KR101960161B1

KR101960161B1 - 호모시스테인 및 시스테인 검출용 바이오센서

Info

Publication number: KR101960161B1
Application number: KR1020170053868A
Authority: KR
Inventors: 신재호; 아바스 자디 사비; 허민
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2019-03-19
Also published as: KR20180120001A

Abstract

본 발명은 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대해 높은 선택성을 나타내며 검출 한계, 신뢰성 및 안정성 면에서도 우수한 결과를 보이는 바이오센서에 관한 것이다. 특히 본 발명은 분자 각인 중합체(MIP)의 선택에 의해 티올기를 함유하는 유사한 구조의 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)을 구분하는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 이를 적용함으로써 각각의 분석 물질에 대해 높은 선택성을 가지고 검출하는 것이 가능한 수단을 제공한다. 따라서 본 발명은 각종 질환의 지료로 알려져 있는 HCys 및 Cys의 검출에 유의미하게 사용될 수 있다.

Description

호모시스테인 및 시스테인 검출용 바이오센서{Biosensors for detecting Homocysteine and Cysteine}

본 발명은 호모시스테인(Homocysteine, HCys) 및 시스테인(Cysteine, Cys) 검출용 센서에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 분자 각인 중합체(Molecularly imprinted polymer, MIP)를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.

호모시스테인(HCys, 2-아미노-4-머캅토부티르산(2-amino-4-mercaptobutyric acid)) 및 시스테인(Cys, 2-아미노-3-설프하이드릴프로피온산(2-amino-3-sulfhydrylpropanoic acid))은 각각 하기의 구조식으로 나타내어지는 바와 같이 티올기(-SH)를 포함하는 아미노산이다.

호모시스테인(HCys)은 메티오닌(Methionine)이 시스테인(Cysteine)으로 대사되는 과정의 중간물질(중간체)이다. 이 과정에서 문제가 생기면 HCys이 증가하게 된다. 체내에서 HCys의 농도는 심혈관 질환(Cardiovascular diseases), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 골다공증(Osteoporosis), 신경관결손(Neural tube defects) 및 신경독성(Neurotoxicity) 등의 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서 HCys의 농도를 정확하게 측정하는 것은 임상적인 관점에서 매우 가치있는 생체지표를 제공하는 수단이 될 수 있다.

정상적인 체내 HCys의 농도는 5 내지 16 nmol/mL 범위이며, 상기 범위에서 벗어나는 것은 다양한 나이에 관련된 질환들에 대한 지표를 제공한다. 낮은 농도의 HCys은 종종 신경독성(Neurotoxicity)과 관련될 수 있으며, 반면 높은 농도는 심혈관 질환(Cardiovascular diseases), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 특히 임신 중 염증성장질환(Inflammatory bowel diease) 및 골다공증(Osteoporosis), 신경관결손(Neural tube defects)과 관련될 수 있다. 다른 한편, HCys 대사 과정에서의 변화는 임상적으로 당뇨병 환자에게서 관찰될 수 있으며 또한 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되었다.

한편, 시스테인(Cys)은 HCys 대사의 최종 산물로서 물에 대한 용해도가 매우 낮기 때문에 소변을 통해 배출되지 않고 축적되어 시스틴뇨증(Cystinuria)를 유발하거나, 신장과 같은 체내 기관에 축적되어 신경독성(Neurotoxicity)을 유발할 수 있다. 또한 낮은 농도의 Cys은 느린 성장(Slow growth), 모발 탈색(Hair depigmentation), 수종(Edema), 기면(Lethargy), 간 손상(Liver damage), 근육 및 지방 감소(Muscle and fat loss), 피부 병변(Skin lesions) 및 체력 약화(Weakness) 등의 원인이 된다.

상술한 바와 같이 HCys 및 Cys의 농도를 정확하게 측정하는 것은 각종 질환의 환자에 대한 정확하고 적합한 치료를 제공하기 위하여 의료진에게 매우 중요한 과제이다.

