KR101660016B1 - Ｄｎａ―ｒｎａ 혼성 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 세포 내로 유입되어 특정 유전자의 발현을 억제하는 입자 및 그 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 DNA와 상기 DNA와 부분적으로 상보적 결합하는 RNA를 포함하며 상기 DNA는 표적 세포에서 생성되는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 포함하고 상기 RNA는 상기 표적 세포 내의 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하여, 약물(siRNA)을 안전하고 효과적으로 표적 세포 내로 전달하여 질병을 치료할 수 있고, 생체물질인 DNA와 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있으며, DNA와 RNA 상보적 결합에 의해 생성되므로 체내에 존재하는 핵산분해효소인 DNase와 RNase에 대해 저항성을 가지는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법에 대한 것이다.

Description

ＤＮＡ―ＲＮＡ 혼성 입자 및 그 제조방법{DNA-RNA hybridized particles and manufacturing method thereof}
본 발명은 표적 세포 내로 유입되어 특정 유전자의 발현을 억제하는 입자 및 그 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 DNA와 상기 DNA와 부분적으로 상보적 결합하는 RNA를 포함하며 상기 DNA는 표적 세포에서 생성되는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 포함하고 상기 RNA는 상기 표적 세포 내의 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하여, 약물(siRNA)을 안전하고 효과적으로 표적 세포 내로 전달하여 질병을 치료할 수 있고, 생체물질인 DNA와 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있으며, DNA와 RNA 상보적 결합에 의해 생성되므로 체내에 존재하는 핵산분해효소인 DNase와 RNase에 대해 저항성을 가지는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법에 대한 것이다.
siRNA(small interfering RNA)는 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현(즉, 특정 유전자의 발현)되는 것을 억제한다. 상기 siRNA에 의한 유전자 발현억제(gene silencing)는 그 효율 및 선택적 발현 저해능력이 뛰어나 새로운 질병 치료제(법)로 각광받고 있다. 특히, 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide)를 이용한 치료법에 비해, siRNA를 이용한 질병 치료법은 적은 양으로 뛰어난 유전자 발현 억제 효과를 얻을 수 있고, 세포 독성이 적어 향상된 안전성을 제공할 수 있다. 위와 같은 효과를 충분히 얻기 위해서는 표적 RNA가 존재하는 세포 내로 상기 siRNA를 효과적으로 전달하는 것이 필수적인데, 일 예로 하기의 특허문헌과 같이 유기 재료(고분자)를 이용하여 siRNA를 세포 내에 전달한다.
<특허문헌>
공개 특허 제10-2007-0061770호(2007. 06. 14. 공개) "siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의 접합체 및 그의 제조방법"
하지만, 상기 특허문헌을 포함하는 siRNA를 표적 세포 내에 전달하기 위한 종래의 전달체는 여전히 세포막을 통해 세포 내로 섭취(uptake)되는 것과 세포 내에서 엔도좀(endosome)을 빠져 나와 세포질로 siRNA를 전달하는 것에서 어려움을 겪고 있으며, 생체 내에 존재하는 분해 효소로 인해 siRNA가 분해될 수 있기 때문에 전달 효율이 떨어지는 한계점이 존재하고, 전달체로 유무기 재료가 사용되므로 인체에 대한 안전성을 담보할 수 없는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 하나의 약물로 작용하며 동시에 약물 전달체의 역할 또한 수행할 수 있는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 DNA와 RNA가 부분적으로 상보적 결합을 통해 구형 형태의 나노크기의 입자를 형성하며, 상기 DNA는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 포함하고, 상기 RNA는 표적 RNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하여, 약물(siRNA)을 안전하고 효과적으로 표적 세포 내로 전달하여 질병을 치료할 수 있는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 생체물질인 DNA와 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 부작용이 없이 안전하게 사용할 수 있는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 DNA와 RNA의 상보적 결합에 의해 생성되므로, 체내에 존재하는 핵산분해효소인 DNase와 RNase에 대해 저항성을 가지는 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자는 DNA와, 상기 DNA와 부분적으로 상보적 결합하는 RNA를 포함하며, 상기 DNA는 표적 세포에서 생성되는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 포함하고, 상기 RNA는 상기 표적 세포 내의 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자는 구의 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자는 100 내지 150nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자는 DNA 가닥과 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 형성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법은 특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프라이머를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 전사용 DNA를 생성하는 전사용DNA생성단계와; 특정 