KR101660017B1 - Ｒｎａ 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 내로 유입되어 특정 단백질의 발현을 억제하는 RNA 입자 및 그 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 복수 개의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하며 상기 복수 개의 RNA 각각의 상보적 결합부분은 siRNA 염기서열을 포함하여, RNA 중합효소가 2개 이상의 환형의 DNA에서 RNA를 반복적으로 뽑아내며 서로 상보적인 부분이 결합하여 siRNA 구조를 이루도록 하여 RNA 입자를 생성하므로 RNA 입자가 상대적으로 많은 양의 siRNA 전구체를 가지고, 상기 siRNA 전구체가 Dicer 효소에 의해서 보다 효율적으로 siRNA로 분리되도록 하며, RNA 중합효소의 농도에 따라 RNA 입자 크기가 나노미터 수준으로 조절되므로 RNA 입자의 세포 내 섭취 효율을 높일 수 있는 RNA 입자 및 그 제조방법에 대한 것이다.

Description

ＲＮＡ 입자 및 그 제조방법{RNA particles and manufacturing method thereof}
본 발명은 세포 내로 유입되어 특정 단백질의 발현을 억제하는 RNA 입자 및 그 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 복수 개의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하며 상기 복수 개의 RNA 각각의 상보적 결합부분은 siRNA 염기서열을 포함하여, RNA 중합효소가 2개 이상의 환형의 DNA에서 RNA를 반복적으로 뽑아내며 서로 상보적인 부분이 결합하여 siRNA 구조를 이루도록 하여 RNA 입자를 생성하므로 RNA 입자가 상대적으로 많은 양의 siRNA 전구체를 가지고, 상기 siRNA 전구체가 Dicer 효소에 의해서 보다 효율적으로 siRNA로 분리되도록 하며, RNA 중합효소의 농도에 따라 RNA 입자 크기가 나노미터 수준으로 조절되므로 RNA 입자의 세포 내 섭취 효율을 높일 수 있는 RNA 입자 및 그 제조방법에 대한 것이다.
siRNA(small interfering RNA)는 표적 RNA에 결합하여 상기 표적 RNA가 단백질로 발현(즉, 특정 유전자의 발현)되는 것을 억제한다. 상기 siRNA에 의한 유전자 발현억제(gene silencing)는 그 효율 및 선택적 발현 저해능력이 뛰어나 새로운 질병 치료제(법)로 각광받고 있다. 특히, 종래의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide)를 이용한 치료법에 비해, siRNA를 이용한 질병 치료법은 적은 양으로 뛰어난 유전자 발현 억제 효과를 얻을 수 있고, 세포 독성이 적어 향상된 안전성을 제공할 수 있다. 위와 같은 효과를 충분히 얻기 위해서는 표적 RNA가 존재하는 세포 내로 상기 siRNA를 효과적으로 전달하는 것이 필수적인데, 일 예로 하기의 특허문헌과 같이 유기 재료(고분자)를 이용하여 siRNA를 세포 내에 전달한다.