생물적 시스템 내에서, HCys은 다른 티올기 함유 화합물 예를 들면, Cys, 메티오닌(Methionine), N-아세틸시스테인(N-acetylcycteine), 시스티아민(Cysteamine) 및 글루타치온(Glutathione)과 함께 존재한다. 이들은 HCys의 정확한 측정을 방해하는 방해종으로 작용한다. 따라서 HCys 및 Cys의 농도를 정확하게 측정하기 위한 수많은 방법들이 제시되어 왔다. 예들 들어, 크로마토그래피적 분리(Chromatographic separation)(Abad Khan, Muhammad I. Khan, Zafar Iqbal, Yasar Shah, Lateef Ahmad, Shabnam Nazir, David G. Watson, Jamshaid Ali Khan, Fazli Nasir, Abbas Khan, Ismail, Talanta 84 (2011) 789-801), 전기영동 방법(Electrophoretic methods)( Xinjian Huang, W. Th. Kok, J. Chromatogr A, 716, 1995, 347-353), 분광학적 방법(Spectrometric methods)(Xiangming Guan, Brianna Hoffman, Chandradhar Dwivedi, Duane P Matthees, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 31, Issue 2, 26 February 2003, Pages 251-261), 비색법(Colorimetric methods)(Weihua Wang, Jorge O. Escobedo, Candace M. Lawrence, and Robert M. Strongin, Direct Detection of Homocysteine, J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 3400-3401), 형광법(fluorimetric detection)(Y.V. Tcherkas , A.D. Denisenko, Journal of Chromatography A, 913 (2001) 309-313), 전기화학적발광(Electrochemiluminescence, ECL) 면역센서 측정법(Immunosensor detection)(Haijun Wang, Yaqin Chai, Ruo Yuan, Yaling Cao, Lijuan Bai, Highly enhanced electrochemiluminescent strategy for tumor biomarkers detection with in situ generation of l-homocysteine for signal amplification, AnalyticaChimicaActa815(2014) 16-21), 직접적인 전기화학적 측정법(direct electrochemical detection)(Kuanping Gong, Yu Dong, Shaoxiang Xiong, Yi Chen, Lanqun Mao, Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 253-259 외 다수) 등이 있다. 이 중에서 전기화학적 측정법은 티올(Thiols) 및 다이설파이드(Disulfides)와 같은 산화환원적으로 활성인 화합물의 분석에 있어서 매우 중요한 수단으로 활용되어져 왔다.

여러 티올 함유 화합물 중에서도 HCys 및 Cys의 경우 앞서 보여진 구조식에서와 같이 그 구조가 매우 유사하기 때문에 특히 이들을 구분하여 농도를 측정하는 것이 쉽지 않다. 따라서 이들 각각의 농도를 정확하게 측정하고자 하는 노력을 계속하던 중 본 발명에 이르게 되었다.

한편, '분자 각인 중합체(Molecularly imprinted polymer, MIP)'는 적당한 주형물질(Template; 이후 설명될 것이지만 본 발명에서는 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 해당됨)과 단량체(또는 단위체)를 이용하여 중합체를 합성한 후 주형물질을 제거함으로써 주형물질의 형상을 기억하고 그와 동일한 공간을 포함하고 있는 중합체를 말한다. 분자 각인 중합체는 높은 선택성 및 안정성 때문에 특정 물질의 검출, 인식, 제거, 추출, 전달, 분석 등 다양한 분야에 응용되어 왔다(Gonzalez, G.P., Hernando, P.F., Alegria, J.S.D., Anal. Chim. Acta, 2009, 638, 209-212외 다수). 상기 분자 각인 중합체를 얻는 기술 즉, 분자 각인 기술(Molecular imprinting technique)은 어떠한 주형물질이라도 단량체 용해되어 있는 용액에 투입하여 3차원의 고분자 구조를 형성할 수 있고, 이로부터 주형물질을 제거한 후에는 원래 주형물질에 대해 선택성 있게 결합할 수 있는 캐비티(Cavities)가 형성된다. 또한 MIP는 가혹한 합성 및 분석 환경에서 높은 안정성 및 견고성을 나타낸다.

본 발명은 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)을 구분하여 각각의 농도를 정확하게 측정할 수 있는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 분자 각인 중합체(MIP)를 이용함으로써 간단한 방법으로 이들을 구분하는 방법을 제시하고자 한다.

