WO2013147388A1 - Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서 - Google Patents

Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서 Download PDF

Info

Publication number
WO2013147388A1
WO2013147388A1 PCT/KR2012/010330 KR2012010330W WO2013147388A1 WO 2013147388 A1 WO2013147388 A1 WO 2013147388A1 KR 2012010330 W KR2012010330 W KR 2012010330W WO 2013147388 A1 WO2013147388 A1 WO 2013147388A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
image sensor
cmos image
measuring
concentration
signal
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/010330
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김민곤
Original Assignee
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광주과학기술원 filed Critical 광주과학기술원
Priority to US14/388,205 priority Critical patent/US9829438B2/en
Publication of WO2013147388A1 publication Critical patent/WO2013147388A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G01N21/6454—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates using an integrated detector array
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N25/00—Circuitry of solid-state image sensors [SSIS]; Control thereof
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N25/00—Circuitry of solid-state image sensors [SSIS]; Control thereof
    • H04N25/70—SSIS architectures; Circuits associated therewith
    • H04N25/76—Addressed sensors, e.g. MOS or CMOS sensors

Definitions

  • the present invention provides a CMOS image sensor for maximizing the detection sensitivity in the same reaction signal by measuring and analyzing a chemiluminescence signal according to the reaction concentration of a target material on a CMOS image sensor substrate on which a bioreceptor is fixed.
  • the present invention relates to a CMOS image sensor capable of maximizing the detection sensitivity by directly analyzing a signal of each pixel array in a measurement area and measuring the number of pixels beyond the cutoff.
  • Biochip is a biosensor technology that is applied to a wide range of fields such as biomarker screening, disease diagnosis, and environmental monitoring by immobilizing hundreds to tens of thousands of different analytes on a solid surface and analyzing specific signals using analytical equipment.
  • Substrates used in biochips include silicon wafers, hydro-gels ( PerkiinElmer Life sci ), hybond ECL membranes ( Anal. Biochem, 294, 55, 2001 ), glass surfaces, thin-flim NC slides ( J. Biomol) Technol, 18, 245, 2007 ), photonic crystal surface, NC slide, and the like, and a method of immobilizing a target material on a surface by using an adsorption and covalent bonding method is known.
  • Biochips fix different biomaterials on the sensor surface where a reactor capable of immobilizing biomaterials is immobilized, and then react with analytes to react secondary reactants labeled with specific substances, and measure them using analytical equipment.
  • methods such as microarray and light patterning are used, and various labeling materials, in addition to enzymes, fluorescence, fluorescent nanoparticles, metal nanoparticles, and quantum dots, are used as labeling materials.
  • labeling materials in addition to enzymes, fluorescence, fluorescent nanoparticles, metal nanoparticles, and quantum dots, are used as labeling materials.
  • it may be accompanied by various types of measurement systems such as fluorescent scanners, SPR biosensors and absorbance sensors.
  • Biochips which are most widely used for disease diagnosis or new drug development, are diagnostic sensors that screen for candidates or diagnose specific diseases in patient samples by fixing antibodies or antigen proteins on the surface of the sensor.
  • the detection sensitivity of biochips studied so far is from several pg / ml to several tens pg / ml.
  • cytokines which mediate cell signaling
  • analytical equipment such as a fluorescence scanner and an SPR sensor that analyze existing biochips is a rather expensive equipment for general use, and thus, the economical efficiency of the measurement equipment is also important. Therefore, in order to realize more advanced biomarker discovery, new drug candidate screening, and disease diagnosis through biochip technology, a new biochip technology that is economical and capable of measuring high sensitivity compared to existing technologies is urgently needed.
  • chemiluminescence it is known as an ultra-high sensitivity detection method that shows detection sensitivity up to the level of zeptomole (10 -18 to 10 -21 mole) in the immune response ( Clin Biochem, 26, 325, 1993 ) .
  • chemiluminescence it is known as an ultra-high sensitivity detection method that shows detection sensitivity up to the level of zeptomole (10 -18 to 10 -21 mole) in the immune response ( Clin Biochem, 26, 325, 1993 ) .
  • chemiluminescence in diagnostic sensors such as high sensitivity strip sensors is increasing ( BioChip J. 4 (2), 155, 2010 ).
  • the present inventors have researched and tried to develop a highly sensitive measuring method capable of analyzing a very small amount of samples that are difficult to analyze using conventional sensing technology.
  • the surface of the measuring unit of the CMOS image sensor is divided into pixels, and the measurement of the CMOS image sensor is performed.
