CN105181769A - 基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器及制备方法，属于电化学传感器及其制备技术领域。基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器为制备的肽纳米管/壳聚糖在电极界面形成了类似网状结构，肽纳米管相互交错、均匀的分布在壳聚糖薄膜中，其中肽纳米管直径在100-500nm，长度在100-1000μm范围内。制备步骤包括：肽纳米管/壳聚糖复合材料的制备，肽纳米管/壳聚糖修饰电极的制备，基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器的制备。优点在于，通过简单的制备方法，构建高性能的界面，从而实现对癌细胞快速、灵敏地检测。

Description

基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器及制备方法

技术领域

本发明属于电化学传感器及其制备技术领域，具体涉及一种基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器及制备方法。

背景技术

癌症是引起死亡率最高的疾病之一。癌症的早期诊断是提高癌症治疗成功率和病人存活率最重要和最有效的保障之一。因此，早期准确地检测癌症细胞对于临床诊断以及检测癌症相关过程的监测具有非常重要的意义。然而现代诊断技术大多数存在仪器设备昂贵、过程繁琐而且花费高、耗时长等不足。电化学方法，由于其响应快、灵敏度高、成本低以及易于操作等优点，是一种癌症监测的理想方法。然而，构建电化学细胞传感器存在两个关键问题，第一要求构建的电极界面具有好的生物相容性，有利于细胞的黏附和存活；另一方面要求电极界面具有好的电子导电性，有利于电子的传递。为了满足这些目标，近年来许多纳米材料如金纳米粒子、碳纳米纤维及其他们的复合材料等已应用于构建电化学细胞传感器。但是，这些纳米材料在应用中仍存在着安全性、器件化、制备复杂等问题。因此，发展生物相容性高、制备方法简单的电化学细胞传感器是未来的发展方向之一。

天然的生物纳米材料以及生物分子自组装形成的纳米结构具有优秀的生物相容性和安全性，非常适合于生物传感的构建。近来发现的二苯丙氨酸二肽(简称二肽，FF)作为Alzheimer疾病中β-淀粉样多肽成纤维的主要识别基序，具有优秀的生物相容性。以其为前体可自组装形成肽纳米管，该生物纳米材料显示出高的稳定性和好的电子传导能力，在电化学传感器中具有良好的应用前景。但是，将其在电化学细胞传感器中应用还鲜有报道。考虑到肽纳米管外表面疏水性较强，以及在电极界面黏附的稳定性差等问题，本发明将FF前体在生物聚合物壳聚糖溶液中一步自组装，在电极表面构建了生物相容性好，导电性高，稳定性好的肽纳米管/壳聚糖仿生界面，用于电化学细胞传感器的构建。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器及制备方法，通过简单的制备程序，构建高性能的界面，易于从下至上构建传感器器件；制备的仿生界面生物相容性和亲水性好，有利于细胞的黏附和存活，并且使用的原料及其降解产物均为环境友好物质；肽纳米管/壳聚糖修饰电极具稳定性好，电子传导能力佳，通过电化学交流阻抗技术，可实现对癌细胞快速、高灵敏地检测。

本发明基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器为制备的肽纳米管/壳聚糖在电极界面形成了类似网状结构，肽纳米管相互交错、均匀的分布在壳聚糖薄膜中，其中肽纳米管直径在100-500nm，长度在100-1000μm范围内。

上述电化学细胞传感器的制备包括以下步骤：

(1)肽纳米管/壳聚糖复合材料的制备

首先将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.8％-1.2％的醋酸溶液中，在20-25℃，转速为200-300rpm下磁力搅拌8-10h，直到壳聚糖粉末完全溶解，得到质量分数为0.3％-0.7％的壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中滴加FF六氟异丙醇溶液，其中FF的浓度为100–110mg·mL^-1，FF遇水后立即自组装成肽纳米管，加完后充分混匀，得到肽纳米管/壳聚糖复合溶液，其中FF六氟异丙醇溶液和壳聚糖溶液的混合体积比为1:45-1:50；

(2)肽纳米管/壳聚糖修饰电极的制备

将步骤(1)所得肽纳米管/壳聚糖复合溶液按照50-110μL·cm^-2，滴至经抛光和清洗的玻碳电极表面，置于20-25℃下干燥，得到肽纳米管/壳聚糖修饰电极；

为了测量该修饰电极的稳定性，将其在含有5mmol·L^-1K₃Fe(CN)₆和0.1mol·L^-1KCl的水溶液中，在-0.2-0.7V电压范围内，连续扫描50周。图4给出了实施例1中该修饰电极的循环伏安图。由图可见肽纳米管/壳聚糖修饰电极连续扫描50周后，氧化峰电流仍能保持为第一周氧化峰电流的99.4％，表明该修饰电极具有很高的稳定性，有利于进一步构建电化学细胞传感器。