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프라이머를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 복제용 DNA를 생성하는 복제용DNA생성단계와; 상기 원형의 전사용 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA를 생성하고, 상기 원형의 복제용 DNA를 DNA중합효소를 사용하여 복제시킴으로써 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 생성하며, 상기 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA와 상기 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 부분적으로 상보적 결합시킴으로써 입자를 형성하는 이중효소연쇄반응단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA는 롤링 서클 전사에 의해 생성되며, 상기 압타머 염기서열을 포함하는 DNA는 롤링 서클 복제에 의해 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 이중효소연쇄반응단계에서는 RNA중합효소 활성화온도와 DNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격으로 번갈아 가며 일정 시간 동안 지속시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 이중효소연쇄반응단계는 일 용기에 상기 전사용 DNA와 RNA중합효소를 혼합하고 RNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격동안 유지하는 제1단계와, 타 용기에 상기 복제용 DNA와 DNA중합효소를 혼합하고 DNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격동안 유지하는 제2단계와, 상기 제1단계와 제2단계 후에 일 용기의 내용물과 타 용기의 내용물을 혼합한 후, RNA중합효소 활성화온도와 DNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격으로 번갈아 가며 일정 시간 동안 지속시키는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 반응시간간격을 조절하여 입자의 크기 및 형태를 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 전사용DNA생성단계는 특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 라가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법에 있어서 상기 복제용DNA생성단계는 특정 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 라가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 하나의 약물로 작용하며 동시에 약물 전달체의 역할 또한 수행할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 DNA와 RNA가 부분적으로 상보적 결합을 통해 구형 형태의 나노크기의 입자를 형성하며, 상기 DNA는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 포함하고, 상기 RNA는 표적 RNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하여, 약물(siRNA)을 안전하고 효과적으로 표적 세포 내로 전달하여 질병을 치료할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 생체물질인 DNA와 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 부작용이 없이 안전하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 DNA와 RNA의 상보적 결합에 의해 생성되므로, 체내에 존재하는 핵산분해효소인 DNase와 RNase에 대해 저항성을 가지는 효과가 있다.
도 1은 원형의 전사용(복제용) DNA를 형성하는 원리를 나타내는 개략도.
도 2는 원형의 전사용(복제용) DNA를 이용하여 혼성입자를 형성하는 원리를 나타내는 개략도.
도 3은 원형의 전사용(복제용) DNA를 이용하여 혼성입자를 형성하는 과정을 설명하기 위한 개략도.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼성입자 현미경 사진.
도 5는 RTI와 원형 DNA의 농도변화에 따라 제조된 혼성입자의 현미경 사진.
도 6은 RTI 변화에 따른 DNA-RNA 혼성입자의 크기 및 분포를 나타내는 도표.
도 7은 DNA-RNA 혼성입자의 DNA와 RNA 상보적 결합의 확인 위한 image cytometry 결과를 나타내는 도표.
도 8은 RTI 변화에 따른 DNA-RNA 혼성입자의 상보적 결합을 확인 위한 gel electrophoresis 결과를 나타내는 도포.
도 9는 DNA-RNA 혼성입자의 핵산효소 저항성을 확인 위한 gel electrophoresis 결과를 나타내는 도포.
도 10 내지 12는 세포 내 혼성입자의 전달능력을 확인하기 위한 confocal microscope 사진.
도 13은 DNA-RNA 혼성입자의 세포독성을 확인하기 위한 cell viability assay 결과를 나타내는 도표.
도 14는 DNA-RNA 혼성입자의 RNAi 작용을 확인하기 위한 실험 결과를 나타내는 도표.
이하에서는 본 발명에 따른 DNA-RNA 혼성 입자 및 그 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 표적 세포 내로 유입되어 표적 유전자의 발현을 억제하는 DNA-RNA 혼성 입자에 대한 것으로, 상기 DNA-RNA 혼성 입자는 DNA와, 상기 DNA와 부분적으로 상보적 결합하는 RNA를 포함하며, 상기 DNA는 표적 세포에서 생성되는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열(aptamer sequence)을 포함하고, 상기 RNA는 상기 표적 세포 내의 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열(small interfering RNA sequence)을 포함한다. 상기 DNA-RNA 혼성 입자는 일정한 형태와 크기를 가지나 바람직하게는 구의 형태를 가지고 100 내지 150nm의 직경을 가진다. 상기 DNA-RNA 혼성입자는 DNA 가닥과 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 형성되게 된다.
