JPH07506429A - 血液凝固検定を行うためのテスト物品及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液凝固検定を行うためのテスト物品及び方法本発明は、一般的に血液凝固テス ト、そしてさらに特に、テスト物品であってこのような検定及びそのテスト物品 からの蛍光又は他の可視シグナルの生成に頼る方法に必要な試薬を含んで成るテ スト物品に関する。

血液凝固テストは、外科手術を経験した患者の出血可能性の測定及び皿洗（ｂｌ ｏｏｄ　ｃｌｏｔｓ）を防ぐための抗−血液凝固治療を経験した患者の監視を含 む様々な目的のために、行われることができる。様々な血液凝固テストが現在使 用されている。最も一般的なものの１つは、外因性血液凝固経路の誘導に頼る“ プロトロンビン時間”（ＰＴ）テストであり、そして他のものは、内因性血液凝 固経路の誘導に頼る”活性化部分トロンボプラスチン時間”（ＡＰＴＴ）テスト である。

外因性及び内因性血液凝固経路の両方が、フィブリノーゲンのフィブリンへの変 換を触媒するタンパク質分解酵素であるトロンビンの生産をもたらす。このよう な変換は、皿洗化機構における本質的な機能である。便利には、トロンビン生産 は、トロンビン角￥裂により活性化されたレポーター分子に解裂可能な状態で結 合された合成トロンビン基質ペプチドに患者の血液サンプルを晒すことによりモ ニターされることができる。レポーター分子は、観察可能な変化、例えば、着色 生産物又は蛍光を作り出し；そして（血液凝固能力の尺度である）トロンビン活 性が光学的手段により評価される。

これまで、このような血液凝固テストは、複雑である傾向を有しており、実施が 一般的に臨床的な実験室に限定されていた。このような集中的なテストは外科手 術患者に適当であることができるけれども、抗−血液凝固治療をモニターするた めに規則的に医院又はクリニックを訪ねることは、はとんど受入れられていない 。このように、便利且つ実用的な家庭用の（ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｈｏｍｅ）血 液凝固モニタリング・テストの必要性は、明らかある。

しかしながら、患者自身により投与される程十分に簡単である血液凝固テストを 案出することにおける技術的挑戦が、実質的なものである。テストは、非常に簡 単で、低コストで、丈夫でなければならず、そして広く変化する容量の全血によ る使用を許容しなければならない。家庭環境における血液サンプリングは、一般 的に、（指がスプリング−装填装置上に載せられた小さな針により刺されるよう な）“フィンガースティック（ｆ　ｉｎｇｅｒｓｔｉｃｋ）“法に限定されてお り、それは、一般的に５から３０μＩまてである比較的非制御の全血容量を作り 出す。さらに、血液凝固テストが室温において行われることができる場合に、骨 の折れる温度制御装置の必要性を取り除くことが望ましいであろう。

首尾よい家庭の血液テストは、他の化学物質、例えば、コレステロール及びグル コースのためには案出されている。家庭的使用に最も好適な装置の中には、所望 の分析を行うために適当に含浸された領域をもつ吸収材料の層を含んで成る”テ スト・ストリップ（ｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓ）’″が在る。例えば、Ｌｉｆｅｓｃ ａｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｉｌｐｉｔａｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手可能 な血液グルコース分析を行うためにテスト・ストリップは、適用された血液中の グルコース・レベルに応答する発色反応を作り出す浸潤試薬をもつポリアミド膜 に１滴の血液を適用することに頼っている。血液凝固能力を測定するための等価 なテスト装置は全く開発されていない。血液凝固を測定するための特定のテスト 物品が提案されているけれども、最も簡単なものでさえ、血液の前測定容量が適 用されなければならない多層を使用する。

血液凝固経路の性質は、単層テスト・ストリップ血液凝固検定の実行を問題の多 いものにしている。血液凝固は、一連の複雑且つよく分かっていない酵素反応で あって表面界面効果に高く感度のあるものを含んでいる。さらに、特定の材料と の血液の接触は、その血液凝固経路の誘導に必要な酵素を失活させることがてき る。したがって、はとんどの先の血液凝固検定は、上記血液凝固経路の不注意の 活性化又は阻害の見込みを減少させるために最小の表面積をもつ容器を使用して いる。これに反し、テスト・ストリップ検定は、一般的に、非常に大きな表面積 をもつ高く細孔性の材料内において行われる。したがって、このようなテスト・ ストリップ膜は、一般的に、血液凝固検定における使用のために禁忌を示される であろう。

先の理由のために、患者の血液凝固能力を測定するための単純化されたテスト物 品及び方法を提供することが望ましいであろう。このテスト物品及び方法は、訓 練を受けていない患者により、特に家庭内にある患者自身によりテストが行われ ることを許容するのに十分に簡単で且つ信頼できるものでなければならない。好 ましくは、このテストは、１段階だけ、例えば、血液の滴をテスト物品に適用し 、その後そのテスト結果を自動的に読むことを必要としなければならない。テス トは、血液サンプル容量における変化に感受性であってはならず、そして最小の 温度制御又は温度制御を全く伴わずに行われることができなければねらない。特 に、テスト・ストリップが測定される血液凝固経路に対し実質的に全く効果を及 ぼさない細孔性膜テスト・ストリップを使用するテスト物品及び方法を提供する ことが望ましいであろう。

２、　背景技術の説明 血液凝固検定における使用に好適なトロンビン基質は、米国特許第３．８８４． ８９６号及び第４．６４０．８９３号中に記載されている。カルシウム分離から 生じる改善された安定性をもつトロンボプラスチンの錠剤形態が、米国特許第４ ．７５５．４６１号中に記載されている。液相血液凝固検定に有用なトロンボプ ラスチン及びトロンビンがら成る乾燥試薬は、米国特許第４．４５８．０１５号 中に記載されている。

吸光反応を作り出す試薬に含浸された不活性の細孔性マトリックスから成る、血 液中のグルコースを測定するための検定装置が、米国特許第４．９３５．３４６ 号中に記載されている。血液サンプルは、マトリックスの１つの側に適用され、 そして反射率がその反対側上で測定される。この装置内で使用される膜は、赤血 球を破壊（溶解）する傾向にある。これは、高レベルのヘモグロビンが膜の内部 に浸透させ：そして高レベルのヘモグロビンがマトリックスの反対側上で観察さ れることができる。この゛３４６特許は、分析物、例えば、グルコースについて は、この効果は、この放出されたヘモグロビンの優勢なスペクトル上で区別され ることができるスペクトルの性質をもつ光学シグナル作る特定の化学物質を使用 し、そしてヘモグロビンのスペクトルを補正する２波長光学装置による結果を読 むことにより、克服されることができる。このようなアプローチは、非常にデリ ケートな且つヘモグロビン感受性のトロンビン支持体の血液凝固化学のためには 、役に立たないであろう。血液グルコース、コレステロール、及び尿素の測定に 好適な他の検定装置は、米国特許第４゜７７４、１９２号中に記載されている。

必要な試薬は、不斉膜であることができる構造物、例えば、細孔性膜又は水分を 吸収し易いフィルム内に含浸されている。この′１９２号特許は、構造物内のサ ンプル分布を制御するための流れ制御剤の使用についても示唆している。

米国特許第４．８６１．７１２吟、第４．９１０．５１０号、及び第５．０５９ ．５２５弓は、血液凝固をモニター＝するのに好適な多層デスｌ−物品について 記載している。、二の゛”１１２号希許は、繊維状材料、及びその繊維状ｔＪ料 をコーｌ−ｔ−１■つ含浸する水溶性非イオン性ポリマーから成る複雑な構造に ０いて記載している。この構造は、トロンボプラスチン及び検出可能なトロンビ ン基質を含むことかでき、そしてトロンビン時間を含む多数の血液凝固パラメー ターをモニターするのに有用である。

上記の°５２５号特許は、担体材料を含む血液凝固テストのための複雑な乾燥試 薬について記載しており、そしてその中で・プロトロンビン（又は因子Ｖｌ［− Ｘ）に応答性のプロテアーゼ、発色性プロテアーゼ基質、バッファー、及び第二 の血液凝固因子が乾燥されている。

この乾燥試薬中にプロテアーゼを含むことは、血液凝固因子、例えば、因子Ｘで あって、それらの酵素活性か測定されることかできる前にタンパク質分解解裂に より最初に活性化されなければならないものに・ついて検定を行うのに有用であ る。

米国特許第４．７５６．８８４号は、トロンビン時間を含む血液特性を測定する ための毛細管流れ装置について記載している。

発明に要約 本発明に従って、簡単なプロトコール及びフォーマットを使用して血液凝固検定 を行うためのテスト物品及び方法を提供する。本テスト物品は、外因性又は内因 性のいずれかの血液凝固経路を開始させることかできる血液凝固開始剤により含 浸された透過性膜、及び開始された血液凝固経路の前選択成分による活性化の間 に検出可能なシグナルを作り出す基質を含んで成る。膜は、赤血球を溶解しない ものであるように選ばれ、そしてサンプル適用側の反対の膜の光学監視表面側の 直下の校内部の少なくども一部から、ニオ］らの無傷の赤血球を排除することか できる。さらに、膜は、血液凝固経路の開始及び継続の妨害を実質的（二叉（」 ではならず、特に経路の不活性化又は偽の活性化を導くことができる経路の酵素 及び他の成分との表面相互作用を受けてはならない。このような膜は、このよう な表面（相互作用）からそれ自体が自由である材料から成ることかでき、又は不 所望の表面相互作用を減少させるタンパク質又は他の基質によりコートされ又は ブロックされる他の材料から成ることかできる。

