ensayo. Los métodos de enriquecimiento de célula B y célula T son bien conocidos en la técnica y pueden llevarse a cabo por métodos que incluyen, pero no están limitados a, sedimentación dependiente de densidad, y/o clasificación de célula/FACS. Después de incubación del tejido con el mitógeno, el fluido desde la parte superior de la sangre puede extraerse y probarse fácilmente para anticuerpo. Opcionalmente, los glóbulos rojos pueden lisarse ya sea por choque osmótico suave o con un detergente suave. De esta forma, los glóbulos blancos permanecen viables. Otro método sería sedimentar los glóbulos blancos a través de densidad, o gradiente de densidad.

Generalmente, los resultados de una prueba o ensayo de acuerdo con la invención pueden presentarse en cualquiera de una variedad de formatos. Los resultados pueden presentarse en una forma cualitativa. Por ejemplo, el reporte de prueba puede indicar únicamente si se detectaron anticuerpos específicos de virus particulares o no, tal vez también con una indicación de los límites de detección. Los resultados pueden presentarse en una forma semi-cuantitativa. Por ejemplo, pueden definirse varios rangos, y los rangos pueden asignarse con una puntuación (por ejemplo, 1+ a 4+) que proporciona cierto grado de información cuantitativa. Tal puntuación puede reflejar varios factores, por ejemplo, el número de virus detectado, la intensidad de la señal (que puede indicar el nivel de expresión de células B específicas de virus, o células T), etc. El resultado puede presentarse en una forma cuantitativa, por ejemplo, con un porcentaje de las células en donde se detectan los anticuerpos específicos de virus, como una concentración de anticuerpo específica viral (según determinado a través de ensayo de unión/detección de anticuerpo diferente), etc. Como se apreciará por un experto en la técnica, el tipo de salida proporcionado por una prueba variará dependiendo de las indicaciones técnicas de la prueba y la importancia de la lógica asociada con detección.

En una modalidad de la presente invención, se recolecta sangre entera en un tubo de recolección de sangre que contiene medio de cultivo y mitógeno. Las muestras de sangre entonces se incuban con una dilución final de aproximadamente 1:50-1:500 de mitógeno de de la hierba de carmín a una concentración de 0.1x106 de células viables por mililitro durante 4 días a 37°C en una atmósfera humedecida de C02 al 3-10%. La sangre entonces se centrífuga y el fluido sobrenadante se recolecta y ensaya con aproximadamente 24 horas para anticuerpos reactivos por ELISA, flujo lateral, y/o técnicas de prueba. En la alternativa, puede tomarse una alícuota de fluido directamente de la muestra. Cada muestra debe filtrarse por anticuerpo por flujo lateral (prueba Rápida) o E LISA p rimero, luego pueden someterse muestras consideradas positivas a una prueba adicional, por ejemplo análisis de prueba.

En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden los pasos descritos. En otra modalidad, los métodos de la presente invención consisten esencialmente de los pasos descritos. En otra modalidad, los métodos de la presente invención consisten de los pasos descritos. En una modalidad, las composiciones de la presente invención, que en una modalidad, son equipos comprenden dos elementos descritos. En otra modalidad, las composiciones de la presente invención, que en una modalidad, son equipos que consisten esencialmente de los elementos descritos. En otra modalidad, las composiciones de la presente invención, que en una modalidad, son equipos que consisten de los elementos descritos.

En una modalidad, los métodos y equipos de la presente invención pueden utilizarse en conjunto con otros métodos para determinar la incidencia de infección retroviral conocida en la técnica.

EJEMPLO 1 Prueba para infección por VIH Reciente Utilizando Dispositivos de Estimulación Una infección por VIH que está en su Periodo de Ventana Seronegativa, principalmente el periodo entre adquirir la infección y el tiempo de seroconversión en el cual los niveles de anticuerpo han alcanzado niveles medibles, es indetectable por pruebas de diagnóstico tales como ensayos con inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)/inmunoensayo de enzima (EIA). Para mitigar el efecto de este Periodo de Ventana Seronegativa al producir resultados negativos falsos, se desarrollaron métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación para mejorar la detección de anticuerpo cuando se utilizan pruebas de diagnóstico de VIH existentes. Los métodos d e estimulación y lo dispositivos de estimulación innovadores estimulan células inmunes específicas cebadas in vivo para producir anticuerpos in vitro, que resultan en niveles de anticuerpo que alcanzan niveles detectables más pronto después de la infección, y por lo tanto reducen el Periodo de Ventana Seronegativa, como se ilustra en la Figura 1.

Una característica inesperada de los métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación es que los niveles de anticuerpo aumentados en un espécimen de sangre incubado en métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación comparados con especímenes de sangre de control se desvanecen con el tiempo después de seroconversion (Figura 1). La comparación de los niveles de anticuerpo en plasma y plasma estimulado pueden llevar a distinguir seroconversion reciente de infecciones más antiguas, por el aumento en niveles de anticuerpo encontrados en el plasma estimulado (el Indice de Estimulación). Los niveles de anticuerpo aumentados en las etapas tempranas de seroconversion se derivan del hecho que la producción de anticuerpo in vivo no es una fuerza completa, y de esa forma la activación adicional in vitro lleva a niveles superiores de anticuerpos en el plasma estimulado. Posteriormente, la activación inmune y producción de anticuerpos están en niveles tan altos en el cuerpo que los niveles de anticuerpos medidos en el plasma estimulado no difieren de esos en el plasma regular.

