CN110938147B - 一种玻璃毛细管表面抗体固定方法 - Google Patents

一种玻璃毛细管表面抗体固定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：修饰，将玻璃毛细管表面进行修饰处理；S2：包被抗体，将稀释后的包被抗体溶液固定到经修饰处理后的玻璃毛细管上；S3：封闭，将S2中已包被抗体玻璃毛细管进行封闭处理；本发明对固相玻璃毛细管进行氨基化修饰处理，将树枝状大分子的独特结构引入到毛细管内壁修饰中，可以使玻璃毛细管表面凹凸不平，大大增加毛细管的表面积和容量，让其具有吸附蛋白质的能力，为玻璃毛细管表面抗体包被提供了一种新思路。

Description

一种玻璃毛细管表面抗体固定方法
技术领域
本发明涉及一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，属于表面化学及蛋白固定技术领域。
背景技术
在免疫学检验中，经常采用将抗体固定到固相载体上来检测样品中的目标物，目前常用的固定方法主要包括物理吸附法和化学共价法，其他抗体固定方式如聚合物包埋法等。
物理吸附法：指通过离子键、静电作用、疏水力和极性相互作用等非共价形式固定到固相表面，是最简单的抗体固定方法。优点是操作简单、反应简单、快速且不需要添加偶联试剂或对目标抗体进行修饰；但缺陷也比较明显，固相与抗体间的作用力受离子强度、PH、温度等影响较大，重现性较差，抗体容易失活、变性等。
化学共价法：指利用蛋白质表面的氨基通过化学反应，将蛋白分子共价固定到固相表面。目前最为广泛应用于羧基和氨基的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和1-环已基-2吗啉乙基碳二亚胺（CMC）。它们可直接将抗体固定到羧基或氨基的固相表面；也可以先与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）联合使用，将固相的羧基活化成NHS活化酯，然后与抗体的氨基形成酰胺键，该反应是蛋白内部氨基酸之间的缩合反应。
目前物理吸附所常用固定抗体的固相材料包括塑料（聚苯乙烯和硅树脂）、膜（硝酸纤维素膜和尼龙膜）和金属表面。其中聚苯乙烯是最广泛应用的酶联免疫吸附测定的固相载体。如酶联免疫吸附法（ELISA）检测，直接用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗体，然后加到酶标板上实现抗体固定化，研究发现用从灰树花中提取的疏水蛋白对固相聚苯乙烯进行修饰可以提高固相载体的亲水性。Raghav研究表明直接在L-天冬酰胺包覆的柠檬酸盐包覆金纳米颗粒（cit-AuNPs）上进行物理吸附效果明显优于直接在cit-AuNPs上进行物理吸附和用EDC/NHS活化cit-AuNPs。玻璃材质本身对抗体没有吸附能力，通过对没有蛋白吸附能力的的玻璃毛细管进行改性修饰，使其结构发生变化，据张志胜“以枝形大分子聚酰胺胺(PAMAM)为键合固定相的开管毛细管电色谱柱的制备及评价”成功的将枝形大分子结构引入玻璃毛细管内部修饰，并带有大量活性基团。
申请号为：CN200910027564.3，公开号为：CN101671395的发明专利公开了一种氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，将玻璃、硅片、金等固相表面氨基化，用EDC/NHS混合液使多羧基化合物（至少含两个羧基的化合物，如乙二酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、乙二胺四乙酸等）的羧基功能化，将功能化的多羧基化合物与氨基化的固相表面反应使功能化的的多羧基化合物结合到氨基化固相表面，而剩余的功能化羧基可迅速的与带固定蛋白分子或其他含氨基的分子反应，使蛋白固定到固相表面。该化学共价偶联方法步骤较多，耗时耗力，且需要交联剂、多羧基化合物等辅助试剂，需要使用浓硫酸/过氧化氢混合溶液等危险试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，该固定方法在固相玻璃毛细管基础上进行优化，以一种更有效、更简单、更安全的方式来达到玻璃毛细管表面抗体固定的目的。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明的基本构思如下：
研究发现将不能吸附抗体的玻璃毛细管通过氨基化修饰处理可以改变玻璃毛细管表面，可以直接物理吸附待固定抗体，通过该方式固定抗体也能达到所需的实验要求。
本发明的主要目的是：如何更安全简单的对玻璃毛细管进行氨化处理，并在此基础上进行物理吸附包被抗体，以此达到实验需要。
现提供三种修饰处理玻璃毛细管的方式：