상기 DNA는 표적 세포에서 생성되는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열과, 상기 DNA가 상기 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 RNA결합 위한 염기서열을 포함한다. 상기 RNA는 표적 세포 내의 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열과, 상기 RNA가 상기 DNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 DNA결합 위한 염기서열을 포함한다. 그리고, 상기 RNA결합 위한 염기서열과 상기 DNA결합 위한 염기서열은 전체적으로 또는 부분적으로 서로 상보적인 염기서열을 가지므로 상기 DNA와 RNA는 서로 부분적으로 상보적 결합하여 엉키면서 DNA-RNA 혼성입자를 형성하고, 상기 DNA-RNA 혼성입자는 표적 단백질과 결합할 수 있는 압타머 염기서열을 가지므로 표적세포 내로 효율적으로 전달되고, 상기 DNA-RNA 혼성입자는 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 가지므로 표적세포 내의 표적 RNA와 결합하여 유전자의 발현을 억제(RNAi 작용)하게 된다. 또한, DNA-RNA 혼성입자는 생체물질로만 이루어져 체내 독성이 없으며, DNA-RNA의 상보적인 결합에 의해 형성되므로 신체 내에 존재하는 핵산분해효소(DNase, RNase)에 대해 상대적으로 큰 저항성을 가진다.
상기와 같은 DNA-RNA 혼성입자를 제조하는 방법을 이하에서 설명하기로 한다. 상기 DNA-RNA 혼성입자는 이하의 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 DNA-RNA 혼성입자의 제조방법은 특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 전사용 ssDNA(single strand DNA)와 프라이머(primer)를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 전사용 DNA를 생성하는 전사용DNA생성단계와; 특정 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 복제용 ssDNA와 프라이머를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 복제용 DNA를 생성하는 복제용DNA생성단계와; 상기 원형의 전사용 DNA를 RNA중합효소(RNA polymerase)를 사용하여 전사시킴으로써 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA를 생성하고, 상기 원형의 복제용 DNA를 DNA중합효소(DNA polymerase)를 사용하여 복제시킴으로써 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 생성하며, 상기 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA와 상기 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 부분적으로 상보적 결합시킴으로써 입자를 형성하는 이중효소연쇄반응단계;를 포함한다.
상기 전사용DNA생성단계는 전사용 ssDNA와 프라이머를 상보적 결합시킴으로써 원형의 전사용 DNA를 생성하는 단계로, 특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 전사용 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화(hybridization)단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제(ligase)를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션(ligation)하는 리게이션단계를 포함한다. 상기 전사용 ssDNA는 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 프라이머 및 복제용 ssDNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 포함하여, 도 1에 도시된 바와 같이 상기 전사용 ssDNA와 프라이머는 서로 부분적으로 상보적 결합하여 혼성화되고 리가아제에 의해 원형의 ssDNA의 Nick 부분은 리게이션되게 된다. 상기 전사용 ssDNA의 결합 염기서열은 이중효소연쇄반응단계에서 DNA결합 위한 염기서열이 되게 된다.
상기 복제용DNA생성단계는 복제용 ssDNA와 프라이머를 상보적 결합시킴으로써 원형의 복제용 DNA를 생성하는 단계로, 특정 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 복제용 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화(hybridization)단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제(ligase)를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션(ligation)하는 리게이션단계를 포함한다. 상기 복제용 ssDNA는 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열과, 프라이머 및 전사용 ssDNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 포함하여, 도 1에 도시된 바와 같이 상기 복제용 ssDNA와 프라이머는 서로 부분적으로 상보적 결합하여 혼성화되고 리가아제에 의해 원형의 ssDNA의 Nick 부분은 리게이션되게 된다. 상기 복제용 ssDNA의 결합 염기서열은 이중효소연쇄반응단계에서 RNA결합 위한 염기서열이 되게 된다.
상기 이중효소연쇄반응단계는 도 2에 도시된 바와 같이 상기 원형의 전사용 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 롤링 서클 전사(rolling circle transcription, RCT)시킴으로써 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA를 생성하고, 상기 원형의 복제용 DNA를 DNA중합효소를 사용하여 롤링 서클 복제(rolling circle amplication, RCA)시킴으로써 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 생성하며, 상기 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA와 상기 압타머 염기서열을 포함하는 DNA를 부분적으로 상보적 결합시킴으로써 입자를 형성한다. 상기 이중효소연쇄반응단계는 도 3에 도시된 바와 같이 일 용기(A)에 상기 전사용 DNA와 RNA중합효소를 혼합하고 RNA중합효소 활성화온도(RNA polymerase activation temperature, RPAT)를 반응시간간격(reaction time interval, RTI)동안 유지하는 제1단계와, 타 용기(B)에 상기 복제용 DNA와 DNA중합효소를 혼합하고 DNA중합효소 활성화온도(DNA polymerase activation temperature, DPAT)를 반응시간간격(RTI)동안 유지하는 제2단계와, 상기 제1단계와 제2단계 후에 일 용기(A)의 내용물과 타 용기(B)의 내용물을 혼합한 후, RNA중합효소 활성화온도(RPAT)와 DNA중합효소 활성화온도(DPAT)를 반응시간간격(RTI)으로 번갈아 가며 일정 시간 동안 지속시키는 제3단계를 포함함으로써 이루어지게 된다. 상기 이중효소연쇄반응단계에서 DNA중합효소의 경우 전사용 DNA에 결합하여 불필요한 DNA 가닥을 생성할 수 있으므로, 반응의 효율을 높이기 위해 이중효소연쇄반응단계의 초기과정에서 RCT와 RCA를 서로 다른 용기에 각기 따로 반응시간간격 동안 진행하게 된다. 이 과정에서 두 복제효소는 목표로 하는 원형 DNA에 결합하게 된다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 원형의 전사용 DNA의 제조
1) 양 말단에 프라이머 및 복제용 ssDNA와 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 가지고, 중앙에 siRNA 염기서열(일 예로 Anti-luciferase siRNA sequence)과 상보적인 염기서열을 가지는 전사용 ssDNA[5'-ATAGTGAGTCGTATTAACGTA(서열번호:1)-CCAACAACTTACGCTGAGTACTTCGATTACTTGAATCGAAGTACTCAGCGTAAGTTT(서열번호:2)-AGAGGCATATCCCT(서열번호:3)-3']를 설계하였다. 그리고, 프라이머[5'-TAATACGACTCACTATAGGGAT-3'(서열번호:4)]를 사용하였다.