Por lo tanto, el Indice de Estimulación (SI), definido como la relación de niveles de anticuerpos estimulados a no estimulados, medida por un ensayo semi-cuantitativo puede utilizarse como un biomarcador novedoso para probar infección reciente. Las características de desempeño potenciales de un TRI utilizando métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación se investigaron, utilizando un grupo de datos capturados por los Centros para Control y Prevención de Enfermedad (CDC) y el Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos en Beijín (NICBPB) en individuos en varias regiones de China.

Métodos: Se recolectaron muestras de sangre en heparina de >350 usuarios de fármaco intravenoso (IDU) en China y se llevó al laboratorio local del Centro para Control de Enfermedad (CDC). Se transfirió 1 mi de sangre a un método de estimulación y/o dispositivo de estimulación dentro de 24 horas después de recolección y se incubó durante 5 días en C02 al 5%, incubadora de 37°C, generando plasma estimulado. El plasma restante se recolectó y almacenó. El plasma estimulado y el plasma corrieron, en paralelo, en el mismo equipo de ELISA, y se registraron lecturas de O.D. Se utilizó plasma de sujetos seropositivos para VIH en los siguientes análisis.

Datos: muchas muestras en esta población de muy alto riesgo, mostraron un Indice de Estimulación de >1.5 (indicando niveles superiores de anticuerpos anti-VIH en el plasma estimulado contra plasma regular, Figura 2), que es consistente con reportes independientes de alta prevalencia e índices de incidencia en esta población.

En contraste, en poblaciones separadas, ninguna de las muestras en cualquier población tuvieron un Indice de Estimulación (SI) >1.2 (Figuras 3A-3B), que es consistente con reportes independientes que describen las infecciones en esta población como siendo debido a mala práctica médica 5 años antes del inicio del estudio.

EJEMPLO 2 Distribución de Indice de Estimulación (SI) La información epidemiológica basada en los SI de varias poblaciones demuestra que las infecciones que tienen un largo período asintomático se caracterizan por una distribución de SI como se muestra en la Figura 4, mientras las infecciones que tienen un período asintomático corto se caracterizan por una distribución de SI como se muestra en la Figura 7. Las poblaciones con una alta incidencia de infecciones recientes se caracterizan por una distribución SI predispuesta hacia una proporción mayor de altos valores de SI (Figura 5), mientras las poblaciones caracterizadas por infecciones antiguas, o de etapa tardía se caracterizan por una proporción más grande de bajos valores de SI (Figura 6).

Los datos de mundo real soportan los modelos mostrados en las Figuras 5-6, demostrando que las poblaciones que son conocidas por tener un gran número de infecciones de etapa tardía tienen una distribución de valores de SI como se muestra en el modelo de la Figura 6 (Figuras 8-9), mientras la distribución de valores de SI en poblaciones chinas y húngaras con un índice de incidencia muy alto refleja el modelo mostrado en la Figura 5 (Figuras 10-11).

Aunque ciertas características de la invención han sido mostradas y descritas aquí, muchas modificaciones, sustituciones, cambios, y equivalentes ocurrirán ahora para aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, se entenderá que las reivindicaciones anexas pretenden cubrir todas esas modificaciones y cambios para que caigan dentro del verdadero espíritu de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende los pasos de: a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación posterior del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; c) estimular la segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; f) determinar si el SI obtenido en el paso (e) para cada muestra está sobre un valor de umbral predeterminado, en donde un valor bajo dicho umbral indica que la muestra no se infectó recientemente y un valor sobre dicho umbral indica que la muestra se infectó recientemente; y g) calcular el número medio de muestras recientemente infectadas dividido entre el producto de número de muestras en la Duración de Recencia Media para dicho umbral, por lo cual se determina la incidencia de infecciones por VIH en dicha población.

2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dichas muestras de tejido en el paso (c) en un medio que comprende uno o más activadores de células específicas de VIH.

3.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dichas muestras de tejido en el paso (c) en un medio que comprende uno o más activadores de células inmunes.

4. - El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho activador es un mitógeno.

5. - El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

6.- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citosina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

7.- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dichas células inmunes son línfocitos B.

8. - El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dichas células inmunes son linfocitos T.

9. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende inducir activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica.

10. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende inducir activación específica de VIH de células mononucleares de sangre periférica.

11. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido estimulado del paso (c) comprende anticuerpos producidos in vivo y anticuerpos producidos por estimulación in vitro.

12. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH comprende realizar un ensayo de anticuerpo en cada alícuota de dichas muestras de tejido.