好ましい膜は、ポリスルホンから成り、特に不斉ポリスルホン膜であることがで きる。

本発明の方法に従って、血液容量は透過性膜の１つの外面に適用され、そこで、 それが血液凝固開始剤及び基質の存在中で膜の内部に吸収される。このように血 液凝固が開始され、そしてこの血液凝固経路の前選択成分の生成が、基質の活性 化が普通には膜の反対の外面上の検出可能なシグナルを作り出すことを生じさせ る。膜の細孔寸法は、サンプルの赤血球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）が適 用外面上又は付近で維持され、それらが検出可能なシグナルの生成を妨害するこ とかできるであろう膜の観察外面の直下にある内部の一部へ侵入しないように、 選択される。そのうえ、膜の吸収容量は、それが、過剰の全血を適用表面上に残 しながら、分離された血液結晶の比較的低い容量を受け入れるであろうように選 ばれる。この方法において、テスト物品か、非常に低いテスト容量にさえ適合す ることができ、そしてテスト物品に適用された血液サンプルの実際の量は、決定 的ではない。

テストの結果は、典型的に、典型的には蛍光性検出可能シグナルの場合において は蛍光計を含んで成る自動化検出装置又はテスト装置により読まれるであろう。

自動化検出装置は、普通には、適当な時間における又は適当なテスト期間にわた る検出を許容するためのタイマーを含んで成る制御回路、及び血液凝固の”値（ ｖａｌｕｅ）”を計算するための手段を含むてあろう。普通には、制御回路は、 所定温度においてサンプルを維持するための温度制御手段を含むであろう。

あるいは、自動化検出装置は、サンプル温度における変化を補正するためも最初 に測定された血液凝固”値”を上方又は下方に調整するために温度補正されるこ とかできる。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の原理に従って構築されたテスト物品の例示的態様の略図である 。

図２は、本発明の原理に従って行われる血液凝固検定において使用されるときに テスト物品からの結果を読むのに有用なテスト装置のブロック線図である。

図３は、図１中に示したテスト物品及び図２中に示したテスト装置を使用した実 験からの結果である。この実験において１、正常のプロトロンビン時間をもつ全 血サンプルを、僅かに延長されたプロトロンビン時間をもつ全血サンプル及びか なり延長されたプロトロンビン時間をもつ全血サンプルと比較した。

特定の態様の説明 本発明のテスト物品は、典型的には、３μｌから５０μｌまての、普通には５μ ｍから３０μｌまてのレンジにおける小容量において血液を提供し、そして典型 的には、膜の反対側上の膜表面上で可視シグナルを検出することに好適な形態に おける細孔性膜を含んで成る。

この膜は、シート、ストリップ、ディスク、テープ（リール）、等として形成さ れることかでき、そして単一膜が１以上のテストのために使用されることかでき る。多数のテストのために使用されるどき、血液サンプルは、典型的には、同時 に又は逐次的にかのいずれかて、異なる位置にスポットされるであろう。膜は、 典型的には、非常に薄く、普通には飽和に達するのに必要な血液血漿の容量を限 定するために０．１ｍｍから０．３ｍｍまでの厚さをもつ。過剰な血液は、それ が適用された膜表面上に維持され、典型的には０．５μｌから２μｌまてのレン ジ内にある望ましい容量の血漿のみが膜の内部に侵入するてあろう。膜又はその 選択部分が飽和された後、血液タンパク質及びテスト試薬が比較的遅く拡散し、 以降に詳細に説明するようなテスト・プロトコールが行われることを許容するで あろう。

本発明の原理に従って構築された例示的テスト物品（１０）を、図１において説 明する。このテスト物品（１０）は、支持構造物（１４）、典型的には、ユーザ ーによるテスト物品の操作を許容するためのハンドルの上に載せられた細孔性膜 構造物（１２）を含む。テスト物品（１ｏ）は、細孔性膜（１２）のアプリケー ター外面（１６）に非測定の血液の滴を適用することにより使用される。血液血 漿の少なくとも一部が膜（１２）内に吸収され、そして以降に記載するような膜 内て開始される血液凝固の結果として、検出可能なシグナルが膜のインジケータ ー外面（１８）上に作られ、そこで、そのインジケーター外面が典型的には上記 アプリケーター外面（１６）に横方向に向かい合っている。インジケーター外面 （Ｉ８）上で作られた検出可能なシグナルは、ハンドル（１４）を通して可視化 できるであろう。このハンドルは、透明であり、好適な監視孔（図示せず）、等 をもっている。検出可能なシグナルの観察は、血液凝固反応の連続的な評価及び 血液サンプルの血液凝固能力の測定を可能にする。

細孔性膜構造物（１２）は、親水性（水分を吸収する）、非膨潤性のポリマー・ マトリックス材料であって血液細胞、特に赤血球細胞を排除しながら、血液血漿 及びタンパク質の侵入を許容する細孔寸法をもつものから成るであろう。膜は、 ミクロン（μｍ）オーダーの幅をもつチャンネルの曲がりくねったネットワーク から成るフオーム様構造をもつ単一の、連続性のポリマー材料から成らなければ ならない。チャンネルの曲がりくねったネットワークは”密に詰まって”おり、 その中では、チャンネルの空の空間により占有された′空隙容量”が全膜容量の 程よいパーセンテージ、典型的には１０％以上である。全反応化学、及びその後 のシグナル生成がこの空隙容量内で生じるので、高い空隙容量が強いシグナルを 作るために望ましい。

チャンネルの曲がりくねったネットワークは、真っ直ぐで直線的な細孔（例えば 、抜孔膜により得られた短い直線的な孔）よりも望ましい。なぜなら、より長い 平均チャンネル長が、反応化学が生じる膜の領域と、膜の表面上に残る過剰のサ ンプルとの間の増加した隔離を作り出す傾向にあるからである。これは、適用さ れたサンプル容量における変化に感受性の乏しい装置を与える助けになる。

以下に詳細に討議するように、細孔性膜構造物（１２）は、細孔性マトリックス の内部に侵入する血液血漿中の血液凝固を誘導し、そして血液の血液凝固能力の 指示として検出可能なシグナルを作り出すために必要な試薬により含浸されるで あろう。細孔性膜（１２）のポリマー・マトリックス材料が、誘導されている血 液凝固経路の妨害から実質的に自由であることが本発明にとって特に決定的なこ とである。特に、ポリマー・マトリックス材料は、表面効果、相互作用、及び血 液凝固を誘導し又は開始された経路の成分、例えば、酵素を失活させることがで きる人工産物から自由でなければならない。血液凝固経路の意図されていない開 始は、偽陽性の測定を導き、一方、酵素の失活は、偽陰性の測定を導くことがで きるであろう。それ故、ポリマー・マトリックス材料が膜内て生じる血液凝固反 応に対する非促進又は削減効果をもつことが重要である。

以下の基準を、膜が本発明のテスト物品及び方法における使用に許容されるかと うかを決定するために使用することができる：Ａ：　膜は、膜の外側外面への赤 血球の透過を排除する細孔幾何及びサイズ分布をもたなければならない。

Ｂ：　膜は、血液サンプルからの血漿が数秒以内、好ましくは１−２秒間以内に その膜を完全に透過することができるように親水性であり（又は親水性になるよ うに処理され）なければならない。

Ｃ：　膜は、その膜に適用される全血が溶解しないように血液細胞適合性であり （又は血液細胞適合性となるように処理されるかのいずれかで）なければならな い。さらに、膜は、赤血球不合及びヘモグロビン不合血漿だけがサンプル適用側 の反対の膜の側に通過するように血漿から血液細胞を分離する十分な能力をもた なければならない。赤血球不含及びヘモグロビン不合血漿を作り出すこの能力は 、少なくとも３０〜５５％のへマドクリット・レンジを超える、ヘマトクリット の有用なレンジを超えて持続しなければならない。

Ｄ：　膜は、外因性（又は内因性）血液凝固経路の進行を許容するように十分に 血液凝固中性であり（又は血液凝固中性となるように処理され）なければならな い。これは、実験的に、（実験セクション中に記載する）反応混合物によりその 膜を透過させ、乾燥させ、そして次に全血又は血漿のサンプルにより再活性化す ることにより、決定されることができる。多くのＮｕ（Ｄｉｍｉｎｉｃ−Ｈｕｎ ｔｅｒ　Ａｓｙｐｏｒ、　Ｐａ１ｌｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ″ Ｃ”、　ｅｔｃ、）が、全体として外因性（又は内因性）血液凝固経路をクエン チする。膜は、正常な血漿及び外因性経路（又は内因性経路）因子欠損血漿の両 方を許容し、首尾よく反応し、そして臨床的に正確な結果を作るように、十分に 血液凝固中性でなければならない。

Ｅ：膜は、約５から３０マイクロリツターまでの凡その量のレンジにある全血の 変化容量により処理されるとき、それが実質的に同様の結果を作り出すように容 量抵抗性を提供しく又は容量抵抗性を提供するように処理され）なければならな い。

Ｆ・　膜の光学的性質は、検定において使用される観察波長と互換性でなければ ならない。例えば、膜の内因性蛍光は、反応において使用されるトロンビン基質 の蛍光より優勢であってはならない。