  • the present invention has been completed by discovering that the bioreceptor can be directly fixed to the negative surface to enable chemiluminescence to increase the response efficiency of the image sensor.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring the concentration of a substance to be measured using a CMOS image sensor in which a bioreceptor is directly fixed to a surface of a measuring unit.
  • a method for measuring the concentration of the material to be measured using a CMOS image sensor comprising the steps of: dividing the surface of the measurement unit of the CMOS image sensor by each pixel; Fixing the bioreceptor to a surface of the measurement unit of the CMOS image sensor; And analyzing a chemiluminescent signal at each pixel.
  • the present invention provides a CMOS image sensor comprising a measurement unit is divided into each pixel for the analysis, the bioreceptor is fixed to the surface.
  • the present invention can increase the measurement sensitivity by using the CMOS image sensor itself as a bioreceptor immobilization substrate, and measuring the change of each pixel by measuring the intensity of light in a state in which the light emission reaction is in close proximity.
  • the analysis method provided by the present invention may enable analysis and screening of trace amounts of biomarkers, which have been difficult to measure in existing protein chips, it is possible to apply the analysis method to new drug development and discovery of new biomarkers. It is possible.
  • the present invention is possible to implement a miniaturized and inexpensive high-sensitivity biosensor in place of the expensive analysis device used in the conventional protein chip analysis, it can be applied to an economical biochip analysis system.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a CMOS image sensor of the present invention.
  • Figure 2 shows the process of measuring the chemiluminescence signal by fixing the streptavidin-peroxidase (STA-HRP) in Example 1.
  • FIG. 3 illustrates a sensing result of identifying a pixel representing a chemiluminescent signal having a cut-off value or higher in Example 1.
  • Example 4 is a graph comparing the accuracy of the analysis method of Example 1 and the method of measuring the average intensity of the pixel according to the concentration of streptavidin-peroxidase (STA-HRP).
  • Figure 5 shows the process of measuring chemiluminescence signal by fixing IL-5 in Example 2.
  • FIG. 6 illustrates sensing results of confirming in three dimensions a pixel representing a chemiluminescent signal having a cut-off value or higher in Example 1.
  • CMOS image sensor 11 measuring unit
  • connection 21 STA-HRP
  • the present invention comprises the steps of: classifying a surface of a measurement unit of a CMOS image sensor into a plurality of pixels; Fixing the bioreceptor to a surface of the measurement unit of the CMOS image sensor; And analyzing the chemiluminescence signal at each pixel, thereby measuring the concentration of the measurement target material using a CMOS image sensor.
  • the present invention is characterized by a CMOS image sensor comprising a measurement unit, the surface is divided into a plurality of pixels, the bioreceptor is fixed to the surface.
  • the CMOS image sensor 10 includes a measurement unit 11 and a sensor connection unit 12 as shown in FIG. 1.
  • the measuring unit 11 serves to detect the chemiluminescent signal
  • the sensor connection unit 12 serves to connect the measuring device and the sensor.
  • the surface of the measuring unit is divided into a plurality of pixels, and the pixels preferably have a size of 0.01 to 100 ⁇ m 2 , more preferably 0.1 to 50 ⁇ m 2 , but the size and number of pixels are measured. It may be appropriately adjusted depending on the target material.
  • the reactor may be introduced to the surface of the measuring unit through various methods, and the sensor surface into which the reactor is introduced may be used as a biochip by fixing various types of bioreceptors.
  • the bioreceptor may be one or more selected from the group consisting of antibodies, DNA, enzymes, aptamers, peptide nucleic acids (PNAs), and ligands.
  • the target substance to be measured may be at least one selected from the group consisting of enzymes, proteins, DNA, RNA, microorganisms, animal and plant cells, and organs, wherein the enzyme is a peroxidase, Phosphatase, luciferase.
  • a chemiluminescence reaction is used to analyze a signal of a target substance that reacts with a bioreceptor fixed on the surface of the measurement unit.
  • luminol, isoluminol, luciferin, lucigenin, 3- (2'-Spiroadamantane) -4-methoxy -4- (3 ''-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2 '-(5'-chloro) tricyclo [3.3. 1.13,7] decan ⁇ -4-yl) phenyl phosphate (CSPD) may be used, but is not limited thereto and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the concentration of the measurement target material is measured by analyzing the chemiluminescence signal at each pixel on the surface of the measurement unit.
