CN101303348A - 珠体组、珠体组的制造方法和珠体组的使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种珠体组、珠体组的制造方法和珠体组的使用方法，其中珠体组由多个珠体子组构成。在每个子组中的珠体每个都设置有一个表面，该表面允许参与预定的对应的反应或相互作用的物质固定在其上。在珠体组中的各个珠体分别设置有不同的物理要素，从而可以通过由计算机分析在珠体组中的各个珠体的拍摄图像来将珠体组中的各个珠体分成多个子组。

Description

珠体组、珠体组的制造方法和珠体组的使用方法
相关申请的交叉引用
本发明包含于2007年5月10日和2007年6月27日向日本专利局提交的日本专利申请JP 2007-125273和日本专利申请JP2007-168866的主题，其全部内容结合于此作为参考。
技术领域
本发明涉及一种在生化分析技术中特别有用的新型技术。更具体地，本发明涉及一种能够通过新型方法进行各个珠体的识别的珠体组、珠体组的制造技术和关于该珠体组的应用技术。
背景技术
在生化技术等领域中，在某些情况下可以使用通常称为“珠体(微珠)”的微粒载体。作为珠体最广泛采用的生化应用，可列举的有使用硅石珠体或聚合物珠体作为用于液相色谱法的分离柱中的填充材料。
通过使珠体的表面结合抗体、抗生物素蛋白等，还可以使其用于从生物样品中捕获、分离、精制目标物质等。例如，将其上已预先固定了对蛋白质中的特定氨基酸序列的抗体的珠体混合在细胞提取液中以捕获目标蛋白质(或其复合体)的方法已成为用于分析蛋白质的相互作用的有用方法(ISOBE，Toshiaki和TAKAHASHI，Nobuhiro：“Extra Issue-Experimental Lecture 2 for Postgenome Age，Proteome Analysis Methods”，p.166-174，2000，Yodosha Co.，Ltd.)。
还已知有使用“磁性珠体”的方法。可以举出使用其上已固定有针对微生物抗原的抗体的磁性珠体来通过抗原-抗体反应从样品中捕获和检测目标微生物的例子(日本专利公开第2006-017554和2001-004631号等)。还已经提出了另一种方法，将磁性珠体与微通道系统组合以进行细胞的分离(日本专利公开第2006-006166号)。
又已经提出了另一种方法。根据该方法，允许在珠体表面进行物质间的相互作用(例如杂交)。然后，为了分析物质间的相互作用存在与否，向相互作用的位置施加电场，从而使珠体根据保持在珠体上的各物质电荷量(库仑力)而迁移(日本专利公开第2003-302373号)。
此外，分析技术已经建立了实际应用，其中，使用了可以通过根据两种荧光染料不同比例的组合区分从各种珠体发出的光的颜色一种一种地区分这些不同种的珠体的珠体组(最多由多达100种珠体组成)(“LUMINEX”系统(注册商标)；访问http://hitachisoff.jp/dnasis/luminex/microbead/beads.html)。然而，因为不同种珠体是根据发光强度的不同区分的，所以该方法需要精确地检测发光。
发明内容
如上所述，目前在生化领域对珠体的应用技术的开发仍在进行中，并期待其应用在未来进一步扩展。
另一方面，对可以在各种生化分析技术的领域促成高速化、综合分析的实现、效率的提高、精度的提高等新型技术有突出的需求。例如，主要的技术需求包括在DNA序列技术中的读取时间的高速化、以及在药物筛选技术中工作效率的提高。近年来，已报道了不编码蛋白质的核糖核酸(RNA)存在并控制蛋白质的功能，并且已提出某些DNA片段充当了风湿病发病的原因。因此，对用于细胞中作为片段存在的DNA或RNA序列的综合和高精度检测中的技术有突出的需求。
希望提供可以满足上述技术需求的新型生化分析技术。更具体地，本发明的主要需求是提供一种能够显著增加可一种一种地区分的各种珠体的数量的珠体识别技术，以及利用珠体识别技术的应用分析技术。
在本发明的一个实施例中，因此提供了一种由多个珠体子组组成的珠体组，其中，每个子组中的珠体每个都设置有允许参与预定的对应反应或相互作用的物质固定在其上的表面，并且，在所述珠体组中的所述各个珠体分别设置有不同的物理要素，以便所述珠体组中的所述各个珠体可以通过计算机分析在所述珠体组中的所述各个珠体的拍摄图像而被分成所述多个子组。珠体的外形、珠体核心部分的外形、标识符等可以作为物理要素的例子。应注意，本文广泛使用的术语“反应或相互作用”表示了化学结合(包括物质间的非共价结合、共价结合和氢键结合)和离解，并且例如，广泛地包括诸如作为核酸(核苷酸)之间的互补结合，以及大分子-大分子、大分子-小分子和小分子-小分子的结合或离解的杂交的特定结合或离解。