Ｇ、膜は、製造の間の正常な加工に耐え、そして反応の経過の間にテスト結果を 変形することを回避するように乾燥及び湿らせられたとき、十分に寸法的に安定 でなければならない。

実験セクションにおいてより詳細に討議するが、非常に少ない膜のタイプがこれ らのすへての基準に適合する。例として、ポリアミド膜、例えば、Ｐａ１ｌ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　”Ａ”、　”Ｂ″及び＋ｃ”　シリー ズは、テストＣを満足しない。負電荷のポリアミド膜、例えば、Ｂｉｏｄｙｎｅ ″Ｃ”は、テストＣ及びＤの両方を満足しない。セルロース・べ−ス不斉細孔性 膜、例えば、Ｄｏｍｉｎｉｃ　Ｈｕｎｔｅｒにより製造されたＡｓｙｐｏｒシリ ーズは、テストＤを満足しない。ガラス繊維フィルター材料、例えば、５ｃｈｌ ｅｃｈｔｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　３４Ｇは、テストＥを満足しない。

これらのすへての基準に適合することが見つかった１つの非処理膜タイプは、不 斉ポリスルホン膜、例えば、Ｆｉｌｔｅｒｉ　ｔｅ／Ｍｅｍｔｅｃから入手可能 なりＴＳ−２５０，４５μｍ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ 　ｍｅｍｂｒａｎｅである。しかしながら、他の好適な膜は、先の基準を使用し て同定されることができなかった。

また、様々なな他の膜材料が先に述べた特定の基準に適合するように処理される 限り使用されることができる。例えば、全血サンプルよりもつむしろ血漿サンプ ルによる使用が望ましい場合には、ポリアミドが先に記載したように血液凝固中 性を強化するようにブロックされることができる。典型的には、このようなブロ ッキングは、残存試薬の導入に先立って又はそれと同時に好適なタンパク質溶液 により膜を前インキュベートすることにより達成されることができる。

ポリマーのマトリックスの細孔寸法は、適用された血液サンプルからの血液血漿 及びタンパク質の吸収を許容し、一方、細胞血液成分、特に、血液凝固検出化学 を妨害することが見つかっている赤血球細胞をｔＪＦ除するように選ばれるであ ろう。マトリックスの細孔寸法は、一般的に０．０５μｍから５μｍまでのレン ジ内に、典型的には、０．１μｍから１．０μｍまでのレンジ内にあるであろう 。好ましい態様においては、細孔寸法は、不斉に配列され、より大きな細孔が膜 構造物（Ｉ２）の適用外面（１６）上に置かれ、そしてより小さい細孔がインジ ケーター外面（１８）上に置かれるであろう。このような不斉細孔サイズ分布は 有益である。なぜなら、それが、より大きい細孔が血液が適用される表面に存在 し、その膜内への血液の速い浸入を容易にするからである。しかしながら、膜の 反対外面上のより小さな細孔は、血漿から赤血球を分離し、そして光学的検出装 置に赤血球及びヘモグロビン不含血漿を提示する。好ましくは、膜構造物（１２ ）のアプリケーター外面（１６）上の細孔寸法は、２μｍから５０μｍまでのレ ンジ内にあるであろうし、そしてインジケータ外面（１８）上では、０．１μｍ から１．０μｍまでのレンジ内にあるであろう。

ポリマー・マトリックス材料は、非膨潤性であろう。すなわち、マトリックスは 、普通には、水溶液、例えば、血液血漿に晒されたときに実質的には変形されな ず、したがってその元の立体形状及びサイズを保持するであろう。典型的には、 細孔性膜構造物（１２）の容量における変化は、血液血漿又は他の水性媒質に晒 される間、２０％未満、好ましくは１０％未満であろう。

上記に要求のす・＼てに適合する特に好ましいポリマー・マトリックスＨ料は、 Ｆｉｌｔｅｒｉｔｅ−Ｍｅｍｔｅｃ、　）Ｊｅｍｔｅｃ　Ａｍｅｒｉｃａ、　９ ６９０　Ｄｅｅｖｅｃｏ　Ｒｏａｄ、　Ｓｔｅ、　７．　Ｔｉｍｏｎｉｕｍ、　 ＭＤ　２１０９３から入手可能な０．４５　Ｉｌｍの不斉ポリスルポン膜Ｉ４料 である。この好ましい材料は、カタログ番号ＢＴＳ−２５ｍｅｄｉａである。

本発明の血液凝固検定を行うために必要な化学試薬は、すぐ上に記載したポリマ ー・マトリックス材料内に含浸される。必要試薬は、外因性又は内因性血液凝固 経路のいずれかにおいて前選択事件又は段階を開始させる血液凝固開始剤、及び 血液凝固経路のその後の段階において作られる成分により活性化される基質を含 む。また、バッファーは、血液凝固経路に適合するレンジ内でテストｐＨを維持 するために提供されるであろうし、そして付随的な試薬は、膜に浸入する血液タ ンパク質の発色団分離を減少させる流れ制御剤、血液凝固経路の化学反応を持続 させ又は強化する補因子、安定性エンハンサー、及びデス１−物品の光学特性を 強化する顔料を含む。典型的には、これらの試薬は、ポリマー・マトリックス材 料のすへて又は一部に適用される（先に記載した膜プロキング剤をさらに含んて 成ることかてきる）１以上の水溶液中で併合されるであろう。次に、マトリック ス材料が、その中で非共有結合により吸着される試薬をもつデス１−物品を作る ために乾燥又は凍結乾燥され（そして場合によりハンドル（１４）−ｈに載せら れ）ることができる。幾つかの場合においては、少なくとも幾つかに試薬を共有 結合により付着させることか可能である。但し、共有結合による付着は、普通に は必要でないであろう。

このように調製したテスト物品を、直ぐに使用し又はその後の使用のために保存 することができる。吸収された試薬は、血液サンプルを適用することにより再構 築され、これは、血液血漿が細孔性膜マトリックスの内部に侵入し、ぞしてその 試薬をＭらぜることを生１ンさぜる。

様々な好適な血液凝固開始剤をａ１呵用４゛る、二とができろ。これらの開始剤 は、医薬テストのために一般的に使用される標準点において血液凝固経路の引き 金を引くであろう。例えば、外因性血液凝固経路の開始剤は、因子Ｘを活性化す るために因子＼ｉｌｌ　とカルシラｌ、と結合するであろう。内因性血液凝固経 路開始剤は、因子ＸＩ［を活ｆ１化し、次に因子Ｘ１を活性化するであろう。外 因性血液凝固経路の好適な開始剤も、本技術分野においてよく知られており、モ してエラグ酸（ｅｌｌｅｇｉｅ　ａｃｉｄ）、カオリン、シリカ、等を含む。こ れらの及び他の開始剤の記載は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　（Ｔｈｉｒｄ　 Ｅｄｉｔｉｏｎ）、１９８３．　Ｍａｒｊｏｒｉｅ　Ｓ、Ｓｉｒｒｉｄｇｅ　ａ ｎｄ　Ｒｅａｎｅｒ　５ｈａｎｎｏｎ、ｌｅａ　＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ、　Ｐｈ１ ｌａｄｅｌｐｈｉａ；及び）ＩｅｍＯ３ｔａＳｉＳ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ ｉｓ、　ａ　ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　（Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄ ｉｔｉｏｎ）、　１９８３゜Ｊａｃｋ　Ｈｉｒｓｈ　ａｎｄ　Ｅｌｉｚａｂｅｔ ｈ　Ｂｒａｉｎ、Ｃｈｕｒｅｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、ＮｅｗＹｏｒ ｋ（この開示を、引用により本明細書中に取り込む。）中に提供されている。選 択された血液凝固開始剤は、血液血漿の予想サンプル容量において血液凝固を開 始させるのに十分な量においてマトリックスに適用されるであろう。例えば、ト ロンボプラスチンの好適な量は、血液血漿中で再構築されるとき、１００ｍｇ／ ｌからｌＯｇ／ｌまでのレンジ内の濃度を提供するのに十分なものであろう。

血液凝固反応をモニタリングするのに好適な基質は、外因性及び内因性血液凝固 経路の両方において最終事件として作られるトロンビンにより活性化される特定 の誘導ペプチドを含む。このペプチドは、リポータ−分子、例えば、発色性の、 化学発光性の、又は蛍光性の分子に解裂可能な状態で結合する。トロンビンは、 このペプチドを認識し、解裂可能なリンカ−を解裂させ、そして検出可能なシグ ナル、例えば、色の変化、光放射、又は蛍光をもたらすリポータ−分子の光学特 性における変化を引き起こす。多くの好適なトロンビン基質ペプチドか、米国特 許第３．８８４．８９６号；第４．０７０．２４５号；及び第４．１６９．０５ １号（これらの開示を、全体として引用により本明細書中に取り込む。）中に記 載されている。これらの基質ペプチドは、一般的に（常にてはないカリ、Ｂ−Ｘ −Ｙ−Ａｒｇ−Ｎｔ（−Ｒ（ここて、Ｂがプロラギング基であり、Ｘ−Ｙがジペ プチド（しばしば、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　、Ｐｈｅ−Ｖａｌ　、等 ）であり、モしてＲが加水分解可能なＮＨ結合によりペプチドに結合したリポー タ−分子である。）を有する。