  • the cut-off value of the chemiluminescence signal can be selected, and the concentration of the measurement target material can be measured by measuring the number of pixels representing the signal equal to or greater than the cut-off value.
  • the cut-off value of the chemiluminescence signal is selected, and the concentration of the material to be measured is measured by measuring the number of pixels whose difference in signal intensity before and after the chemiluminescence reaction indicates a signal equal to or greater than the cutoff value. Can be.
  • the cutoff value may be appropriately adjusted and selected according to the measurement target material, the measurement item, or the measurement method.
  • the measurement method using the CMOS image sensor of the present invention has the maximum detection sensitivity compared to the method of measuring the general chemiluminescence intensity, and the chemiluminescence signal of the target material reacting with the fixed bioreceptor has a distance of several nm from the sensor. To the extent the sensor is advantageous for responding to chemiluminescent signals.
  • the characteristic of the measurement method using the CMOS image sensor is that the number of pixels representing the signal of more than the cutoff value in each pixel is analyzed. For example, if there is a signal difference between 1000 pixels and 1 or 2 pixels before and after the response, converting it into an average light intensity of 1000 pixels would be meaningless, but analyzing the number of individual pixels with signal differences would be meaningful. It is a numerical value.
  • CMOS image sensor measuring unit 11 of FIG. 1 On the surface of the CMOS image sensor measuring unit 11 of FIG. 1, 46000 pixels each having a length of about 4 ⁇ m in length and width are formed.
  • the biotin was prepared by dissolving streptavidin-horseradish peroxidase (STA-HRP, Calbiochem, USA) in 10 mM PB buffer (pH 7.0) (concentration 0, 1, 100, 10000 fg / ml). The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes on the surface of the measuring unit modified with groups, and the enzyme was immobilized on the surface by adsorption. The surface was washed with 10 mM PB buffer solution, distilled water, and 0.1 M carbonate buffer solution (pH 9.0).
  • FIG. 2 A process of forming a chemiluminescence signal according to the treatment of the luminol and hydrogen peroxide solution is shown in FIG. 2.
  • the chemiluminescence signal was measured in pixels, and the cut-off value per pixel was selected as 10 digits. That is, the number of pixels representing the chemiluminescent signal of 10 digits or more was measured, and FIG. 3 shows that the pixels representing the chemiluminescence signal of 10 digits or more were blackened through the measuring method.
  • STA-HRP When STA-HRP is processed at a concentration of 100 fg / ml, more than 10 digits of the signal are displayed at 3,419 pixels. When STA-HRP is processed at a concentration of 10,000 fg / ml (10 pg / ml), more than 10 digits of signals are 19,248 pixels Indicated.
  • 4 is a graph comparing the average digit value of the measurement region according to the concentration of STA-HRP.
  • the concentration of the STA-HRP can be measured with a higher sensitivity through the method of the present invention.
  • the CMOS image sensor measuring unit 11 of FIG. 1 was ultrasonically cleaned in 0.1 N NaOH for 15 minutes, and then washed three times with ethanol to dissolve APTMS ((3-Aminopropyl) trimetoxysilane) dissolved in 1% ethanol. The reaction was carried out for about 2 hours. Then, after washing twice with ethanol, and then again ultrasonically washed in ethanol for 5 minutes and dried with high purity nitrogen gas. In order to make the surface react with the antibody, glutaraldehyde dissolved in 2% by volume in 10 mM PB buffer was reacted for about 4 hours, and finally the surface of the measurement part was modified with an aldehyde group.
  • APTMS ((3-Aminopropyl) trimetoxysilane)
  • 0.1 mg / ml IL-5 capture antibody was reacted with the modified surface for about 1 hour, and reacted with 1% BSA solution for about 2 hours to eliminate non-specific reactions.
  • the mixture of IL-5 antigen dissolved in PBS buffer and biotinylated 5 ⁇ g / ml IL-5 detection antibody was mixed for 10 minutes, and then reacted for 30 minutes on the surface of the measurement unit to allow antigen-antibody reaction to proceed.
  • the surface was washed with PBS buffer and distilled water in that order.
  • 5 ⁇ g / ml of STA-HRP dissolved in PBS buffer was added thereto, followed by reaction for 30 minutes, followed by washing with PBS buffer and 0.1 M carbonate buffer (pH 9.0).
  • FIG. 5 A process of forming a chemiluminescence signal according to the treatment of the luminol and hydrogen peroxide solution is shown in FIG. 5.
  • FIG. 6 is a three-dimensional image of a pixel having the cutoff value or higher, and three if the concentration of IL-5 antigen is 0, 11 for 100 fg / ml, and 10,000 fg / ml (10 pg / ml). In the case of, the signal increase of more than 2 digits appeared in 4069 pixels.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면을 복수의 픽셀로 구분하고 상기 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면에 바이오 리셉터를 직접 고정하여 측정 대상 물질의 농도에 따른 화학 발광 신호를 측정함으로써 측정 대상 물질을 분석할 수 있는 방법 및 이에 적용되는 CMOS 이미지 센서에 관한 것이다.