只要使用通过计算机分析拍摄到的珠体图像的方法，就不限定珠体的区别。例如，珠体组可以由在二维或三维形状不同的多个珠体子组构成，并且通过计算机分析拍摄到的珠体图像，可以基于每个珠体形状的不同将珠体分成多个组。作为另一个实例，可以将在珠体组中的各个珠体分别设计为包括核心部分和作为核心部分的外层的外壳部分，并且核心部分分别设置有随子组的不同而不同的形状，以便在珠体组中的所述各个珠体可以通过计算机根据关于珠体组中的各个珠体的拍摄图像的信息分析核心部分的形状而被分成多个子组。作为另一个实例，可将多个珠体子组设置有随子组的不同而不同的标识符，并且标识符的不同可以通过计算机分析珠体组中的各个珠体的拍摄图像而区分。
在本发明的另一个实施例中，还提供了一种用于构成根据权利要求1所述的珠体组的珠体的制造方法，包括以下步骤：将在多个子组中的珠体分别设置为具有不同的物理要素，以便可以通过计算机分析珠体的拍摄图像将珠体组中的珠体区分成多个子组，其中，珠体属于多个子组之一；以及分别对子组中的所得珠体实施表面处理，以便预定的对应物质能够分别固定在子组中的珠体上。珠体的外形、珠体核心部分的外形、标识符等可以作为物理要素的例子。
在本发明的又一个实施例中，还提供了一种用于确定目标核酸链的碱基序列的方法，包括至少要使用上述珠体组；以及一种用于检测生物大分子参与的反应或相互作用(例如杂交)的方法，包括至少要使用上述珠体组。
根据本发明的珠体组通常可以由可以按子组的不同而逐个区分的大量珠体子组构成，因此，可以被用作能够在各种分析技术中获得高速化、综合分析的实现、效率的提高、精度的提高等的有用工具。可将本发明广泛使用在例如碱基序列确定(序列测定)技术；为各种目的实践的杂交检测技术，包括基因表达分析等；药物筛选技术；涉及DNA、RNA等的序列分布和定量的测量技术；探针设计技术；蛋白质组分析方法；等等。
附图说明
图1是示出了根据本发明的珠体组的第一实施例的示图；
图2是示出了根据本发明的珠体组的第二实施例的示图；
图3是描述了根据本发明的珠体组的第三实施例(第二实施例的修改)的示图；
图4是示出了用于说明图1的珠体组的制造方法的一个实例的说明性处理流程的示图；
图5是示出了用于在制造方法中的光掩膜的一个实例的平面图；
图6A～图6C是示出了其中还配置了光屏蔽部分的光掩膜中的透光区域的实例的平面图；
图7是示出了仅在特定珠体上进行的使用引物进行聚合酶扩增反应的概念图；
图8是示出了能够执行珠体形状的测量和荧光强度的测量的系统构造的一个实例的示意性框图；
图9是关于珠体形状的识别和评估的流程图；
图10是关于珠体形状的识别和评估的程序的概念图；
图11是柱状表示分别对应于每个核心部分的形状都不同的总共七种珠体所测量的荧光强度的示图；
图12是示出了用于通过使用固定在根据本发明的实施例的珠体组上的碱基序列来确定目标DNA低聚物的序列的概念的示意图；以及
图13是示出了用于通过使用根据本发明的实施例的说明性的珠体组来检测杂交的概念的示意图。
具体实施方式
下文中，将参考附图来描述本发明的一些优选实施例。(1)珠体
图1是示出了根据本发明的珠体组的第一实施例的示图，具体地，该珠体组是“由多个珠体子组组成的珠体组，其中，在每个子组中的珠体都设置有表面，能够在该表面上固定参与预定的对应反应或相互作用的物质，并且在珠体组中的各个珠体分别设置有不同的物理要素，以便珠体组中的各个珠体可以通过计算机分析在珠体组中的各个珠体的拍摄图像而被分成多个子组”。图2是示出了珠体组的第二实施例的示图，以及图3是示出了珠体组的第三实施例的示图。应注意，在这些图中所示的第一、第二和第三实施例都是通过实例简单示出了根据本发明的珠体组的一些典型实施例并且本发明并不局限于此。
现在将描述图1所示的珠体组1。该珠体组1是由多种珠体构成，多种珠体的立体形状不同，从而可以基于由计算机进行的图像处理使这些珠体相互区分。例如，如在图1中由数1共同表示，珠体组1由立方体(正六面体)珠体11和三角锥(正四面体)珠体12构成。应注意，尽管为了更容易理解本实施例示出了这两种珠体，但是对于珠体种类的数量并没有明确的限制，并且可以根据目的和需要来合理设置。
作为珠体组1的修改，珠体组可以由具有不同二维形状(例如圆形、正方形、三角形等)的多种珠体构成，从而多种珠体可以基于计算机进行的图像处理而相互区分(图中未示出)。
还可以设计成对珠体组1或修改应用预定标识符。应用这些标识符以通过向计算机进行的图像处理提交由CCD相机等拍摄的图像来区分珠体的种类。