<특허문헌>
공개 특허 제10-2007-0061770호(2007. 06. 14. 공개) "siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의 접합체 및 그의 제조방법"
하지만, 상기 특허문헌을 포함하는 siRNA를 표적 세포 내에 전달하기 위한 종래의 전달체는 유무기 재료가 사용하므로, 인체에 대한 안전성을 담보할 수 없는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 질병을 일으키는 특정 단백질의 발현을 억제함으로써, 다양한 질병을 치료할 수 있는 RNA 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 생체물질인 RNA로만 이루어져 인체에 대한 안전성을 담보할 수 있는 RNA 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 하나의 환형 DNA를 전사시켜 생성된 하나의 RNA 가닥이 결합하여 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA 입자를 형성하는 것에 비하여, RNA 중합효소가 2개 이상의 환형의 DNA에서 RNA를 반복적으로 뽑아내며 서로 상보적인 부분이 결합하여 siRNA 구조를 이루도록 하여 RNA 입자를 생성하므로, 상기 RNA 입자가 상대적으로 많은 양의 siRNA 전구체를 가지는 RNA 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 RNA 중합효소의 농도(양)에 따라 RNA 입자 크기가 나노미터 수준으로 조절되므로, RNA 입자의 세포 내 섭취 효율을 높일 수 있는 RNA 입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적 결합하는 제2의 RNA를 포함하며, 상기 제1의 RNA 및 제2의 RNA 각각의 상보적 결합부분은 표적 RNA에 결합하여 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 제1의 RNA 가닥과 제2의 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 형성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 다공성의 구의 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자에 있어서 상기 제1의 RNA는 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하고, 상기 제2의 RNA는 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열 및 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 표적 RNA에 결합하여 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 형성되게 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 다이서 효소에 의해 잘려나가 siRNA가 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 다공성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 복수 개의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하여 형성되고, 상기 복수 개의 RNA 각각의 상보적 결합부분은 siRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자는 복수 개의 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 형성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법은 siRNA 상보 염기서열을 포함하는 제1의 DNA를 생성하는 제1의DNA생성단계와; 상기 제1의 DNA의 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 제2의 DNA를 생성하는 제2의DNA생성단계와; 상기 제1의 DNA 및 제2의 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써, 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제2의 RNA를 생성하며, 상기 제1의 RNA와 제2의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하여 입자를 형성하는 상보적효소반응단계;를 포함하며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 siRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 상보적효소반응단계에서 RNA 중합효소의 농도를 조절함으로써, RNA 입자의 크기를 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 상보적효소반응단계에서 RNA 중합효소의 농도를 조절함으로써, RNA 입자의 물리적 특성을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 제1의 DNA 및 제2의 DNA는 환형의 형태를 가지며, 상기 상보적효소반응단계는 상보적 롤링 서클 전사를 통해 RNA 입자를 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 상보적으로 결합하여 엉키면서 자가조립을 통해 RNA 입자를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 제1의DNA생성단계는 특정 siRNA 상보 염기서열을 포함하는 제1의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 제2의DNA생성단계는 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 입자의 제조방법에 있어서 상기 제1의 ssDNA는 프로모터 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 질병을 일으키는 특정 단백질의 발현을 억제함으로써, 다양한 질병을 치료할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 생체물질인 RNA로만 이루어져 인체에 대한 안전성을 담보할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 하나의 환형 DNA를 전사시켜 생성된 하나의 RNA 가닥이 결합하여 siRNA 염기서열을 포함하는 RNA 입자를 형성하는 것에 비하여, RNA 중합효소가 2개 이상의 환형의 DNA에서 RNA를 반복적으로 뽑아내며 서로 상보적인 부분이 결합하여 siRNA 구조를 이루도록 하여 RNA 입자를 생성하므로, 상기 RNA 입자가 상대적으로 많은 양의 siRNA 전구체를 가지는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 RNA 중합효소의 농도(양)에 따라 RNA 입자 크기가 나노미터 수준으로 조절되므로, RNA 입자의 세포 내 섭취 효율을 높일 수 있는 효과가 있다.
도 1은 RNA 입자를 생성하여 최종적으로 siRNA를 형성하는 과정을 설명하기 위한 개략도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 SEM 사진.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 AFM 사진.
도 4는 RNA 중합효소의 농도 변화에 따른 RNA 입자의 크기 및 분포를 나타내는 도표.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 표면 전하를 나타내는 도표.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 구성성분을 확인하기 위한 형광 현미경 사진.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 물리적 특성을 확인하기 위한 도표.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 siRNA의 생산정도를 확인 위한 gel electrophoresis 결과를 나타내는 도표.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 세포 내 전달 확인 위한 공초점 현미경 사진.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 입자의 단백질 발현 능력을 확인하기 위한 형광현미경 사진.