Description

ＣＭＯＳ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서
본 발명은 바이오리셉터가 고정된 CMOS 이미지 센서 기판 위에 측정대상물질의 반응 농도에 따른 화학발광 신호를 CMOS 이미지 센서의 픽셀 단위로 측정, 분석하여 동일한 반응 신호에서 그 검출감도를 극대화 하는 CMOS 이미지 센서에 관한 것으로, 측정 영역에서 각각의 픽셀 배열의 신호를 직접 분석하여 컷오프 이상의 픽셀 수를 측정함으로써 그 검출 감도를 극대화할 수 있는 CMOS 이미지 센서에 관한 것이다.
바이오칩은 고체 표면 위에 수십~수만개의 서로 다른 분석물질을 고정화 한 후, 분석장비를 이용하여 특정 신호를 분석하여 생체 표지 물질 스크리닝, 질병진단, 환경 모니터링 등 폭넓은 분야에 응용되고 있는 바이오센서 기술이다. 바이오칩에 사용되는 기판으로는 실리콘 웨이퍼, 하이드로-겔(PerkiinElmer Life sci), hybond ECL membrane (Anal. Biochem, 294, 55, 2001), 유리 표면(glass surface), thin-flim NC slide(J. Biomol. Technol, 18, 245, 2007), 광 결정 표면(photonic crystal surface), NC slide 등이 있으며, 흡착 및 공유결합 방법을 이용하여 대상 물질을 표면에 고정화 하는 방법이 알려져 있다.
바이오칩은 생체물질을 고정시킬 수 있는 반응기가 도입된 센서 표면 위에 서로 다른 생체물질을 고정 후, 분석 물질과 반응시켜 특정 물질이 표지된 2차 반응 물질을 반응시키고, 분석장비를 이용하여 측정하게 된다. 다중 분석 바이오칩을 제작하는 방법으로는 마이크로어레이, 광 패턴닝등의 방법이 사용되고 있으며, 표지 물질로는 효소, 형광, 형광나노입자, 금속나노입자, 양자점 이외에도 다양한 표지 물질이 사용되고 있다. 또한 그 표지 형태와 표면에 따라 형광스캐너, SPR 바이오센서, 흡광센서 등 다양한 종류의 측정시스템을 수반한다.
질병진단 또는 신약개발 등에 가장 널리 사용되는 바이오칩은 센서 표면에 항체 또는 항원 단백질을 고정하여 후보물질 스크리닝이나 환자 시료에서 특정 질병의 유무를 진단해 내는 진단 센서이다. 그러나 현재까지 연구된 바이오칩의 검출 감도는 수 pg/ml에서 수십 pg/ml 정도로, 체내에 pg/ml 이하의 농도로 포함된 바이오마커를 분석하는 것은 불가능하다. 일 예로 생체 내에 존재하는 중요 바이오마커 중 세포간의 신호전달을 매개하는 시토카인(cytokaine)의 경우, 대부분이 pg/ml 이하의 농도로 존재하므로 바이오칩 기술을 이용하여 분석하는 것이 거의 불가능하다. 또한 기존의 바이오칩을 분석하는 형광스캐너, SPR센서 등의 분석장비는 일반적으로 사용하기에는 다소 고가의 장비들이 대부분이므로 측정장비의 경제성도 개선해야 할 중요한 문제이다. 따라서 보다 진보된 바이오마커 발굴, 신약후보물질 스크리닝, 질병진단 등이 바이오칩 기술을 통하여 구현되기 위해서는 경제적이고 기존의 기술과 비교하여 고감도의 측정이 가능한 새로운 바이오칩 기술이 개발이 절실히 필요하다.
바이오칩의 검출 감도를 향상시키기 위해서는, 사용되는 표지 시스템의 검출 감도를 향상 시키는 방법과 효율적인 신호 분석 시스템이 필요하다. 화학발광법(Chemiluminescence)의 경우 면역반응에서 젭토몰(zeptomole, 10-18~10-21 mole) 수준까지 검출감도를 보이는 초 고감도 검출 방법으로 알려져 있다( Clin Biochem, 26, 325, 1993). 최근에는 화학발광을 이용하여 고감도 스트립 센서와 같은 진단센서에 응용하는 예가 점점 증가하고 있다(BioChip J. 4(2), 155, 2010).
미국특허 US 8,021,848, US2005/0190286 등 다수의 특허에서는 CMOS 이미지 센서를 이용한 바이오이미징, 형광 센서, 마그네틱 센서 등의 센서가 다수 보고된 바 있다.
그러나 상기 측정방법과 비교하여 검출감도가 우수하고 센서의 광 감응도가 향상된 바이오 센서의 개발이 지속적으로 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 기존의 센싱 기술로서 분석하기 어려운 극미량의 시료 분석이 가능한 고감도의 측정방법을 개발하고자 연구, 노력한 결과, CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면을 각 픽셀로 구분하고, 상기 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면에 바이오 리셉터를 직접 고정하여 화학 발광이 이루어지도록 하면 이미지 센서의 감응 효율을 높일 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 측정부의 표면에 바이오 리셉터가 직접 고정된 CMOS 이미지 센서를 이용하여 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, CMOS 이미지 센서를 이용하여 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법으로서, CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면을 각 픽셀로 구분하는 단계; 상기 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면에 바이오 리셉터를 고정하는 단계; 및 상기 각 픽셀에서의 화학 발광 신호를 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 분석을 위하여 표면이 각 픽셀로 구분되고, 상기 표면에 바이오 리셉터가 고정된 측정부를 포함하는 CMOS 이미지 센서를 제공한다.