典型的には、Ｒは、ＮＨ結合かトロンビンにより加水分解された後にその光学状 態を変化させるであろう。例示的な基質ペプチドは、７−アミｌ’−４−メチル クマリン・リポータ−分子に結合したＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ である。この基質は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ 、　Ｌ。

ｕｉｓ、　ＭＯから商業的に入手可能である。

特に好ましいのは、蛍光生成性リポータ−分子、例えば、７−アミド−４−メチ ルクマリン、ローダミン１１０、アミノキノリン、アミノナフタレン、ヘンゾフ ラザン、アクリジン、等の使用である。本発明において使用される細孔性膜のポ リマー・マトリックス材料は、典型的には、非常に薄く、先に記載したように普 通には０．１から０゜３ｍｍまでのレンジ内にあるであろうし、これは、多くの 発色性基質を使用するときクリアな色シグナルを提供するのに不十分な光学経路 を定めている。発色性基質により、検出のための十分なレベルに達した色を増加 させるために、膜内の基質濃度を非生理学的なレベルに増加させることがしばし ば必要である。このような高い基質濃度、典型的には、ｌｏ−４以上は、トロン ビンのための正常なフィブリノーゲン基質の濃度よりも有意に高く、そして血液 凝固経路を妨害する傾向をもつ。さらに、このような高い基質レベルは、トロン ビン酵素が完全に変換されるための実質的な時間を要する。これらの効果は、本 検定の臨床的な使用を格下げする傾向にある。１０−’を下回る基質濃度を使用 することにより、これらの効果を回避することができ、そして優れた結果を得る ことができる。蛍光リポータ−分子を使用することにより、強いシグナルか１０ −’Ｍを下回る、典型的には、１０−５Ｍ以下の基質濃度により得ることができ ることがここに発見された。

血液凝固経路に適合するｐＨを提供するために、ポリマー・マトリックス材料内 にバッファーを含浸する。特に好適なのは、ｐＨがそのマトリックスに依存して 約７から８まで変化するであろうＴｒｉｓバッファーである。約７．５において ｐＨを維持するバッファーが好ましいポリスルホン不斉膜材料及び外因性経路の ために好ましい。

血液凝固補因子、例えば、カルシウムを、血液凝固経路を持続させるために使用 することができる。特に、カルシウム・キレート剤により前もって抗血液凝固さ れた血液サンプルをテストするとき、カルシウムを、塩化カルシウムの形態で、 使用することが必要であることかてきる。カルシウムが必要である場合、試薬の 安定性の特徴を、物理的に分離されるか又はマイクロカプセル化されるかのいず れかにより、膜内のトロンボプラスチンからそれを単離することにより改善する ことかできる。

流れ制御剤も、血液血漿の粘度を増加させ、そして反応成分のクロマトグラフィ ー分離を限定するために膜内に含浸されることができる。好適な流れ制御剤は、 高分子量のポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニル・ア ルコール、等を含む。さらに、マトリックス内の顔料の包含は、蛍光の放射を強 化することかできる。好適な顔料は、小さな、光散乱粒子の材料であって血液凝 固経路を妨害しないものを含む。好適な顔料は、商標名Ｒｏｐａｑｕｅ”　０Ｐ −８４の下で、Ｒｏｈｍ　＆　Ｂａａｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌ ｐｈｉａ、　ＰＡから入手可能なスチレン−アクリル・コポリマー粒子から成る ことが見つかった。

単一のプロトロンビン時間検定を行うことを意図されたポリマー・マトリックス 材料の部分に含浸される様々な試薬の例示的な量は以下のよってある。

トロンボプラスチン　Ｏ，Ｉｇ／Ｌ−１２ｇ／Ｌ　３ｇ／Ｌ〜９ｇ／Ｌ基質　１ ０−７Ｍ／Ｌ〜１０−”Ｍ／Ｌ　１０−’Ｍ／Ｌ〜１０−’ＭルＢＳＡ　Ｏ〜２ ００ｇ／Ｌ　５０　〜１５０ｇ／ＬＣａＣＬ　Ｏ〜２ｘｌＯ−２Ｍ／Ｌ　Ｏ〜１ ｘｌＯ−’Ｍルヒドロキシブ口ビル　−　セルロース　０　〜１００ｇ／Ｌ　２ ５ｇ／Ｌ　〜　７５ｇ／ＬＲｏｐａｑｕｅ　”　０Ｐ−８４０〜　１０％　０　 〜　ｌＯ％Ｔｒｉｓバッフｙ　−ｐＨ７，０〜ｐＨ８，３ｐＨ７，２〜ｐＨ７， ８使用においては、典型的にフィンガー・スティック装置により得られた約５〜 ３０μｌの容量をもつ血液サンプルを、細孔性膜構造物（１２）のアップリケ− ジョン外面（１６）に適用する。サンプルを適用した後、テスト物品（１０）を 、血液凝固検定の結果を読むために自動検出装置又はテスト装置（２０Ｘ図２） 上に置（。蛍光テスト物品（１０）による使用に好適なテスト装置（２０）は、 光源（２２）、フィルター素子（２４）、及び光検出装置（２６）を含む。光源 （２Ｉ）は、基質の活性化蛍光リポータ−分子において蛍光を誘導するために好 適な励起波長における光（２２）を作り出す。蛍光は、励起波長に集中した好適 なバンドについて選択性であるフィルター（２４）を通過する放射光（２３）を もたらし、そのフィルターを通過する光（２５）は、検出装置　（２６）により 検出される。リポータ−分子として４−アミド−７−メチルクマリンを使用する ことを開示された例については、励起波長は、典型的には、３６５　ｎｍであろ うし、一方、検出波長は、４５０　ｎｍであろう。しかしながら、より長い励起 及び放射波長をもつ他のリポータ−分子も可能性がある。一般的には、より長い 波長が好ましい。なぜなら、光源のコストが小さいからであり、そして検出の効 率が改善されることができるからである。テスト装置（２０）は、さらに、望ま しい血液凝固テスト・プロトコール、例えば、プロトロンビン・テスト（ＰＴ） 、活性化部分トロンボプラスチン・テスト（ＡＰＴＴ）、等に従って時間にわた り検出装置（２６）により検出される光の量を分析する制御回路（２８）を含む 。普通には、この制御回路（２８）は、手動で、又は特定の事件、例えば、膜（ １２）への血液の適用の結果として開始されることができるタイマーを含むであ ろう。場合により、制御回路は、温度における変化がテスト結果を翻訳するとき に考慮に入れられることができるような温度測定能力を含むであろう。あるいは 、テスト装置（２０）は、特定の温度、典型的には３７°Ｃにおいて血液を維持 するための温度制御チャンバーを含むことかできるであろう。温度制御チャンバ ーが使用されるとき、透明支持体材料上に試薬膜を載せ、そしてサンプルの適用 前に望ましいテスト温度にこの支持体を前平衡させることが遊離であろう。これ は、適用されたサンプルが所望の温度に速く平衡化することを容易にする。場合 により、カバーリング層を、速い温度安定化をさらに容易にするためにサンプル の上に置くことができる。上記制御回路は、血液の血液凝固”値“を計算するた めに、さらに計算手段、例えば、マイクロプロセッサ−を含むであろう。プロト ロンビン時間又は他の血液凝固値を計算するための多くのアルゴリズムか可能で ある。以下のものは、反応時間か遅い場合、室温（２３°Ｃ）において操作され るように設計された４分間経過プロトロンビン時間テストのために最適化された 例である。蛍光データを、１０秒の時間点、すなわち、Ｆ（０）、Ｆ（１０）　 、Ｆ（２０）　・・・Ｆ（２４０）において採取する。この配列Ｆ（ｔ）を、次 に試薬のバッチの間の蛍光背景及び強度における差異について補正するために正 常化する。この正常化された値Ｆ’（ｔ）を、以下のように計算する二次に、Ｆ ’　（Ｔ）が最初に５０％最大値に達する値ｔを、Ｆ’（ｔ）時間点の間の線型 補間により決定する。これを、Ｔｓｏとして表す。最後に、プロトロンビン時間 、ＰＴを簡単な適合により決定する。

ＰＴ　＝ＩＴＳＧ”　＋　ｎＴｓｏ　＋　ｍ　（２）（式中、ｎ、及びｍは、実 験的に決定される。）反応を、一定の温度段階において行う場合、温度補正は、 全く必要ない。反応を周囲温度において行う場合、試薬の温度を、密接した熱伝 対により測定し、そしてＰＴ時間をそれにより調整する。多数の温度調整アルゴ リズムも可能である。比較的簡単なものは以下のものである： ＰＴ　３７　＝：ＰＴ　ｍｗ−ｂ＋ｅｎ＋　−ａ（３７−ｔｅｍｐ　ａｍｂｌｅ ｎｌ　）ＰＴ　２ａｍｂ＋ｅｎ＋　−ｂ（３７−ｔｅｍｐ　、ｂｌ、、Ｉ　）Ｐ Ｔ　、、ｙ、、ｌ　−ｃ（３７−ｔｅｍｐ　、、ｂｌ、、ｌ）　（３）（式中、 Ｔ　ａ＋ｍｂｌｓ＋＋＋は、（摂氏において測定された）試薬ストリップの温度 であり、ＰＴ−７は、（３７°Ｃ対照温度に調整された）温度補正プロトロンビ ン時間であり、そしてＰＴ　ａ＋ｍｌ＋ｌ＊＋＋１は、式（２）から得られたＰ Ｔ結果である。）パラメーターａ、ｂ及びＣは、実験的に決定される。さらに複 雑な温度補正も可能である。より高次の多項式適合を所望により式（２）及び（ ３）の両方において使用することができる。あるいは、式（２）の、係数を温度 補正することができる。

