CN111635931B

CN111635931B - 一种多靶标miRNA检测微流控芯片、检测方法及其快速定量检测系统

Info

Publication number: CN111635931B
Application number: CN202010460726.9A
Authority: CN
Inventors: 吕雪飞; 何芳兰; 邓玉林; 姚梦迪; 李堃杰; 李晓琼
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111635931A

Abstract

本发明提出一种多靶标miRNA检测微流控芯片，检测微流控芯片在预环化腔室和环化腔室间设有第一微混合器，在环化腔室、扩增腔室间通道设有第二微混合器，在扩增腔室和试纸条腔室间通道设有第三微混合器；预环化腔室完成环化体系的进样，环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；试纸条腔室内设有荧光侧流向层析试纸条。本系统为miRNA的快速检测提供了一种微流控芯片检测平台，可以实现核酸提取‑扩增‑检测一体化，在缩小样本量的同时极大地提高检测效率。

Description

一种多靶标miRNA检测微流控芯片、检测方法及其快速定量检测系统

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种多靶标miRNA检测微流控芯片、检测方法及其快速定量检测系统。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内源单链非编码的小RNA分子，长度为18—25nt。迄今为止，已有超过2500种miRNA被报道为基因表达的关键调节因子，涉及诸如细胞增殖、迁移和癌变等细胞过程。大量研究表明miRNA可作为细菌/病毒感染、精确肿瘤诊断和预后的重要生物标志物。因此，miRNA的定量检测技术研究对于提高疾病的早期诊断率、快速分诊、危险分层和预后评估等均具有重要意义。

迄今为止，已有许多研究报道关于miRNA检测的分析方法。其中，微阵列分析、Northern印记、实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)被认为是传统标准方法。

(1)微阵列分析，RNA纯化后，通常使用T4 RNA连接酶在miRNA的3'末端标记带有荧光基团的核苷酸。在载玻片上，通过标记的miRNA与离散排列的探针(互补的DNA寡核苷酸)杂交发现特定的miRNA。miRNA的微阵列分析方法的优势在于比其他分析方法成本低，而且可以进行大量的平行检测。miRNA微阵列最适用于比较两种状态(例如治疗与对照或疾病与健康)之间的特定miRNA的相对丰度，不能用于绝对定量。此外，对于miRNA家族成员之间的高序列同源性样品，其灵敏度较差，并且微阵列间存在交叉杂交和实验室间重现性较差的问题。由于特异性有限，通常再通过第二种方法如Northern印迹或qRT-PCR验证初始观察结果。

(2)Northern印记，将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，能够直接反映RNA的丰度，结果更加直接可信。但是Northern印迹耗时长、灵敏度较差、吞吐量低，通常需要大量样本，限制了其在临床诊断中的应用。

(3)RT-PCR，基于miRNA到cDNA的逆转录，进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法，可以实时监测反应产物的积累量。RT-PCR的优点在于实用性强、灵敏度高、准确性高。但是，miRNA的短片段长度使得引物设计更加复杂，增加了实验成本和复杂性。此外，RT-PCR需要精确控制温度，且容易造成假阳性。

近年来，有许多关于miRNA检测新方法见诸于报道，如比色法、生物发光、酶分析和基于深度测序的检测方法等。相比于相对复杂、耗时长的传统方法，这些检测新方法相对简单快速。由于miRNA分子小、表达量少，qPCR可以提高检测灵敏度，同时由于其高特异性和准确度的优点，仍然是应用最为广泛的miRNA定量方法。然而qPCR工作量相对较大、耗时较长，并且需要专业的技术人员以及昂贵的技术仪器，显著影响了其在即时诊断(point-of-caretesting,POCT)中的应用。

值得一提的是，上述这些方法均不能实现miRNA的提取、扩增和检测一体化。而微流控技术和传感器技术的结合，可以将生物样品的制备、分析物的标记、富集、信号放大和检测等步骤集成在一个小型化的平台上，以有限的试剂高精度、自动地完成相应的反应。此外，与有热循环参与的PCR相比，核酸的等温扩增在恒定温度下进行，在提高分析灵敏度的同时降低了分析成本。

因此，目前迫切需要一种集成miRNA提取、扩增和检测于一体的POCT技术，同时基于便携移动设备的成像能力和数据分析能力，实现miRNA的多靶标即时定量检测，并进行数据存储和传输。