본 발명은 CMOS 이미지 센서 자체를 바이오리셉터 고정화 기판으로 사용하고, 발광반응을 근접한 상태에서 광의 세기를 측정하여 각 픽셀의 변화값을 분석하는 방식에 의해 측정감도를 높일 수 있다.
또한 본 발명에서 제공하는 분석방법을 이용하여 기존의 단백질 칩 등에서 측정하는 것이 어려웠던 극미량의 바이오마커의 분석 및 스크리닝이 가능해 질 수 있으므로, 상기 분석방법을 신약개발 및 새로운 바이오마커의 발굴에 적용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은 종래의 단백질칩 분석에 사용되는 고가의 분석장치를 대신하여 소형화 및 저가의 고감도 바이오센서의 구현이 가능한 바, 경제성 있는 바이오 칩 분석 시스템으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CMOS 이미지 센서의 모식도를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(STA-HRP)를 고정하여 화학 발광 신호를 측정하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 컷오프(cut-off) 값 이상의 화학발광 신호를 나타내는 픽셀을 확인한 센싱 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(STA-HRP)의 농도에 따른 실시예 1의 분석방법과 픽셀의 평균 강도를 측정하는 방법의 정확도를 비교한 그래프이다.
도 5는 실시예 2에서 IL-5를 고정하여 화학 발광 신호를 측정하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1에서 컷오프(cut-off) 값 이상의 화학발광 신호를 나타내는 픽셀을 3차원으로 확인한 센싱 결과를 나타낸 것이다.
[부호의 설명]
10 : CMOS 이미지 센서 11 : 측정부
12 : 연결부 21 : STA-HRP
22 : IL-5 포획 항체 23 : IL-5 항원
24 : IL-5 검출 항체 25 : HRP
본 발명은 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면을 복수의 픽셀로 구분하는 단계; 상기 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면에 바이오 리셉터를 고정하는 단계; 및 상기 각 픽셀에서의 화학 발광 신호를 분석하는 단계를 포함함으로써 CMOS 이미지 센서를 이용하여 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 표면이 복수의 픽셀로 구분되고, 상기 표면에 바이오 리셉터가 고정된 측정부를 포함하는 CMOS 이미지 센서를 특징으로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립 CMOS 이미지 센서의 모식도이다. CMOS 이미지 센서(10)의 경우 도 1에서 보는 바와 같이 측정부(11)와 센서 연결부(12)를 포함한다. 측정부(11)에서는 화학발광 신호를 감지하는 역할을 수행하며, 센서 연결부(12)는 측정기와 센서를 연결하는 역할을 한다.
상기 측정부의 표면은 복수의 픽셀로 구분되어 있으며, 상기 픽셀은 0.01 ~ 100 ㎛2크기를 가지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 50 ㎛2 크기를 가질 수 있으나, 픽셀의 크기와 수는 측정 대상 물질에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
또한 상기 측정부의 표면에는 다양한 방법을 통하여 반응기가 도입될 수 있으며, 반응기가 도입된 센서 표면은 다양한 종류의 바이오 리셉터를 고정하여 바이오칩으로 사용될 수 있다. 상기 바이오 리셉터로는 항체, DNA, 효소, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성되는 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.
한편 본 발명에서, 측정 대상이 되는 목적 물질은 효소, 단백질, DNA, RNA, 미생물, 동·식물 세포 및 기관으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이 때 상기 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 포스파타제(phosphatase), 루시퍼라제(luciferase)일 수 있다.