以下の例は、説明的なものであり、限定的なものではない。

実験 蛍光活性を、サンプルから３０ｃｍに保たれた７５０μＷ／ｃｍ２（１５ｃｍに お（Ｊる）長の波（３６５ｎｍ）紫りＩ線→ン＝自こより照らされた暗いチャン バー内の反Ｌｉ、”：膜を観察することによりモニターした。すへての反応を、 室温（２３°Ｃ）において行った。反応速度を、５０ｍｍレンズを備えたＭｉｎ ｏｌｔａ　Ｍａｘｘｕｍ　５０００　ＳＬＲ３５ｍｍカメラを使用して所定間隔 においてサンプルの写真を撮ることによりモニターした。この写真は、ｆ５．６ において１−又１４２−秒間の露出てＡＳＡ　４００　Ｋｏｄａｋ　Ｇｏｌｄカ ラー・プリント・フィルムを使用した。コントラストつかの写真を、Ｃｏｒｉｏ ｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｓ４０−４５０−Ｒ　４５０ｎｍフィルター（４ ０ｎｍハ〉ト幅）を使用して撮影した。フィルターは、それ以下の波長をＷｉ． ルさせながら、７−了ミドー４ーメチルクマリン蛍光団の４６０ｎｍの蛍光放射 か通過するのを許容する。時間計測は、ストップウォッチにより手動により行っ た。特に二とわらないかぎり、すべての試薬は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ．　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ．　ＭＯから得た。機器を備えた観ｉ ｌｌｌは、原）フの機器を使用して行った。光学装置ブロックは、２５ナノメー ターのハント幅をもツｃｏｒｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｓ２５−４５０ −Ａ　４５０十ツメ−クー　・フィルターの王に設置さ第１たＳｉｅｍｅｎｓ　 ＢＰＷ−３４Ｂ光検出装置を使用した。Ｅｄｍｕｎｄ　Ｓ日ｅｎｔｉｆ＋ｃ　１ ０ｍｍ　Ｘ　１０ｍｍ　Ｒ３２．６０１ブリズｌ、・キーｌ−ブ・ヒーム・スプ リッターを、フィルターの直上に載」た。試１−をヒーｌ、・スプリッターの上 に置き、そして３６５０ｍ波長のｔＪＶ　Ｍ’：を使用して下から照らした。光 検出装置からの出力を、（ＩＣ　Ｌｌｓｃｒ　（”ａｓｅｂｏｏｋ．　１９８８ 、　ｂｙ　Ｊｏｓｅｐｌ）　Ｃａｒ．　Ｈａｗａｒｄ　Ｓａｍｍｓ　＆　Ｃｏｍ ｐａｎｙの８９ベ−　ノに記載された）機器増幅装置により増幅し、１２ヒツト の了ナロゲーディシタル変換器によりディンタル化し、ぞしてＩＢＭ互換性バー ゛ノ＋ル・コンピューター上に記録した。温度側ｉ＆ｌＩを（これを使用すると き）Ｆｉｓｈｅｒ　ｍｏｄｅｌ　１４７等温乾燥浴を使用して維持した。

試薬透過膜を、晒された膜セクションを全体的に飽和させるために膜・＼十分な 液体試薬混合物を添加することにより調製した。次に、過剰の液体試薬を取り除 き、そして飽和されｔ，−膜を、約５０°Ｃにおいて３０分間熱風ブロアーの下 で空気乾燥させた。乾燥された膜を、使用するまで室温においてシリカ・ゲル乾 燥剤と共に、気密容器内に保存した。

最初の実験を、血液凝固中性テスト（先の討議した基準Ｄ）に集中した。これら の研究は、血漿のみを使用し、そしてＳｉｇｍａ　Ｃ−７９１６レペル１血液凝 固対照（正常限界内の活性化部分トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時 間）　、Ｓｉｇｍａ　Ｃ−８９１６レベル１１血液凝固対照（活性化部分トロン ボプラスチン時間及びプロトロンビン時間についての穏やかに高められた値）、 又はＳｉｇｍａ　Ｃ−９９１６レベルＩＩＩ血液凝固対照（活性化部分）・ロン ボブラスチン時間及びプロトロンビン時間についてのかなり高められた値）の、 １５μｌサンプルを使用してテストされた。後者の実験は、血漿対照に加えて全 血を使用した。全血サンプルは、フィンガースティック・サンプルから得られた 非抗血液凝固フレッシコ・サンプル、又は８時間未満のクエン酸添加抗血液凝固 静脈血液のいずれかであり、そして使用するまで冷蔵された。これらの実験にお いて使用されたトロンボプラスチンは、２０ｍｇ／ｍｌの濃度におけるＳｉｇｍ ａ　Ｔ−０２６３ウサギ脳トロンボプラスチンであった。使用］またウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ　Ａ−３２９４、プロテアーゼ不合画分Ｖ扮 末であった。トロンビン基質は、Ｓｉｇａｍから得られたＮ−ｔ−Ｂｏｅ−Ｖａ ｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７−了ミドー４ーメチルクマリンであ−った。使用したヒ ドロキシプロピルセルロースは、Ａｑｕａｌｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから 得られたＫｌｕｃｅｌ■ＥＦてあった。

害７Ａ　（？Ｉ　ｌ−　ブロー・「７ンピン時間反応にＮする様４・な膜の効果 液体試ぷ・混合物を、Ｉｕ’Ｆのものを組み含オー）ｕることにより調製した １２００、ｉｌｌ　１１．２ＡＩ　Ｔｒｉｓ　／＜　ソフ−ｒ−．　ｐＨ　８． ３６００１１１１・口：，・・ボブ→スチン１００　ｕ　ｌ　Ｉ００ｍ八ｆ　へ ＣａＣＬｌｏｏ　ｍｇ　ＢＳＡ ］００μｌのｌ　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｊ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７− アミＩ’　−　４−メヂルクマリン。

試ｉ１ｉ’ｌｉ．合物のアリ１ノ）（ｌｏｃＩＪｌ）を、以下の５−〇の異なる 膜にスボソＩ−　ｔ−、グこ Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍｉｃｒｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ” Ｂ”（第四アンモニア誘導体化ポリアミド） Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍｉｃｒｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　 ”じ（カルホギン誘導体化ポリアミド） ［１ｏｍｉｎｉｃ　Ｈｕｎｔｅｒ　０．８μｍ　Ａｓｙｐｏｒ不＊セルロース膜 Ｗｈａｊｍａｎ　３ＭＭフィルター紙 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ　５９３フイルタ一紙Ｗｈａｔｍａ ｎ　ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター紙。

膜　反応 Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍｉｃｒｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｃ″ Ｂ＋＋（明るい環）Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍｉｃｒｏｎ 　Ｂｉｏｄｙｎｅ　”Ｃ＋−　（反応せず）Ｄｏｍｉｎｉｃ　ｔ（ｕ口ｔｅｒ　 Ｏ．８μｍ　ＡｓｙｐｏｒＷｈａｔｍａｎ　３ＭＭフィルター紙 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｅｈｕｅｌｌ　５９３７　４ルタ一紙Ｗｈａｔｍ ａｎ　ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター紙　＋（明るい環）Ｗｈａｊｍａｎ　ＧＦ ／Ｃガラス繊維フィルター・紙は、陽性対照として作用した。なぜなら、ガラス 繊維桐材か特定の血液凝固経路に適合性であることか知られているからである。

この結果は、これらの条件の下では、多くの膜が外因性血液凝固経路と適合性が ないということを示した。また、これらの結果は、反応性膜上の蛍光強度が適用 されたサンプルの溶媒曲面に一致する薄い環上に濃縮されるということを示した 。これは、トロンビン基質の実質的なりロマトグラフィーかこれらの条件下て生 じたことを示していた。これは、望ましいことではない。なぜなら、蛍光の非均 −な分布は、反応速度の翻訳を複雑にするからである。

実施例２・　様々な流れ制御剤の効果 液体試薬混合物を、以下のものを組み合わぜることにより調製した ２０００μＩ　Ｏ．２Ｍ　Ｔｒｉｓバッフｙ，ｐＨ８．３１ｍｌｌ・ロンボブラ スチン １５０　μｌ　１００ｍＭ　ＣａＣ１２１５０　ｍｇ　Ｂ５Ａ １５０μｌの１　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７− アミド−４−メチルクマリン。

混合物を３つの、１ｍｌアリコツトに分けた。第一アリコツトには何も添加しな かった。５０ｍｇの高分子量（Ｓｉｇｍａ　Ｄ−５５０１５，０００，０００− ４０゜ｏｏｏ、　ｏｏｏモル重量）デキストランを第三アリコツトに添加し、そ して５０ｍｇのＡｑｕａｌｏｎ　ＫｌｕｃｅｌＯＥＦ（ヒドロキシプロピルセル ロース）を、第三アリコツトに添加した。これらのアリコツトを、完全に溶解す るまで混合し、そして１．２　ｍ１ｃｒｏｎ　Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｂ膜上にスポットした。