2) 상기 전사용 ssDNA와 프라이머가 3μM이 되도록 하나의 튜브(Tube)에 넣은 후 thermal cycler를 이용하여 전사용 ssDNA와 프라이머가 결합되도록 하였다(전체 부피 100㎕). 상기 과정에서 전사용 ssDNA의 결합 염기서열은 프라이머와 상보적으로 결합하여 원형의 DNA가 형성되게 된다.
3) 이후, ssDNA가 완전한 원형이 될 수 있도록 Ligase buffer와 T4 Ligase를 각각 전체 부피의 1/10, 1/50의 비율로 넣어주고, 상온에서 8시간 이상 리케이션(ligation)시켜 원형의 전사용 DNA를 제조하였다.
<실시예 2> 원형의 복제용 DNA의 제조
1) 양 말단에 프라이머 및 전사용 ssDNA와 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 가지고, 중앙에 압타머 염기서열(일 예로 NCL(necleolin)-aptamer sequence)과 상보적인 염기서열을 가지는 복제용 ssDNA[5'-AGGGATATGCCTCTAATAAATATTAA(서열번호:5)-CCACCACCACCACCACAACCACCACCACC(서열번호:6)-AATAATAAGAAGTTGGTACGTTAATACGACTCACTAT(서열번호:7)-3']를 설계하였다. 그리고, 프라이머[5'-TTAGAGGCATATCCCTATAGTG-3'(서열번호:8)]를 사용하였다.
2) 상기 복제용 ssDNA와 프라이머가 3μM이 되도록 하나의 튜브(Tube)에 넣은 후 thermal cycler를 이용하여 복제용 ssDNA와 프라이머가 결합되도록 하였다(전체 부피 100㎕). 상기 과정에서 복제용 ssDNA의 결합 염기서열은 프라이머와 상보적으로 결합하여 원형의 DNA가 형성되게 된다.
3) 이후, ssDNA가 완전한 원형이 될 수 있도록 Ligase buffer와 T4 Ligase를 각각 전체 부피의 1/10, 1/50의 비율로 넣어주고, 상온에서 8시간 이상 리케이션(ligation)시켜 원형의 복제용 DNA를 제조하였다.
<실시예 3> DNA-RNA 혼성입자의 제조
1) 도 3에 기재된 바와 같이 튜브(A)에 전사용 DNA 3pmol, T7 RNA Polymerase(500unit), RNAPol Reaction buffer 20㎕(40mM Tris-HCl, 6mM MgCl2, 10mM DTT, 2mM spermidine, pH 7.9@25℃), rNTP mix(200 nmol)를 넣어준 후(전체부피 50㎕), 37℃(RPAT)로 10min(RTI) 동안 반응시킨다.
2) 도 3에 기재된 바와 같이 튜브(B)에 복제용 DNA 3pmol, Phi29 DNA Polymerase(500unit), Reaction buffer 20㎕(400mM Tris-HCl, 500mM KCl, 100mM MgCl2, 50mM (NH4)2SO4, 40mM DTT), dNTP mix(200 nmol)를 넣어준 후(전체부피 50㎕), 30℃(DPAT)로 10min(RTI) 동안 반응시킨다.
3) 이후, 도 3에 기재된 바와 같이 상기 튜브(A)와 튜브(B)의 내용물을 혼합하고 thermal cycler에 넣고, 반응온도를 37℃와 30℃로 각각 10분(RTI)씩 유지시키고, 매 10분마다 온도변호 과정을 반복해 20시간 진행함으로써 혼성입자를 제조한다.