이하에서는 본 발명에 따른 RNA 입자 및 그 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 입자에 대한 것으로, 상기 RNA 입자는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적 결합하는 제2의 RNA를 포함하며, 상기 제1의 RNA 및 제2의 RNA 각각의 상보적 결합부분은 표적 RNA에 결합하여 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열을 포함한다. 상기 RNA 입자는 제1의 RNA 가닥과 제2의 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 형성되게 되며, 일정 형상을 가지나 바람직하게는 다공성을 가진 구의 형태를 가진다.
상기 제1의 RNA는 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하고, 상기 제2의 RNA는 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열 및 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 표적 RNA에 결합하여 표적 RNA가 단백질로 발현되는 것을 억제하는 siRNA 염기서열로 이루어지게 된다. 상기 RNA 입자는 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 형성되게 되며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 siRNA 염기서열로 이루어지므로, 상기 RNA 입자는 다이서 효소(Dicer enzyme)에 의해 잘려나가 siRNA가 되게 된다. 상기 제1의 RNA는 제2의 RNA, 제3의 RNA, 제4의 RNA 등과 부분적으로 상보적 결합하여 입자를 형성하는 것이 가능하며, 즉 복수 개의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하고 복수 개의 RNA 각각의 상보적 결합부분이 siRNA 염기서열을 포함하여 입자가 형성되는 것도 가능하며, 이때 복수 개의 RNA 가닥이 부분적으로 상보적인 염기서열에 의해 서로 결합하고 엉키면서 자가조립을 통해 입자가 형성되게 된다.
상기와 같은 RNA 입자를 제조하는 방법을 이하에서 설명하기로 한다. 상기 RNA 입자는 이하의 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RNA 입자의 제조방법은 특정 siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열(이하, 'siRNA 상보 염기서열'이라 함)을 포함하는 제1의 ssDNA(single strand DNA)와 프로모터(promoter) DNA를 상보적으로 결합시킴으로써 환형의 제1의 DNA를 생성하는 제1의DNA생성단계와; 상기 제1의 ssDNA의 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시킴으로써 환형의 제2의 DNA를 생성하는 제2의DNA생성단계와; 환형의 제1의 DNA 및 환형의 제2의 DNA를 RNA중합효소(RNA polymerase)를 사용하여 전사시킴으로써, 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제2의 RNA를 생성하며, 상기 제1의 RNA와 제2의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하여 엉키면서 자기조립(self-assembly)을 통해 입자를 형성하는 상보적효소반응단계;를 포함한다. 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 siRNA 염기서열로 이루어진다.
상기 제1의DNA생성단계는 제1의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시킴으로써 환형의 제1의 DNA를 생성하는 단계로, 특정 siRNA 상보 염기서열을 포함하는 제1의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화(hybridization)단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제(ligase)를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션(ligation)하는 리게이션단계를 포함한다. 상기 제1의 ssDNA는 siRNA 상보 염기서열과, 프로모터 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열(이하, '결합 염기서열'이라 함)을 포함하여, 상기 제1의 ssDNA와 프로모터 DNA는 서로 부분적으로 상보적 결합하여 혼성화되고 리가아제에 의해 원형의 ssDNA의 Nick 부분은 리게이션되게 된다. 상기 제1의 ssDNA의 siRNA 상보 염기서열은 상보적효소반응단계에서 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 되게 된다.
상기 제2의DNA생성단계는 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시킴으로써 환형의 제2의 DNA를 생성하는 단계로, siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화(hybridization)단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제(ligase)를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션(ligation)하는 리게이션단계를 포함한다. 상기 제2의 ssDNA는 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열과, 결합 염기서열을 포함하여, 상기 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA는 서로 부분적으로 상보적 결합하여 혼성화되고 리가아제에 의해 원형의 ssDNA의 Nick 부분은 리게이션되게 된다. 상기 제2의 ssDNA의 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열은 상보적효소반응단계에서 제1의 RNA결합 위한 염기서열이 되게 된다.