(3)基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器的制备

首先将白血病细胞K562在1000-1200rpm下离心10-15min，将其从培养液中分离，再用PBS缓冲溶液水洗，稀释得到系列浓度的K562细胞悬浮液，然后将此悬浮液按照50-110μL·cm^-2滴加到肽纳米管/壳聚糖修饰电极的表面，在36.5-37.5℃细胞培养箱中培养2-3h，即得到了肽纳米管/壳聚糖为基础的电化学细胞传感器。

本发明与其他传统纳米材料制备的电化学细胞传感器相比，具有如下优点：

(1)由于肽纳米管/壳聚糖复合材料采用的合成方法是一步自组装的方法，即FF单体在壳聚糖溶液中，立即形成肽纳米管。相对与其他纳米材料如碳纳米纤维或石墨烯等采用高温固相法合成，然后需要经过酸化处理，超生分散等系列制备步骤，而本发明中的复合材料具有明显的制备方法简单、省时、省力，此外，该复合材料合成基于溶液自组装方法，这也有利于传感器的器件化制备；

(2)由于本发明中采用的肽纳米管和壳聚糖两种材料，都是具有高度生物相容性的特点，并且他们的降解产物均为环境友好物质，因此该复合材料有利于细胞分子的存活，以及传感器废弃后不污染环境；

(3)肽纳米管/壳聚糖形成的网状复合结构，联合了肽纳米管和壳聚糖两种材料的优点，即壳聚糖良好的成膜能力和肽纳米管好的电子传导能力，克服各自的缺点，最终形成的肽纳米管/壳聚糖仿生界面具有高的亲水性、优秀的稳定性，高的比表面积，通过电化学交流阻抗技术，可实现对癌细胞快速、高灵敏地检测。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的肽纳米管/壳聚糖复合材料的SEM图。

图2是本发明实施例1制备的肽纳米管/壳聚糖复合材料的XRD图，其中a为壳聚糖，b为肽纳米管，c为肽纳米管/壳聚糖复合材料。

图3是本发明实施例1制备的肽纳米管/壳聚糖复合材料的接触角表征图，其中a为肽纳米管，b为壳聚糖，c为肽纳米管/壳聚糖复合材料。

图4是本发明实施例1制备的肽纳米管/壳聚糖复合材料修饰玻碳电极的循环伏安曲线图，其中电解质溶液为含有5mmol·L^-1K₃Fe(CN)₆和0.1mol·L^-1KCl的水溶液，扫速为50mV·s^-1，扫描圈数50周。

图5是本发明实施例1制备的肽纳米管/壳聚糖复合材料修饰玻碳电极，在不同浓度白血病细胞K562修饰后的交流阻抗图，其中(a)5×10³，(b)5×10⁴，(c)5×10⁵，(d)5×10⁶，(e)5×10⁷cells·mL^-1，电解质溶液为5mmol·L^-1K₃Fe(CN)₃/K₄Fe(CN)₃和0.1mol·L^-1KCl的水溶液，频率范围为0.05Hz-100KHz。内插图：基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器对白血病细胞K562的定量检测的校准曲线。

具体实施方式

实施例1：

(1)肽纳米管/壳聚糖复合材料的制备

首先将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.8％的醋酸溶液中，在20℃，转速为200rpm下磁力搅拌8h，直到壳聚糖粉末完全溶解，得到质量分数为0.3％的壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中滴加FF六氟异丙醇溶液，其中FF在六氟异丙醇溶液中的浓度为100mg·mL^-1，FF遇水后立即自组装成肽纳米管，加完后充分混匀，得到肽纳米管/壳聚糖复合溶液，其中FF六氟异丙醇溶液和壳聚糖溶液的混合体积比为1:45；

图1为实施例1中制备的复合材料滴加到硅片表面，干燥后的SEM图。由图可见FF在壳聚糖溶液中可以自组装成为肽纳米管，其直径在100-500nm范围内，长约几百微米，并且形成的肽纳米管交错、均匀的分布在壳聚糖薄膜中，形成了类似网状结构。该结构具有较大的比表面积，有利于进一步细胞的固定。

图2为实施例1中制备的复合材料滴加到玻璃片表面，干燥后的XRD图。由图可见得到的复合材料的XRD衍射峰，与单独肽纳米管在水溶液中组装的衍射峰一致，并且在20°左右出现了鼓包与单独壳聚糖的类似，说明得到了肽纳米管/壳聚糖复合材料。

图3为实施例1中制备的复合材料滴加到玻璃片表面，干燥后测量接触角的图。由图可见得到的复合材料界面测量的接触角为29.4°，比单独肽纳米管(86.5°)或单独壳聚糖界面(52.0°)测量的接触角要小很多。表明肽纳米管/壳聚糖复合材料具有良好的亲水性，适宜用于细胞的固定。