<실시예 4> DNA-RNA 혼성입자의 크기 및 형태의 확인
실시예 3에서 제조된 혼성입자를 SEM(scanning electron microscope), TEM(transmission electron microscope), AFM(atomic force microscope)을 통해 확인하였다. 도 4 (a)의 SEM사진으로부터 100~150nm의 직경을 갖는 구형의 나노입자를 확인할 수 있다. 도 4 (b)의 TEM사진으로부터 DNA와 RNA가 빽빽하게 밀집되어 나노입자가 형성된 것을 확인할 수 있다. 도 4 (c)의 AFM사진으로부터 SEM사진에서 확인한 결과와 일관된 입자의 형태를 가짐을 확인할 수 있다.
<실시예 5> RTI와 원형 DNA 농도 변화에 따른 DNA-RNA 혼성입자의 크기 및 형태의 확인
1) 실시예 3의 제조방법에서 RTI를 10min에서 20min로 변경한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
2) 실시예 3의 제조방법에서 RTI를 10min에서 60min로 변경한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
3) 실시예 3의 제조방법에서 전사용 DNA와 복제용 DNA를 각각 3pmol에서 30pmol로 변경한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
4) 상기 1), 2), 3)에서 제조된 혼성입자를 SEM(scanning electron microscope), AFM(atomic force microscope)을 통해 확인하였다. 도 5 (a), (b), (c)는 각각 실시예 5의 1), 2), 3)에서 제조된 혼성입자의 SEM사진이고 도 5 (d), (e), (f)는 각각 실시예 5의 1), 2), 3)에서 제조된 혼성입자의 ARM사진인데, 이를 통해 RTI가 20분으로 늘어나면 구형의 particle과 aggregation에 의해 뭉쳐지는 particle이 공존하는 양상을 보인다(도 5 (a), (d) 참조). RTI가 1시간으로 늘어나면 구형의 particle은 거의 존재하지 않고 뭉쳐진 particle이 대부분을 이루는 형태를 하고 있다(도 5 (b), (e) 참조). 이 결과를 통해 RTI가 증가할수록 particle이 구형의 형태보다는 그물형태로 서로 뭉쳐지는 경향을 확인할 수 있다. 그 이유는 RTI가 증가하면 RCA와 RCT가 서로 전환되는 횟수가 줄어들고, 한번의 cycle에서 DNA와 RNA 가닥이 생성되는 시간은 증가한다. 따라서, 한번의 cycle에서 생성되는 DNA와 RNA 가닥의 길이 또한 증가하게 된다. 그러한, 긴 길이의 DNA와 RNA 가닥은 구형의 나노입자를 생성하기보다 그물을 엮는 실처럼 작용하여 그물 구조를 이루게 된다. 원형 DNA 농도를 높여줄 경우, RTI를 유지시키더라도 나노입자끼리의 뭉침에 의해 그물 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있다(도 5 (c), (f) 참조).
<실시예 6> RTI 변화에 따른 DNA-RNA 혼성입자의 크기 및 분포의 확인
실시예 3, 실시예 5의 1) 및 실시예 5의 2)에 의해 제조된 혼성입자의 Dynamic Light Scattering(Particle Size Analyzer WI30i 입도분석기 사용)을 실시하여 그 결과 도 6에 표시하였다. RTI가 증가할수록 혼성입자의 평균 크기가 증가하고, 200nm 이하의 크기를 갖는 혼성입자는 감소하는 경향이 나타난다. 이는, 온도간격이 증가함에 따라 구형의 나노입자보다는 그물구조를 형성하기 때문이다.
<실시예 7> DNA-RNA 혼성입자의 DNA와 RNA 상보적 결합의 확인
1) 실시예 3의 제조방법에서 Cy3-UTP가 포함된 rNTP mix를 사용하고, Cy5-dCTP가 포함된 dNTP mix를 사용하는 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
2) 실시예 3 및 실시예 7의 1)에 의해 제조된 혼성입자를 image cytometry를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 7에 표시하였다. Cy3-UTP는 RNA 가닥의 생성물로써 오렌지 형광파장을 띄고, Cy5-dCTP는 DNA 가닥의 생성물로써 강한 빨간색의 형광파장을 띈다. 이러한 과정을 통해 생성된 혼성입자를 image cytometry로 측정한 결과(실시예 7의 1), 도 7의 (b))를 봤을 때 Cy3-UTP와 Cy5-dCTP를 첨가하지 않았을 때(실시예 3, 도 7의 (a))와 달리 강한 두 가지 형광파장을 띄는 것을 확인할 수 있어, 혼성입자가 DNA와 RNA로 이루어짐을 알 수 있다.