13. - El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende exponer cada uno de dichas muestras de tejido a un antígeno de VIH con lo cual permite que se forme un complejo inmune de antígeno-anticuerpo y se detecte dicho complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

14. - El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho ensayo de anticuerpo son ensayos semi-cuantitativo.

15. - El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho ensayo anticuerpo comprende un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, un ensayo de químioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, o un ensayo de inmunofluorescencia, un arreglo de péptido-circuito, o un arreglo de circuito de anticuerpo.

16. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el SI es calculado al calcular la relación de niveles de anticuerpo anti- VIH estimulado a no estimulado.

17. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el SI es calculado al calcular la diferencia entre niveles de anticuerpo anti-VIH estimulado y no estimulado.

18.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas muestras de tejido son muestras de sangre entera.

19. - Un equipo para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

20. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho ensayo comprende un antígeno de VIH al cual se exponen dichas muestras de sangre, por lo cual se permite que se forme y se detecte un complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

21. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho ensayo de semi-cuantitativo.

22.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho ensayo comprende un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, o un ensayo de inmunofluorescencia, un ensayo de quimioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, un arreglo de péptido-circuito, o una arreglo de circuito de anticuerpo.

23.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho activador es un mitógeno.

24. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

25. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citosina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

26.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dichos linfocitos son linfocitos B.

27. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dichos linfocitos son linfocitos T.

28. - Un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende los pasos de: a) obtener muestras de tejido de un número representativo de sujetos en dicha población; b) separar una primera alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para determinación subsecuente del nivel de anticuerpo anti-VIH inicial; c) estimular una segunda alícuota de cada una de dichas muestras de tejido para producir anticuerpos anti-VIH in vitro; d) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dichas primeras y segundas alícuotas de cada una de dichas muestras de tejido; e) calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido de dicha segunda alícuota en el paso (c) y el valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH inicial obtenido de dicha primera alícuota en el paso (c) para cada muestra; f) graficar los valores del SI obtenido en el paso (e) para que las muestras determinen la distribución de infecciones de etapa reciente, no reciente, y tardía, en donde las muestras con un valor de SI sobre un valor de umbral predeterminado tienen una infección reciente, las muestras con un valor de SI de dicho valor de umbral predeterminado aproximadamente tienen una infección no reciente, y las muestras seropositivas con un valor de SI menor que dicho valor de umbral predeterminado tienen una infección tardía, con lo cual se determina la distribución de infecciones por VIH de etapa reciente, no reciente, y tardía en dicha población.

29.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el SI es calculado al calcular la relación de niveles de anticuerpo anti-VIH estimulado a no estimulado.

30.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el SI es calculado al calcular la diferencia entre niveles de anticuerpo anti-VIH estimulado y no estimulado.

31. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, que además comprende el paso de calcular la relación de infecciones por VIH de etapa reciente, no reciente, y tardía a infecciones por VIH totales en dicha población.

32. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, que además comprende el paso de calcular el área bajo la curva (AUC) de la gráfica obtenida en el paso (f), en donde una AUC mayor sobre el umbral indica infecciones por VIH más recientes y una AUC mayor bajo el umbral indica más infecciones por VIH de etapa más tardía.

33. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dichas muestras de tejido en el paso (c) en un medio que comprende uno o más activadores de células específicas de VIH.

34. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dichas muestras de tejido en el paso (c) en un medio que comprende uno o más activadores de células inmunes.

35.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho activador es un mitógeno.

36.- El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

37.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citosina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

38.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dichas células inmunes son linfocitos B.

39. - El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dichas células inmunes son linfocitos T.

40. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de estimulación comprende inducir activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica.

41. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de estimulación comprende i nducir activación específica de VIH de células mononucleares de sangre periférica.

42.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la muestra de tejido del paso (c) comprende anticuerpos producidos in vivo y anticuerpos producidos por estimulación in vitro.

43. - El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho paso de determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH comprende realizar un ensayo de anticuerpo en cada alícuota de dichas muestras de tejido.

44. - El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende exponer cada una de dichas muestras de tejido a un antígeno de VIH con lo cual se permite que se forme un complejo inmune de antígeno-anticuerpo y detecte dicho complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

45. - El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicho ensayo de anticuerpo es un ensayo semi-cuantitativo.

46. - El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, un ensayo de quimioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, un ensayo de inmunofluorescencia, un arreglo de péptido-circuito, o un arreglo de circuito de anticuerpo.

47.- El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dichas muestras de tejido son muestras de sangre entera.

48.- Un equipo para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde uno de los contenedores comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos de VIH o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones para uso.

49.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicho ensayo comprende un antígeno de VIH al cual se exponen dichas muestras de sangre, permitiendo con ello que se forme y se detecte un complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

50.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicho ensayo es semi-cuantitativo.

51. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicho ensayo comprende un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, o un ensayo de inmunofluorescencia, un ensayo de quimioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, un arreglo de péptido-circuito, un arreglo de circuito de anticuerpo.

52. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicha activador es un mitógeno.

53. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 52, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

54. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citosina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

55. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dichos linfocitos son linfocitos B.

56. - El equipo de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dichos linfocitos son linfocitos T.