상기 상보적효소반응단계는 도 1에 도시된 바와 같이 환형의 제1의 DNA(Circular DNA 1) 및 환형의 제2의 DNA(Circular DNA 2)를 RNA중합효소(RNA polymerase)를 사용하여 상보적 롤링 서클 전사(Complementary rolling circle transcription, cRCT)시킴으로써, 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제2의 RNA를 생성하며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 상보적으로 결합하여 엉키면서 자가조립을 통해 RNA 입자를 형성한다. 상기 상보적 롤링 서클 전사라 함은 도 1에 도시된 바와 같이, RNA 중합효소가 2개 이상의 환형의 DNA에서 RNA를 반복적으로 뽑아내며 서로 상보적인 부분이 결합하여 siRNA 구조를 이루는 과정을 의미한다. 상기 상보적 롤링 서클 전사 과정에서는 상대적으로 많은 양의 dsRNA(Double straded RNA)가 생성되며 상기 dsRNA는 상기 RNA 입자에 포함되게 되어 상기 RNA 입자는 상대적으로 많은 양의 siRNA 전구체를 포함하고, 상기 RNA 입자는 다이서 효소에 의해 쪼개지도록 설계되며, 상기 상보적효소반응단계에서의 RNA중합효소의 농도(양)에 따라 RNA입자 크기가 나노미터 수준으로 조절되므로, siRNA의 발생과 세포 내의 침투 효율을 높여 RNA 간섭현상(RNA interference)의 효율을 높일 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 환형의 제1의 DNA의 제조
1) 양 말단에 프로모터 DNA(Promoter DNA)와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열(이하, '결합 염기서열'이라 함)과, 중앙에 siRNA 염기서열(일 예로, Anti-GFP(Green fluorescent protein) siRNA sequence)과 상보적인 염기서열(이하, 'siRNA 상보 염기서열'이라 함)을 가지는 제1의 ssDNA[5'-Phosphate--ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:1)-AAAACTTCAGGGTCAGCTTGCTT(서열번호:2)-GCTGGATGAAGGACGGTCGAACGC-AAAACTTCAGGGTCAGCTTGCTT(서열번호:2)-ATCCCT(서열번호:3)-3']를 설계하였다(상기 제1의 ssDNA에서 동일한 siRNA 상보 염기서열(서열번호2에 해당)을 두 개 포함하도록 설계함). 그리고, 프로모터 DNA[5'-TAATACGACTCACTATAGGGAT-3'(서열번호:4)]를 설계하였다.
2) 상기 제1의 ssDNA 1μM과 프로모터 DNA 1μM을 뉴클라아제 프리 워터(nuclease free water)에 혼합하고, PCR thermal cycler(T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad)를 사용하여 95℃로 2분 동안 가열하고 1시간 동안 점진적으로 25℃까지 냉각한다. 상기 과정에서 제1의 ssDNA의 결합 염기서열은 프로모터 DNA와 상보적으로 결합하여 환형의 제1의 DNA 1μM이 형성되게 된다.
3) 이후, 환형의 제1의 DNA에서 닉(nick)을 리게이트(ligate) 하기 위해, 상기 실시예 1의 2) 과정을 진행하여 생성된 용액에 T4 Ligase(Promega, cat. No. M1804) 0.06 Uμl-1, Ligase buffer(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT and 1mM ATP)를 혼합하고 상온에서 하루 밤 동안 배양하고, 생성된 환형의 DNA(1μM)를 원심여과기(YM-3, Millipore)를 사용하여 15μM로 농축하여 최종적으로 도 1에 도시된 바와 같은 환형의 제1의 DNA(Circular DNA 1)를 생성한다.