发明内容

为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种多靶标miRNA检测微流控芯片、检测方法及其快速定量检测系统，集miRNA提取、扩增和检测、定量分析、结果显示于一体，从而实现多靶标miRNA的定量检测，具有特异性好、灵敏度高、样本量小、操作简便以及成本低廉等优势，对miRNA的POCT检测具有重要的研究意义和实际应用价值。

本发明提供以下技术方案：

一种多靶标miRNA检测微流控芯片，包括预环化腔室、环化腔室、扩增腔室、试纸条腔室，所述检测微流控芯片将预环化腔室、环化腔室、扩增腔室和试纸条腔室通过通道依次连通；

在预环化腔室和环化腔室之间设有第一微混合器，在环化腔室、扩增腔室之间的通道上设有第二微混合器，在扩增腔室和试纸条腔室之间的通道上设有第三微混合器；

所述预环化腔室完成环化体系的进样，所述环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，所述扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；所述试纸条腔室内通过荧光侧流向层析试纸检测目标miRNA。

进一步的，在所述层析试纸的结合垫上设有荧光微球-核酸探针偶联物，检测线上设置检测核酸序列。

进一步的，所述微混合器设置为进液和出液均为螺旋线路且底部有颗粒的通道。

一种miRNA检测微流控芯片，所述检测微流控芯片将结合腔室、洗脱腔室、预环化腔室、环化腔室、扩增腔室和试纸条腔室通过通道依次连通，

在所述结合腔室内设有磁铁薄片和磁珠冻干粉，在预环化腔室和环化腔室之间设有第一微混合器，在环化腔室、扩增腔室之间的通道上设有第二微混合器，在扩增腔室和试纸条腔室之间的通道上设有第三微混合器；

所述结合腔室中目标miRNA与磁珠上的寡聚dT序列碱基配对，完成目标miRNA的提取；所述洗脱腔室完成目标miRNA的洗脱；所述预环化腔室完成环化体系的进样，所述环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，所述扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；所述试纸条腔室内通过荧光侧向流层析试纸检测目标miRNA。

一种miRNA检测微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：

步骤一在与结合腔室连通的进样通道注入磁珠复苏缓冲液，并注入待测样品与裂解液的混合液；

步骤二从结合腔室进样通道注入洗涤缓冲液，从结合腔室侧面的废液通道吸出废液；

步骤三打开结合腔室下游的第一阀门，从结合腔室进样通道注入洗脱缓冲液，液体进入洗脱腔室后，关闭第一阀门；

步骤四打开洗脱腔室下游的第二阀门，洗脱液进入预环化腔室，关闭第二阀门，向预环化腔室进样通道注入锁式探针、DNA连接酶，打开预环化腔室下游和第一微混合器下游的第三、第四阀门，液体从第一微混合器中经过到达环化腔室，关闭第三、第四阀门；

步骤五在环化腔室内完成环化，从环化腔室进样通道注入DNA聚合酶、dNTPs，打开环化腔室下游和第二微混合器下游的第五、第六阀门，液体从第二微混合器中经过到达扩增腔室，关闭第五、第六阀门；

步骤六完成扩增后，向扩增进样通道中注入上样缓冲液和表面活性剂；

步骤七打开扩增腔室下游的第七阀门，液体从第三微混合器中经过到达试纸条腔室，经层析，目标miRNA扩增产物在结合垫上与荧光微球-核酸探针偶联物结合，在检测线上与检测核酸序列结合。

一种基于检测微流控芯片的快速定量检测系统，所述系统包括所述检测微流控芯片和移动设备；所述移动设备包括试纸条承载模块、成像模块、图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块；

所述检测微流控芯片中的试纸条捕获目标miRNA的扩增产物；

所述移动设备的试纸条承载模块为试纸条提供避光环境并承放试纸条；成像模块对试纸条的检测线和质控线位置拍照，进行荧光成像；所述图像荧光分析模块根据荧光图像的G值计算待测miRNA的浓度；所述存储模块对图像及数据结果进行存储，所述交互界面模块提供用户操作界面并显示检测结果。

