CN105784706A - 一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素b1速测方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法,所述速测方法是制备黄曲霉素B1微通道,并在微通道中加入检测试剂制作银染PC片;后通过3DMax软件设计并由3D打印机打印黄曲霉素B1检测光学硬件,并将银染PC片和手机置于光学硬件装置中,利用手机摄像头对黄曲霉素B1反应区进行拍照,通过智能手机检测程序处理并显示黄曲霉素B1的检测结果。本发明基于智能手机实现黄曲霉素B1的快速检测,具有携带方便,操作简便,成本低廉,灵敏度高等优点,适用于现场快速检测。

Description

一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法
技术领域
本发明涉及一种黄曲霉素B1的快速检测方法,具体地说是一种将黄曲霉素B1检测液加入以聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料的多通量微通道中,银染后的透明塑料片插入硬件装置中,通过智能手机检测程序计算反应条带的光学灰度比(ODR)来实现黄曲霉素B1快速定量检测的分析方法。
背景技术
随着食品工业进入新阶段,食品安全问题已引起全世界的广泛关注。在众多食品安全风险因素中,以霉菌毒素的污染最为严重,其中又以黄曲霉素B1的毒性和致癌性最强。传统的检测方法多以昂贵的大型仪器为主,如高效液相色谱法,液相色谱-质谱,气相色谱-质谱等,此类检测方法虽灵敏度高,准确性高,但其成本高、耗时长、需专业人员操作,受限于一些专业检测机构,不利于现场快速检测。因此,开发一种简便、低成本的黄曲霉素B1快速检测方法对保障食品安全是非常必要的。
黄曲霉素B1是食品中的霉菌在生长繁殖过程中产生的一种有毒次级代谢产物,大量摄入会引起急性中毒;而微量持续摄入则会造成慢性中毒,出现生长发育迟缓、肝肾损伤、恶心头疼等症状,严重威胁人类及动物的健康。
目前针对黄曲霉素B1的快速检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法。相对于色谱法,ELISA方法已经比较快速简便,但是仍需借助专业检测仪器。而胶体金免疫层析法作为快速筛查工具具有成本低,操作简便等优点,但通常仅限于定性或半定量判定,而且灵敏度较低。近年来,研究人员相继开发出一些新型的黄曲霉素B1快速检测方法。如Shim等人(W.-B.Shim,M.J.Kim,H.MunandM.-G.Kim,Anaptamer-baseddipstickassayfortherapidandsimpledetectionofaflatoxinB1,Biosens.Bioelectron.,2014,62,288-294)利用DNA适配体修饰的试纸建立了一种快速检测AFB1的方法,该方法用DNA适配体取代抗体,使待测物与荧光标记的DNA探针竞争性得与生物素修饰的适配体结合,之后利用毛细作用迁移到硝酸纤维膜上,通过检测荧光信号实现AFB1的定量分析。再如Deng等人(G.Deng,K.Xu,Y.Sun,Y.Chen,T.ZhengandJ.Li,HighsensitiveimmunoassayformultiplexmycotoxindetectionwithphotoniccrystalmicrospheresuspensionArray,Anal.Chem.,2013,85,2833-2840)报道了利用二氧化硅光子晶体微球悬浮阵列实现AFB1,FB1和CIT的定量检测,其检测原理是微球上结合的蛋白质包被的霉菌毒素和待测霉菌毒素与荧光标记的抗体竞争性结合,最后通过分析荧光信号的强度实现AFB1,FB1,CIT的定量检测。还有Song等人(S.Song,N.Liu,Z.Zhao,E.N.Ediage,S.Wu,C.Sun,S.D.SaegerandA.Wu,Multiplexlateralflowimmunoassayformycotoxindetermination,Anal.Chem.,2014,86,4995-5001)报道了利用多路测流免疫层析法制备霉菌毒素的免疫检测结构,最后通过专业的试纸条读出仪分析T线的吸光度实现AFB1,ZEA,DON的同时定量检测。
