CN107533030A - 利用变化的电压刺激的基于纳米孔的测序 - Google Patents

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Abstract

公开了一种分析纳米孔中的分子的方法。通过将纳米孔耦合到电压源来跨插入在隔膜中的纳米孔施加电压。将纳米孔与电压源解耦和。在解耦和之后，确定跨纳米孔的电压的衰减的速率。基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率区分纳米孔中的分子与其它可能的分子。

Description

利用变化的电压刺激的基于纳米孔的测序
背景技术
近年来半导体产业内在微型化方面的进步已使生物科技人员能够开始将传统上庞大的感测工具包装成越来越小的形状因数，包装到所谓的生物芯片上。将会希望开发使生物芯片更加强健、高效并且成本有效的用于生物芯片的技术。
附图说明
在下面的详细描述和附图中公开本发明的各种实施例。
图1图示基于纳米孔的测序芯片中的单元100的实施例。
图2图示利用Nano-SBS技术执行核苷酸测序的单元200的实施例。
图3图示将要利用预加载标记执行核苷酸测序的单元的实施例。
图4图示利用预加载标记的核酸测序的过程400的实施例。
图5图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路500的实施例。
图6图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路600的实施例，其中跨纳米孔施加的电压能够被配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化。
图7A图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路700的另外实施例，其中跨纳米孔施加的电压能够被配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化。
图7B图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路701的另外实施例，其中跨纳米孔施加的电压能够被配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化。
图8图示用于分析纳米孔内部的分子的过程800的实施例，其中纳米孔被插入在隔膜中。
图9图示当过程800被执行并且重复三次时跨纳米孔施加的电压与时间的绘图的实施例。
图10图示当纳米孔处于不同状态时的跨纳米孔施加的电压与时间的绘图的实施例。
具体实施方式
本发明能够被以许多方式实现，这些方式包括：过程；设备；系统；物质的成分；计算机程序产品，体现在计算机可读存储介质上；和/或处理器，诸如被配置为执行存储在耦合到处理器的存储器上和/或由该存储器提供的指令的处理器。在本说明书中，这些实现方式或本发明可采用的任何其它形式可被称为技术。通常，可在本发明的范围内改变公开的过程的步骤的次序。除非另外指出，否则诸如被描述成被配置为执行任务的处理器或存储器的部件可被实现为在给定时间暂时地被配置为执行该任务的通用部件或被制造为执行该任务的专用部件。如这里所使用的，术语‘处理器’指代被配置为处理数据(诸如，计算机程序指令)的一个或多个装置、电路和/或处理核。
以下提供本发明的一个或多个实施例以及图示本发明原理的附图的详细描述。结合这种实施例描述本发明，但本发明不限于任何实施例。本发明的范围仅由权利要求限制，并且本发明包括许多替代物、变型和等同物。在下面的描述中阐述许多特定细节以便提供对本发明的彻底的理解。为了示例的目的而提供这些细节，并且可在没有这些特定细节中的一些或全部的情况下根据权利要求实施本发明。为了清楚的目的，在与本发明相关的技术领域中已知的技术材料未被详细地描述，以免不必要地模糊本发明。