コートされた膜を、対照］血漿によりテストし、そして視覚的に評価した。１０ 分後の結果は、以下のよってあった：流れ制御油剤　反応 無し　＋（明るい環） デキストラン　−（反応せず） Ｋｌｕｃｅｌ■叶＋（明るい均一な環）流れ制御剤の非存在においては、蛍光基 質は、先のようにサンプル溶媒の前面と共に移動し続けた。これに反し、デキス トラン添加は、プロトロンビン時間反応を阻害した。しかしながら、Ｋｌｕｃｅ ｌ■ＥＦ（ヒドロキシプロピルセルロース）は、反応を阻害することなくクロマ トグラフィーを減少させるのに十分にその反応混合物を濃縮した。この結果は、 より均一な蛍光シグナルてあった。この実験の結果として、Ｋ　ｌ　ｕｃｅ　ｌ ■ＥＦは、定例的に本配合品に添加された。また、この実験は、血液凝固中性ポ リマーを使用する重要性について説明している。

１つの関心は、先の実験において観察された明らかな”プロトロンビン時間”反 応が実際には幾つかの種の非生理学的“人工産物“てあったということてあった 。観察された反応が実際に純粋なプロトロンビン時間反応であるかどうかを見る ために、その反応がカルシウム及びトロンボプラスチンが進行する必要があるか どうかを見るための実験を行った。さらに、その反応が、正常対照血漿と、延長 されたＰＴ時間をもつ異常対照血漿との間を識別する能力についてテストした。

これを行うために、カルシウム及びトロンボプラスチンを伴う、又は伴わない多 くの異なる膜ケースを調製した。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した： ２　ｍｌ　０．２Ｍ　Ｔｒｉｓバッフ７−、　ｐＨ８，３１５０ｍｇ　Ｂ５Ａ １５０　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ　９ＥＦ １５０μｌのｌ　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７− アミド−４−メチルクマリン。

混合物を２つの、１ｍｌアリコツトに分けた。０．５ｍｌのトロンボプラスチン 溶液を、１つのアリコツトに添加し、そして０．５ｍｌ　０．２Ｍ　Ｔｒｉｓバ ッファー、ｐＨ８，３を他ののちのに添加した。これらは、（＋／′−）トロン ボプラスチンのケースであった。

それぞれのケースをさらに、２つの追加のサブ−ケースにサブ分割した。これら の１つは、カルシウムをもち、そしてこれらの１っは、（カルシウムと結合する ）ＥＤＴＡをもっていた。これは、それぞれのケースを２つの０．５ｍｌサンプ ルに分割することにより行った。

（＋）カルシウム・ケースは、２５μＩの１００　ミリモルの塩化カルシウムを 受け取った。（＝）カルシウム・ケースは、２５μＩの１００ｍＭ　Ｎａ２ＥＤ ＴＡを受け取った。全部で、４つの最終的なケースが生した。これらは、以下の ものであった： （＋）トロンボプラスチン（＋）　ＣａＣ１２（＋）トロンボプラスチン（＋） 　ＥＤＴＡ（−）トロンボプラスチン（＋）　ＣａＣ１２（＝）トロンボプラス チン（＋）　ＥＤＴＡ　。

それぞれの溶液のサンプルをＰａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍ１ ｃｒｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｂ上にスポットし、そして乾燥させた。次に４つの すへてのケースを、対照Ｉ及び対照Ｉ！血漿により同時に挑戦させ、そして観察 した。強い蛍光が、対照Ｉ（正常ＰＴ待時間サンプルによる（＋）トロンボプラ スチン（＋）　ＣａＣ１２ケースにおいてのみ顕色された。他のすへてのケース は、陰性であった。

この実験は、観察された反応がカルシウムとトロンホブラスチンの両方が作用す ることを要求し、そして正常なプロトロンビン時間の血漿と異常なプロトロンビ ン時間の血漿とを区別することかでき、その装置が生理学的に重要なプロトロン ビン時間反応を行っている良好な証拠を提供することを、証明している。

実施例４　正常及び異常プロトロンビン時間血漿による試薬動態。

他の実験（示さず）は、試薬混合物のｐＨか延長されたプロトロンビン時間をも つサンプルに向かう装置の相対感度に対する効果をもっていたことを示した。一 般的に、７．５に近いｐＨは、延長されたプロトロンビン時間をもつサンプル検 出するためのより高い感度をもつ傾向にある。このように、反応カクテルのｐＨ は、その後の実験のために７．５に変更された。

以下の実験においては、対照Ｉ及び対照ＩＩ血漿の間の相対蛍光強度が時間推移 写真によりモニターされた。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した： １２００μＩ　Ｏ，２Ｍ　Ｔｒｉｓバッフｙ、ｐＨ７，５６００μｌ　トロンボ プラスチン １００　ｕＩ　１００　ｍλ１ｃａｃ１２１００　ｍｇ　Ｂ５Ａ １００　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ■ＥＦ １００μｌの］　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７− アミド−４−メチルクマリン。

試薬を、普通には、Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍ１ｃｒｏｎ 　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｂ上にスポットした。次に、乾燥膜を対照Ｉ及び対照１１血 漿により挑戦させ、そして１分毎に写真を撮った。結果は、以下のようであった 。

時間（分）　対照Ｉ　対照ＩＩ 、−れらの結果は、試薬膜−して生じた生理学的に重要なブロトロンヒン時間反 応ど再び一致した。予想されたように、異常（対照ｍサンプル（二おける蛍光シ グナルの出現時間は、正常サンプルの時間の約２倍であった。

先の実験（ごおいて得られたプロトロンｌぐン時間反応は、許容できない程に長 か−）ｊ−０長い反応時間は、股上の不安定な血液凝固因子の失活じよると推定 されｆ’−ｏさらに、この失活が装置に過剰の結合適合性や〕、バタ質を添加す る、−とによりブロックされることかできたと推定された。

、二の推定をテストするために、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐ８７．５及び２％プ ロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む”ブロッキング溶液”を調 製し、そして膜サンプルを、室温における１２時間の上記溶液により処理するか 、又は非処理てテスｌ−するかのいずれかを行った。

以下の膜を、前処理した： Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１．２　ｍ１ｃｒｏｎ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　 ”Ｂ−Ｇｅｌｍａｎ　５ｕｐｅｒ　８００ Ｆｉｌｔｅｒｉｔｅ／Ｍｅｍｔｅｃ　０６４５　ｍ１ｃｒｏｎ　不斉ポリスルホ ンＤｏｍｉｎｉｃ　Ｈｕｎｔｅｒ　Ｏ，８，ｃｚｍ　ｍ１ｃｒｏｎ　Ａｓｙｐｏ ｒＳｅｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　３４　Ｇガラス繊維フィルター 紙。

この実験、及び以下の実験においては、反応カクテルのＢＳＡ成分を、ＢＳＡか 血液凝固因子に対する保護効果をもっという観察に基つき、先のケースの２倍に した。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した １２００μＩ　Ｏ，２Ｍ　Ｔｒｉｓバッフ−ｒ　−、ｐ！（７，５６００μｍト ロンボプラスチン ２００　ｕ　！　！００　ｍＭ　ＣａＣ１２２００ｍｇ　プロテアーゼ不含Ｂ５ Ａ １００　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦ １００１１１の１　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７ −アミド−４−メチルクマリン。

これらの膜、及び対応する未処理膜のサンプルを、テスト・スタンドに固定し、 そして試薬混合物により飽和させ、そして普通に風乾させた。

次にサンプルを、レベル１及び＋１血液凝固対照に晒し、そしてテストした。反 応時間は、劇的に減少された。前処理の効果は、レベルＩ！、（延長されたＰＴ 待時間対照について最も表明された。レベル！対照（示さず）は、対応してより 速く（典型的には、このシリーズにおけるず・＼でのサンプルに一ついて２分間 ）、ぞして前処理の存在又は非存在により顕著に影Ｖされなかった。

す・＼“このサンプルについて、反応混合物からトロンボプラスチンを査くごど が、いずれのシグナルをも生しさぜないというどに、注目のこと。

結果（シ・ベル［１対照） １分　２分　３分　４分　５分　６分 Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　＋　＋　＋　＋３４　Ｇ　＋　＋　＋　＋ ＡＳ）’ｍｍｅｔｒｉｃ　＋　＋　＋　＋前処理の存在においては、Ｂｉｏｄｙ ｎｅ　Ｂは、本質的に、６分目までの間、レベル１１対照に非反応性であったこ とに、注目のこと。これに対【７て、前処理が、検出可能な反応がここで４分目 までに生じるように、レベル１１対照に対するＢｉｏｄｙｎｅ　Ｂの感度を増加 させた。。

しかしなから、不斉ポリスルホンは優れた血液凝固中性を示した。

これは、血液凝固因子のより少ない失活が上記膜支持体上で生じることを示す、 より速いレベルＩ［ＰＴ反応により示される。前処理の前に既に良好な、上記膜 の血液凝固中性は、前処理後も測定可能なほど変更されなかった。