상기 측정부의 표면에 고정된 바이오 리셉터와 반응하는 목적 물질의 신호를 분석하기 위하여 화학 발광 반응을 사용한다. 상기 화학 발광 반응을 유도하기 위하여 바람직하게는 화학발광물질로서 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 루시퍼린(luciferin), 루시게닌(lucigenin), 3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl) phenyl phosphate (CSPD) 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 측정부의 표면의 각 픽셀에서의 화학 발광 신호를 분석하여 측정 대상 물질의 농도를 측정하게 된다.
이 때, 1) 화학 발광 신호의 컷오프(cut-off) 값을 선정하고, 상기 컷오프 값 이상의 신호를 나타내는 픽셀의 수를 측정하여 측정 대상 물질의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 2) 화학 발광 신호의 컷오프(cut-off) 값을 선정하고, 화학 발광 반응 전과 후의 신호 세기의 차이가 상기 컷오프 값 이상의 신호를 나타내는 픽셀의 수를 측정하여 측정 대상 물질의 농도를 측정할 수 있다.
상기 컷오프 값은 측정 대상 물질, 측정 항목 또는 측정 방법에 따라 적절하게 조절하여 선정할 수 있다.
상기 본 발명의 CMOS 이미지 센서를 이용한 측정 방법은 일반적인 화학발광 강도를 측정하는 방법에 비하여 그 검출감도가 극대화되며, 고정된 바이오 리셉터와 반응하는 목적 물질의 화학발광 신호는 센서와의 거리가 수 nm 정도로 상기 센서는 화학발광 신호를 감응하는데 유리하다.
특히 상기 CMOS 이미지 센서를 이용한 측정 방법의 특징은 각 픽셀에서 컷오프 값 이상의 신호를 나타내는 픽셀의 수를 분석한다는 점에 있다. 예를 들어 1000개의 픽셀에 1 ~ 2개 픽셀에 반응 전후의 신호 차이가 있는 경우 1000개 픽셀의 평균 광세기로 환산하면 의미없는 수치가 되지만, 신호 차이가 있는 개개 픽셀의 수를 분석하면 의미있는 수치가 된다.
전술한, 그리고 추가적인 본 발명의 양상들은 첨부된 도면들을 참조하여 설명되는 바람직한 실시예들을 통해 더욱 명확하게 설명될 것이다. 이하에서는 본 발명을 이러한 실시예들을 통해 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 상세히 설명하기로 한다.
그러나 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(STA-HRP)의 측정
상기 도 1의 CMOS 이미지 센서 측정부(11)의 표면에는 가로, 세로 각각 약 4 ㎛ 길이를 가지는 46000개의 픽셀이 형성된다. 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase, STA-HRP, Calbiochem, USA)를 10 mM PB 완충용액(pH 7.0)에 용해시킨 용액(농도 0, 1, 100, 10000 fg/ml)을 상기 바이오틴기로 개질된 측정부의 표면에 상온에서 30분 동안 반응시켜, 표면에 흡착법에 의해 효소를 고정화하였다. 그리고 10 mM PB 완충용액, 증류수, 0.1M 카보네이트 완충용액(pH 9.0) 순으로 표면을 세척하였다.
다음, 0.1M 카보네이트 완충용액(pH 9.0)에 녹인 2 mM 루미놀과 2mM 과산화수소 용액을 처리하였다.
상기 루미놀과 과산화수소 용액의 처리에 따른 화학 발광 신호의 형성 과정을 도 2에 나타내었다.
처리 후 1분이 경과하면 화학발광 신호를 픽셀 단위로 측정하였으며, 픽셀 당 컷오프(cut-off) 값은 10 digit로 선정하였다. 즉, 10 digit 이상의 화학발광 신호를 나타내는 픽셀의 수를 측정하였으며, 상기 측정방법을 통하여 10 digit 이상의 화학발광 신호를 나타내는 픽셀을 검게 표현한 것을 도 3에 나타내었다.
STA-HRP가 100fg/ml 의 농도로 처리되는 경우 3,419개의 픽셀에서 10 digit 이상의 신호를 나타냈으며, 10,000 fg/ml(10 pg/ml)의 농도로 처리되는 경우 19,248개의 픽셀에서 10 digit 이상의 신호를 나타냈다.
또한 STA-HRP의 농도에 따른 측정 영역의 평균 digit 값과 비교한 그래프를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4의 그래프에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법을 통하여 STA-HRP의 농도를 보다 높은 감도로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2 : IL-5의 측정
상기 도 1의 CMOS 이미지 센서 측정부(11)를 0.1N NaOH 용에 15분간 초음파 세척을 진행한 후, 에탄올로 3회 세척하여 에탄올에 1% 농도로 녹인 APTMS((3-Aminopropyl)trimetoxysilane)를 약 2시간 동안 반응시켰다. 다음, 에탄올로 약 2회 세척 후, 다시 5분간 에탄올에서 초음파 세척을 진행하고 고순도 질소가스로 건조시켰다. 그리고, 항체와 반응하는 표면을 만들기 위하여 10 mM PB 완충용액에 2 부피%로 용해된 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 약 4시간 동안 반응시켜 최종적으로 측정부의 표면을 알데하이드기로 개질하였다.