以上基于荧光标记的免疫检测法具有较高的灵敏度,但是由于需要使用价格昂贵的荧光光谱仪,因此不利于推广;而基于纳米金标记的免疫层析法则需要专门的试纸条读出仪,才能实现定量检测。因此,申请人提出基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法。
由于智能手机强大的图像处理功能和开放的应用程序开发环境,很多研究人员都将其应用于生物检测中。如Coskun等人(A.F.Coskun,J.Wong,D.Khodadadi,R.Nagi,A.TeyandA.Ozcan,Apersonalizedfoodallergentestingplatformonacellphone,LabChip,2013,13,636-640)建立了一个食物过敏原检测平台,其原理是在试管中进行比色测定,两个LED灯垂直照射测试管和对照管,利用智能手机获取图像,通过分析吸光度与分析物浓度的关系实现食物过敏原的定量检测。再如Yu等人(L.Yu,Z.Shi,C.Fang,Y.Zhang,Y.LiuandC.Li,DisposableLateralFlow-throughStripforSmartphone-cameratoQuantitativelyDetectAlkalinePhosphataseActivityinMilk,Biosens.Bioelectron.,2015,69,307-315)开发了一次性横流试纸检测原料乳中碱性磷酸酶的活性;使用智能手机拍照,分析检测区域上由于纳米金积累引起的颜色变化实现定量检测目的。还有Lee等人(S.Lee,G.KimandJ.Moon,PerformanceImprovementoftheOne-DotLateralFlowImmunoassayforAflatoxinB1byUsingaSmartphone-BasedReadingSystem,Sensors,2013,13,5109-5116)开发了用于检测AFB1的试纸,具体是在检测区固定上AFB1抗体,待测AFB1和胶体金垫上的Gold-AFB1-BSA在毛细作用下迁移到硝酸纤维膜上竞争性的与抗体结合,之后利用手机App采集并分析检测区的灰度值,通过灰度值与浓度的关系实现对AFB1的检测。
以上所述方法操作快速简便,但每次只能检测一个样本,无法实现多通量检测。基于此本发明提出借助PDMS微通道实现多通量检测,利用智能手机检测程序计算反应条带的光学灰度比来实现谷物中黄曲霉素B1的快速定量检测。而Wong等人(J.X.Wong,F.S.LiuandH-ZYu,Mobileapp-basedquantitativescanometricanalysis,Anal.Chem.,2014,86,11966-11971)已经研究出通过手机应用程序分析光学灰度比实现定量检测目的,以生物素与链霉亲和素反应验证其性能,由于通道数目的限制使其在多通量检测上存在一定局限性并且其只给出光学灰度比无法直接显示检测物浓度值。因此,本发明所作出的改进是借助微流体通道实现多通量检测的目的,并且利用智能手机检测程序同时得到反应条带的光学灰度比,校准方程和待检物中黄曲霉素B1的浓度,直接显示在结果界面上,真正实现一步快速检测,极大地缩短了检测时间。
发明内容
本发明要解决的具体技术问题是现有黄曲霉素B1检测方法通常都需要昂贵的专业仪器;而基于智能手机的黄曲霉素B1检测方法虽然已被提出,但是此方法只能进行定性或半定量检测,灵敏度低。本发明的目的是提供一种借助PDMS微通道,利用智能手机检测程序与3D打印技术实现对黄曲霉素B1的便携、快速、定量、精确的检测方法,即一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法。