一是氨基化玻璃毛细管，其制备过程中先让玻璃毛细管表面羟基化，H2O、110℃大大提高了羟基化的效率，再将枝形聚合物 PAMAM通过硅烷化试剂 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），并主要通过甲基丙烯酸甲酯（MMA）的双键与 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的端氨基发生Micheal加成反应，逐步键合到玻璃毛细管内壁上得到半代的 PAMAM，然后端酯基与乙二胺（EDA）发生酰胺化反应，得到整代的枝形大分子聚酰胺-胺（PAMAM），得到氨基化的玻璃毛细管表面。
二是羧基化玻璃毛细管，其制备过程是先H2O、110℃处理让玻璃毛细管表面羟基化，再通过二氢-3-[3-（三乙氧基硅基）丙基]呋喃-2,5-二酮（TESPSA）与硅羟基反应得到含端羧基的羧基化玻璃毛细管。
三是羟基化玻璃毛细管，单独的羟基化玻璃毛细管并不能很好的吸附抗体，需要增加其支链结构，其制备过程是先H2O、110℃处理让玻璃毛细管表面羟基化，再通过3-（2,3环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）接枝于羟基得到端环氧基团，然后环氧基通过硫基乙醇转化为羟基，得到含有枝形结构的羟基化玻璃毛细管。
再将修饰处理后的玻璃毛细管通过磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等缓冲液稀释过的抗体溶液，37℃包被1-5H将抗体固定到玻璃毛细管表面；再通过脱脂奶粉、酪蛋白钠盐、牛血清白蛋白等封闭液封闭1-3H，可有效的减少有关的非特异性结合。对各步反应中各反应物质的使用量以及温度、反应时间进行限定，优化了偶联反应的条件。
再将修饰处理后的玻璃毛细管通过磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等缓冲液稀释过的抗体溶液，37℃包被1-5H将抗体固定到玻璃毛细管表面；再通过脱脂奶粉、酪蛋白钠盐、牛血清白蛋白等封闭液封闭1-3H，可有效的减少有关的非特异性结合。对各步反应中各反应物质的使用量以及温度、反应时间进行限定，优化了偶联反应的条件。
其中，已包被抗体玻璃毛细管的主要成分是氨基化处理的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的材质为高硼硅玻璃ID=0.7mm（±0.005mm）；OD=1.2mm（±0.02mm)；L=30mm(±0.5mm）。
其中，已包被抗体玻璃毛细管是通过包被抗体溶液与毛细管按照包被量为10～30μg/mL，于37℃温育条件下在pH为6.5～7.5的20～100mmol/L磷酸盐缓冲液中交联反应1～5h得到。
其中，包被抗体偶联的毛细管的制备，还包括：包被抗体偶联的毛细管中加入毛细管封闭液2%酪蛋白钠盐溶液，于37℃条件下反应1～3H。
本发明对固相玻璃毛细管进行氨基化修饰处理，将树枝状大分子的独特结构引入到毛细管内壁修饰中，可以使玻璃毛细管表面凹凸不平，大大增加毛细管的表面积和容量，让其具有吸附蛋白质的能力，为玻璃毛细管表面抗体包被提供了一种新思路。
具体来说，本发明具体方案如下：
一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：修饰，将玻璃毛细管表面进行修饰处理；
S2：包被抗体，将稀释后的包被抗体溶液固定到经修饰处理后的玻璃毛细管上；
S3：封闭，将S2中已包被抗体玻璃毛细管进行封闭处理。
其中，S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的氨基化处理，具体过程如下：
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化；
b. 将枝形聚合物 PAMAM通过硅烷化试剂 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的端氨基与甲基丙烯酸甲酯（MMA）的双键发生Micheal加成反应，逐步键合到玻璃毛细管内壁上得到半代的 PAMAM；然后端酯基与乙二胺（EDA）发生酰胺化反应，得到整代的枝形大分子聚酰胺-胺（PAMAM），得到氨基化的玻璃毛细管表面。
作为一种选择，在S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的羧基化处理，具体过程如下：
先让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化，再通过二氢-3-[3-（三乙氧基硅基）丙基]呋喃-2,5-二酮（TESPSA）与硅羟基反应得到含端羧基的羧基化玻璃毛细管。
作为一种选择，在S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的羟基化处理，具体过程如下：
先让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化；再通过3-（2,3环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）接枝于羟基得到端环氧基团，然后环氧基通过硫基乙醇转化为羟基，得到含有枝形结构的羟基化玻璃毛细管。