이후, 상기 개질된 표면에 0.1 mg/ml IL-5 포획 항체를 약 1시간 동안 반응시키고, 비 특이적 반응을 제거하기 위하여 1% BSA 용액으로 약 2시간 동안 반응시켰다. 그리고, PBS 완충용액에 녹인 IL-5 항원과 비오틴화된 5 μg/ml IL-5 검출항체를 혼합하여 10분간 반응 후, 측정부의 표면에서 30분간 반응시켜 항원-항체 반응이 진행되도록 한 후, PBS 완충용액, 증류수 순으로 표면을 세척하였다. 다음 PBS 완충용액에 녹인 STA-HRP 5 μg/ml을 첨가하여 30분간 반응 후, PBS 완충용액, 0.1 M 카보네이트 완충용액 (pH 9.0) 순으로 세척하였다.
다음, 0.1M 카보네이트 완충용액(pH 9.0)에 녹인 2 mM 루미놀과 2mM 과산화수소 용액을 처리하였다.
상기 루미놀과 과산화수소 용액의 처리에 따른 화학 발광 신호의 형성 과정을 도 5에 나타내었다.
처리 후 1분이 경과하면 상기 루미놀과 과산화수소 용액 처리 전의 화학발광 신호와의 차이를 측정하였다. 픽셀 당 컷오프(cut-off) 값은 2 digit 으로 선정하였고, 화학 발광 반응 전과 후의 신호 세기의 차이가 상기 컷오프 값 이상인 픽셀 수를 측정하였다. 도 6은 상기 컷오프 값 이상인 픽셀을 3차원 이미지로 나타낸 것이며, IL-5 항원의 농도가 0인 경우에는 3개, 100 fg/ml인 경우에는 11개, 10,000 fg/ml(10 pg/ml)의 농도인 경우에는 4069개의 픽셀에서 2 digit 이상의 신호 증가가 나타났다.
따라서 본 발명의 방법을 통하여 IL-5의 정량 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. CMOS 이미지 센서를 이용하여 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법에 있어서,
    CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면을 복수의 픽셀로 구분하는 단계;
    상기 CMOS 이미지 센서의 측정부의 표면에 바이오 리셉터를 고정하는 단계; 및
    상기 각 픽셀에서의 화학 발광 신호를 분석하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    화학 발광 신호의 컷오프(cut-off) 값을 선정하고, 상기 컷오프 값 이상의 신호를 나타내는 픽셀의 수를 측정하여 분석하는 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    화학 발광 신호의 컷오프(cut-off) 값을 선정하고, 화학 발광 반응 전과 후의 신호 세기의 차이가 상기 컷오프 값 이상의 신호를 나타내는 픽셀의 수를 측정하여 분석하는 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 픽셀의 크기는 0.01 ~ 100 ㎛2 인 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 측정 대상 물질은 효소, 단백질, DNA, RNA, 미생물, 동·식물 세포 및 기관으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 리셉터로는 항체, DNA, 효소, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성되는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질의 농도를 측정하는 방법.
  7. 표면이 복수의 픽셀로 구분되고, 상기 표면에 바이오 리셉터가 고정된 측정부를 포함하는 것을 특징으로 하는 CMOS 이미지 센서.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 바이오 리셉터로는 항체, DNA, 효소, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성되는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 CMOS 이미지 센서.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 픽셀의 크기는 0.01 ~ 100 ㎛2 인 것을 특징으로 하는 CMOS 이미지 센서.
PCT/KR2012/010330 2012-03-28 2012-11-30 Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서 WO2013147388A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/388,205 US9829438B2 (en) 2012-03-28 2012-11-30 High sensitivity biosensor using pixel analysis of CMOS image sensor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120031608A KR101359379B1 (ko) 2012-03-28 2012-03-28 Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서
KR10-2012-0031608 2012-03-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013147388A1 true WO2013147388A1 (ko) 2013-10-03