进一步的，所述成像模块由光源、光纤、第一滤光片、第二滤光片、透镜、摄像头组成，光源发出的光通过第一滤光片过滤成中心波长为470nm的蓝色光，通过光纤传导在荧光微球表面激发荧光，荧光通过透镜汇聚，通过第二滤光片过滤成中心波长为530nm的绿色光，由摄像头采集图像。

进一步的，所述摄像头的位置对应试纸条上的检测线和质控线。

进一步的，所述图像荧光分析模块计算待测miRNA浓度的方法，包括以下步骤：

1)输入各个编号试纸条对应的标准品miRNA梯度浓度，获得各浓度标准品miRNA的荧光图像及待测样品miRNA的荧光图像；

2)设定图像中检测线所在区域的特定长宽像素区域；

3)提取选定区域每个像素的G值，计算平均G值；

4)以标准品miRNA的浓度为自变量，平均G值为因变量，生成线性回归方程，判断相关系数是否大于预设数据，若大于等于则进入下一步，若小于则结果计算失败，程序终止；

5)以待测样品miRNA的平均G值带入线性回归方程，计算待测样品miRNA的浓度。

进一步的，在步骤2)前还包括质控线显色验证的步骤，设定图像中质控线所在区域的特定长宽像素区域，提取选定区域每个像素的G值，求平均值，若G平均值大于等于设定阈值则进入下一步，若G平均值小于设定阈值则取消该编号试纸条的结果，若取消编号的试纸条为待测样品试纸条，则计算失败，终止程序。

进一步的，所述移动设备为智能手机，试纸条承载模块为一个避光壳体，试纸条可容纳其中，在对应试纸条检测线和质控线的壳体位置开设拍摄区；成像模块的光源为智能手机闪光灯，滤光片、透镜、光纤集成中避光壳体拍摄区前端，手机的摄像头与拍摄区位置对应，进行荧光成像。

进一步的，开发微信小程序，运行所述图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块的功能。

进一步的，所述移动设备还包括通讯模块。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

(1)在微流控芯片上进行miRNA的提取、滚环扩增(rolling circleamplification,RCA)和试纸条检测，具有成本低、小型化、集成化、样品量小等优点，本系统为miRNA的快速检测提供了一种微流控芯片检测平台，可以实现核酸提取-扩增-检测一体化，在缩小样本量的同时极大地提高检测效率。另外，荧光侧流层析试纸条具有成本低、分析时间短、操作简便等优点，与特定荧光检测器配合具有超灵敏的定量能力。

(2)在微流控芯片上miRNA的扩增采用等温扩增，miRNA的短序列在不同类型的等温扩增中可以作为模板、引物或触发器，从而进行扩增，提高了miRNA的检测灵敏度，将等温扩增应用于微流控芯片上，可以大大降低操作的复杂性，提高检测效率，采用RCA反应作为信号放大手段，大大提升了检测灵敏度。

(3)对于不同的目标miRNA，锁式探针中均设计有一段相同的序列，将该段序列作为转换信号的核酸探针，使一种荧光微球-核酸探针偶联物就可同时检测多种miRNA，大大降低了实验难度与成本。

(4)本发明基于便携移动设备的荧光定量检测系统具有便携、快速、低成本、易操作等优点，在分析测试完成之后，智能手机等便携移动设备可以将结果无线传输至医生、医疗保健或疾病监测网络，并进行数据存储，这在一定程度上推动了新的医疗保健模式包括远程医疗和移动医疗等在内的发展。基于智能手机的生物传感器具有便携、快速、低成本、易操作等优点，在改善POC病理诊断和治疗方面存在着巨大的潜力，尤其是在资源匮乏或相对偏远的地区。

(5)本系统的成像模块的光路为斜入射式，光源可为智能手机的LED闪光灯，摄像头为智能手机的摄像头，整体结构简单，所需光学元件少，易微型化，成本低廉；

(6)选择微信小程序实现荧光图像分析，使用方便、开发简单、可跨平台运行以及可快速分发与迭代。

附图说明

图1是本发明miRNA扩增的原理示意图；

图2是本发明层析试纸条检测miRNA的原理示意图；

图3是本发明实施例中一种多靶标miRNA检测微流控芯片的结构示意图；

图4是本发明实施例中另一种多靶标miRNA检测微流控芯片的结构示意图；

图5是本发明实施例3中荧光试纸条的检测结果示意图；

图6是本发明快速定量检测系统的结构示意图；

图7是本发明成像模块的光路示意图；

图8是本发明快速定量检测系统以智能手机作为移动设备的结构示意图。

其中：1-结合腔室、2-洗脱腔室、3-预环化腔室、4-环化腔室、5-扩增腔室、6-试纸条腔室、7-第一微混合器、8-第二微混合器、9-第三微混合器、10-第一阀门、11-第二阀门、12-第三阀门、13-第四阀门、14-第五阀门、15-第六阀门、16-第七阀门、101-避光壳体、102-成像组件、103-智能手机、104-手机壳