또한 본 발명은 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys) 각각에 대하여 우수한 검출 한계 및 신뢰성 있는 결과를 제공하는 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 전극 및 상기 전극 위에 형성된 호모시스테인(Homocysteine, HCys) 또는 시스테인(Cysteine, Cys)에 대한 분자 각인 중합체(molecularly imprinted polymer, MIP)를 포함하며, 상기 분자 각인 중합체는 각각 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대해 선택성을 갖는 것으로서, 이에 의해 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)의 농도를 측정하는 바이오센서를 제공한다.

바람직하게, 상기 센서는 분자 각인 중합체(MIP)의 선택에 의해 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)을 구분하여 측정할 수 있다.

바람직하게, 상기 전극은 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)이다.

바람직하게, 상기 분자 각인 중합체는 폴리아닐린(Polyaniline, PANI) 또는 폴리피롤(Polypyrrole, PPy)을 포함하는 것이다.

바람직하게, 상기 분자 각인 중합체는 호모시스테인(Homocysteine, HCys) 및 아닐린(Aniline)을 포함하는 용액 내에 상기 전극을 딥핑하여 중합 반응을 개시함으로써 제조되며, 중합 반응 완료 후에는 호모시스테인(HCys)이 제거되는 것이다.

바람직하게, 상기 분자 각인 중합체는 시스테인(Cysteine, Cys) 및 피롤(Pyrrole)을 포함하는 용액 내에 상기 전극을 딥핑하여 중합 반응을 개시함으로써 제조되며, 중합 반응 완료 후에는 시스테인(Cys)이 제거되는 것이다.

바람직하게, 상기 바이오센서는 작업 전극, 카운터 전극 및 기준 전극의 삼전극계 또는 작업전극 및 기준 전극의 이전극계이다.

바람직하게, 상기 중합 반응은 순환 전압 전류법(Cyclic voltammetry, CV), 네모파 순환전압 전류법(Squarewave voltammetry, SWV), 계단 전압 전류법(Staircase voltammetry), 또는 차이 펄스 전압 전류법(Differential pulse voltammetry, DPV)에 의해 수행되는 것이다.

바람직하게, 상기 분자 각인 중합체는 폴리아닐린(Polyaniline, PANI)을 포함하며, 호모시스테인(HCys)의 농도를 측정하는 것이다.

바람직하게, 상기 바이오센서는 호모시스테인(HCys)에 대한 검출 한계가 ≥0.4 μM인 것이다.

바람직하게, 상기 분자 각인 중합체는 폴리피롤(Polypyrrole, PPy)을 포함하며, 시스테인(Cys)의 농도를 측정하는 것이다.

바람직하게, 상기 바이오센서는 시스테인(Cys)에 대한 검출 한계가 ≥1 μM인 것이다.

본 발명에 의하면 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대하여 선택성이 높은 바이오센서가 제공될 수 있다. 상기 바이오센서에서는 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys) 각각에 대하여 높은 선택성을 갖는 분자 각인 중합체를 사용함으로써 여러 방해 물질이 존재하는 환경에서도 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대한 높은 타겟팅 특성을 보인다. 또한 전도성 고분자의 전기 중합에 의해 형성된 분자 각인 중합체로 인하여 안정된 전도도를 제공하며, 소량의 시료로 정확한 측정값을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명 센서 및 비교예 센서의 제조 과정을 대략적으로 도시한 것이다.
도 2는 분석 물질(HCys 및 Cys)에 대한 본 발명 센서 및 비교예 센서의 감응성을 나타낸 것이다.
도 3은 분석 물질(HCys 및 Cys)에 대한 비교예 센서의 감응성 및 선택성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 센서의 선택성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 센서에서 분석 물질(HCys 및 Cys)의 농도에 따른 신호의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 체내에 존재하는 티올(-SH) 함유 화합물, 그 중에서도 특히 유사한 구조를 갖는 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys) 각각에 대해 선택성이 높은 바이오센서를 제공하여 상기 두 물질을 구분하여 측정할 수 있는 수단을 제공한다. 이를 위해 본 발명에서는 분석 물질, 즉 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대해 높은 선택성을 갖는 분자 각인 중합체(MIP)를 제조하고 이를 포함하는 센서를 제공한다.