3) 실시예 3, 실시예 5의 1) 및 실시예 5의 2)에 의해 제조된 혼성입자에 DNA와 RNA의 상보적 결합을 분해하는 RNase H효소(2,000 U/mL)를 혼합하여 혼성입자를 24시간 동안 반응시킨 후 gel electrophoresis를 실시하여 그 결과를 도 8에 표시하였다. 도 8의 가장 왼쪽에 위하는 Lane이 Lane 1이고 가장 오른쪽에 위치하는 Lane이 Lane 7이다. 도 8의 Lane 1은 100 base pair ladder이다. 도 8의 Lane 2(실시예 3), 4(실시예 5의 1), 6(실시예 5의 2)은 RNase H효소를 첨가하지 않았을 때의 결과이고, Lane 3(실시예 3), 5(실시예 5의 1), 7(실시예 5의 2)은 RNase H를 첨가하였을 때의 결과이다. RTI 10min로 생성한 혼성입자(실시예 3) 경우 효소에 의해 완전히 분해되었지만(Lane 2와 3 비교), RTI 20min로 생성한 혼성입자(실시예 5의 1))와 RTI 60min로 생성한 혼성입자(실시예 5의 2))의 경우 거의 분해되지 않은 것을 확인할 수 있다(Lane 4과 5 비교, Lane 6과 7 비교). 이러한 결과를 통해 혼성입자는 DNA와 RNA로 이루어지고 온도 간격이 증가함에 따라 길게 생성되는 DNA와 RNA 가닥이 상보적 결합보다는 그물구조를 형성하는 섬유와 같은 형태로 생성되어 진다는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 8> DNA-RNA 혼성입자의 핵산분해효소에 대한 저항성 확인
1) 상기 전사용 DNA 3pmol, T7 RNA Polymerase(500unit), RNAPol Reaction buffer 20㎕(40mM Tris-HCl, 6mM MgCl2, 10mM DTT, 2mM spermidine, pH 7.9@25℃), rNTP mix(200 nmol)를 넣어준 후(전체부피 50㎕), 37℃(RPAT)로 20hr 동안 반응시켜 RNA입자를 형성하였다.
2) 상기 복제용 DNA 3pmol, Phi29 DNA Polymerase(500unit), Reaction buffer 20㎕(400mM Tris-HCl, 500mM KCl, 100mM MgCl2, 50mM (NH4)2SO4, 40mM DTT), dNTP mix(200 nmol)를 넣어준 후,(전체부피 50㎕), 30℃(DPAT)로 20hr 동안 반응시켜 DNA입자를 형성하였다.
3) 실시예 3, 실시예 8의 1) 및 실시예 8의 2)에 의해 제조된 혼성입자에 핵산분해효소를 혼합하여 5시간 반응시킨 후 gel electrophoresis를 실시하여 그 결과를 도 9에 표시하였다. 도 9의 가장 왼쪽에 위하는 Lane이 Lane 1이고 가장 오른쪽에 위치하는 Lane이 Lane 7이다. 도 9의 Lane 1은 100 base pair ladder이다. 도 9의 Lane 2는 핵산분해효소 없는 DNA시료(실시예 8의 2))의 결과이고, Lane 3은 DNase Ⅰ과 DNA가 혼합된 시료의 결과이며, Lane 4는 핵산분해효소 없는 RNA시료(실시예 8의 1))의 결과이고, Lane 5는 RNase Ⅰ, Ⅲ와 RNA가 혼합된 시료의 결과이며, Lane 6은 핵산분해효소 없는 혼성입자시료(실시예 3)의 결과이고, Lane 7은 DNase Ⅰ, RNase Ⅰ, Ⅲ와 혼성입자가 혼합된 시료의 결과이다. DNA로만 이루어진 입자의 경우 DNase I에 의해 완전히 분해되었고(Lane 2과 3 비교), RNA로만 이루어진 입자 역시 RNase I, Ⅲ에 의해 완전히 분해되었다(Lane 4과 5 대비). 하지만 DNA와 RNA의 상보적 결합에 의해 형성된 나노입자의 경우 분해효소에 의해 어느 정도 분해되기는 하였지만 여전히 상대적으로 많은 양이 남아있는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 나노입자가 분해효소에 대해 저항성을 지니고 있음을 확인할 수 있다(Lane 6와 7 대비).
<실시예 9> DNA-RNA 혼성입자의 표적 세포 내 전달 능력 확인
1) 실시예 3의 제조방법에서 Cy5-dCTP(red 형광 dye)가 포함된 dNTP mix를 사용하는 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
2) 실시예 9의 1) 제조방법에서 복제용 ssDNA의 압타머 염기서열(NCL(necleolin)-aptamer sequence)과 상보적인 염기서열(CCACCACCACCACCACAACCACCACCACC(서열번호:6)) 대신에 압타머 기능을 수행하지 않는 무의미한 염기서열(CGACCACTAGGATTACAGCCACCTTCACC(서열번호:9))로 치환한 복제용 ssDNA를 사용하는 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 혼성입자를 제조하였다.