为了实现上述目的,本发明所采取的措施是一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法,所述方法是以PC为透明基底层,在透明基底层上覆盖按一定尺寸设计好的PDMS微通道,在微通道内加入黄曲霉素B1检测试剂。随后将银染PC片插入光学硬件装置中。最后利用智能手机检测程序计算反应条带的光学灰度比,拟合出校准方程并得出待测样品中黄曲霉素B1的浓度,显示到结果界面上。其所述速测的具体方法如下。
一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法,所述速测方法是按下列步骤进行的:
用于黄曲霉素B1的微通道制备;
用于加入所述微通道黄曲霉素B1的检测试剂,银染放大为银染PC片;
用于黄曲霉素B1的光学硬件装置;
用于黄曲霉素B1的智能手机检测程序,显示黄曲霉素B1的检测结果。
进一步地,所述速测方法是按下列步骤进行的:
(1)将透明基底层(1)和透明通道层(2)通过物理吸附结合为一体构成黄曲霉素B1微通道;
(2)在上述黄曲霉素B1微通道中加入AFB1-BSA,并固定于透明基底层(1)上,随后加入黄曲霉素B1标准液和生物素标记的黄曲霉素B1抗体的混合液,同时再加入黄曲霉素B1提取待测液和生物素标记的黄曲霉素B1抗体的混合液,然后加入纳米金标记的链霉亲和素,最后将乙酸银溶液和对苯二酚溶液按体积比为1:1混合并加入反应区,银染放大为银染PC片;
(3)通过3DMax软件分别设计出光学硬件的结构,将其导出STL文件格式,再将STL文件格式导入3D打印软件中,用3D打印机打印出各部件,并将白色LED灯以及其相应的反射纸,导光板和扩散板安装于发光部件中,然后再将各部件组装构成一便携式黄曲霉素B1的光学硬件装置;
(4)在所述便携式光学硬件装置的光路上,依次设置有上述步骤(2)制作的银染PC片和智能手机摄像头,后由白色LED灯发出的光线经银染PC片照射到智能手机摄像头,并由智能手机拍摄银染PC片上黄曲霉素B1反应区,后通过黄曲霉素B1的智能手机检测程序处理,显示黄曲霉素B1的检测结果。
进一步地,附加技术特征如下。
所述透明基底层是由聚碳酸酯透明塑料薄片构成。
所述透明通道层是由聚二甲基硅氧烷制成的薄片,薄片的一面均布有微通道。
所述光学硬件是由黑色塑料外壳构成的,其中依次设置有电池盒、发光部件及手机插槽;所述发光部件是由顶端面水平设置的反射纸,反射纸下面水平设置的导光板,导光板四周侧边均布的白色LED灯,以及在导光板下面平行水平设置的扩散板和银染PC片插槽构成;所述手机插槽位于银染PC片相对应照射的位置。
所述智能手机检测程序是由Java语言编写并运行在Android手机平台上。
实现上述本发明所提供的一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法,以PC为透明基底层,在透明基底层上覆盖按一定尺寸设计好的PDMS微通道,在微通道内加入黄曲霉素B1检测试剂,将银染PC片插入光学硬件中,最后利用智能手机检测程序计算反应条带的光学灰度比,拟合出校准方程并得出待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度,显示到结果界面上。本发明借助PDMS微通道,利用智能手机检测程序与3D打印技术,实现了对黄曲霉素B1的快速定量精确检测,而且携带方便,成本低廉,操作简单,适用于现场及时检测,极大地改善和提高了黄曲霉毒素B1检测的便利性和及时性。这种检测方法克服了现有黄曲霉素B1检测时,需要到专业的检测机构,采用昂贵的专业仪器,成本高的不足;而基于智能手机的黄曲霉素B1检测方法虽然已被提出,但存在只能进行定性或半定量检测,灵敏度低的问题。
与现有技术相比,本速测方法集中体现在如下几点:
(1)检测微通道具有多通量检测、重复使用、成本低廉的优点。
(2)试剂用量少,大大降低了检测成本。
(3)采用光学硬件装置避免了外界环境光对图片成像时的干扰,使得分析结果更为准确。
(4)利用智能手机检测程序计算反应条带的光学灰度比并直接给出待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度,真正实现一步快速检测,大大缩短了检测时间。
(5)整个检测过程所用仪器为智能手机和3D打印机,普及范围广。
附图说明