구체적으로 본 발명은 전극 및 상기 전극 위에 형성된 호모시스테인(Homocysteine, HCys) 또는 시스테인(Cysteine, Cys)에 대한 분자 각인 중합체(Molecularly imprinted polymer, MIP)를 포함하며, 상기 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대해 선택성을 갖는 분자 각인 중합체(MIP)에 의해 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)의 농도를 측정하는 바이오센서를 제공한다. 특히 본 발명에서는 상기 분자 각인 중합체(MIP)의 선택에 의해 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)을 구분하여 측정할 수 있는 바이오센서를 제공한다.

상기 '전극'이라 함은 작업 전극을 의미한다. 즉, 본 발명의 센서는 후술될 실시예에서와 같이, 바람직하게 작업 전극, 카운터 전극 및 기준 전극을 사용하는 삼전극계로 구성되는 것이며, 이중에서 본 발명은 특히 작업 전극의 구성에 관심을 가지고 기재될 것이다(따라서 이후 '전극'이라 함은 별 다른 언급이 없는 한 작업 전극을 의미한다).

우선 상기 전극으로 사용될 수 있는 것은 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)이나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 전극 표면에 도 1에 도시된 바와 같이 분자 각인 중합체(MIP)를 형성한다. 상기 분자 각인 중합체는 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys) 각각에 대해 선택성을 갖는 것이다. 이것은 중합 과정에서 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)을 주형 물질로 사용하여 중합된 다음, 중합 완료 후에 상기 주형 물질을 제거함으로써 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)의 형상 등을 기억하고 있게 된다. 이러한 분자 각인 중합체로는 전도성 고분자를 사용하는 것이 센서의 전도성을 향상시키므로 바람직하다.

전도성 고분자 중에서도 본 발명에서는 특히 폴리아닐린(PANI) 또는 폴리피롤(PPy)이 본 발명의 분석 물질인 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)에 대해 높은 선택성을 나타내는 것을 확인하고 이를 분자 각인 중합체로서 사용하는 방법을 제시한다. 나아가 본 발명에서는 상기 전도성 고분자의 선택에 따라 호모시스테인(HCys)과 시스테인(Cys)을 구분하여 측정하는 것이 가능하다는 것을 확인하고 이를 제시한다. 즉, 호모시스테인(HCys)의 경우 폴리아닐린(PANI)을 사용하고, 시스테인(Cys)의 경우 폴리피롤(PPy)을 사용하는 것이 선택성이 높게 나타난다. 반면, 이들을 반대로 조합할 경우, 다시 말하여, 호모시스테인(HCys)에 폴리피롤(PPy)을 사용하는 경우 및 시스테인(Cys)에 폴리아닐린(PANI)을 사용하는 경우에는 선택성이 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 분석 물질, 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 따라 높은 선택성이라는 현저한 효과를 나타낼 수 있도록 분자 각인 중합체를 제공하는 기술을 제시한다.

상기와 같이 분석 물질, 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 따라 분자 각인 중합체, 더욱 정확하게는 분자 각인 중합체로 사용하는 전도성 고분자를 선택할 경우 본 발명의 센서는 각각의 분석 물질에 대해 임상적으로 유의미하게 사용될 수 있는 검출 한계를 제공한다.

상기 분자 각인 중합체를 제조하기 위하여 본 발명에서는 도 1에 도시된 바와 같이 주형 물질(호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)) 및 단량체(아닐린(Aniline) 또는 피롤(Pyrrole))을 포함하는 용액 내에 전극을 딥핑하여 전기적 중합 반응을 개시한다. 상기 전기적 중합 반응은 순환 전압을 일정 회수의 사이클로 걸어주어 전극 표면에 3차원 구조의 분자 각인 중합체가 성장되도록 한다. 중합 반응 완료 후에는 예를 들어 세척 등으로 주형 물질을 제거하는데, 그 후 주형 물질의 형상 등에 대한 기억을 기반으로 주형 물질의 타겟팅을 위한 미세 환경이 조성된 분자 각인 중합체의 제조가 완성되는 것이다. 완성된 전극은 주형 물질을 분석 물질로 포함하는 시료에 투입되었을 때 주형 물질과 선택적으로 결합하게 되고 이에 의해 전기화학적 신호를 발생시키게 된다.