<실시예 2> 제1의 DNA와 부분적으로 상보적 결합이 가능한 환형의 제2의 DNA의 제조
1) 양 말단에 결합 염기서열과, 중앙에 실시예 1의 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 제2의 ssDNA[5'-Phosphate-ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:1)-AAGCAAGCTGACCCTGAAGTTTT(서열번호:5)-CTTAGGCTGGACAACAACCATCTA-AAGCAAGCTGACCCTGAAGTTTT(서열번호:5)-ATCCCT(서열번호:3)-3']를 설계하였다. siRNA 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호 5)은 제1의 ssDNA의 서열번호 2의 염기서열과 상보적으로 디자인되게 된다. 그리고, 프로모터 DNA[5'-TAATACGACTCACTATAGGGAT-3'(서열번호:4)]를 설계하였다.
2) 상기 제2의 ssDNA 1μM과 프로모터 DNA 1μM을 뉴클라아제 프리 워터(nuclease free water)에 혼합하고, PCR thermal cycler(T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad)를 사용하여 95℃로 2분 동안 가열하고 1시간 동안 점진적으로 25℃까지 냉각한다. 상기 과정에서 제2의 ssDNA의 결합 염기서열은 프로모터 DNA와 상보적으로 결합하여 환형의 제2의 DNA 1μM이 형성되게 된다.
3) 이후, 환형의 제2의 DNA에서 닉(nick)을 리게이트(ligate) 하기 위해, 상기 실시예 2의 2) 과정을 진행하여 생성된 용액에 T4 Ligase(Promega, cat. No. M1804) 0.06 Uμl-1, Ligase buffer(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT and 1mM ATP)를 혼합하고 상온에서 하루 밤 동안 배양하고, 생성된 환형의 DNA(1μM)를 원심여과기(YM-3, Millipore)를 사용하여 15μM로 농축하여 최종적으로 도 1에 도시된 바와 같이 환형의 제2의 DNA(Circular DNA 2)를 생성한다.
<실시예 3> RNA 입자의 제조
1) 환형의 제1의 DNA 2.5μM, 환형의 제2의 DNA 2.5μM, Ribonucleotide Solution Mix(25mM of each NTP) 0.625mM, 2X Reaction buffer(400mM Tris-HCl, 20mM spermidine, 60mM MgCl2, 100mM dithiothreitol), T7 RNA polymerase 1 unit μl-1을 혼합하여 반응용액을 생성한다. 상기 반응용액을 20시간 동안 37℃의 온도로 배양하여 자가조립 RNA 입자를 생성한다.
2) 실시예 3의 1)의 제조방법에서 T7 RNA polymerase를 1 unit μl-1에서 10 units μl-1로 변경한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 RNA 입자를 제조하였다.
3) 실시예 3의 1)의 제조방법에서 T7 RNA polymerase를 1 unit μl-1에서 40 units μl-1로 변경한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 RNA 입자를 제조하였다.
<실시예 4> RNA 입자의 크기 및 형태의 확인
1) 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자를 SEM(scanning electron microscope, SNE model, SEC), AFM(atomic force microscope, NX-10, Park systems Corp.)을 통해 확인하였다. AFM은 비접촉 실리콘 캔틸리버(non-contact silicon cantilever, OMCL-AC160TS, Olympus)와 XEI software를 사용한다.
2) 도 2의 A, C, E는 각각 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 SEM사진(scale bar, 30㎛)이고, 도 2의 B, D, F는 각각 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 SEM사진(scale bar, 3㎛)인데, 도 2의 A, C, E를 통해 많은 양의 RNA 입자가 형성되었음을 알 수 있고, 도 2의 B, D, F를 통해 RNA 중합효소의 농도(양)에 따라 다른 크기를 가지는 다공성의 구형 입자가 형성되었음을 알 수 있다. 또한, RNA 중합효소의 농도가 높을수록 입자의 크기가 작아지며 상대적으로 일률적 크기를 가지는 RNA 입자가 형성됨을 알 수 있다(도 2의 B, D, F 대비). 또한, 도 2의 B, D, F를 보면 일부 RNA 입자는 얇은 가닥에 의해 연결되는데, 이를 통해 상기 RNA 입자는 RNA 전사물에 의해서 형성됨을 알 수 있고, 적은 양의 RNA 중합효소를 사용하는 경우 제한 전구체에 대해 적은 경쟁을 통해 상대적으로 긴 RNA 전사물이 생성되어 상대적으로 큰 RNA 입자가 생성되는 것을 예측할 수 있다. 한편, 중합효소의 높은 농도에서는 RNA 중합효과 사이의 경쟁 때문에 상대적은 짧은 RNA 전사물이 나노 사이즈의 RNA 입자를 형성하는 것을 예측할 수 있다.