另一方面，对标识符的具体种类并没有明确的限制。可以从数字、数列、字符、字符串、图形、图样、条形码、附加形状部分和这些标识符中的两种或两种以上的组合来合理地选择和采用这些标识符。至于应用了这些标识符的区域，只要可以根据CCD照相机等拍摄的图像来区分标识符，就不作特定限制。例如，这些区域可以是珠体的表面，或者可以是珠体的内侧部分。
将构成珠体组1的珠体设计成使它们的表面都能够固定参与预定的对应反应或相互作用的物质。如需要，可以向珠体11、12的表面施加涂覆处理或化学处理以分别固定所需物质。例如，珠体可以被处理成使所需物质通过诸如二硫结合、酰胺结合、卵白素-生物素结合等的化学结合分别固定到珠体的表面上。
接下来，从如图2中的放大图所示的珠体可以观察到(参看图2中虚线箭头前部所示的概图)，在图2所示的第二实施例的珠体组2中的珠体通常设置有核心部分2a(构成每个珠体的核心结构部分)和外壳部分2b(被形成为包裹核心部分2a的外围)。
为了可以将珠体组2的各个珠体分成多个子组，核心部分2a以多种形状形成。例如，如正视图所示的形状，除了圆形之外，还以多边形(例如三角形、诸如正方形和矩形的四边形、五边形和六边形和星形)形成了核心部分2a。以圆形作为实例，可以假定每个核心部分2a的尺寸为例如直径约50μm。
作为每个核心部分2a的形状，只要能够区分核心部分的图像，就可以视需要来选择二维形状、三维形状等。另外，也可以根据目的或应用来视需要确定每个核心部分2a的尺寸。
外壳部分2b用作每个珠体的表面层部分，并且是通过由涂覆处理(将在随后的下文中描述)向对应的核心部分2a涂覆合成树脂(例如，聚苯乙烯)形成的部分。对外壳部分2b的外形并没有明确的限制，但是作为实例，它可以是球形或非常接近于球形的形状。更理想地，构成珠体组2的各个珠体可以具有相同的表面积。
图2通过实例示出了其中的核心部分2a的正视图形状为圆形的珠体子组21、其中的核心部分2a的正视图形状为正方形的珠体子组22、以及其中的核心部分2a的正视图形状为三角形的珠体子组23。通过处理由CCD相机等拍摄的珠体图像、以及通过计算机分析其信息，珠体组2的各个珠体可以被分成珠体子组21、珠体子组22和珠体子组23之一。应注意，也可以根据目的视需要来设置每个核心部分2a的形状不同的一个或多个额外珠体子组(未示出)。
接下来参考图3，将描述根据本发明的第三实施例(即，第二实施例的修改)的珠体组20。如图3所示，珠体组20的特征在于已应用预定标识符。应用这些标识符以通过使待由CCD相机等拍摄的图像经过由计算机进行的信息处理来逐个子组地区别珠体。
关于特定种类的标识符，并不局限于如图3所示的这样单个数字，而可以合理地采用数列、字符、字符串、图形、图样、条形码、附加形状部分或这些标识符中的两种或两种以上的组合。应注意，在图3中，作为简单实例示出应用了标识符(数)1的珠体子组201、应用了另一标识符(数)2的珠体子组202和应用了另外一标识符(数)3的珠体子组203。
关于应用了标识符的区域，只要可以从由CCD相机等拍摄的图像中识别出标识符，就不作任何明确限制。当珠体具有核心结构时，可以将标识符应用于珠体核心结构部分的表面(在该情况下，他们的形状可以相同)。也可以不考虑珠体是否具有核心结构，将标识符应用于珠体的表面。
(2)根据本发明的珠体组的制造方法
首先，描述构成上述珠体组1(见图1)的珠体的示例性制造过程。可以采用以下方法，即，通过预定的.光加工曝光系统(photofabrication exposure system)来三维图样化曝光光固化树脂，将图样化曝光的树脂浸入预定的有机溶剂中以洗掉在未固化部分的树脂，并且仅保留曝光并固化的部分，以显影三维图样并因此制造所需的三维结构。
可以将三维图样转换成绘图数据(其三维CAD数据已被切成薄的横截面)，并且使用由对应于切片数据(slice data)的紫外线波长的LED或LD构成的光源，然后通过打开和关闭DMD(数字微镜器件)的各个像素形成对应于切片数据的二维图样。通过物镜，使二维图样的紫外光照射在已涂覆光固化树脂的基板上，从而图样化曝光该光固化树脂。在完成特定切片层的曝光之后，涂覆对应于下一层的光固化树脂作为叠层，然后使其暴露给对应于下一层的图样的UV光。通过重复这些步骤，可以执行对应于立体快速原型的三维图样曝光。
当浸入所得的光固化树脂的图样化曝光块时，在曝光处理之后，在充满有可引起未曝光和未固化树脂部分分解的有机溶液的电解槽中，可以获得所需的三维结构。由于DMD的像素尺寸小至约15μm，所以使用具有大约10的放大率以及相当高的数值孔径的物镜可以执行微米(μm)级别的图样曝光，从而可以用微米级别的精度来实现立体快速原型制作。应注意，可使用LCOS(硅基液晶)代替DMD。描述了采用通过使用SXRD(硅晶体反射显示器)的LCOS的实例，SXRD是一种反射型液晶器件，通过外加电压来控制形成在硅镜表面上的每个液晶的取向，从而改变其反射率。由于其像素尺寸小至约7～9μm，所以可以期待得到两倍于从DMD可得到的解析度。