(2)肽纳米管/壳聚糖修饰电极的制备

将步骤(1)所得肽纳米管/壳聚糖复合溶液按照50μL·cm^-2，滴至经抛光和清洗的玻碳电极表面，置于20℃下干燥，得到肽纳米管/壳聚糖修饰电极；

(3)基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器的制备

首先将白血病细胞K562在1000rpm下离心10min，将其从培养液中分离，再用PBS缓冲溶液水洗，稀释得到系列浓度的K562细胞悬浮液，然后将此悬浮液按照50μL·cm^-2滴加到肽纳米管/壳聚糖修饰电极的表面，在36.5℃细胞培养箱中培养2h，即得到了肽纳米管/壳聚糖为基础的电化学细胞传感器。

图5给出了实施例1中修饰电极在不同浓度白血病细胞K562修饰后的交流阻抗图，其中(a)5×10³，(b)5×10⁴，(c)5×10⁵，(d)5×10⁶，(e)5×10⁷cells·mL^-1，电解质溶液为5mmol·L^-1K₃Fe(CN)₃/K₄Fe(CN)₃和0.1mol·L^-1KCl的水溶液，频率范围为0.05Hz-100KHz。由图可见随着细胞浓度在电极表面的增加，阻抗谱图的半圆直径也随之增加，这可以归因于细胞本身为非导电物质，浓度增加后，电极界面的导电性也随之减弱，因而阻抗值也增加。其相应的校准曲线显示在图5内插图中。从内插图可见，该细胞传感器对白血病细胞K562检测的线性范围为5×10³-5×10⁷cells·mL^-1，根据信号和噪音比为3的原则，可计算出检测下限为630cells·mL^-1。这些结果表明，基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器具有宽的检测范围和低的检测限。

实施例2：

(1)肽纳米管/壳聚糖复合材料的制备

首先将壳聚糖粉末溶于体积分数为1.2％的醋酸溶液中，在25℃，转速为300rpm下磁力搅拌10h，直到壳聚糖粉末完全溶解，得到质量分数为0.7％的壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中滴加FF六氟异丙醇溶液，其中FF的浓度为110mg·mL^-1，FF遇水后立即自组装成肽纳米管，加完后充分混匀，得到肽纳米管/壳聚糖复合溶液，其中FF六氟异丙醇溶液和壳聚糖溶液的混合体积比为1:50；

(2)肽纳米管/壳聚糖修饰电极的制备

将步骤(1)所得肽纳米管/壳聚糖复合溶液按照110μL·cm^-2，滴至经抛光和清洗的玻碳电极表面，置于25℃下干燥，得到肽纳米管/壳聚糖修饰电极；

(3)基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器的制备

首先将白血病细胞K562在1200rpm下离心15min，将其从培养液中分离，再用PBS缓冲溶液水洗，稀释得到系列浓度的K562细胞悬浮液，然后将此悬浮液按照110μL·cm^-2滴加到肽纳米管/壳聚糖修饰电极的表面，在37.5℃细胞培养箱中培养3h，即得到了肽纳米管/壳聚糖为基础的电化学细胞传感器。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器，其特征在于，制备的肽纳米管/壳聚糖在电极界面形成了类似网状结构，肽纳米管相互交错、均匀的分布在壳聚糖薄膜中，其中肽纳米管直径在100-500nm，长度在100-1000μm范围内。

2.一种权利要求1所述的基于肽纳米管/壳聚糖的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)肽纳米管/壳聚糖复合材料的制备

首先将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.8％-1.2％的醋酸溶液中，在20-25℃，转速为200-300rpm下磁力搅拌8-10h，直到壳聚糖粉末完全溶解，得到质量分数为0.3％-0.7％的壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中滴加FF六氟异丙醇溶液，其中FF的浓度为100–110mg·mL^-1，FF遇水后立即自组装成肽纳米管，加完后混匀，得到肽纳米管/壳聚糖复合溶液；

(2)肽纳米管/壳聚糖修饰电极的制备

将步骤(1)所得肽纳米管/壳聚糖复合溶液按照50-110μL·cm^-2，滴至经抛光和清洗的玻碳电极表面，置于20-25℃下干燥，得到肽纳米管/壳聚糖修饰电极；

(3)基于肽纳米管/壳聚糖仿生界面电化学细胞传感器的制备

首先将白血病细胞K562在1000-1200rpm下离心10-15min，将其从培养液中分离，再用PBS缓冲溶液水洗，稀释得到系列浓度的K562细胞悬浮液，然后将此悬浮液按照50-110μL·cm^-2滴加到肽纳米管/壳聚糖修饰电极的表面，在36.5-37.5℃细胞培养箱中培养2-3h，即得到了肽纳米管/壳聚糖为基础的电化学细胞传感器。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述其中FF六氟异丙醇溶液和壳聚糖溶液的混合体积比为1:45-1:50。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述玻碳电极抛光和清洗具体步骤为：分别用粒径为1.0、0.3、0.05μm的α-Al₂O₃粉对玻碳电极进行抛光，并且每次抛光完后都用二次蒸馏水冲洗，然后分别在二次蒸馏水和丙酮溶液中超声清洗1-2min，最后用氮气吹干。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞悬浮液的系列浓度为5×10³-5×10⁷cells·mL^-1。