3) 도 3의 A, B, C는 각각 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 AFM사진(scale bar, 5㎛)인데, 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 크기가 각각 대략 5㎛(도 3의 A 참조), 2㎛(도 3의 B 참조), 600nm(도 3의 C 참조)임을 알 수 있다. 위의 결과를 통해, 중합효소의 양을 조절하여 입자크기를 작게 형성하는 것이 가능하여, 생성된 입자의 세포내 전달성을 높일 수 있다.
<실시예 5> 중합효소의 농도변화에 따른 RNA 입자의 크기 및 분포 확인
1) RNA 입자의 크기 분포를 확인하기 위해 Zetasizer를 사용하였고, 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 Dynamic Light Scattering을 실시하여 도 4에 표기하였다(이하, RPs-1은 실시예 3의 1)에 의해 제조된 RNA 입자를 나타내고, RPs-10은 실시예 3의 2)에 의해 제조된 RNA 입자를 나타내고, RPs-40은 실시예 3의 3)에 의해 제조된 RNA 입자를 나타냄).
2) 도 4를 통해, 도 2의 결과처럼 RNA 중합효소의 농도가 커질수록 입자크기가 크고 입자분포의 폭이 작음을 알 수 있다.
<실시예 6> RNA 입자의 구성성분 확인
1) RNA 입자의 표면 전하(zeta potential)를 확인하기 위해 Zetasizer(Zetasizer Nano ZS90, Malvern)를 사용하여, 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 표면 전하를 도 5에 표기하였다. 또한, 실시예 3의 1)에서 제조된 RNA 입자를 RNA 염색 염료(SYBR Green Ⅱ)로 상온에 2시간 동안 염색한 후, 형광현미경(fluorescent microscope, Eclipse Ti(Nikon))이 사용하여 그 결과는 도 6에 나타내었다.
2) 도 5를 보면 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 표면 전하는 음(negative)의 값을 가져 상기 입자가 RNA로 이루어졌음을 알 수 있고, 도 6을 보면 염색된 RNA 입자가 강한 형광 빛을 띠고 있어 실시예 3의 1)에서 제조된 입자가 RNA로 이루어졌음을 알 수 있다.
<실시예 7> RNA 입자의 영률 측정
1) RNA 입자의 영률(Young's Modulus)을 확인하기 위해 AFM을 사용하여, 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 영률을 도 7에 표기하였다.
2) 도 7을 통해 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 영률은 각각 대략 310MPa, 200MPa, 140MPa임을 알 수 있어, RNA 중합효소의 농도에 따라 생성된 RNA 입자의 물리적인 특성을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 8> 다이서 효소에 의한 siRNA의 생산정도 분석
1) 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자 각각을 recombinant Dicer(Genlantis) 1 unit 및 반응용액(1mM ATP, 2.5mM MgCl2, 40% Dicer Reaction Buffer)과 함께 뉴클라아제 프리 워터(nuclease free water)에 혼합하고 24시간 동안 배양한다.. 배양 후, Dicer Stop Solution(Genlantis) 2μl가 추가로 첨가한다. 이후, 80℃,에서 80V로 2시간 3% agarose gel in Tris-acetate-EDTA(TAE) buffer(40mM Tris-acetate and 1mM EDTA, pH 8.3)의 조건에서 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 실시하여, 도 8에 표기하였다.