作为每个珠体的构造，可以采用边长50μm的立方体(正六面体)或三角锥(正四面体)。另外，在平面上以矩阵图样排列了多达100个珠体的在每个面上形成有标识符(例如，条形码形式的凸面)的构造的珠体。即使排列相同类型的100个珠体，它们也完全可以被配置在1平方毫米之内。通过上述光加工处理可以制造具有不同于立方体和正四面体的各种立体形状并在其表面上携带不同条形码的多种珠体。
在通过上述光加工方法制造珠体之后，通过无电镀处理在珠体的表面上以约几十纳米的厚度涂覆诸如Ni(镍)的金属，从而可以强烈反射可见光。在无电镀方法中，例如，将珠体放在溶解了氨基磺酸镍、二氯化钯等的水溶液中，并且通过使用钯胶体，使Ni沉积在珠体的表面上。
接下来，使镀镍珠体分散在例如聚苯乙烯/丙酮溶液中，并且通过注射向强搅拌下的己烷中逐滴添加分散液，从而用聚苯乙烯来涂覆珠体表面。通过过滤来聚集所得的沉淀物，然后通过使用超声波使其再分散到甲醇/水溶液中。通过离心分离，聚集成下层。
聚集层用甲醇清洗后干燥。使干燥后的珠体在培养皿中展薄，接下来进行臭氧化以在珠体表面上形成羧基。向珠体中添加EDC(1，2-二氯乙烷；100mg/mL)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺；100mg/mL)的混合溶液。在振荡作用下，混合溶液和珠体在室温下反应30分钟。反应产物通过过滤聚集起来并用水清洗，然后与例如合成低聚物(具有氨基末端并且具有特定的DNA碱基序列)/NaCl(1M)溶液进行反应。所得的反应产物通过过滤聚集起来后干燥，从而获得用预期检测探针表面修饰后的目标珠体。
接下来，参考图4和5描述用于制造构成珠体组2的珠体的方法的一个实例。通过向基板(其上已通过使用由照相平板印刷术图样化的印模来图样化催化剂)实施无电镀可以制造在珠体组2中的每个不同形状的核心部分2a(参看图2)。
以下将更具体地描述以上的制造方法。图4是用于制造根据本发明的珠体组1的方法的概念处理流程图。如图4所示，首先在基板(例如，玻璃制成的基板)5上层压保护膜3和干膜抗蚀剂4(例如，“SUNFORT”，Asahi Kasei Corporation的产品)(参看图4中的步骤P1)。在保护膜3上结合光掩膜6(例如，玻璃掩膜，其上图样化有圆形、三角形、正方形、五边形、六边形、星形或矩形)之后，执行UV曝光(参看图4中的步骤P2)。
可选地，代替在基板5上的干膜抗蚀剂4，能够设计成以预定形状形成的核心部分可以通过排列可用酸或碱除去的层(由SiO2或MgO构成的牺牲层)而从基板5上剥去。
图5示出了在当形成圆形核心部分使所采用的光掩膜6上的光屏蔽图样(或透光图样)的一个实例。在图5中，各个圆61是透光区域，而除了这些圆之外的区域62表示光屏蔽区域。每个圆61的尺寸可以被设计成具有例如50μm的直径。
通过设计在光掩膜6上的每个透光区域(圆61)的内侧部分设置由单个数字、数列、字符、字符串、图形、图样(例如光点图样)、条形码或这些标识符之中的两个或两个以上的组合形成的光屏蔽部分(非曝光部分)，能够制造具有对应于光屏蔽部分的数字、字符等的核心部分。
图6A～图6C是示出了排列在光掩膜6上的每个透光区域(圆61)和设置有光屏蔽部分的实例的示图。图6A示出了排列单个数字形式的光屏蔽部分的实例，图6B示出了排列光图样形式的光屏蔽部分的另一实例，而图6C示出了排列矩形图形(或条形码)形式的光屏蔽部分的又一实例。
现在，再次参考图4进行描述。在上述紫外曝光步骤P2之后，剥去保护膜3和光掩膜6(参看图4中的步骤P3)，随后，用弱碱性的水溶液除去未曝光的部分，接下来进行干燥(参看图4中的步骤P4)。接下来，在纯净水(20mL)中制备二氯化钯(5mg)和盐酸(0.1mL)的水溶液、然后涂覆在所形成图样的凸面上并进行干燥(见图4中的步骤P5)。
作为用于形成催化剂图样7的方法，可以通过光在基板上固定例如用于无电镀的光敏催化剂(参考文献：“Technical Report 2000”，p52，Sumitomo Osaka Cement Co.，Ltd.)或钯胶体。
接下来，将在凸面上转移了催化剂图样的基板5在被控制在85℃(参看图4中的步骤P6)的“BF-Ni溶液”(商标，KhozaiCorporation的产品)中侵入10分钟，用水清洗，然后用强碱清洗(参看图4中的步骤P7)。在通过使用玻璃滤器聚集剥去后的核心部分8之后，将它们与玻璃滤器一起在真空中干燥以获得珠体的核心部分8(参看图4中的步骤P8)。应注意，这样获得的核心部分8(对应于图2中的符号2a)被设计成具有例如约2μm的厚度。