其中，在S2中，所述包被抗体溶液由磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液进行稀释；并将玻璃毛细管在37℃条件下，包被1-5H。
其中，所述封闭处理时间为1-3H，封闭处理时使用的封闭液为：脱脂奶粉、酪蛋白钠盐或者牛血清白蛋白溶液。
其中，在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管主要成分是氨基化处理的玻璃毛细管，玻璃毛细管的材质为高硼硅玻璃ID=0.7mm（±0.005mm）；OD=1.2mm（±0.02mm)；L=30mm(±0.5mm）。
其中，在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管是通过包被抗体溶液与玻璃毛细管按照包被量为10～30μg/mL，于37℃温育条件下，在pH为6.5～7.5的20～100mmol/L磷酸盐缓冲液中交联反应1～5h得到。
其中，所述封闭液为：2%酪蛋白钠盐溶液，所述酪蛋白钠盐溶液加入玻璃毛细管后于37℃条件下反应1～3H。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明对固相材料本身，对玻璃毛细管进行氨基修饰处理，使玻璃毛细管表面增加树枝状大分子的独特结构，使玻璃毛细管可以直接吸附蛋白分子，同时氨基化可以提高玻璃毛细管表面的亲水性。
本发明提供的氨化玻璃毛细管基础上直接物理吸附抗体的一种抗体固定方法，简化了玻璃毛细管表面抗体固定的步骤，缩短了抗体固定的时间，避免在抗体固定过程中EDC/NHS等交联剂及其他辅助试剂的使用，其中EDC/NHS极易吸潮结块，对操作带来极大的不便。该方法也适用其他基团化的玻璃毛细管，如羟基化、羧基化、醛基化修饰玻璃毛细管，只需要将枝状大分子的独特结构引入到玻璃毛细管内壁修饰，再将待固定的抗体与修饰后的玻璃毛细管反应，即可将抗体固定到玻璃毛细管表面。该方法以更有效、更简单、更安全的方式来达到玻璃毛细管表面抗体固定的目的。
更重的是，本发明采用氨基化玻璃毛细管作为固相载体，将待包被抗体固定连接有树枝状大分子玻璃毛细管，树枝状大分子是具有最高支化度、非常规整及可控制结构的三维大分子，并且当树枝状大分子达到一定的分子代数后表面会产生大量功能性端基，足够多的集团数量能够使靶物质迅速且有效地结合在玻璃毛细管上，这样既可提供对内部空间的保护，也可对外部物质起到重要的分子识别作用。因此通过此工艺制得了一种高效、稳定且寿命长的玻璃毛细管，能大大提高检测范围，保证了试剂盒检测结果的准确性；偶联反应结束后加入封闭液，封闭多余氨基及空位，有效地降低了交叉反应的概率和有关的非特异性结合，提高了试剂盒的特异性，进一步保证了检测结果的准确性。
本发明方法可以有效的将抗体固定到玻璃毛细管表面，且该方法操作步骤简单，避免了交联剂的使用，极大的提高了操作的简洁性。
附图说明
图1为本发明线性论证时的拟合图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：修饰，将玻璃毛细管表面进行修饰处理；
S2：包被抗体，将稀释后的包被抗体溶液固定到经修饰处理后的玻璃毛细管上；
S3：封闭，将S2中已包被抗体玻璃毛细管进行封闭处理。
需要说明的是：S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的氨基化处理，具体过程如下：
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化；
b. 将枝形聚合物 PAMAM通过硅烷化试剂 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的端氨基与甲基丙烯酸甲酯（MMA）的双键发生Micheal加成反应，逐步键合到玻璃毛细管内壁上得到半代的 PAMAM；然后端酯基与乙二胺（EDA）发生酰胺化反应，得到整代的枝形大分子聚酰胺-胺（PAMAM），得到氨基化的玻璃毛细管表面。
其中，在S2中，所述包被抗体溶液由磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液进行稀释；并将玻璃毛细管在37℃条件下，包被1-5H。
在本实施例中采用的是磷酸盐缓冲液进行稀释包被抗体溶液。
其中，所述封闭处理时间为1-3H，封闭处理时使用的封闭液为：脱脂奶粉、酪蛋白钠盐或者牛血清白蛋白溶液。
在本实施例中，所述封闭液为：2%酪蛋白钠盐溶液，所述酪蛋白钠盐溶液加入玻璃毛细管后于37℃条件下反应1～3H。
其中，在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管主要成分是氨基化处理的玻璃毛细管，玻璃毛细管的材质为高硼硅玻璃ID=0.7mm（±0.005mm）；OD=1.2mm（±0.02mm)；L=30mm(±0.5mm）。
在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管是通过包被抗体溶液与玻璃毛细管按照包被量为10～30μg/mL，于37℃温育条件下，在pH为6.5～7.5的20～100mmol/L磷酸盐缓冲液中交联反应1～5h得到。