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1-3所示，本发明提供了一种多靶标miRNA检测微流控芯片，包括预环化腔室3、环化腔室4、扩增腔室5、试纸条腔室6，检测微流控芯片将预环化腔室、环化腔室、扩增腔室和试纸条腔室通过通道依次连通；

在预环化腔室和环化腔室之间设有第一微混合器7，在环化腔室、扩增腔室之间的通道上设有第二微混合器8，在扩增腔室和试纸条腔室之间的通道上设有第三微混合器9；

在预环化腔室中完成环化体系的进样，在环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，在扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；

在试纸条腔室内设有荧光侧向流层析试纸，在层析试纸的结合垫上设有荧光微球-核酸探针偶联物，核酸探针的序列与锁式探针的一段核酸序列相同，检测线上设置检测核酸序列，与锁式探针的另一段核酸序列相同。

其中，微混合器设置为进液和出液均为螺旋线路且底部有突起颗粒的通道，微混合器在底部有微纹路的螺旋形通道能够增大通过液体混合的混合效率。

滚环扩增技术RCA是一种模拟自然界微生物环状DNA复制过程的扩增技术。如图1所示，锁式探针5’端与3’端的序列与作为引物的miRNA互补，在连接酶的作用下连接成环，随后在聚合酶的催化下，以连接成环状的锁式探针为模板，从引物3’端开始合成，得到一条含有多段重复序列的长链产物。只有探针和待测miRNA两侧的序列完全互补时才能成环，且只有成环后的探针才可以进入下一步的扩增过程。一旦发生错配，探针环化的过程则无法完成，进而无法进行扩增反应，因此RCA具有灵敏、特异、操作简便的特点。

如图2所示，当样品中含有目标扩增序列时，目标物可以与多个荧光微球-核酸探针偶联物相结合，随后目标扩增序列流经硝酸纤维素膜(nitrocellulose filtermembrane,NC膜)时，被相对应的检测线上的互补序列捕获，检测线上的目标物越多，荧光微球-核酸探针聚集的越多，荧光越亮；同时没有和目标物结合的荧光微球-核酸探针偶联物会与质控线上的互补序列结合，在质控线处聚集，即阳性反应表现为检测线和质控线都发荧光。当样品中不含目标物时，样品与荧光微球-核酸探针偶联物各自独立地流经NC膜，检测线上核酸序列不能与荧光微球-核酸探针偶联物结合，检测线不显色；而在质控线上，荧光微球-核酸探针偶联物会被质控线上的核酸序列捕获从而固定在质控线上，即阴性反应表现为检测线不发荧光而质控线发荧光。

微流控芯片的制备方法如下：

(1)设计、绘制并打印微流控芯片掩膜；

(2)使用紫外光刻机制作每一层光胶基片；

(3)将光胶基片键合并用光胶固定封边；

(4)过夜烘干；

(5)在微阀孔上方覆盖弹性膜并固定微阀；

(6)制备荧光微球-核酸探针偶联物，并固定在结合垫上；

(7)将划有检测线和质控线的NC膜、吸水垫、结合垫、样品垫依次组装到底板上，并插入微流控芯片上的试纸条槽中。

实施例2

如图4所示，本发明提供了另一种miRNA检测微流控芯片，检测微流控芯片将结合腔室1、洗脱腔室2、预环化腔室3、环化腔室4、扩增腔室5和试纸条腔室6通过通道依次连通；

在结合腔室内设有磁铁薄片和磁珠冻干粉，在预环化腔室和环化腔室之间设有第一微混合器7，在环化腔室、扩增腔室之间的通道上设有第二微混合器8，在扩增腔室和试纸条腔室之间的通道上设有第三微混合器9；