在内径方面具有大约一纳米的孔尺寸的纳米孔隔膜装置已在快速核苷酸测序方面表现出有前途。当跨浸没在导电流体中的纳米孔施加电压电势时，能够观测到归因于跨纳米孔的离子传导的小离子电流。电流的大小对孔尺寸敏感。
基于纳米孔的测序芯片可被用于DNA测序。基于纳米孔的测序芯片合并配置为阵列的大量传感器单元。例如，具有一百万个单元的阵列可包括单元的1000行乘1000列。
图1图示基于纳米孔的测序芯片中的单元100的实施例。隔膜102被形成在单元的表面上方。在一些实施例中，隔膜102是脂双层。包含可溶蛋白质纳米孔跨膜分子络合物(PNTMC)和感兴趣的分析物的主体电解质114被直接放置到单元的表面上。通过电穿孔，单个PNTMC 104被插入到隔膜102中。所述阵列中的个体隔膜既不以化学方式彼此连接，也不以电气方式彼此连接。因此，所述阵列中的每个单元是独立测序机，产生与PNTMC关联的单个聚合物分子特有的数据。PNTMC 104对分析物进行操作，并且调制通过另外不可渗透的双层的离子电流。
继续参照图1，模拟测量电路112连接到由电解质的薄膜108覆盖的金属电极110。通过离子不可渗透的隔膜102，电解质的薄膜108与主体电解质114隔离。PNTMC 104穿过隔膜102，并且提供用于离子电流从主体液体流到工作电极110的唯一路径。单元还包括反电极(CE) 116，所述反电极(CE) 116是电化电势传感器。单元还包括参考电极117。
在一些实施例中，纳米孔阵列通过合成(Nano-SBS)技术使用基于单分子纳米孔的测序来实现并行测序。图2图示利用Nano-SBS技术执行核苷酸测序的单元200的实施例。在Nano-SBS技术中，待测序的模板202和引物被引入到单元200。对于这种模板-引物络合物，四个被不同标记的核苷酸208被添加到主体水相。当被正确标记的核苷酸与聚合酶204络合时，标记的尾部位于纳米孔206的筒中。保持在纳米孔206的筒中的标记产生独特的离子阻滞信号210，由此由于标记的不同化学结构而以电子方式识别添加的碱基。
图3图示将要利用预加载标记执行核苷酸测序的单元的实施例。纳米孔301被形成在隔膜302中。酶303(例如，聚合酶，诸如DNA聚合酶)与纳米孔关联。在一些情况下，聚合酶303以共价方式附接到纳米孔301。聚合酶303与待测序的核酸分子304关联。在一些实施例中，核酸分子304是圆形的。在一些情况下，核酸分子304是线性的。在一些实施例中，核酸引物305被混合到核酸分子304的一部分。聚合酶303使用单链核酸分子304作为模板催化核苷酸306到引物305上的合并。核苷酸306包括标记种类(“标记”)307。
图4图示利用预加载标记的核酸测序的过程400的实施例。阶段A图示图3中所述的部件。阶段C示出加载到纳米孔中的标记。“加载”的标记可以是这样的标记：在可感知量的时间(例如，0.1毫秒(ms)到10000 ms)期间位于纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近。在一些情况下，预加载的标记在从核苷酸被释放之前被加载在纳米孔中。在一些实例中，如果标记在核苷酸合并事件时在被释放之后穿过纳米孔(和/或由纳米孔检测到)的概率合适地高(例如，90%至99%)，则标记被预加载。
在阶段A，被标记的核苷酸(四个不同类型A、T、G或C之一)不与聚合酶关联。在阶段B，被标记的核苷酸与聚合酶关联。在阶段C，聚合酶对接到纳米孔。所述标记在对接期间由电动力(诸如，在存在由跨隔膜和/或纳米孔施加的电压产生的电场的情况下产生的力)拉到纳米孔中。
一些关联的被标记的核苷酸不是与核酸分子配对的碱基。这些非配对核苷酸通常在一时间标度内被聚合酶拒绝，所述时间标度比正确配对的核苷酸与聚合酶保持关联的时间标度短。由于非配对核苷酸仅短暂地与聚合酶关联，所以图4中所示的过程400通常不会前进超过阶段D。例如，非配对核苷酸在阶段B或在所述过程进入阶段C之后立即被聚合酶拒绝。