下面结合具体的实验步骤对本发明做进一步详细阐述：
（一）玻璃毛细管表面氨基化处理
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化，其具体步骤如下：
（1）玻璃毛细管准备：将玻璃毛细管装入50ml离心管内（装量：300根/管），通过上下震动或借助镊子让玻璃毛细管竖直平铺一层于离心管中。
（2）玻璃毛细管羟基化：
a向离心管中加入灭菌水（13ml/管，确保水浸没玻璃毛细管），超声或上下震动排除管内气泡，确保玻璃毛细管中无气泡；然后将离心管放入烘箱中100℃空气浴4h。
b处理完成后，排掉玻璃毛细管内水分（通过扎孔的离心管人为甩掉玻璃毛细管内水分），然后将离心管（不需要盖离心管盖）放入烘箱中100℃干燥固定1h。如短时间内不能进行氨化处理，需将玻璃毛细管放入4℃冰箱干燥保存（保存时间不要超过24h），以备后续处理。
（3）玻璃毛细管表面氨基修饰：
b. 将枝形聚合物 PAMAM通过硅烷化试剂 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的端氨基与甲基丙烯酸甲酯（MMA）的双键发生Micheal加成反应，逐步键合到玻璃毛细管内壁上得到半代的 PAMAM；然后端酯基与乙二胺（EDA）发生酰胺化反应，得到整代的枝形大分子聚酰胺-胺（PAMAM），得到氨基化的玻璃毛细管表面，其具体步骤如下：
a半级氨化：玻璃毛细管经羟基化处理后，加入10%APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷) ，放入烘箱中70℃反应4h；然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次（每次浸泡2min），吹干；
b Michael加成：向上述玻璃毛细管中加入10%MMA（甲基丙烯酸甲酯），放入烘箱中40℃反应24h，然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次（每次浸泡2min），吹干；
c 一级氨化：向上述玻璃毛细管中加入20%EDA（乙二胺），放入烘箱中40℃反应24h，然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次（每次浸泡2min），吹干或烘箱中25℃过夜烘干。然后将处理好的玻璃毛细管做好标记（批号和编号）并放入4℃冰箱干燥保存备用。
（二）玻璃毛细管包被抗体溶液的制备
（1）抗体溶液的配制：用100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4±0.05)稀释成10～30μg/mL的包被量对上述已氨基化的玻璃毛细管进行37℃温育包被2小时。
（2）用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液（pH=7.4±0.05）洗去多余抗体溶液，干燥空气吹干。
（3）将步骤2得到的玻璃毛细管用封闭液2%酪蛋白钠盐进行37℃封闭1～3小时，用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液（pH=7.4±0.05）洗去多余封闭液，干燥空气吹干，于2～8℃干燥保存备用。
（三）采用心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒进行检测
心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒包括：心型脂肪酸结合蛋白校准品，酶结合物工作液、已包被抗体玻璃毛细管、清洗液及化学发光底物。
其中，心型脂肪酸结合蛋白校准品是通过校准品稀释液将具有溯源性的校准品稀释至0、6.4、12.8、25.6、64、160ng/mL，所述校准品稀释液的成分为：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、1％牛血清白蛋白、2%甘露醇、0.01%曲拉通、0.1％Proclin300，pH为7.0±0.05；
其中：酶结合物工作液的浓度为0.4～2μg/mL，其是通过在酶结合物溶液加入酶结合物稀释液配制而成。酶结合物稀释液的具体成分为：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、0.9%NaCl、1％酪蛋白钠盐、1％海藻糖、1％甘油、0.01%曲拉通、0.1mmol/L ZnCl2、1mmol/LMgCl2、0.1％Proclin300，pH为7.4±0.05。
其中：已包被抗体玻璃毛细管的心型脂肪酸结合蛋白抗体包被量为10～30μg/mL。
其中：清洗液的配制过程为：依次向容器内加入三羟甲基氨基甲烷6.057g，氯化钠9g，吐温20 0.5g，曲拉通1g，水900mL，混匀至各组分溶解，用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5±0.05，补加水定容至1000mL，混匀30分钟，0.22μm过滤即得到清洗液。