在结合腔室中目标miRNA与磁珠上的寡聚dT序列碱基配对，从而完成目标miRNA的提取；后注入洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，使miRNA与磁珠分离进入洗脱腔室中，完成目标miRNA的洗脱；在预环化腔室中完成环化体系的进样，在环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，在扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；

在试纸条腔室内设有层析试纸，在结合垫上设有荧光微球-核酸探针偶联物，核酸探针的序列与锁式探针的其中一段核酸序列相同，在检测线上设置检测核酸序列，与锁式探针的另一段核酸序列相同。

例如对miRNA 21、miRNA let-7a的检测。

目标miRNA 21的序列如下：

5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’

目标miRNA let-7a的序列如下：

5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’

miRNA 21的锁式探针(LP 21)序列如下：

5’-P-CTGATAAGCTAAGTCTCCTACCCTCAGCCTCCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCTCCTACCCTCAGCCTCCTTCAACATCAGT-3’

miRNA let-7a的锁式探针(LP let-7a)序列如下：

5’-P-CTACTACCTCAAGTCTCCTACCCTCAGCAACTATACAACCTACTACCTCAAGTCTCCTACCCTCAGCAACTATACAAC-3’

与荧光微球偶联的探针的序列如下：

5’-Bio-TTTTTAGTCTCCTACCCTCA-3’

荧光侧流层析试纸条质控线核酸序列如下：

5’-Bio-TGAGGGTAGGAGACTAAAAA-3’

荧光侧流层析试纸条miRNA 21检测线核酸序列如下：

5’-TCAACATCAGTCTGA-Bio-3’

荧光侧流层析试纸条miRNA let-7a检测线核酸序列如下：

5’-AACTATACAACCTACT-Bio-3’

实施例3

实施例2中的检测微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：

步骤一在与结合腔室连通的进样通道注入磁珠复苏缓冲液，并注入待测样品与裂解液的混合液，释放出的miRNA与磁珠上的寡聚dT序列特异性结合而得到固定。

步骤二从结合腔室进样通道注入洗涤缓冲液，从结合腔室侧面的废液通道吸出废液，重复多次，洗去杂质；

步骤三打开结合腔室下游的第一阀门10，从结合腔室进样通道注入洗脱缓冲液，使miRNA与磁珠分离，洗脱的miRNA进入洗脱腔室后，关闭第一阀门；

步骤四打开洗脱腔室下游的第二阀门11，洗脱液进入预环化腔室，关闭第二阀门，向预环化腔室进样通道注入锁式探针、DNA连接酶，打开预环化腔室下游和第一微混合器下游的第三、第四阀门12、13，液体经第一微混合器充分混合后到达环化腔室，关闭第三、第四阀门；

步骤五在环化腔室内完成环化，从环化腔室进样通道注入DNA聚合酶、dNTPs，打开环化腔室下游和第二微混合器下游的第五、第六阀门14、15，液体经第二微混合器充分混合后到达扩增腔室，关闭第五、第六阀门；

步骤七打开扩增腔室下游的第七阀门17，液体经第三微混合器充分混合后到达试纸条腔室，经层析，目标miRNA扩增产物在结合垫上与荧光微球-核酸探针偶联物结合，在检测线上与检测核酸序列结合。

如图5所示，miRNA 21和miRNA let-7a在微流控芯片上的提取、环化、扩增和层析步骤：

(1)在与结合腔室连通的进样通道注入磁珠复苏缓冲液，并注入待测血清样品与裂解液的混合液，血清样品中释放出的miRNA 21和miRNA let-7a与磁珠上的寡聚dT序列特异性结合而得到固定；

(2)从结合腔室进样通道注入洗涤缓冲液，从结合腔室侧面的废液通道吸出废液，重复多次，洗去杂质；

(3)打开结合腔室下游的第一阀门，从结合腔室进样通道注入洗脱缓冲液，使miRNA21和miRNA let-7a与磁珠分离，洗脱的miRNA混合溶液进入洗脱腔室后，关闭第一阀门；

(4)打开洗脱腔室下游的第二阀门，洗脱液进入预环化腔室，关闭第二阀门，向预环化腔室进样通道注入锁式探针、DNA连接酶，打开预环化腔室下游和第一微混合器下游的第三、第四阀门，液体经第一微混合器充分混合后到达环化腔室，关闭第三、第四阀门，在37℃下反应2h；