图1是本发明黄曲霉素B1检测微通道透明基底层。
图2是本发明黄曲霉素B1检测微通道透明通道层。
图3是本发明加入黄曲霉素B1检测试剂。
图4是本发明黄曲霉素B1检测的光学硬件装置。
图5是本发明黄曲霉素B1检测的智能手机检测程序运行界面。
图中:1:透明基底层;2:透明通道层;2-1:透明微通道;2-2:加样/出样孔;3:移液枪;4:光学硬件装置;4-1:电池盒;4-2:反射纸;4-3:导光板;4-4:LED灯;4-5:扩散板;4-6:智能手机;5:智能手机检测程序运行界面;5-1:主界面;5-2:预览界面;5-3:结果界面。
具体实施方式
下面以谷物为例对本发明的具体实施方式做出进一步的详细说明。
如附图1到附图5所示,实施本发明上述所提供的一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法的具体步骤如下。
(1)黄曲霉素B1微通道的制备:将透明塑料片剪成5.5cm×6cm大小的方形作为透明基底层,放入酒精中超声清洗10分钟,之后将其放入UV/Ozone中处理15分钟温育20分钟。取0.36gEDC和0.045gNHS溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH=6)中作为活化液,将透明基底浸入活化液中活化5小时,取出后用超纯水清洗,用氮气吹干。选用道康宁公司产品Sylgard184硅橡胶来制备PDMS薄片,具体步骤是:选用内径为117mm×117mm的方形洁净培养皿作为陈放PDMS液体混合物的载体。将一块硅板平放在培养皿中有凸起的一面朝上。分别取制备PDMS所用材料基质38.82g与固化剂4.31g放入上述培养皿中混合均匀,利用电吹风去除混合液中的气泡,再放入80℃的烤箱中烘烤一小时,静置一段时间时间后将PDMS从硅板上揭下并用打孔器在每个通道的两端打孔。将PDMS薄片剪成5.5cm×6cm大小,并将此PDMS薄片通过物理吸附结合到上述透明塑料片上制备微通道。
(2)AFB1检测标准曲线制作:将150mMNaCl溶于20mMPBS缓冲液(pH=7.4)作为抗原缓冲液,取0.1mgAFB1-BSA溶于250μL抗原缓冲液中配成浓度为400μg/mL的AFB1-BSA溶液。将150mMNaCl和4%BSA溶于20mMPBS缓冲液(pH=7.4)作为封闭液。以20μg/mL的AFB1标准液作为母液溶于甲醇中,配制成浓度分别为0.5、5、20、100、250、500ng/mL的AFB1溶液。将150mMNaCl和0.1%BSA溶于20mMPBS缓冲液(pH=7.4)作为抗体缓冲液,用此缓冲液稀释生物素标记的抗体至22μg/mL。将150mMNaCl,0.1%BSA,0.05%NaN3溶于20mMPBS缓冲液(pH=7.4)作为纳米金-链霉亲和素缓冲液,用此缓冲液将80μg/mL的纳米金-链霉亲和素母液稀释50倍。取2.55g柠檬酸和2.35g柠檬酸钠溶于85mL超纯水中作为银染缓冲液,取50mg对苯二酚溶于10mL银染缓冲液中作为对苯二酚溶液,取20mg乙酸银溶于10mL超纯水中作为乙酸银溶液。取2μLAFB1-BSA溶液加入上述步骤1所述微通道内放置一夜。取2μL封闭液加入通道内封闭3小时。分别取1μLAFB1溶液和1μL抗体混合加入通道内反应40-60分钟。取2μL稀释后的纳米金-链霉亲和素溶液加入通道内放置1小时。以1:1比例取对苯二酚溶液和乙酸银溶液混合作为银染液加入透明塑料片反应区,间隔银染约20分钟。
(3)谷物中的AFB1检测:以谷物中的玉米为例进行AFB1检测。以20μg/mL的AFB1标准液作为母液溶于甲醇中,配制成浓度为50ng/mL的AFB1溶液。将从当地超市买回的玉米磨成粉末(粒度小于2mm),称取0.1g粉末置于2.5ml离心管中,加入50μL浓度为50ng/mL的AFB1溶液,封口振荡,放入通风柜内开口干燥一夜。以甲醇:水=70:30的比例配制提取液,取0.5mL提取液加入离心管中,涡旋振荡2min,然后以3500rpm离心5min,取200μL上清液加入400μL超纯水稀释作为待检液。取2μLAFB1-BSA溶液加入上述步骤1所述微通道内放置一夜。取2μL封闭液加入通道内封闭3小时。分别取1μL待检液和1μL抗体混合加入通道内反应40-60分钟,一式三份。取2μL纳米金-链霉亲和素溶液加入通道内放置1小时。以1:1比例取对苯二酚溶液和乙酸银溶液混合作为银染液加入透明塑料片反应区,间隔银染约20分钟。