其中：化学发光底物为购买的APS-5底物，需要再2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。
（四）线性验证（论证1）
选一份高浓度样本（160ng/mL），将其依次稀释出至少7个浓度梯度的样本（低值浓度样本需接近1ng/mL），对每一浓度样本均重复测定至少2次，计算其平均值，将结果平均值与稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，如图1所示，相关系数r2=0.9988＞0.99，说明本发明提供的试剂盒的线性较好。
（五）精密度验证（论证2）
取具有溯源性的血清低值质控品、高值质控品各一份，对每份质控品进行10次检测，将共10次检测结果计算平均值、标准偏差。根据变异系数CV＝(标准偏差/平均值)×100％，计算得到：CV1(6.4ng/mL)＝6.57％，CV2(25.6ng/mL)＝5.12％。由此可知，本发明提供的试剂盒具有较高的精密度。
（六）准确度验证（论证3）
取具有溯源性的血清高值质控品、低值质控品各一份，用本发明的试剂盒分别进行检测，各检测5次，计算平均值，后与质控品靶值进行对照。结果显示，本发明的试剂盒检测值与靶值接近，说明本发明提供的试剂盒具有较高的准确度。
（七）灵敏度验证（论证4）
取具有溯源性的质控品稀释至检测范围下限(1ng/mL)附近进行测定，重复测定3次，计算平均值，后与质控品靶值进行对照。结果显示，本发明的试剂盒检测值与靶值接近，说明本发明提供的试剂盒具有较高的灵敏度。
（八）检测范围验证（论证5）
取具有溯源性的标准品，稀释不同的倍数后分别检测是否有发光现象，结果显示，在浓度为1～160ng/mL的范围内，均有发光现象，表明本发明的试剂盒检测范围为1～160ng/mL。
（九）包被毛细管37℃稳定性验证（论证6）
取部分包被抗体后的玻璃毛细管于37℃恒温恒湿箱中放置7天进行加速试验，试验后测得信号保留率90%左右，说明此包被毛细管具有较高的稳定性。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：在S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的羧基化处理，具体过程如下：
先让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化，再通过二氢-3-[3-（三乙氧基硅基）丙基]呋喃-2,5-二酮（TESPSA）与硅羟基反应得到含端羧基的羧基化玻璃毛细管。
下面结合具体的实验步骤对本发明做进一步详细阐述：
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化，其具体步骤如下：
（1）玻璃毛细管准备：将玻璃毛细管装入50ml离心管内（装量：300根/管），通过上下震动或借助镊子让玻璃毛细管竖直平铺一层于离心管中。
（2）玻璃毛细管羟基化：
a向离心管中加入灭菌水（13ml/管，确保水浸没玻璃毛细管），超声或上下震动排除管内气泡，确保玻璃毛细管中无气泡；然后将离心管放入烘箱中100℃空气浴4h。
b处理完成后，排掉玻璃毛细管内水分（通过扎孔的离心管人为甩掉玻璃毛细管内水分），然后将离心管（不需要盖离心管盖）放入烘箱中100℃干燥固定1h。如短时间内不能进行氨化处理，需将玻璃毛细管放入4℃冰箱干燥保存（保存时间不要超过24h），以备后续处理。
（3）玻璃毛细管表面羧基修饰：
b.通过二氢-3-[3-（三乙氧基硅基）丙基]呋喃-2,5-二酮（TESPSA）与硅羟基反应，得到含端羧基的羧基化玻璃毛细管，其具体步骤如下：
羧基化：玻璃毛细管经羟基化处理后，加入10% TESPSA (二氢-3-[3-（三乙氧基硅基）丙基]呋喃-2,5-二酮) ，放入烘箱中37℃反应16-20h；然后排掉管内试剂，用去离子水洗3次（每次浸泡2min），吹干或烘箱中25℃过夜烘干。然后将处理好的玻璃毛细管做好标记（批号和编号）并放入4℃冰箱干燥保存备用。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的羟基化处理，具体过程如下：
先让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化；再通过3-（2,3环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）接枝于羟基得到端环氧基团，然后环氧基通过硫基乙醇转化为羟基，得到含有枝形结构的羟基化玻璃毛细管。
下面结合具体的实验步骤对本发明做进一步详细阐述：
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化，其具体步骤如下：
（1）玻璃毛细管准备：将玻璃毛细管装入50ml离心管内（装量：300根/管），通过上下震动或借助镊子让玻璃毛细管竖直平铺一层于离心管中。
