JP4194992B2 - 抽出層を用いてアナライトを測定する方法 - Google Patents
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Description
・指標物質がこの測定にとって特に好適な環境で検出されるようにする機能、
・指標物質の検出を妨害しうる物質が抽出層内に進入するのを防止して指標物質が実質的に妨害を受けずに検出されるようにする機能、および
・抽出層内に特別な物質、いわゆる捕獲物質を含有し、捕獲物質が選択的に抽出層内の指標物質を濃縮してアナライト測定の感度と特異性を増加させる機能を遂行する。
このトロンビン測定は、次のプロセスに基づく:
血液サンプルの凝固は、例えば、組織因子を加えることによりトリガーされ、その結果、凝固カスケードが進行して最終的にプロトロンビンがトロンビンに転化される。Pefafluor TH(Pefa-15865;供給元:Pentapharm Ltd., Engelsgasse 109, CH-4002 Basle)はトロンビンの特異的基質であり、トロンビンによりアミノメチルクマリンの切断を伴ってタンパク分解的に転化される。アミノメチルクマリンの蛍光特性は基質形態ではトリペプチドとのアミド結合によりかなり低下している。遊離されたアミノメチルクマリンは342nmの励起波長および440nmの発光波長において強い蛍光を有し、従ってトロンビン活性を検出するために、従ってサンプル中のトロンビンの量および濃度を測定するために利用することができる。アミノメチルクマリンの遊離により測定したトロンビン濃度は、凝固カスケードの経過と相関がある。トロンビン濃度をある特定の期間(通常、凝固反応開始後、数分)にわたって測定しかつ記録することにより、トロンビン濃度の時間経過から他の凝固特異的パラメーター、例えばプロトロンビン時間、活性凝固時間または活性部分トロンボプラスチン時間を測定することが可能である。これらのパラメーターは血液凝固の障害を診断するために広く利用されている。
最初に、本発明による方法と対照的に、追加の抽出層を使わないで行う予備実験を実施した。このために、Mowiol 4-88、Hepesバッファー、スクロース、グリシン、RPLA-4、Pefa-15865、組織因子、ポリブレンおよびmega 8を前処理してない全血サンプル5μlに加えた。これらの物質の濃度は、実施例1cに記載の凝固用混合物上にスプレーしたものの濃度と同様である。明確に可視性の凝固が起こるが、蛍光シグナルは血液中では検出されなかった。もし全血の代わりに血漿をサンプル液として用いた場合には、蛍光測定によるアミノメチルクマリンの切断をはっきりと観察することが可能である。これは、Pefa-15865からの強蛍光性アミノメチルクマリンの切断によりトロンビンを測定する原理が凝固パラメーターを測定するために利用できることを示す。さらに、ヘモグロビンまたは赤血球が同時に存在するとヘモグロビンは血中に溶解したアミノメチルクマリンの蛍光をほとんど完全にクエンチするので、全血中のこのような測定の実施は不可能であることも示した。この蛍光クエンチングは、全血から血漿を単離するステップの一部としての血球、従ってまたヘモグロビンを含有する赤血球の分離によっても起こらなくなったが、遠心分離などのさらなる手間のかかる処理ステップが必要であり、これは検出方法をさらに複雑にしかつさらに妨害を受け易くする。
例えば全血中のグルコースを検出するために使用されるような、前部に妨害物質を除去するフィルター層をもつ通常の層構造は、患者血中の所要の凝固因子が高分子量であるために、層により少なくとも部分的に阻まれるので、トロンビンの蛍光測定により凝固を測定するのに使用することはできない。同様に、凝固に必須でありかつこれもまた非常に大きいリン脂質も円滑に移動することができない。それ故に、通常の層構造における個々の層の排除判定基準により、特に高分子の凝固因子が反応層中に円滑に進入できないので、円滑な凝固反応は不可能である。
予備実験結果に基づいて、基本処方20g当たりヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン7.5gの層を上記の方法で試験担体に塗布し、そして凝固用試薬をスプレーした。基本処方だけを含有して追加の捕獲物質を含有しない層を塗布した試験担体を、対照として用いた。