(4)光学硬件装置:利用3DMax软件分别设计出光学硬件各个部件的结构并将其导出STL文件格式,将STL文件导入3D打印软件中并用3D打印机打印出各个部件。将2节7号电池安装到电池盒内,为LED灯供电,在发光部件顶端面水平设置一张反射纸(51mm×51mm),在反射纸下面水平设置一块导光板(51mm×51mm),并在此导光板的四周侧边均布有16个白色LED灯珠(2mm×3mm×4mm),在导光板下方水平设置一块扩散板(53mm×53mm)和银染PC片插槽,手机插槽位于银染PC片相对应照射的位置。最后依次将电池盒、发光部件、手机插槽组装成一个完整装置。
(5)智能手机检测程序读取过程:首先将手机插入光学硬件装置中,将银染后的PC片插入插槽中并打开开关,在手机屏幕上点击图标进入主界面,主界面包括四个按钮,分别为NewTest、History、Instructions、Quit。点击NewTest按钮进入手机相机预览界面,此时预览界面上会显示出一个大的红色矩形框,在此矩形框内又分布着十一条红色窄条框,将银染PC片上的反应条带对准红色窄条框后,点击Capture按钮,程序会自动截取红色矩形框内的图片并转化成灰度模式保存到手机中,然后点击Analyse按钮,程序会自动计算出每个条带的光学灰度比,并根据AFB1标准液的浓度及对应的光学灰度比拟合出校准方程,结合此校准方程与待检液对应的光学灰度比计算出待测样品中AFB1的浓度值,最后将检测结果直接显示到界面上。

Claims (6)

1.一种基于智能手机检测系统的黄曲霉素B1速测方法,所述速测方法是按下列步骤进行的:
用于黄曲霉素B1的微通道制备;
用于加入所述微通道黄曲霉素B1的检测试剂,银染放大为银染PC片;
用于黄曲霉素B1的光学硬件装置;
用于黄曲霉素B1的智能手机检测程序,显示黄曲霉素B1的检测结果。
2.如权利要求1所述的速测方法,所述速测方法是按下列步骤进行的:
(1)将透明基底层(1)和透明通道层(2)通过物理吸附结合为一体构成黄曲霉素B1微通道;
(2)在上述黄曲霉素B1微通道中加入AFB1-BSA,并固定于透明基底层(1)上,随后加入黄曲霉素B1标准液和生物素标记的黄曲霉素B1抗体的混合液,同时再加入黄曲霉素B1提取待测液和生物素标记的黄曲霉素B1抗体的混合液,然后加入纳米金标记的链霉亲和素,最后将乙酸银溶液和对苯二酚溶液按体积比为1:1混合并加入反应区,银染放大为银染PC片;
(3)通过3DMax软件分别设计出光学硬件的结构,将其导出STL文件格式,再将STL文件格式导入3D打印软件中,用3D打印机打印出各部件,并将白色LED灯以及其相应的反射纸,导光板和扩散板安装于发光部件中,然后再将各部件组装构成一便携式黄曲霉素B1的光学硬件装置;
(4)在所述便携式光学硬件装置的光路上,依次设置有上述步骤(2)制作的银染PC片和智能手机摄像头,后由白色LED灯发出的光线经银染PC片照射到智能手机摄像头,并由智能手机拍摄银染PC片上黄曲霉素B1反应区,后通过黄曲霉素B1的智能手机检测程序处理,显示黄曲霉素B1的检测结果。
3.如权利要求2所述的速测方法,所述透明基底层(1)是由聚碳酸酯透明塑料薄片构成。
4.如权利要求2所述的速测方法,所述透明通道层(2)是由聚二甲基硅氧烷制成的薄片,薄片的一面均布有微通道。
5.如权利要求1所述的速测方法,所述光学硬件是由黑色塑料外壳构成的,其中依次设置有电池盒、发光部件及手机插槽;所述发光部件是由顶端面水平设置的反射纸,反射纸下面水平设置的导光板,导光板四周侧边均布的白色LED灯,以及在导光板下面平行水平设置的扩散板和银染PC片插槽构成;所述手机插槽位于银染PC片相对应照射的位置。
6.如权利要求1所述的速测方法,所述智能手机检测程序是由Java语言编写并运行在Android手机平台上。
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