(5)在环化腔室内完成环化，从环化腔室进样通道注入DNA聚合酶、dNTPs，打开环化腔室下游和第二微混合器下游的第五、第六阀门，液体经第二微混合器充分混合后到达扩增腔室，关闭第五、第六阀门，37℃反应3h；

(6)完成扩增后，向扩增进样通道中注入上样缓冲液和表面活性剂；

(7)打开扩增腔室下游的第七阀门，液体经第三微混合器充分混合后到达试纸条腔室，经层析15-20min后，miRNA 21和miRNA let-7a分别被T1线和T2线捕捉。

(8)将试纸条取出，放入检测系统的试纸条承载模块中。

实施例4

如图6所示，本发明提供了一种基于检测微流控芯片的快速定量检测系统，系统包括检测微流控芯片和移动设备；移动设备包括试纸条承载模块、成像模块、图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块。

检测微流控芯片中的试纸条捕获目标miRNA的扩增产物，扩增后的目标miRNA与结合垫上的荧光微球-核酸探针偶联物结合，在检测线上被检测核酸序列固定，过量的荧光微球-核酸探针偶联物则与质控线上的核酸序列特异性结合而得到固定；移动设备的试纸条承载模块为试纸条提供避光环境并承放试纸条；成像模块对试纸条的检测线和质控线位置拍照，使荧光微球被激发出荧光，进行荧光成像；图像荧光分析模块分析图像每个像素RGB值中的G值并求平均值，以不同浓度梯度miRNA标准品图像的G平均值生成线性回归方程，根据线性回归方程计算待测miRNA的浓度；存储模块对图像及数据结果进行存储，交互界面模块提供用户操作界面并显示检测结果。

优选地，移动设备还包括通讯模块，可以将结果无线传输至医生、医疗保健或疾病监测网络，进行数据通讯，在一定程度上推动了包括远程医疗和移动医疗等在内的新医疗保健模式的发展。

如图7所示，成像模块由光源、光纤、第一滤光片、第二滤光片、透镜、摄像头组成，光源发出的光通过第一滤光片过滤成中心波长为470nm的蓝色光，通过光纤传导在荧光微球表面激发荧光，荧光通过透镜汇聚，通过第二滤光片过滤成中心波长为530nm的绿色光，由摄像头采集图像。其中，摄像头的位置对应试纸条上的检测线和质控线。

实施例5

图像荧光分析模块计算待测miRNA的浓度的方法，包括以下步骤：

2)设定图像中检测线所在区域的特定长宽像素区域；

3)提取选定区域每个像素的G值，计算平均G值；

4)以标准品miRNA的浓度为自变量，平均G值为因变量，生成线性回归方程，判断相关系数是否大于预设数据，一般为0.99，若大于等于则进入下一步，若小于则结果计算失败，程序终止；

优选的，在步骤2)前还包括质控线显色验证的步骤，设定图像中质控线所在区域的特定长宽像素区域，提取选定区域每个像素的G值，求平均值，若G平均值大于等于设定阈值则进入下一步，若G平均值小于设定阈值则取消该编号试纸条的结果，若取消编号的试纸条为待测样品试纸条，则计算失败，终止程序。

优选的，移动设备可以为智能手机，如图8所示，试纸条承载模块为一个避光壳体101，试纸条可容纳其中，在对应试纸条检测线和质控线的壳体位置开设拍摄区；成像模块的光源为智能手机闪光灯，滤光片、透镜、光纤集成的成像组件102在避光壳体拍摄区前端，智能手机103的摄像头与成像组件及拍摄区位置对应，进行荧光成像，通过手机壳104放置手机，在手机上固定试纸条承载模块。

开发微信小程序，运行图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块的功能。

智能手机的内部传感器及存储器、先进的计算能力、高分辨率的图像捕获及处理功能以及开源操作系统使其具有智能性、集成性和便携性，可用于改善POC诊断方法。本发明将上述生物识别过程和换能分析过程完全集成在智能手机上形成独立的生物传感器，应当理解的是，在智能移动设备集成以上成像模块、试纸条承载模块的硬件，从而组成的检测系统检测miRNA的技术方案均属于本发明的保护范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种多靶标miRNA检测微流控芯片、检测方法及其快速定量检测系统

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 目标miRNA 21的序列(人工序列)