また、膜を、正常なプロトロンビン時間をもっ全血サンプルにより挑戦させた。

結果は以下によってあった１１分　２分　３分　４分　５分　６分 膜 Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｅ　＋　十　＋ 膜 Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　＋　＋　＋　＋ｓｙｐｏｒ ３４　Ｇ 結果は、Ｂｉｏｄｙｎｅ″Ｂ”及び５ｕｐｅｒ−８００膜が正常なレベルＩの血 液凝固対照血漿により良好なシグナルを与えるけれとも、それらが全血により蛍 光シグナルを全く与えないということを示している。これに対して、不斉ポリス ルホンはシグナルを与え続ける。より長い（１０分間）の時間点において、５ｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　３４Ｇ、血漿がら赤血球を濾過するガ ラス繊維材料も、全血による陽性シグナルを与えた。このように、テストされた 材料の中では、不斉ポリスルホンが全血検定について最良であった。

実施例６．不斉ポリスルホン上のプロトロンビン時間反応に対するヒドロキシプ ロピルセルロース（流れ制御試薬）の効果不斉ポリスルホンに対するヒドロキシ プロピルセルロースの効果をテストした。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した １２００μｌ　Ｔｒｉｓバッフｙ　−、ｐＨ７，５６００μｌ　トロンボプラス チン ２００　μｌ　ＣａＣ１２ ２００ｍｇ　ＢＳＡ　０ 混合物を、２つの、１ｍｌアリコツトに分けた。５０ｍｇのＫｌｕｃｅｌ■ＥＦ を、１つに添加し、そして他のものには、何も添加しなかった。Ｋｌｕｃｅ　ｌ ■叶を溶解した後、５０μｌのｌ　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−７−アミトー４−メチルクマリンを両方のサンプルに添加した。

それぞれのケースを、開孔側上の０．４５　ミクロン不斉ポリスルポン膜のサン プルに適用した。過剰のサンプルを除去し、そして膜を普通に風乾した。

次に４つのすべてのケースを、対照Ｉ、対照ＩＩ及び対照ＩＩＩ血漿により同時 に挑戦させた。次に上記ケースを普通に観察した。

結果： １分　２分　３分　４分　５分　６分 （−）Ｋｌｕｃｅｌ　＠　ＥＦ 対照Ｉ　−環＋　＋＋＋＋ 対照］ｌ　環＋　＋＋＋ 対照１１１−　−　環＋　環＋ （＋）Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦ 対照１　＋　＋　＋　＋　＋ 対照ｒｔ　＋　＋　＋　＋ 対照ＩＩＩ　−十＋ 上記２ケースの速度及び蛍光強度は非常に類似していたけれとも、（−）Ｋｌｕ ｃｅｌ　＠　ＥＦケースは、溶媒前面における環内で最初に顕色する蛍光をもち 、そしてその後、サンプルしゆうに均一な顕色をもつ傾向かあった。これに対し て、（＋）Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦケースは、環を形成する傾向を伴わずに最初か ら均一に顕色した。このように、ＫｌｕｃｅｌＯＥＦは、配合物中に維持され、 クロマトグラフィー効果を減少させた。

実施例７：　プロトロンビン時間”テスト−ストリップ“本実験は、正常（レベ ルＩ）対照を、穏やかに異常な（レベルＩＤ対照から、かなり異常な（レベルＩ ＩＩ）対照から区別することができるして単層組成物が製造されることができ、 そしてこの単層組成物が小さな滴の全血を使用して機能することがてきるであろ うことを・　証明した。さらに本実験は、この反応がトロンボプラスチンが機能 することを要求するであろうことを証明した。

本実験は、再び、Ｆｉｌｔｅｒｉｔｅ／λｌｅｍｔｅｃ　Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏ ｎから得られた０゜４５ミクロンの細孔サイズ不斉ポリスルホン膜を使用した。

生体適合性を強化するために、膜を、１２時間ｐＨ７，５における０、０５Ｍ　 Ｔｒｉｓバッファー中の２％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミンの溶液に晒し 、その後風乾することにより前処理した。

この不斉膜は全血により陽性の蛍光シグナルを与えていたけれども、そのシグナ ルの強度は、未だ血清単独に満たなかった。顔料が全血シグナルをさらに強化す ることができるかどうかを見るために、この実験は、Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたスチレン／アクリル酸ポリマーの小さ な、中空の、０．５　ミクロン・サイズの粒子から成る顔料であるＲｐｐａｑｕ ｅ■による膜のドーピング効果についても調査した。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した。

８００μｌの０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ　バッファ、１）＋（７，５２００μｌの１０ ０ｍＭ　ＣａＣｌ□ ２００　ｍｇ　のＢＳＡ １００　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦ １００μｌ　のＩ　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７ −アミＦ＝４−メチルクマリン。

混合物を２つの、５５０μｌアリコツトに分けた。３００μｌのトロンボプラス チン溶液を、１つのアリコツトに添加し、そして３００μｌのＨ２Ｏを他のもの に添加した。これらは、＋／−トロンボプラスチンのケースであった。それぞれ のアリコツトを今度は、２つの、４００μｌのアリコツトに分けた。１つのアリ コツトは、１００μｌの５０％Ｒｏｐａｑｕｅ■懸濁液を受け取り、そして他の アリコツトは、１００μｌの８２０を受け取った。これらは、（＋／−）　Ｒｏ ｐａｑｕｅ■ケースであった。全部で、４つの最終的なケースが生じた。これら は、以下のものであった。

（＋）トロンボプラスチン（＋）　Ｒｏｐａｑｕｅ＠（＋）トロンボプラスチン （−）　Ｒｏｐａｑｕｅ■（−）トロンボプラスチン（＋）　Ｒｏｐａｑｕｅ■ （−）トロンボプラスチン（−）　Ｒｏｐａｑｕｅ■。

それぞれのケースを、開孔側上の０．４５　ミクロン不斉ポリスルホン膜のサン プルに適用した。過剰のサンプルを除去し、そして膜を普通に風乾した。

次に４つのすべてのケースを、対照ｌ、対照１１及び対照［［［血漿、並びに正 常な全血のサンプルにより同時に挑戦させた。次に上記ケースを普通に観察した 。蛍光は、（＋）トロンボプラスチン・ケースにおいては、以下の表に従って顕 色した：（＋）トロンボプラスチン・ケース １分　２分　３分　４分　５分　６分 （−）Ｒｏｐａｑｕｅ＠ 対照１　＋　＋　＋　＋　＋ 対照ＩＩ　＋　＋　＋　＋ 対照ＩＩＩ　＋　＋ 血液　−環士　環＋　環＋　環＋ （＋）Ｒｏｐａｑｕｅ＠ 対照１　＋　＋　＋　＋　＋ 対照Ｉｔ−＋　＋　＋　＋ 血液　＋　＋＋＋ （−）トロンボプラスチン・ケース １分　２分　３分　４分　５分　６分 ←）Ｒｏｐａｑｕｅ■ （＋”）Ｒｏｐａｑｕｅ■ 蛍光は、（−）ｌ−ロンホブラスチン・ケースのいずれにおいても顕色せず、ト ンボブラスチンが本反応に必要であることを示している。

（＋）Ｒｏｐａｑｕｅ■ノ「−スは、一般的に（−）Ｒｏｐａｑｕｅ′＠ケース よりも強い蛍光シグナルをｌｊえ、そしてより均一な蛍光分布を与える傾向をさ らにもっていた。、二のように、Ｒｏｐａｑｕｅ■は、有益であるよってあ−２ ）だ。

実施例８　カル］ノウムの効用 プロトロンビン時間反応に対するカルシウムの効果を研究し、そしてＲｏｐａｑ ｕｅ■か全血による蛍光シグナルを一貫して強化することを確認するために、先 の実験と並行な実験を行った。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した： ８００μｌの０．２ｈｌ　Ｔｒｉｓバッフｙ、ｐＨ７，５６００μｌのトロンボ プラスチン ２００　ｍｇ　のＢ５Ａ １００　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦ １００　ｍｇの１　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７ −アミド−４−メチルクマリン。

混合物を２つの、０．７５　ミリリッターのアリコツトに分けた。１００ノｌｌ の１００　ｍｌＪ　ＣａＣ１２を１つに添加し、１００μｌの８２０を他のもの に添加した。それぞれのアリコツトをさらに２つの、０．４　ミリリッターのア リコツトに分けた。１００μｌの５０％Ｒｏｐａｑｕｅ■懸濁液を１つのアリコ ツトに添加し、そして１００μｍの１１，０を他のアリコツトに添加した。全部 で、４つの最終的なケースが生した。これらは、以下のものであった （＋）　ＣａＣ１、（＋）　Ｒｏｐａｑｕｅ■（＋）　ＣａＣｌ　２　（−）　 Ｒｏｐａｑｕｅ■（−）　ＣａＣ１、（＋）　Ｒｏｐａｑｕｅ■（−）　ＣａＣ ｌ　２　（−）　Ｒｏｐａｑｕｅ＠０それぞれのケースを、開孔側上の０．４５ ミク１コン不斉ポリスルホン膜のサンプルに適用した。過剰のサンプルを除去し 、そして膜を普通に風乾した。