한편, 도 1에 함께 도시된 바와 같이 주형 물질을 포함시키지 않고 단량체 만으로 중합 반응을 실시하면 분자 각인 중합체(MIP)에 대조적으로, 주형 물질에 대한 미세 환경을 포함하지 않는 중합체(No imprinted polymer, NIP)가 형성된다. 이들에 대해서는 후술될 것이지만, 주형 물질에 대한 타겟팅이 일어나지 않으므로 당연히 전기화학적 신호가 발생하지 않는다.

본 발명의 센서는 상기 제조된 전극을 작업 전극으로 사용하고, 이에 한정되는 것은 아니나, 예로서 백금 와이어를 카운터 전극으로 Ag/AgCl를 기준 전극으로 사용하는 삼전극계로 구성되거나 Ag/AgCl 전극을 카운터 및 기준전극으로 사용하는 이전극계로 구성될 수 있다. 또한 본 발명의 센서로부터 분석 물질의 검출을 위해서는 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry, CV), 네모파 전압 전류법(Square wave voltammetry, SWV), 계단 전압 전류법(Staircase voltammetry, SCV), 차이 펄스 전압 전류법(Differential pulse voltammetry, DPV)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게, 차이 펄스 전압 전류법(DPV)을 사용한다.

일 실시예로서 도 2에서와 같이 산화 및 환원 반응에 의해 얻어지는 곡선 'DPV 커브' 상의 피크 전류 값에 의해 분석 물질의 농도를 측정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

<호모시스테인(HCys) 농도 측정을 위한 바이오센서(HCys-센서)의 제작>

백금 전극(Pt) 표면을 알루미나-물 슬러리로 연마하고 증류수로 세척한 다음, 0.5 M H₂SO₄ 용액 내에서 CV를 15회 반복(15 cycles) 하였다(스캔 속도: 100 mV/s, 스캔 범위: -0.2 내지 1.6 V).

다음으로, 전극 위에 분자 각인 중합체를 형성하기 위하여, 0.1 M의 HCl 및 톨루엔 내의 20 mM의 HCys 및 100 mM의 아닐린(aniline) 용액 내에 전극을 딥핑하고, -0.5 내지 1.6 V의 구간에서 100 mV/s의 스캔 속도로 CV를 10회 반복(10 cycles) 하여 전기적 중합 반응이 일어나도록 하였다. 중합이 완료된 후에는 HCys을 제거하기 위하여 에탄올:아세트산(90:10 v/v %) 혼합물로 수분 간 세척하는 것으로 작업 전극을 완성하였다.

다음으로 상기 작업전극, 카운터 전극(백금 와이어) 및 기준 전극(Ag/AgCl)으로 구성되는 센서를 제작하였다.

실시예 2

<시스테인(Cys) 농도 측정을 위한 바이오센서(Cys-센서)의 제작>

실시예 1에서 분자 각인 중합체 형성을 위한 전극 딥핑 용액으로 0.1 M LiClO₄ 내의 25 mM의 Cys 및 50 mM의 피롤(pyrrole) 용액을 사용하며, 전기적 중합 반응을 위하여 -0.6 내지 1.0 V의 구간에서 CV를 수행 순환 전압 스윕핑하는 것을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 제작하였다.

비교예 1

도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 전극 딥핑 용액에 HCys이 포함되지 않는 것을 사용하며, HCys을 제거하기 위한 과정을 수행하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 제작하였다.

비교예 2

도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 2에서 전극 딥핑 용액에 Cys이 포함되지 않는 것을 사용하며, Cys을 제거하기 위한 과정을 수행하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 제작하였다.

비교예 3

실시예 1에서 분자 각인 중합체 형성을 위한 전극 딥핑 용액에 HCys 대신 Cys을 사용하는 것을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 제작하였다.