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 目标miRNA let-7a的序列(人工序列)

<400> 2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> miRNA 21的锁式探针序列(人工序列)

<400> 3

ctgataagct aagtctccta ccctcagcct ccttcaacat cagtctgata agctaagtct 60

cctaccctca gcctccttca acatcagt 88

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> miRNA let-7a的锁式探针序列(人工序列)

<400> 4

ctactacctc aagtctccta ccctcagcaa ctatacaacc tactacctca agtctcctac 60

cctcagcaac tatacaac 78

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 与荧光微球偶联的探针(人工序列)

<400> 5

tttttagtct cctaccctca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 质控线核酸序列(人工序列)

<400> 6

tgagggtagg agactaaaaa 20

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> miRNA 21检测线核酸序列(人工序列)

<400> 7

tcaacatcag tctga 15

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> miRNA let-7a检测线核酸序列(人工序列)

<400> 8

aactatacaa cctact 16

Claims

1.一种多靶标miRNA检测微流控芯片，包括预环化腔室、环化腔室、扩增腔室、试纸条腔室，其特征在于，所述检测微流控芯片将预环化腔室、环化腔室、扩增腔室和试纸条腔室通过通道依次连通；

所述预环化腔室完成环化体系的进样，所述环化腔室完成锁式探针与目标miRNA的环化反应，所述扩增腔室完成目标miRNA与锁式探针环化产物的滚环扩增；所述试纸条腔室内通过荧光侧流向层析试纸检测目标miRNA；

所述微混合器设置为进液和出液均为螺旋线路且底部有颗粒的通道。

2.根据权利要求1所述的检测微流控芯片，其特征在于，在所述层析试纸的结合垫上设有荧光微球-核酸探针偶联物，检测线上设置检测核酸序列。

3.一种根据权利要求1所述的miRNA检测微流控芯片，其特征在于，所述检测微流控芯片将结合腔室、洗脱腔室、预环化腔室、环化腔室、扩增腔室和试纸条腔室通过通道依次连通，

4.一种根据权利要求3所述的miRNA检测微流控芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种基于权利要求1所述的检测微流控芯片的快速定量检测系统，其特征在于，所述系统包括所述检测微流控芯片和移动设备；所述移动设备包括试纸条承载模块、成像模块、图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块；

所述检测微流控芯片中的试纸条捕获目标miRNA的扩增产物；

6.根据权利要求5所述快速定量检测系统，其特征在于，所述成像模块由光源、光纤、第一滤光片、第二滤光片、透镜、摄像头组成，光源发出的光通过第一滤光片过滤成中心波长为470nm的蓝色光，通过光纤传导在荧光微球表面激发荧光，荧光通过透镜汇聚，通过第二滤光片过滤成中心波长为530nm的绿色光，由摄像头采集图像。

7.根据权利要求6所述的快速定量检测系统，其特征在于，所述摄像头的位置对应试纸条上的检测线和质控线。

8.根据权利要求5所述的定量检测系统，其特征在于，所述图像荧光分析模块计算待测miRNA浓度的方法，包括以下步骤：

2)设定图像中检测线所在区域的特定长宽像素区域；

3)提取选定区域每个像素的G值，计算平均G值；

9.根据权利要求8所述的定量检测系统，其特征在于，在步骤2)前还包括质控线显色验证的步骤，设定图像中质控线所在区域的特定长宽像素区域，提取选定区域每个像素的G值，求平均值，若G平均值大于等于设定阈值则进入下一步，若G平均值小于设定阈值则取消该编号试纸条的结果，若取消编号的试纸条为待测样品试纸条，则计算失败，终止程序。

10.根据权利要求6所述的定量检测系统，其特征在于，所述移动设备为智能手机，试纸条承载模块为一个避光壳体，试纸条可容纳其中，在对应试纸条检测线和质控线的壳体位置开设拍摄区；成像模块的光源为智能手机闪光灯，滤光片、透镜、光纤集成中避光壳体拍摄区前端，手机的摄像头与拍摄区位置对应，进行荧光成像。

11.根据权利要求10所述的定量检测系统，其特征在于，开发微信小程序，运行所述图像荧光分析模块、存储模块、交互界面模块的功能。

12.根据权利要求5所述的定量检测系统，其特征在于，所述移动设备还包括通讯模块。