Marcumar(登録商標)(Hoffmann-La Roche Aktiengesellschaft, Basle, Switzerland)は、血液凝固を遅延させるが完全に無効化するものでない経口投与凝固阻害剤である。Marcumar(登録商標)は凝固第II、第VII、第IXおよび第X因子のビタミンK依存性合成を抑制する。Marcumar(登録商標)は、静脈血栓症、心筋梗塞および肺塞栓症の予防および治療に主に利用される。その作用は出血傾向の上昇と関連するので、必要あれば投与量を調節できるように、規則的な制御測定によるモニタリングが絶対に必要である。モニタリングは、医師または患者自身が実施する凝固特異的パラメーターの規則的な測定に基づく。本発明による方法をこの目的に利用することができれば好ましい。
特別な抽出層内の指標物質の測定に基づいてアナライトを測定する本発明による原理は、特別な捕獲物質を用いることにより指標物質が抽出層内に濃縮され妨害物質が抽出層内に排除されて留まることを特徴とし、この原理は他のアナライトおよびパラメーターに応用することができる。
Claims (10)
- 少なくとも2つのコンパートメントを含む試験系を用いて全血またはそれから誘導される血液産物中のグリコシル化ヘモグロビンを測定する方法であって、グリコシル化ヘモグロビンを測定するために必要な検出反応が第1コンパートメント内で実施され、そして検出反応に関与する指標物質の分析測定が第2コンパートメント内で行われ、
a)2つのコンパートメントは、指標物質が第2コンパートメント内に進入することを可能にしかつ第2コンパートメント内で指標物質の分析測定を妨害しうる妨害サンプル成分の進入を少なくとも部分的に阻止する様式で互いに分離されていること、および
b)第2コンパートメント内の指標物質を、指標物質との間の親水性/疎水性相互作用に基づいて選択的に濃縮する特異的捕獲物質が第2コンパートメント内に固定された形態で存在すること、
を特徴とし、さらに
c)第1コンパートメント内で、グリコシル化ヘモグロビンと特異的に結合する低分子量の標識した試薬が検出反応の経過中に指標物質として存在するステップ、
d)第2コンパートメント内で、グリコシル化ヘモグロビンと結合していない指標物質を特異的捕獲物質を用いて濃縮する一方、妨害するサンプル成分を排除しかつグリコシル化ヘモグロビンと結合した指標物質を排除するステップ、および
e)第2コンパートメント内で、指標物質を光学的方法を用いて検出するステップ
を特徴とする上記方法。 - 低分子量の標識した試薬が低分子量の蛍光標識したボロン酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 特異的捕獲物質が炭水化物もしくはジオールであることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 妨害サンプル成分が血球および発色物質であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 発色物質がヘモグロビンであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 光学的方法が蛍光-光学的方法であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 第2コンパートメントが選択的に浸透可能なマトリックスの形態に設計されていることにより2つのコンパートメントが分離されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法
- 選択的に浸透可能なマトリックスがゲル、フィルム、膜またはポリマー層であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 特異的捕獲物質を固定するマトリックスが同時に2つのコンパートメントを分離することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つのコンパートメントを含む、全血またはそれから誘導される血液産物中のグリコシル化ヘモグロビンを測定するための試験系であって、グリコシル化ヘモグロビンを測定するために必要な検出反応が実施される第1コンパートメントと、検出反応に関与する指標物質の分析測定が行われる第2コンパートメントとを含み、
a)2つのコンパートメントは、指標物質が第2コンパートメント内に進入することを可能にしかつ第2コンパートメント内で指標物質の分析測定を妨害しうる妨害サンプル成分の進入を少なくとも部分的に阻止する様式で互いに分離されており、
b)指標物質が、グリコシル化ヘモグロビンと特異的に結合する低分子量の標識した試薬であり、
c)第2コンパートメント内のグリコシル化ヘモグロビンと結合していない指標物質を、指標物質との間の親水性/疎水性相互作用に基づいて選択的に濃縮する特異的捕獲物質が第2コンパートメント内に固定された形態で存在する
ことを特徴とする上記試験系。
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