在聚合酶对接到纳米孔之前，纳米孔的电导是大约300微微西门子(300 pS)。在阶段C，纳米孔的电导是与四个类型的被标记的核苷酸之一对应的大约60 pS、80 pS、100 pS或120 pS。聚合酶经受异构化和磷酸根转移反应以将核苷酸合并到生长核酸分子中，并且释放标记分子。具体来说，当标记保持在纳米孔中时，由于标记的不同化学结构而产生独特的电导信号(例如，参见图2中的信号210)，由此以电子方式识别添加的碱基。重复所述循环(即，阶段A至E或阶段A至F)允许核酸分子的测序。在阶段D，释放的标记穿过纳米孔。
在一些情况下，未被合并到生长核酸分子中的被标记的核苷酸也将会穿过纳米孔，如图4的阶段F中所见。在一些实例中，未被合并的核苷酸能够由纳米孔检测到，但所述方法提供一种方式用于至少部分地基于在纳米孔中检测到核苷酸的时间区分被合并的核苷酸和未被合并的核苷酸。绑定到未被合并的核苷酸的标记快速地穿过纳米孔，并且在短时间段(例如，小于10 ms)期间被检测到，而绑定到被合并的核苷酸的标记被加载到纳米孔中并且在长时间段(例如，至少10 ms)期间被检测到。
图5图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路500的实施例。如上所述，当标记保持在纳米孔502中时，由于标记的不同化学结构而产生独特的电导信号(例如，参见图2中的信号210)，由此以电子方式识别添加的碱基。当测量电流时，图5中的电路维持跨纳米孔502的恒定电压。具体来说，所述电路包括运算放大器504和通过装置506，所述运算放大器504和通过装置506跨纳米孔502维持等于Va或Vb的恒定电压。在电容器ncap 508处对流经纳米孔502的电流进行积分，并且由模数(ADC)转换器510测量流经纳米孔502的电流。
然而，电路500具有许多缺点。缺点之一在于：电路500仅测量单向电流。另一缺点在于：电路500中的运算放大器504可能引入许多性能问题。例如，运算放大器504的偏移电压和温度漂移可使跨纳米孔502施加的实际电压在不同单元间变化。跨纳米孔502施加的实际电压可能在预期值以上或以下漂移几十毫伏，由此引起显著的测量不准确。另外，运算放大器噪声可引起另外的检测误差。另一缺点在于：电路的用于在进行电流测量的同时维持跨纳米孔的恒定电压的各部分是面积密集的。例如，与其它部件相比，运算放大器504在单元中占用显著更大的空间。当基于纳米孔的测序芯片被缩放以包括越来越多的单元时，运算放大器所占用的面积可能增加至难以得到的尺寸。不幸的是，在具有大尺寸阵列的基于纳米孔的测序芯片中缩小运算放大器的尺寸可能引起其它性能问题。例如，它可能甚至进一步加重单元中的偏移和噪声问题。
图6图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路600的实施例，其中跨纳米孔施加的电压能够被配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化。纳米孔的可能状态之一是当附接有标记的聚磷酸盐不存在于纳米孔的筒中时的开路通道状态。纳米孔的另外四个可能状态对应于当四个不同类型的附接有标记的聚磷酸盐(A、T、G或C)保持在纳米孔的筒中时的状态。纳米孔的再另一可能状态是当隔膜破裂时。图7A和7B图示基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路(700和701)的另外的实施例，其中跨纳米孔施加的电压能够被配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化。在以上电路中，不再需要运算放大器。
图6示出插入到隔膜612中的纳米孔602，并且纳米孔602和隔膜612位于单元工作电极614和反电极616之间，以使得电压跨纳米孔602被施加。纳米孔602也与主体液体/电解质618接触。需要注意的是，与图1中的纳米孔和隔膜相比，纳米孔602和隔膜612被颠倒地绘制。以下，单元意图包括至少隔膜、纳米孔、工作单元电极和关联的电路。在一些实施例中，反电极在多个单元之间被共享，并且因此也被称为共用电极。共用电极能够被配置为将共用电势施加于与测量单元中的纳米孔接触的主体液体。共用电势和共用电极对于所有的测量单元而言是共用的。在每个测量单元内存在工作单元电极；与共用电极相对，工作单元电极614可被配置为施加独立于其它测量单元中的工作单元电极的不同电势。