（2）玻璃毛细管羟基化：
a向离心管中加入灭菌水（13ml/管，确保水浸没玻璃毛细管），超声或上下震动排除管内气泡，确保玻璃毛细管中无气泡；然后将离心管放入烘箱中100℃空气浴4h。
b处理完成后，排掉玻璃毛细管内水分（通过扎孔的离心管人为甩掉玻璃毛细管内水分），然后将离心管（不需要盖离心管盖）放入烘箱中100℃干燥固定1h。如短时间内不能进行氨化处理，需将玻璃毛细管放入4℃冰箱干燥保存（保存时间不要超过24h），以备后续处理。
c 通过3-（2,3环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）接枝于羟基得到端环氧基团，然后环氧基通过硫基乙醇转化为羟基，得到含有枝形结构的羟基化玻璃毛细管，其具体步骤如下：
玻璃毛细管经羟基化处理后，加入10% GPTMS (3-（2,3环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷) ，放入烘箱中70℃反应4h；然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次（每次浸泡2min），吹干；向上述玻璃毛细管中加入10%硫基乙醇，放入烘箱中40℃反应16-20h，然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次（每次浸泡2min），吹干或烘箱中25℃过夜烘干。然后将处理好的玻璃毛细管做好标记（批号和编号）并放入4℃冰箱干燥保存备用。

Claims (3)

1.一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：修饰，将玻璃毛细管表面进行修饰处理；
S2：包被抗体，将稀释后的包被抗体溶液固定到经修饰处理后的玻璃毛细管上；
S3：封闭，将S2中已包被抗体玻璃毛细管进行封闭处理；
S1中，所述修饰处理为玻璃毛细管的氨基化处理，具体过程如下：
a.让玻璃毛细管在110℃的H2O中使玻璃毛细管表面羟基化；
具体步骤为：向离心管中加入灭菌水确保水浸没玻璃毛细管，超声或上下震动排除管内气泡，确保玻璃毛细管中无气泡；然后将离心管放入烘箱中100℃空气浴4h；
处理完成后，排掉玻璃毛细管内水分，然后将离心管放入烘箱中100℃干燥固定1h；如短时间内不能进行氨化处理，需将玻璃毛细管放入4℃冰箱干燥保存，以备后续处理；
b. 将枝形聚合物 PAMAM通过硅烷化试剂 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的端氨基与甲基丙烯酸甲酯（MMA）的双键发生Micheal加成反应，逐步键合到玻璃毛细管内壁上得到半代的 PAMAM；然后端酯基与乙二胺（EDA）发生酰胺化反应，得到整代的枝形大分子聚酰胺-胺（PAMAM），得到氨基化的玻璃毛细管表面；具体步骤如下：
a半级氨化：玻璃毛细管经羟基化处理后，加入10%APTES，放入烘箱中70℃反应4h；然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次，每次浸泡2min，吹干；
b Michael加成：向上述玻璃毛细管中加入10%MMA，放入烘箱中40℃反应24h，然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次，每次浸泡2min，吹干；
c 一级氨化：向上述玻璃毛细管中加入20%EDA，放入烘箱中40℃反应24h，然后排掉管内试剂，用无水乙醇洗3次，每次浸泡2min，吹干或烘箱中25℃过夜烘干；然后将处理好的玻璃毛细管做好标记并放入4℃冰箱干燥保存备用；在S2中，所述包被抗体溶液由磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液进行稀释；并将玻璃毛细管在37℃条件下，包被1-5H；
在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管主要成分是氨基化处理的玻璃毛细管，玻璃毛细管的材质为高硼硅玻璃 ID=0.7mm±0.005mm ； OD=1.2mm±0.02mm ；L=30mm±0.5mm；
在S3中，所述已包被抗体玻璃毛细管是通过包被抗体溶液与玻璃毛细管按照包被量为10～30μg/mL，于37℃温育条件下，在pH为6.5～7.5的20～100mmol/L磷酸盐缓冲液中交联反应1～5h得到。
2.根据权利要求1所述的一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：所述封闭处理时间为1-3H，封闭处理时使用的封闭液为：脱脂奶粉、酪蛋白钠盐或者牛血清白蛋白溶液。
3.根据权利要求2所述的一种玻璃毛细管表面抗体固定方法，其特征在于：所述封闭液为：2%酪蛋白钠盐溶液，所述酪蛋白钠盐溶液加入玻璃毛细管后于37℃条件下反应1～3H。
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