将通过上述步骤P1～P8获得的核心部分8添加到丙酮中1wt％的聚苯乙烯(分子量：100,000)溶液中，并且使其彻底地分散在该溶液。在烈搅拌下的己烷中，从注射器中逐滴加入该分散液，以使核心部分8的表面涂覆有苯乙烯，从而形成了外壳部分(对应于图2中的符号2b)。通过过滤聚集所得的沉淀物，然后通过使用超声波使其再分散到甲醇/水溶液中。通过离心分离聚集下层。聚集层用甲醇清洗后干燥。
(3)使用珠体的实例
以具有通过上述制造方法获得的核心部分8作为核心的构造的干燥珠体作为实例，下文中将基于实例来描述干燥珠体的一个应用实例(序列测定)。
将获得的干燥珠体在培养皿中展薄，并且通过在臭氧化处理系统(“PDC200”，商标；由Yamato K.K.制造)中的臭氧化，在珠体的表面形成羧基。然后向具有分别以100mg/mL混合的EDC(1，2-二氯乙烷)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)的溶液中添加珠体。在室温下的振荡下，它们进行30分钟的反应。反应产物通过过滤聚集起来并用水清洗，然后与具有氨基末端(作为引物)/NaCl(1M)溶液的DNA低聚物进行反应。所得的反应产物通过过滤聚集起来然后被干燥，从而提供目标珠体。
作为珠体的核心部分，总共设置了七个子组，例如，包括作为如正视图所示的图形的圆形、三角形、正方形、五边形、六边形、星形和矩形。在各个子组中的珠体的表面上，通过酰胺结合分别固定下表1所示的碱基序列的7-mer的DNA低聚物(作为引物)。在该实例中，还预先提供了已知序列的25-mer的DNA低聚物(序列编号8：tccgataaca gtgatcagca tggct)作为目标。
表1
  核心部分的形状 固定的DNA低聚物的碱基序列   序列编号
  圆形 aggctat(1-7)   1
  三角形 tattgtc(5-11)   2
  正方形 gtcacta(9-15)   3
  五边形 tagtcgt(14-20)   4
  六边形 cgtaccg(18-24)   5
  星形 aggctag(1-7，第七碱基是错配碱基)   6
  矩形 ggcctta(错配序列)   7
在上述7个珠体子组每个都被测量出多达1mg并被混合到一起之后，添加用“CYTM3”(荧光染料，Amersham Biosciences Limited的产品)示踪的ddNTP、“IPROOF DNA POLYMERASE”(商标，Bio-Rad Laboratories，Inc.的产品)以及目标DNA低聚物，然后添加“IPROOF HF BUFFER”(商标，Bio-Rad Laboratories，Inc.的产品)，以分别以200mM和1μM来调节ddNTP和目标DNA低聚物的浓度。
在将所得的混合溶液在98℃加热10秒钟之后，将混合溶液冷却至30℃并以相同温度保持1分钟。再次将混合溶液在98℃保持10秒钟之后，进行离心分离。在埃彭道夫管中进行反应，并将由用1M的NaCl清洗和随后的离心分离组成的操作重复三次。向这样获得混合物添加1M的NaCl(10μL)，并且对各个珠体的形状和荧光强度进行测量。
当采用一种方法以通过固定在各个珠体子组上的DNA低聚物(作为引物)和作为模板的目标DNA低聚物(序列编号8)之间的互补链的构造(使用引物的聚合酶扩增反应)来尝试碱基序列的复制工作时，可以经设计使其代替利用以荧光染料示踪的ddNTP方法，预先将诸如荧光染料(例如，荧光素)和猝灭剂(例如，“BHQTM1”，Biosearch Technologies，Inc.的产品)的染料-猝灭剂对分别结合至固定在珠体上的各个DNA低聚物的5’-位置和3’-位置，并且作为利用固定的DNA低聚物(作为引物)的扩增反应的结果，猝灭剂被释放并消除了由猝灭剂引起的荧光熄灭从而发出了荧光。
本质上，可以通过使用以下方法来执行预期的分析(例如，模板DNA的碱基序列的确定)，即，根据珠体子组预先改变待固定的DNA低聚物(作为引物)的种类，并且确认关于互补链(使用引物的聚合酶扩增反应)的形成进入到哪个珠体子组或哪几个子组。
通过举例，图7示意性示出了不同碱基序列A、B、和C的DNA低聚物(作为引物)已被分别固定在三种珠体21、22和23上、作为关于固定在珠体21(在珠体21、22、23中21具有圆形核心部分)上的DNA低聚物(作为引物)A的模板目标DNA(参看图7中的符号T)已被杂交，并且使使用DNA低聚物(作为引物)A的聚合酶扩增反应能够执行的情况。