3) ① 96well plate에 7,000 cell/well의 조건으로 cell(MDA-MB-231(NCL을 가짐))을 처리하고, ② 처리된 cell이 well 바닥에 완전히 붙도록 24시간 동안 incubation시키고, ③ growth medium을 제거하고 opti-mem과 sample(실시예 9의 1)에 의해 제조된 혼성입자)을 3:1로 혼합한 후 각 well에 넣고, ④ 4시간 incubation 후 opti-mem과 sample 혼합물을 제거하고 고정액(4% Paraformaldehyde)을 넣고, ⑤ 10분 후 고정액을 제거하고 Actin-dye를 각 well에 넣어 세포질을 염색하고, ⑥ 10분 후 Actin-dye solution을 제거하고 mounting solution을 slide 표면에 처리하고, ⑦ cover glass로 slide를 덮은 후 confocal microscope를 통해 세포 내부를 확인하여 그 결과를 도 10의 (b), 도 11 및 도 12의 (a)에 나타내었다.
4) 실시예 9의 3)에서 sample을 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실험하여 그 결과를 도 10의 (a)에 나타내었다.
5) 실시예 9의 3)에서 sample을 실시예 9의 1)에 의해 제조된 혼성입자에서 실시예 9의 2)에 의해 제조된 혼성입자로 변경한 것을 제외하고는 동일하게 실험하여 그 결과를 도 12의 (b)에 나타내었다. 참고로, 도 11 및 12는 도 10에 비해 현미경의 배율을 높여 일부 세포만을 확대하여 나타내었다.
6) transfection되지 않은 세포(실시예 9의 4))와 달리 transfection된 세포(실시에 9의 3))의 세포질 내부에 빨간색의 형광이 나타나는 것을 볼 수 있다(도 10의 (a)와 (b) 비교). 도 11을 보면, 세포질 내부와 세포막 주위(파란색으로 표기)에 혼성입자(빨간색으로 표기)가 다수 존재하는 것을 알 수 있다. 도 12의 (a)를 보면 NCL-압타머가 존재하는 혼성입자(빨간색으로 표기)는 세포질(녹색, 파란색으로 표기) 내부에 존재하나 무의미한 염기서열이 존재하는 혼성입자는 세포질 내부에 존재하지 않음을 알 수 있다. 따라서, NCL-압타머를 가지는 혼성입자는 세포막 주위 및 내부에 다수가 위치하는 것을 확인할 수 있어 혼성입자를 효과적으로 세포에 전달할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 10> DNA-RNA 혼성입자의 세포 내 독성 확인
1) ① 96well plate에 7,000 cell/well의 조건으로 cell(hela)을 처리하고, ② 처리된 cell이 well 바닥에 완전히 붙도록 24시간 동안 incubation한 후, ③ growth medium을 제거하고 opti-mem과 sample(실시예 3)을 혼합한 후(혼성입자가 0, 0.04, 0.2, 1, 5fM이 되도록) 각 well에 넣고, ④ 4시간 incubation 후 opti-mem과 sample 혼합물을 제거하고 growth medium으로 교체하고, ⑤ medium 교체 후 48시간 동안 세포를 incubation하고, ⑥ 48시간 이후 growth medium을 제거하고 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) stock solution을 각 well에 넣고, ⑦ MTT stock solution을 넣고 4시간을 기다린 후 formazan crystal 용해 용매를 각 well에 넣어 crystal을 solution상태로 녹인 후, ⑧ Microplate reader 장비를 이용하여 formazan crystal이 녹아있는 각 well의 solution의 흡광도(570nm)를 측정하고, ⑩ 아무 처리를 하지 않은(혼성입자를 혼합하지 않은) 세포가 있는 well의 흡광도와 비교하여 상대적인 비율을 계산하여, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
2) 도 13을 통해, 혼성입자의 농도를 높여가며 세포에 처리하여도 세포는 95% 이상 생존하는 것을 알 수 있다. 따라서, 혼성입자는 DNA와 RNA로만 이루어져 있기 때문에 체내적합성이 매우 뛰어나다는 것을 알 수 있다.