<센서의 성능 평가>

1. 분자 각인 중합체의 선택에 따른 센서의 선택성 평가

(1) HCys 센서

실시예 1의 센서에 대하여 0.1 M PBS(Phosphate buffer solution) 용액(pH: 7.0), 100 μM의 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0) 및 100 μM의 Cys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0)에서 3 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 차이 펄스 전압법(DPV)으로 -0.2 내지 0.8 V의 구간에서 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 또한 비교를 위하여 비교예 1의 센서에 대하여 100 μM의 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0)에서 3 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 -0.2 내지 0.8 V의 구간에서 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 결과를 도 2(a)에 나타내었다. 이를 보면, 실시예 1의 센서는 HCys에 대하여 높은 감응성(0.55 V에서의 산화 피크)을 나타내었고 Cys에 대해서는 거의 감응하지 않았다. 따라서 실시예 1의 센서는 HCys에 대해 높은 선택성을 갖는 센서임을 확인할 수 있다. 특히, HCys와 Cys이 구조적으로 유사함에도 불구하고, 생성된 분자 각인 중합체 내의 미세구조는 HCys에 대한 선택성을 나타내는 것이다. 한편, 비교예 1의 센서는 HCys에 대하여 감응하지 않았다.

상기 결과로부터, 실시예 1 센서의 제작 과정에서 주형 물질로 포함된 HCys에 의해 분자 각인 중합체 내에 HCys가 선택적으로 결합되는 미세 구조가 형성되었으며, 여기에 HCys가 선택적으로 결합됨으로써 HCys에 대한 선택성을 갖는 센서가 제작되었음을 확인할 수 있었다.

(2) Cys 센서

다음으로, 실시예 2의 센서에 대하여 0.1 M PBS 용액(pH: 8.0), 100 μM의 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 8.0) 및 100 μM의 Cys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 8.0)에서 5 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 -0.8 내지 0.4 V의 구간에서 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 또한 비교를 위하여 비교예 2의 센서에 대하여 100 μM의 Cys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 8.0)에서 5 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 -0.8 내지 0.4 V의 구간에서 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 결과를 도 2(b)에 나타내었다. 이를 보면, 실시예 2의 센서는 Cys에 대하여 높은 감응성(0.2V에서의 산화 피크)을 나타내었고, HCys에 대해서는 거의 감응하지 않거나 낮은 감응성을 보였다. 따라서 실시예 2의 센서는 Cys에 대해 높은 선택성을 갖는 센서임을 확인할 수 있다. 특히, Cys와 HCys이 구조적으로 유사함에도 불구하고, 생성된 분자 각인 중합체 내의 미세구조는 Cys에 대한 선택성을 나타내는 것이다. 한편, 비교예 2의 센서는 Cys에 대하여 감응하지 않았다.

상기 결과로부터, 실시예 2 센서의 제작 과정에서 주형 물질로 포함된 Cys에 의해 분자 각인 중합체 내에 Cys가 선택적으로 결합되는 미세 구조가 형성되었으며, 여기에 Cys가 선택적으로 결합됨으로써 Cys에 대한 선택성을 갖는 센서가 제작되었음을 확인할 수 있었다.

한편, 비교예 3의 센서에 대하여 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0), 100 μM의 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0) 및 100 μM의 Cys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0)에서 3 분 동안 인큐베이션시킨 다음, -0.2 내지 0.8 V 구간에서 순환전압전류법(CV)으로 100 mV/s의 속도로 스캔하였다.

결과를 도 3(a)에 나타내었다. 이를 보면, 비교예 3의 센서는 주형 물질로 HCys을 사용한 경우인 실시예 1의 센서와 비교할 때 및 분자 각인 중합체로 PPy을 사용한 경우인 실시예 2의 센서와 비교할 때, Cys에 대한 높은 선택성을 나타내지 못한다는 것을 알 수 있다. 즉, HCys 및 Cys을 잘 구분하지 못하였다.

다음으로, 도 3(b)는 비교예 3 센서의 선택성을 다시 한번 확인하기 위하여 100 μM의 다양한 분석 물질을 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0)에서 3 분 동안 인큐베이션시킨 다음, -0.2 내지 0.8 V 구간에서 순환전압전류법(CV)으로 100 mV/s의 속도로 스캔한 결과를 나타낸 종합하여 나타낸 것이다. 이를 보면, 비교예 3의 센서는 Cys에 대하여 가장 높은 신호를 나타내기는 하지만 HCys과의 구분이 여전히 분명하지 않음을 재차 확인할 수 있었다.