例如，通过测量从通过聚合酶扩增反应合成的ddNTP引起的荧光和来自在DNA低聚物(作为引物)A上示踪的荧光染料的荧光的强度并且还指定这些荧光从珠体21引起，可以确定作为模板的目标DNA(参看图7中的符号T)至少具有能够与DNA低聚物(作为引物)A形成互补链的碱基序列区域。当目标DNA的数量很小时，可以设计为重复使用引物的聚合酶扩增反应。
下文中将描述用于测量珠体形状的示例性方法以及用于测量荧光强度的示例性方法。例如，可以通过使用图8所示构造的系统100来执行珠体形状和荧光强度的测量。
该系统100被构造成使用于引导珠体样品的注射泵101和用于输送辅助溶液以控制流速和珠体分离的另一注射泵102通过Y形管103连接在一起，并且将珠体样品经由Y形管103引入到流动室104中。作为流动室104，例如，可以使用光导纤维连接毛细管(NipponElectric Glass Co.，Ltd.的产品；内径：0.25×0.127mm)。
打开排列在流动室104附近的荧光激发激光器105，从而连续监控流动室104的发射。激光器105的这种打开是周期性存在的，通过PMT(光电倍增管)108，经由安排在光传播路径上的分色镜106和滤光器107检测荧光，并且在滤光处理和增幅之后，将所得的荧光输入到锁定放大器109中来测量其强度。
在荧光的强度开始增加时，打开图像检测激光器110以通过CCD相机112经由显微镜111来拍摄珠体的形状，通过计算机113基于来自它们拍摄的图像的形状来识别珠体，并将图像信息记录在计算机113的存储单元中。在分析单元114，累积荧光强度数据和图像信息来分析它们的相互关系。
为了增加图像识别的准确性，可设计多次执行图像输入操作直到荧光强度下降。通过将在每个输入操作中的荧光强度与在前输入操作中的对应值进行比较，取确定后的最大值作为珠体的荧光强度并分析在对应于最大值的输入操作中输入的图像，可以确定珠体的类型。然后将珠体的类型和最大荧光强度作为数值的组合而存储。
接下来，具体描述用于识别珠体形状的方法的一个实例。可以通过用作为基准的图形进行叠加来执行珠体形状的识别及其评估。图9是关于珠体形状的识别及其评估的示例性流程图，以及图10是关于珠体形状的识别及其评估的示例性程序的概念图。
下文中将描述的在示例性识别方法中所采用的是通过检测所得的多个图像的边缘来提取珠体的核心部分的形状的方法。应注意，对于珠体的形状识别，也可以使用诸如依赖特征点的提取的识别方法的其他方法。
检测拍摄图像的边缘，提取核心部分的图像，然后确定图像中的最长边。将最长边设为垂直轴，将图像尺寸标准化。将所拍摄的图像相互比较，并选择具有最大面积的图像作为候选图像。执行候选图像与每个基准图像的叠加，并辨别给出最大重叠的基准图像(具体参看图10)。增加在各个图像上测量的荧光强度的最大值以计算来自各个图像的荧光的总量。
接下来，要描述用于碱基序列的归属的示例性操作。在图11中，柱状示出了分别对应于总共七种珠体(每种珠体的核心部分的形状都不同)而实际测量的荧光强度。从固定有作为模板DNA(低聚物)的部分序列的DNA低聚物的珠体(如正视图所示，具有圆形、三角形、正方形、五边形、以及六边形形状作为核心部分的形状)，基本上测量到相同的荧光量(参看图11)。
另一方面，从末端碱基不同的珠体类型(在正视图每个核心部分的形状中具有星形的形状)以及能够与目标DNA低聚物(模板)形成任何互补链的珠体类型(在正视图每个核心部分的形状中具有矩形的形状)，仅可以观察到少量的荧光(参看图11)。
图12是示出了用于通过使用固定在珠体上的碱基序列来确定目标DNA低聚物的序列的概念的示意图。
通过并排提高珠体的碱基序列的荧光强度(参看图12)、叠加重叠的序列区域以确定序列、以及获得互补的序列，可以精确确定目标DNA低聚物的序列。
在关于序列的确定的实例中，已具体描述了使用7种碱基序列所得到的结果。当使用每个都由例如7个碱基组成的7种碱基序列时，存在多达4的7次幂(16,384)个组合。通过使用所有这些组合的珠体，可以确定任何所给的碱基序列。当已一定程度了解碱基序列时，可以使待使用的珠体种类比该实例中的更少。
作为根据本发明的珠体组的应用，已以序列测定技术为中心描述了该实例。然而，珠体组的应用并不局限于序列测定技术。例如，它也可以应用于检测杂交等。
如图13所示，例如，将多种珠体21、22和23添加给相互作用的预定位置，在各个珠体21、22和23上，已预先固定了不同碱基序列的DNA探针D1、D2和D3。