<실시예 11> DNA-RNA 혼성입자의 RNAi 작용 확인
1) ① 96well plate에 7,000 cell/well의 조건으로 cell(hela 세포에 luciferase 유전자를 도입한 세포)을 처리한 후, ② 처리된 cell이 well 바닥에 완전히 붙도록 24시간 동안 incubation한 후, ③ growth medium을 제거하고 opti-mem과 sample(실시예 3)을 혼합한 후(혼성입자가 0, 1, 2.5, 5fM이 되도록) 각 well에 넣고, ④ 4시간 incubation한 후 opti-mem과 sample 혼합물을 제거하고 growth medium으로 교체하고, ⑤ medium 교체 후 48시간 동안 세포를 incubation하고, ⑥ 48시간 이후 각 well에 Dual-Glo luciferase stock solution을 넣고 10분 후 Microplate reader 장비를 이용하여 각 well의 luminescence(590nm)를 측정하고, ⑦ 48시간 이후 각 well에 Dual-Glo stop&Glo stock solution을 넣고 10분 후 Microplate reader 장비를 이용하여 각 well의 luminescence (590nm)를 측정하고, ⑧ 위에서 측정한 형광도의 비율을 통해 각 well의 luciferase 형광 발현도를 확인하여, 도 14에 나타내었다.
2) 도 14를 통해, 혼성입자의 농도를 더 높여줄수록 세포가 발현하는 luciferase가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 세포 내부에 존재하는 dicer 효소에 의해 혼성입자를 이루고 있는 RNA 가닥들이 siRNA 단편으로 분해되고, 그러한 siRNA 단편들은 세포 내부에서 RNAi 작용을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> DNA-RNA hybridized particles and manufacturing method thereof <130> PDAHJ-14131 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding primer <400> 1 atagtgagtc gtattaacgt a 21 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for siRNA generation <400> 2 ccaacaactt acgctgagta cttcgattac ttgaatcgaa gtactcagcg taagttt 57 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding primer <400> 3 agaggcatat ccct 14 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for circular DNA generation <400> 4 taatacgact cactataggg at 22 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding primer <400> 5 agggatatgc ctctaataaa tattaa 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for aptamer generation <400> 6 ccaccaccac caccacaacc accaccacc 29 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding primer <400> 7 aataataaga agttggtacg ttaatacgac tcactat 37 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for circular DNA generation <400> 8 ttagaggcat atccctatag tg 22 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control region of ssDNA for comparing with aptamer <400> 9 cgaccactag gattacagcc accttcacc 29

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  5. 전사용 ssDNA와 프라이머를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 전사용 DNA를 생성하는 전사용DNA생성단계와; 복제용 ssDNA와 프라이머를 상보적으로 결합시킴으로써 원형의 복제용 DNA를 생성하는 복제용DNA생성단계와; 상기 원형의 전사용 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써 RNA를 생성하고, 상기 원형의 복제용 DNA를 DNA중합효소를 사용하여 복제시킴으로써 DNA를 생성하며, 상기 RNA와 DNA를 부분적으로 상보적 결합시킴으로써 입자를 형성하는 이중효소연쇄반응단계;를 포함하며,
    상기 전사용 ssDNA는 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 프라이머 및 복제용 ssDNA와 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 포함하고, 상기 복제용 ssDNA는 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열과, 프라이머 및 전사용 ssDNA와 상보적인 결합이 가능하도록 하는 결합 염기서열을 포함하여, 상기 이중효소연쇄반응단계에서 전사에 의해 생성되는 RNA는 siRNA 염기서열과 DNA결합 위한 염기서열을 포함하며 복제에 의해 생성되는 DNA는 압타머 염기서열과 RNA결합 위한 염기서열을 포함하고,
    상기 이중효소연쇄반응단계에서 상기 DNA결합 위한 염기서열과 RNA결합 위한 염기서열의 상보적인 결합에 의해 상기 DNA와 RNA는 서로 엉키면서 구형의 DNA-RNA 혼성입자를 형성하며,
    상기 이중효소연쇄반응단계는 일 용기에 상기 전사용 DNA와 RNA중합효소를 혼합하고 RNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격동안 유지하는 제1단계와; 타 용기에 상기 복제용 DNA와 DNA중합효소를 혼합하고 DNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격동안 유지하는 제2단계와; 상기 제1단계와 제2단계 후에 일 용기의 내용물과 타 용기의 내용물을 혼합한 후, RNA중합효소 활성화온도와 DNA중합효소 활성화온도를 반응시간간격으로 번갈아 가며 일정 시간 동안 지속시키는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA-RNA 혼성입자의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA는 롤링 서클 전사에 의해 생성되며, 상기 압타머 염기서열을 포함하는 DNA는 롤링 서클 복제에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제5항에 있어서,
    상기 반응시간간격을 조절하여 입자의 크기 및 형태를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 전사용DNA생성단계는
    특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 전사용 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 라가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 복제용DNA생성단계는
    특정 압타머 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 복제용 ssDNA와 프라이머를 혼합하여 상보적 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 라가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA-RNA 혼성 입자의 제조방법.
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