在图7A和7B中，替代于示出插入在隔膜中的纳米孔和包围纳米孔的液体，示出表示纳米孔和隔膜的电气性质的电气模型702。电气模型702包括：电容器706，模仿与隔膜关联的电容；和电阻器704，模仿与处于不同状态(例如，开路通道状态或与在纳米孔内部具有不同类型的标记/分子对应的状态)的纳米孔关联的电阻。在图7A和7B中要注意的是，相应电路不需要片上加工的额外电容器（例如图5中的ncap 508），从而促进减小基于纳米孔的测序芯片的尺寸。
图8图示用于分析纳米孔内部的分子的过程800的实施例，其中纳米孔被插入在隔膜中。可使用图6、7A或7B中示出的电路执行过程800。图9图示当过程800被执行并且重复三次时跨纳米孔施加的电压与时间的绘图的实施例。如以下将更详细描述的，跨纳米孔施加的电压不保持恒定。相反，跨纳米孔施加的电压随着时间而变化。电压衰减的速率(即，跨纳米孔施加的电压与时间绘图的斜率的陡度)取决于单元电阻(例如，图7A中的电阻器704的电阻)。更具体地讲，因为与在不同状态(例如，开路通道状态、与在纳米孔内部具有不同类型的标记/分子对应的状态和当隔膜破裂时的状态)中的纳米孔关联的电阻由于分子/标记的不同化学结构而不同，所以不同的对应的电压衰减的速率可被观测到，并且因此可被用于识别纳米孔的不同状态。
参照图8和图7A，在过程800的802，通过将纳米孔耦合到电压源来跨纳米孔施加电压。例如，如图7A中所示，当开关S1 708闭合时，电压Vpre 710被施加于单元工作电极。如图9中所示，跨纳米孔施加的初始电压是Vpre–Vliquid，其中Vliquid是与纳米孔接触的主体液体的电压。当电压源连接到工作电极时，与隔膜关联的电容器被充电并且能量被存储在跨隔膜的电场中。
在过程800的804，通过将纳米孔和隔膜与电压源解耦合，与隔膜关联的电容器(电容器706)被放电，并且存储在跨隔膜的电场中的能量由此被耗散。例如，如图7A中所示，当开关S1 708断开时，电压源被断开连接。在开关S1 708断开之后，跨纳米孔的电压开始指数衰减，如图9中所示。指数衰减具有RC时间常数τ= RC，其中R是与纳米孔关联的电阻(电阻器704) 并且C是与R并联的与隔膜关联的电容（电容器C 706）。
在过程800的806，确定跨纳米孔施加的电压的衰减的速率。电压衰减的速率是跨纳米孔施加的电压与时间曲线的斜率的陡度，如图9中所示。可按照不同方式确定电压衰减的速率。
在一些实施例中，通过测量在固定时间间隔期间发生的电压衰减来确定电压衰减的速率。例如，如图9中所示，首先由ADC 712在时间t1测量在工作电极处施加的电压，并且然后由ADC 712在时间t2再次测量所述电压。当跨纳米孔的电压与时间曲线的斜率较陡时，电压差ΔVapplied较大，并且当电压曲线的斜率不那么陡时，电压差ΔVapplied较小。因此，ΔVapplied可被用作用于确定跨纳米孔施加的电压的衰减速率的度量。在一些实施例中，为了增加电压衰减的速率的测量的准确性，可在固定间隔处测量电压另外几次。例如，可在t3、t4等等处测量电压，并且在所述多个时间间隔期间的ΔVapplied的多个测量值可被共同用作用于确定跨纳米孔施加的电压的衰减速率的度量。在一些实施例中，为了增加电压衰减的速率的测量的准确性，可以使用相关的双重采样(CDS)。
在一些实施例中，通过测量所选择的量的电压衰减所需的持续时间来确定电压衰减的速率。在一些实施例中，可测量电压从固定电压V1下降到第二固定电压V2所需的时间。当电压曲线的斜率较陡时，需要的时间较少，并且当电压曲线的斜率不那么陡时，需要的时间较多。因此，测量的所需要的时间可被用作用于确定跨纳米孔施加的电压的衰减速率的度量。