将用荧光染料F示踪的目标(例如，cDNA)T1添加至相互作用的位置，并且在预定的适当条件下进行杂交。共同分析通过珠体的识别获得的结果以及通过荧光强度测量获得的结果。例如，当发现仅从珠体21发出荧光时，确定目标T1具有与固定在珠体21上的DNA探针D1互补的序列。以这种方式，可以发现例如疾病相关基因的表达状态。
当在样品中同时存在多种DNA(或RNA)时，即使分析无法确定它们的碱基序列，本发明仍可以发现具有特定部分序列的DNA(或RNA)的存在比例。
当在本发明中使用杂交检测的方法时，对检测方法没有明确的限制。根据目的，例如，可以自由选择以使用特别结合成双链的插入剂来发出荧光、或采用不同于荧光检测的检测方法(例如，依靠放射性物质的检测、或电检测)，而不局限于荧光示踪目标的方法。

Claims (8)

1.一种由多个珠体子组构成的珠体组，其中，每个子组中的所述珠体每个都设置有允许参与预定的对应反应或相互作用的物质固定在其上的表面，并且，所述珠体组中的所述各个珠体分别设置有不同的物理要素，以便所述珠体组中的所述各个珠体可以通过计算机分析所述珠体组中的所述各个珠体的拍摄图像而被分成所述多个子组。
2.根据权利要求1所述的珠体组，其中，所述珠体组由二维或三维形状不同的多个珠体子组构成。
3.根据权利要求1所述的珠体组，其中，所述珠体组中的所述各个珠体分别包括核心部分和作为所述核心部分的外层的外壳部分，并且，所述核心部分分别设置有随子组的不同而不同的形状，以便所述珠体组中的所述各个珠体可以通过计算机根据关于所述珠体组中的所述各个珠体的拍摄图像的信息来分析所述核心部分的所述形状而被分成所述多个子组。
4.根据权利要求1所述的珠体组，其中，所述多个珠体子组设置有随子组的不同而不同的标识符，并且，所述标识符的不同可以通过计算机分析所述珠体组中的所述各个珠体的拍摄图像而区分。
5.一种用于构成根据权利要求1所述的珠体组的珠体的制造方法，包括以下步骤：
将多个子组中的所述珠体分别设置为具有不同的物理要素，以便可以通过计算机分析所述珠体的拍摄图像将所述珠体组中的所述珠体区分成所述多个子组，其中，所述珠体属于所述多个子组之一；以及
分别对所述子组中的所得珠体实施表面处理，以便预定的对应物质能够分别固定在所述子组中的所述珠体上。
6.一种用于确定目标核酸链的碱基序列的方法，包括至少使用根据权利要求1所述的珠体组。
7.一种用于检测生物大分子参与的反应或相互作用的方法，包括至少使用根据权利要求1所述的珠体组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述反应或相互作用是杂交。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102128922A (zh) * 2009-12-16 2011-07-20 索尼公司 用于检验微珠的单元和分析微珠的方法
CN102333890A (zh) * 2009-02-27 2012-01-25 皇家飞利浦电子股份有限公司 使用编码的微载体进行的基因组选择和测序

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2430112B1 (en) 2009-04-23 2018-09-12 The University of Chicago Materials and methods for the preparation of nanocomposites
JP5589616B2 (ja) * 2009-09-15 2014-09-17 ソニー株式会社 マイクロビーズ解析方法及びマイクロビーズ解析装置
JP5707909B2 (ja) * 2010-12-06 2015-04-30 大日本印刷株式会社 微粒子の製造方法
JP5824878B2 (ja) * 2011-05-31 2015-12-02 大日本印刷株式会社 偽装防止用粒子の製造方法
JP6246176B2 (ja) * 2015-11-05 2017-12-13 株式会社オプティム 立体型情報コード、及び、立体型情報コード読み取り装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1018365A2 (en) * 1995-10-26 2000-07-12 University Of Hertfordshire Coded particles for process sequence tracking in combinatorial compound library preparation