상기의 결과는 Cys에 대한 분자 각인 중합체로 PPy 대신 PANI을 사용할 경우 Cys에 대해 높은 선택성을 갖는 센서를 제작할 수 없다는 것을 확인해준다. 따라서 본 발명에서 제시하는 바와 같이 유사한 구조에도 불구하고 HCys 및 Cys 각각에 대해 선택성을 나타내는 분자 각인 중합체가 존재하며, 이것을 발견하고 선택하는 것에 본 발명 센서 제작 기술의 특징이 존재한다.

2. 센서의 선택성 평가

실시예 1 및 2의 센서의 선택성을 평가하기 위하여 다양한 분석 물질(HCys, Cys, L-메티오닌(L-methionine, L-Meth), N-아세틸-l-시스테인(N-acetyl-l-cysteine, NAC), 아스코르브산(ascorbic acid, AA) 및 요산(Uric acid, UA))을 100 μM 농도로 포함하는 0.1 M PBS 용액에 대하여 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 센서의 신호를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4(a)를 보면 실시예 1 센서의 경우 여러 방해종의 존재에도 불구하고 HCys에 대해 높은 선택성을 나타내고, 도 4(b)를 보면 실시예 2 센서의 경우 Cys에 대해 높은 선택성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 여러 방해종 중에서도 유사한 티올 함유 화합물인 HCys와 Cys 간의 구분이 명확하게 나타난다는 점에서 본 발명 센서의 효과를 확인할 수 있었다.

3. 센서의 감응성 평가

다음으로, 실시예 1 및 2 센서의 분석 물질의 농도에 따른 감응도를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 분석 물질, 즉 HCys 및 Cys을 포함하는 시료에 대해 측정하였다. 실시예 1의 센서를 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 120, 140, 150 μM의 다양한 농도로 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 7.0)에서 3분 동안 인큐베이션시킨 다음, 0.0 내지 0.8 V의 구간에서 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 각 시료에서의 측정 후 센서는 0.1 M PBS 용액 내 -0.5 내지 1 V의 구간에서 수회에 걸친 전위 스캔 및 아세토니트릴 및 아세트산(90/10, v/v%)의 혼합 용액으로 3 내지 4분 동안 용출시키는 것으로 표면을 재생시켰다. 결과를 도 5(a)에 나타내었다.

한편, 실시예 2의 센서를 2, 8, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 120 μM의 다양한 농도로 HCys를 포함하는 0.1 M PBS 용액(pH: 8.0)에서 5분 동안 인큐베이션시킨 다음, 차이 펄스 전압 전류법(DPV)으로 -0.4 내지 0.4 V의 구간에서 100 mV/s의 속도로 스캔하였다. 각 시료에서의 측정 후 센서는 0.1 M PBS 용액 내 -0.5 내지 1 V의 구간에서 수회에 걸친 전위 스캔 및 아세토니트릴 및 아세트산(90/10, v/v%)의 혼합 용액으로 3 내지 4분 동안 용출시키는 것으로 표면을 재생시켰다. 결과를 도 5(b)에 나타내었다.

상기 결과로부터, 시료 내 분석 물질의 농도가 증가할수록 신호가 선형적으로 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 각 센서에서의 검출 한계는 실시예 1 센서에서 0.4 μM 및 실시예 2 센서에서 1 μM로 결정되었다. 이것은 본 발명의 센서가 생물의 유체 내에 포함된 HCys 및 Cys의 유의미한 검출에 충분한 수단으로 사용될 수 있음을 시사한다.

4. 센서의 회수율 평가

센서의 회수율을 평가하기 위하여 spiked sample을 사용하였다. 실시예 1 센서에 대하여 2, 10, 25, 50, 100, 120 μM 농도의 HCys를 포함하는 샘플 및 실시예 2 센서에 대하여 5, 10, 25, 50, 75, 100 μM 농도의 Cys를 포함하는 샘플에 대해 센서의 성능을 평가하였다. 각 샘플에 대해 센서로 농도를 측정하고 측정값으로부터 회수율을 계산하였다. 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었다.