在过程800的808，基于确定的电压衰减的速率确定纳米孔的状态。纳米孔的可能状态之一是开路通道状态，在开路通道状态期间，附接有标记的聚磷酸盐不存在于纳米孔的筒中。纳米孔的其它可能状态对应于当不同类型的分子保持在纳米孔的筒中时的状态。例如，纳米孔的另外四个可能的状态对应于当四个不同类型的附接有标记的聚磷酸盐(A、T、G或C)保持在纳米孔的筒中时的状态。纳米孔的再另一可能状态是当隔膜破裂时。能够基于确定的电压衰减的速率确定纳米孔的状态，因为电压衰减的速率取决于单元电阻(即，图7A中的电阻器704的电阻)。更具体地讲，因为与处于不同状态中的纳米孔关联的电阻由于分子/标记的不同化学结构而不同，所以不同的对应的电压衰减的速率可被观测到，并且因此可被用于识别纳米孔的不同状态。
图10图示当纳米孔处于不同状态时跨纳米孔施加的电压与时间的绘图的实施例。曲线1002示出在开路通道状态期间电压衰减的速率。在一些实施例中，与处于开路通道状态中的纳米孔关联的电阻处于100M欧姆到20G欧姆的范围中。曲线1004、1006、1008和1010示出与当四个不同类型的附接有标记的聚磷酸盐(A、T、G或C)保持在纳米孔的筒中时的四个捕获状态对应的不同的电压衰减的速率。在一些实施例中，与处于捕获状态中的纳米孔关联的电阻处于200M欧姆到40G欧姆的范围内。需要注意的是，每个绘图的斜率彼此可辨别。
在过程800的810，确定是否重复过程800。例如，所述过程可被重复多次以检测纳米孔的每个状态。如果不重复所述过程，则过程800结束；否则，所述过程在802再次重新开始。在802，通过连接到电压源来跨纳米孔重新施加电压。例如，如图7A中所示，当开关S1708闭合时，跨纳米孔施加电压Vpre 710。如图9中所示，施加的电压跳回至Vpre的电平。当过程800重复多次时，随着时间跨纳米孔施加锯齿状电压波形。图9还图示外推曲线904，外推曲线904示出在未重新施加电压Vpre 710的情况下RC电压随着时间衰减。
如以上所示，将跨纳米孔施加的电压配置为在纳米孔处于特定可检测状态的时间段期间变化具有许多优点。优点之一在于：原本在单元电路中在片上加工的运算放大器、通过装置和电容器（例如，图5中的ncap 508）的去除显著减小基于纳米孔的测序芯片中的单个单元的覆盖区，由此促进基于纳米孔的测序芯片的缩放以包括越来越多的单元(例如，在基于纳米孔的测序芯片中具有数百万个单元)。与纳米孔并联的电容包括两个部分：与隔膜关联的电容和与集成芯片(IC)关联的电容。由于隔膜的薄性质，仅仅与隔膜关联的电容就能够足以创建需要的RC时间常数，而不需要另外的片上电容，由此允许单元尺寸和芯片尺寸的显著减小。
另一优点在于：单元的电路未遭受偏移不准确，因为Vpre被直接施加于工作电极，而没有任何中间电路。另一优点在于：由于没有开关在测量间隔期间被断开或闭合，所以电荷注入的量被最小化。
另外，上述技术使用正电压或负电压同样很好地运行。双向测量已被示出为有助于表征分子络合物。另外，当被驱动通过纳米孔的离子流的类型是经由非法拉第传导时，需要双向测量。两种类型的离子流能够被驱动通过纳米孔——法拉第传导和非法拉第传导。在法拉第传导中，化学反应发生在金属电极的表面。法拉第电流是通过一些化学物质在电极的还原或氧化来产生的电流。非法拉第传导的优点在于：在金属电极的表面没有化学反应发生。
虽然已为了清楚理解的目的详细描述前面的实施例，但本发明不限于提供的细节。存在实现本发明的许多替代方式。公开的实施例是说明性的而非限制性的。

Claims (25)

1.一种分析与纳米孔相互作用的分子的方法，其中所述纳米孔被插入在隔膜中，所述方法包括：
通过将纳米孔耦合到电压源来跨插入在隔膜中的纳米孔施加电压；
将纳米孔与电压源解耦和；以及
在解耦和之后，确定跨纳米孔的电压的衰减的速率。
2.如权利要求1所述的方法，还包括：
基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率区分纳米孔中的分子与其它可能的分子。