US20030162181A1 (en) * 2002-02-28 2003-08-28 Eastman Kodak Company DNA sequencing and gene identification

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6284459B1 (en) * 1995-04-25 2001-09-04 Discovery Partners International Solid support matrices with memories and combinatorial libraries therefrom
US6586193B2 (en) * 1996-04-25 2003-07-01 Genicon Sciences Corporation Analyte assay using particulate labels
WO1999060170A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Hyseq, Inc. Linear arrays of immobilized compounds and methods of using same
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
CN1412320A (zh) * 2001-10-11 2003-04-23 宋克 基因芯片联合处理系统及相关技术
US7335153B2 (en) * 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
US20100255603A9 (en) * 2002-09-12 2010-10-07 Putnam Martin A Method and apparatus for aligning microbeads in order to interrogate the same
US20040175842A1 (en) * 2003-03-04 2004-09-09 Roitman Daniel B. Near-field and far-field encoding of microbeads for bioassays
JP2004354164A (ja) * 2003-05-28 2004-12-16 Olympus Corp 微粒子を用いた検体の検査方法及びその検査システム
WO2005061094A1 (en) * 2003-12-22 2005-07-07 Versamatrix A/S Identification of encoded beads
US7183119B2 (en) * 2004-11-15 2007-02-27 Eastman Kodak Company Method for sensitive detection of multiple biological analytes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1018365A2 (en) * 1995-10-26 2000-07-12 University Of Hertfordshire Coded particles for process sequence tracking in combinatorial compound library preparation
US20030162181A1 (en) * 2002-02-28 2003-08-28 Eastman Kodak Company DNA sequencing and gene identification

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102333890A (zh) * 2009-02-27 2012-01-25 皇家飞利浦电子股份有限公司 使用编码的微载体进行的基因组选择和测序
CN102333890B (zh) * 2009-02-27 2017-11-14 皇家飞利浦电子股份有限公司 使用编码的微载体进行的基因组选择和测序
CN102128922A (zh) * 2009-12-16 2011-07-20 索尼公司 用于检验微珠的单元和分析微珠的方法
CN102128922B (zh) * 2009-12-16 2015-05-13 索尼公司 用于检验微珠的单元和分析微珠的方法

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