상기 표로부터 본 발명의 센서는 HCys에 대해 최대 회수율 96.3% 및 최대 RSD 2.03%; 그리고 Cys에 대해 최대 회수율 93% 및 최대 RSD 2.6%을 나타내었다. 상기 회수율은 매우 우수하며, 허용될 만한 수준의 RSD를 갖는 것이다. 이로부터 본 발명의 센서는 신뢰성 있는 측정 결과를 제공할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

5. 센서의 신뢰성 및 안정성 평가

실시예 1 및 2 센서의 반복 측정에서의 신뢰성을 평가하기 위하여 하나의 샘플에 대해 8번 반복 측정하였다. 100 μM의 HCys 및 Cys을 포함하는 샘플을 사용하였다. 그 결과 실시예 1 센서는 3.7% 및 실시예 2 센서는 3.8%의 상대표준편차(RSD) 값을 갖는 신뢰성 있는 결과를 나타냈다.

한편, 실온에서 ~4달 간 보관하면서 센서의 성능을 테스트함으로써 센서의 안정성을 평가하였다. 그 결과 실시예 1 센서의 경우, 8주 경과 후 감응성은 단지 14% 감소되었을 뿐이었다. 그러나 12주 및 16주 후에는 각각 30% 및 60% 감소되었다. 16주 경과 후에는 센서의 감응성이 손실되었다. 또한 실시예 2 센서의 경우, 8주 경과 후 감응성은 단지 20% 감소되었을 뿐이었다. 그러나 12주, 16주 및 18주 후에는 각각 40%, 65% 및 80% 감소되었다. 18주 경과 후에는 센서의 감응성이 손실되었다.

Claims

전극 및 상기 전극 위에 형성된 호모시스테인(Homocysteine, HCys) 또는 시스테인(Cysteine, Cys)에 대한 분자 각인 중합체(Molecularly imprinted polymer, MIP)를 포함하며, 상기 분자 각인 중합체는 각각 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)에 대해 선택성을 갖는 것으로서, 상기 분자 각인 중합체(MIP)의 선택에 의해 호모시스테인(HCys) 및 시스테인(Cys)을 구분하며, 또한 이에 의해 각각 호모시스테인(HCys) 또는 시스테인(Cys)의 농도를 측정하는 바이오센서.
삭제
제 1 항에서,
상기 전극은 금(Au), 백금(Pt) 또는 글래시 카본(GC)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 분자 각인 중합체는 폴리아닐린(Polyaniline, PANI) 또는 폴리피롤(Polypyrrole, PPy)을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 분자 각인 중합체는 호모시스테인(HCys) 및 아닐린(aniline)을 포함하는 용액 내에 상기 전극을 딥핑하여 중합 반응을 개시함으로써 제조되며, 중합 반응 완료 후에는 호모시스테인(HCys)이 제거되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 분자 각인 중합체는 시스테인(Cys) 및 피롤(pyrrole)을 포함하는 용액 내에 상기 전극을 딥핑하여 중합 반응을 개시함으로써 제조되며, 중합 반응 완료 후에는 시스테인(Cys)이 제거되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 바이오센서는 작업 전극, 카운터 전극 및 기준 전극의 삼전극계 또는 작업전극 및 기준 전극의 이전극계인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 6 항에서,
상기 중합 반응은 순환 전압 전류법(Cyclic voltammetry, CV), 네모파 순환전압 전류법(Squarewave voltammetry, SWV), 또는 계단 전압 전류법(Staircase voltammetry), 차이 펄스 전압 전류법(Differential pulse voltammetry, DPV) 중 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 분자 각인 중합체는 폴리아닐린(polyaniline, PANI)을 포함하며, 호모시스테인(HCys)의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 9 항에서,
상기 바이오센서는 호모시스테인(HCys)에 대한 검출 한계가 ≥0.4 μM인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1 항에서,
상기 분자 각인 중합체는 폴리피롤(polypyrrole, PPy)을 포함하며, 시스테인(Cys)의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 11 항에서,
상기 바이오센서는 시스테인(Cys)에 대한 검출 한계가 ≥1 μM인 것을 특징으로 하는 바이오센서.