3.如权利要求1所述的方法，其中在解耦和之后跨纳米孔的电压的衰减的速率由RC时间常数表征，所述RC时间常数对应于与隔膜关联的电容和与纳米孔关联的电阻。
4.如权利要求3所述的方法，其中与纳米孔关联的电阻基于纳米孔中分子的化学结构而变化。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述电压的衰减的速率对应于与隔膜关联的电容的放电。
6.如权利要求1所述的方法，其中确定跨纳米孔的电压的衰减的速率包括确定在预定时间间隔内跨纳米孔的电压衰减。
7.如权利要求6所述的方法，其中确定在时间间隔内跨纳米孔的电压衰减包括：
测量第一电压；
等待跨纳米孔的电压已衰减的所选择的时间，并且测量第二电压。
8.如权利要求1所述的方法，其中确定跨纳米孔的电压的衰减的速率包括确定用于跨纳米孔的电压衰减预定值的时间段。
9.如权利要求1所述的方法，其中基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率可区分的分子包括附接有A标记的聚磷酸盐、附接有T或U标记的聚磷酸盐、附接有G标记的聚磷酸盐以及附接有C标记的聚磷酸盐。
10.如权利要求1所述的方法，还包括：基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率检测纳米孔的开路通道状态。
11.如权利要求1所述的方法，还包括：基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率检测隔膜破裂。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述电压源随时间提供正电压和负电压。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述分子的一部分位于纳米孔内。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述分子耦合到与所述纳米孔相互作用的另一分子。
15.一种分析与纳米孔相互作用的分子的方法，其中所述纳米孔被插入在隔膜中，所述方法包括：
将能量存储在跨隔膜的电场中，其中纳米孔被插入在隔膜中；
耗散存储在跨隔膜的电场中的能量；以及
确定跨隔膜的能量的耗散的速率。
16.如权利要求15所述的方法，还包括：
基于所确定的跨隔膜的能量的耗散的速率区分纳米孔中的分子与其它可能的分子。
17.如权利要求15所述的方法，其中跨隔膜的能量的耗散的速率由RC时间常数表征，所述RC时间常数对应于与隔膜关联的电容和与纳米孔关联的电阻。
18.如权利要求17所述的方法，其中与纳米孔关联的电阻基于纳米孔中分子的化学结构而变化。
19.如权利要求15所述的方法，其中跨隔膜的能量的耗散的速率对应于与隔膜关联的电容的放电。
20.如权利要求15所述的方法，其中确定跨隔膜的能量的耗散的速率包括确定跨纳米孔的电压的电压衰减的速率。
21.一种用于分析与纳米孔相互作用的分子的仪器，其中所述纳米孔被插入在隔膜中，所述仪器包括：
双层，具有纳米孔，电流能够流经纳米孔，并且其中所述双层具有双层电容；
开关电压源，能够与所述双层连接和断开连接；以及
电压测量电路，测量在电压源被断开连接之后跨纳米孔的电压的衰减的速率。
22.如权利要求21所述的仪器，还包括：
处理器，基于所确定的跨纳米孔的电压的衰减的速率区分纳米孔中的分子与其它可能的分子。
23.如权利要求21所述的仪器，其中跨纳米孔的电压的衰减的速率由RC时间常数表征，所述RC时间常数对应于双层电容和与纳米孔关联的电阻。
24.如权利要求23所述的仪器，其中与纳米孔关联的电阻基于纳米孔中分子的化学结构而变化。
25.如权利要求21所述的仪器，其中所述电压的衰减的速率对应于双层电容的放电。
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