Family

ID=49260600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2012/010330 WO2013147388A1 (ko) 2012-03-28 2012-11-30 Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9829438B2 (ko)
KR (1) KR101359379B1 (ko)
WO (1) WO2013147388A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10656088B2 (en) 2016-08-12 2020-05-19 Silanna UV Technologies Pte Ltd Ultraviolet biosensor

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180083700A (ko) 2017-01-13 2018-07-23 삼성전자주식회사 생체 센서를 포함하는 전자 장치
TWI698638B (zh) 2017-12-28 2020-07-11 美商伊路米納有限公司 具有降低的螢光範圍雜訊的檢測器以及用於降低螢光範圍雜訊的方法
US10782236B2 (en) 2018-06-11 2020-09-22 Semiconductor Components Industries, Llc Methods and apparatus for a biosensor

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030227612A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-11 Howard Fein Imaging system for examining biological material
US20080081769A1 (en) * 2006-08-24 2008-04-03 Arjang Hassibi Integrated Semiconductor Bioarray
KR20090081266A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 바이오 칩
US7738086B2 (en) * 2005-05-09 2010-06-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
US20110091870A1 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Robert Bosch Gmbh Multisite biosensor and associated method

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9603267A (pt) * 1996-08-02 1998-04-28 Univ Federal De Sao Paulo Processo de preparação e utilização de antígenos de trypanosoma cruzi e ensaio para o diagnóstico da doença de chagas
US20080124327A1 (en) * 1999-10-08 2008-05-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
CA2459320C (en) 2001-09-06 2016-07-05 Genomic Profiling Systems, Inc. Rapid detection of replicating cells
JP2006506046A (ja) * 2002-05-02 2006-02-23 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 発現プロファイリングを用いるバイオ均等性の決定
US20050190286A1 (en) 2004-02-26 2005-09-01 Gregory Kaduchak Integrated array sensor for real time measurements of biological samples
WO2009113771A1 (ko) * 2008-03-14 2009-09-17 (주)지노믹트리 폐암특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출방법
CN102455549B (zh) * 2010-10-27 2015-11-04 斯坦雷电气株式会社 液晶显示装置
FR2974233B1 (fr) * 2011-04-14 2014-01-10 Commissariat Energie Atomique Procédé de fabrication pour la microélectronique

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030227612A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-11 Howard Fein Imaging system for examining biological material
US7738086B2 (en) * 2005-05-09 2010-06-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
US20080081769A1 (en) * 2006-08-24 2008-04-03 Arjang Hassibi Integrated Semiconductor Bioarray
KR20090081266A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 바이오 칩
US20110091870A1 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Robert Bosch Gmbh Multisite biosensor and associated method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MALLARD, FREDRIC ET AL., BIOSENSOR AND BIOELECTRONICS, vol. 20, 2005, pages 1813 - 1820 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10656088B2 (en) 2016-08-12 2020-05-19 Silanna UV Technologies Pte Ltd Ultraviolet biosensor

Also Published As

Publication number Publication date
KR101359379B1 (ko) 2014-02-07
US9829438B2 (en) 2017-11-28
US20150116484A1 (en) 2015-04-30
KR20130109668A (ko) 2013-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1226434B1 (en) Methods for performing magnetic chromatography assays
CN105392895B (zh) 改进的测定方法
Bao et al. Detection of protein analytes via nanoparticle-based bio bar code technology
EP1648286B1 (en) Sensitive and rapid biodetection
US7390675B2 (en) Multi-functional and configurable assay
US8029985B2 (en) Amplified bioassay
US20030157581A1 (en) Use of an imaging photoelectric flat sensor for evaluating biochips and imaging method therefor
US20160123969A1 (en) Methods, materials, and kits for covalently associating molecular species with a surface of an object
WO2017111194A1 (ko) 바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법
CN101144815A (zh) 一种液相蛋白芯片的制备方法
CN109030829A (zh) 一种均相化学发光法检测犬il-6的定量试剂盒及其使用方法
WO2013147388A1 (ko) Ｃｍｏｓ 이미지 센서의 픽셀 분석을 이용한 고감도 바이오센서
US20170227538A1 (en) Method for detecting target molecule and kit for use in said method
KR20040032926A (ko) 발광검출장치, 발광검출용 마이크로어레이플레이트
WO2014137069A1 (ko) 다중 진단용 병렬식 라인형 바이오칩
US20030119030A1 (en) Immunoassay diagnostic probe and a method for use thereof
CN101303348A (zh) 珠体组、珠体组的制造方法和珠体组的使用方法
US20040043398A1 (en) Use of the multipin platform as anchor device
US7851202B2 (en) Biosensor and method for operating the latter
WO2018074832A1 (ko) 바이오센서
CN100480702C (zh) 以磁性微球介导的微流体分析系统及其检测方法
WO2018056700A1 (ko) 반응과 분석을 포함한 단일 진단칩의 고감도 신속진단방법
WO2010140772A2 (ko) 생체물질을 측정하는 장치 및 그 제조 방법
KR20120046616A (ko) 생화학적 결합반응의 간편한 측정이 가능한 바이오 센싱 칩 및 이를 이용한 바이오 마커의 측정 방법
KR102220357B1 (ko) 면역진단 키트 및 이를 이용한 면역진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12872326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14388205

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12872326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1