次に４つのすへてのケースを、対照１、対照ＩＩ及び対照Ｉｌ＋血漿、並びに正 常な全血のサンプルにより同時に挑戦させた。次に上記ケースを普通に観察した 。

（＋）　ＣａＣ１２ケース １分　２分　３分　４分　５分　６分 （−）Ｒｏｐａｑｕｅ■ 対照ＩＩＩ　−＋　＋ 血液　＋　＋　十　環＋ （＋）Ｒｏｐａｑｕｅ■ 対照１　−　＋　＋　＋　＋　＋ 対照ＩＩ　−４＋　＋　＋ 血液　（＋＋＋ （−）　ＣａＣｌ　、ケース １分　２分　３分　４分　５分　６分 （−）Ｒｏｐａｑｕｅ■ 血液　−十　＋　十　環十 （＋　）Ｒｏｐａｑｕｅ＠ 本実験における（−）　ＣａＣ１２ケースと、先の実験における（−）トロンボ プラスチン・ケースとの間の重要な差異に注目のこと。（−）　ｌ−ロンボブラ スチン・ケースにおける全血により反応は全（得られなかったけれども、正常な 反応が（）　ＣａＣ１２ケースにおける全血により得られた。これは、ここで使 用された新たな全血が、余分のカルシウムを試薬に添加する必要性を伴わずに外 因性経路の引き金を引くのに十分なカルシウムを含んでいたからである。反対に 、カルシウム・キレート剤の使用により消耗されたそれらのカルシウム・レベル をもつ血漿対照は（−）ＣａＣＩ　２ケースにおいて非反応性であった。

これは、優れた試薬安定性かカルシウムがトロンボプラスチンど共に保存されな い場合に達成されることかできるということを示す従来技術の視点において、有 用な発見てあった。家庭テストは、良好な安定性を必要とし、モして全血により 排他的に機能するであろうから、配合品がカルシウムを含まない場合に優れた結 果を得ることかできる。

Ｒｏｐａｑｕｅ■は、いくぶん、蛍光シグナルの強度を増強することにより、そ してそのシグナルの均一性を増加させることにより、全血による、有用な効果を もち続けた。しかしながら、適当な結果がＲ。

ｐａｑｕｅ　＠によらずに得られたことにも注目すべきである。

実施例９：　可変サンプル・サイズの研究良好な家庭テストは、試薬に添加され た全血の量における変化において抵抗性であろうし、そして好ましくは、約５μ ｌまでの非常小さなサンプル・サイズを使用して働くであろう。本実験において は、実験８から持ち越された（−）　ＣａＣ１２（−）Ｒｏｐａｑｕｅ＠及び（ ＋）　ＣａＣｌ２（＋）Ｒｏｐａｑｕｅ＠材料を５．１ｏ及び２０μｌの全血に より挑戦させた。

両方のケースにおいて、蛍光反応の反応速度及び強度は、すべてのサンプル・サ イズについて同一であった。反対に、同一の実験を５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　 ５ｃｈｕｅｌｌ　３４Ｇ又はＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター紙 により行ったとき、５μｍ及び１０μＩの全血サンプルによっては、反応は全く 観察されなかった。

実施例１０：全血サンプルによる定量的研究本実験の目的は、装置の最適化を容 易にするために試薬の性能に対する定量的なデータを得ることである。

液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることにより調製した： ２４００μｌ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５ １２００μｍ　トロンボプラスチン ４００　μｌ　１００ｍＭ　ＣａＣＩｚ４００　ｍｇ　Ｂ５Ａ ２００　ｍｇ　Ｋｌｕｃｅｌ　＠ＥＦ ２００μｌ　のＩ　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７ −アミド４−メチルクマリン。

これを、開孔側上の０．４５　ミクロン不斉ポリスルホン膜のサンプルに適用し た。過剰サンプルを除去し、そして膜を普通に風乾させた。

この膜を別個の試薬ストリップに加工した。これを、１０ｍ１ｌ厚の硬質不透明 支持体上に１／２”幅の３Ｍ　５ｃｏｔｃｈ　ＴＭＣａｔ、　１３６両面テープ のストリップを置き、そしてそのテープの中心を通して及び支持体を通してｌ／ ４゛直径の孔をパンチングすることにより行った。次に処理された膜をテープに ラミネートし、孔サイズを狭くした。この試薬ストリップを、次に便利なサイズ にカットし、そして先に記載した機器の観察領域の上に置いた。

血液サンプルを先に記載したように得た。これらのサンプルを、上記試薬ストリ ップに適用し、そして全部で４分間（２４０秒間）にわたり１０秒間隔において 観察した。この実験は、室温（２５°Ｃ）において行われた。

正常血液サンプル（Ａ）、僅かに延長されたプロトロンビン時間をもつ血液サン プル（Ｂ）、及びかなり延長されたプロトロンビン時間をもつ血液サンプル（Ｃ ）について得た結果を図３中に示す。

この結果は、装置が様々な全血サンプルの間をはつりと区別することができるこ とを示している。

前述の発明を、理解の容易にするために、例示及び実施例によりいくぶん詳細に 記載してきたけれとも、特定の変更及び修正が添付の範囲内で行われることがで きることは明らかであろう。

ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　２１／６４ 　Ｚ　９１１８−２ＪＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テスト物品であって： 血液凝固経路を実質的に妨害しない、側面の対位置においてアプリケーション外 面及びインジケーター外面をもつ透過性膜：その膜内に含浸された血液凝固開始 剤；及びその血液凝固経路の成分による活性化の間に検出可能なシグナルを作り 出す、その膜内に含浸された基質：を含んで成り、それにより、全血がその膜の アプリケーター外面に適用され、そして検出可能なシグナルがその血液凝固経路 成分の生成の結果としてそのインジケーター外面上に作り出されるような、テス ト物品。 ２．透過性膜が、血液凝固経路を妨害しない親水性の非膨潤性材料から成る、請 求項１に記載のテスト物品。 ３．材料が、ポリスルホンである、請求項２に記載のテスト物品。 ４．ポリスルホンが、不斉構造である、請求項３に記載のテスト物５．透過性膜 が、血液凝固経路の妨害を阻害するように処理された親水性の非膨潤性材料であ る、請求項１に記載のテスト物品。 ６．血液凝固開始剤が、外因性血液凝固経路を開始させる、請求項１に記載のテ スト物品。 ７．血液凝固開始剤が、トロンボプラスチン、又は他の因子ＶＩＩ活性化物質か ら成る群から選ばれている、請求項６に記載のテスト物品。 ８．血液凝固開始剤が、内因性血液凝固経路を開始させる、請求項１に記載のテ スト物品。 ９．血液凝固開始剤が、エラグ酸、カオリン、シリカ、又は他の因子ＸＩＩ活性 化物質から成る群から選ばれている、請求項８に記載のテスト物品。 １０．基質を活性化する血液凝固経路成分が、トロンビンである、請求項１に記 載のテスト物品。 １１．トロンビン基質が、リポーター分子に共有結合したペプチドであり、ここ で、トロンビンがそのペプチドに結合し、そしてそのペプチドからリポーター分 子を解裂させ、検出可能なシグナルを作り出すような、請求項１０に記載のテス ト物品。 １２．検出可能なシグナルが、蛍光である、請求項１１に記載のテスト物品。 １３．血液凝固経路及び膜材料に適したｐＨを維持する膜内に含浸されたバッフ ァーをさらに含んで成る、請求項１に記載のテスト物品。 １４．膜内に含浸されたカルシウムをさらに含んで成る、請求項１に記載のテス ト物品。 １５．膜内に含浸された顔料をさらに含んで成る、請求項１に記載のテスト物品 。 １６．膜内に含浸された流れ制御剤をさらに含んで成る、請求項１に記載のテス ト物品。 １７．テスト物品であって： 透過性不斉ポリスルホン膜： その膜内に含浸されたトロンボプラスチン；及びその膜内に含浸されたトロンビ ン基質であって、蛍光リポーター分子に共有結合したトロンビン結合ペプチドを 含んで成り、それによりトロンビンがその基質から蛍光リポーターを放出するよ うなトロンビン基質； を含んで成り、 それにより、全血がその膜の１つの外面に適用されることができ、そして蛍光が そのトロンビン基質のトロンビン仲介解裂の結果としてその反対外面上で検出さ れるような、テスト物品。 １８．血液凝固経路及び膜材料に適したｐＨを維持する膜内に含浸されたバッフ ァーをさらに含んで成る、請求項１７に記載のテスト物品。 １９．膜内に含浸されたカルシウムをさらに含んで成る、請求項１１７に記載の テスト物品。 ２０．膜内に含浸された顔料をさらに含んで成る、請求項１７に記載のテスト物 品。 ２１．膜内に含浸された流れ制御剤をさらに含んで成る、請求項１７に記載のテ スト物品。 ２２．患者の血液凝固能力の測定方法であって：全血サンプルを、透過性膜のア プリケーション外面に適用すること、ここで、その膜が血液凝固経路を実質的に 妨害せず、そして血液凝固開始剤、及びその血液凝固経路の成分による活性化の 間に検出可能なシグナルを作り出す基質が、その膜内に含浸されており；並びに その膜のインジケーター外面上で視覚的シグナルを検出すること、ここで、その インジケーター外面が上記アプリケーター外面に側面に対して置かれており、そ してその視覚的シグナルが、上記血液凝固開始剤及び血液の相互作用によりその 膜内で開始された血液凝固経路成分の生成から生じる、 を含んで成る方法。 ２３．全血サンプルが、適用に先立って測定されない、請求項２２に記載の方法 。 ２４．全血サンプルが、指を刺すこと（ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｃｋ）により得ら れる、請求項２３に記載の方法。 ２５．室温において行われる、請求項２２に記載の方法。 ２６．制御温度において行われる、請求項２２に記載の方法。 ２７．検出可能なシグナルが蛍光である、請求項２２に記載の方法。 ２８．検出可能なシグナルが温度補正される、請求項２２に記載の方法。