2) 도 8에서 Lane 1, 8은 이중 가닥 RNA ladder를 나타내고, Lane 2, 4 및 6은 각각 다이서 효소를 첨가하지 않은 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 전기영동 결과를 나타내며, Lane 3, 5 및 7은 각각 다이서 효소 반응 진행시킨 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자의 전기영동 결과를 나타낸다. 도 8을 보면 다이서 효소의 존재하에 siRNA로 작용하는 21 bp 생산물이 형성되었음을 알 수 있고, 특히 Lane 7을 보면 입자크기 400nm를 가진 RNA 입자에서 21 bp 생산물이 많이 형성되었음을 알 수 있다. 이를 통해 실시예 3의 3)에 의해 제조된 RNA 입자는 나노 크기(400nm)를 가져 세포 내 섭취가 용이하고 잠재적인 siRNA 분자를 많이 생성하여 siRNA 전달의 큰 가능성이 있음을 알 수 있다.
<실시예 9> RNA 입자의 세포 내 전달 확인
1) 헬라세포(Hela cell)는 10%의 fetal bovine serum(Gibco), 1%의 penicillin streptomycin 및 1% antibiotic-antimycotic이 첨가된 Dulbbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 성장된다. 형질주입(transfection) 전 24시간, 상기 세포는 24-well plates와 8-well chamber slides(500,000cells per well)로 옮겨진다.
2) Cy-5로 라벨링(labelling)된 실시예 3의 1), 2), 3)에서 제조된 RNA 입자 각각 40μl는 transfection reagent인 TransIT-X2(Mirus) 6μl를 포함하는 OPTI-MEMI(Gibco) 70μl에 첨가되어, 실온에서 15min동안 배양되어, RNA 입자와 TransIT-X2가 결합한 RNA complex를 형성하게 된다. Cy-5로 라벨링된 RNA 입자라 함은 Cy5-dCTP(red 형광 dye)가 포함된 Ribonucleotide Solution Mix를 사용하는 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 제조된 입자를 의미한다.
3) RNA complex 40μl를 세포의 각 well에 추가하고, 37℃의 온도로 3시간 동안 배양한다.
4) 배양 후, 상기 세포는 트립신처리되고 희석된 후 세포로 파란색으로 염색하는 염색 염료 Hoechst-33342(final concentration of 10㎍ ml-1)를 가지고 37℃의 온도로 15분 동안 배양한다.
5) 세포의 형질주입은 24-well plates를 가지고 Nucleocounter(NC-3000, Chemometec)의 의해 분석되고, 8-well chamber slides를 가지고 공초점 현미경(confocal microscope, Leica TCS SPE)에 의해 시각화되어 도 9에 표기된다. 도 9의 A는 Cy5로 라벨링된 RPs-1의 공초점 현미경 이미지이고, 도 9의 B는 Cy5로 라벨링된 RPs-10의 공초점 현미경 이미지이고, 도 9의 C는 Cy5로 라벨링된 RPs-40의 공초점 현미경 이미지이고, 도 9의 D는 RPs를 첨가하지 않는 헬라세포의 공초점 현미경 이미지인데, 도 9의 A, B, C를 보면 세포질 내부와 세포막 주위(파란색으로 표기)에 RNA 입자(빨간색으로 표기)가 존재하는 것을 알 수 있다. 특히, 도 9의 C를 보면 RNA 입자(빨간색으로 표기)가 많이 존재하여, 작은 크기의 RNA 입자가 더욱 쉽게 세포 내로 전달됨을 알 수 있다.
<실시예 10> RNA 입자의 단백질 발현 능력 평가
1) 염색 염료 Hoechst-33342 대신에 핵의 위치를 확인하기 위해서 5㎍ ml-1 농도의 DAPI를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9의 1), 2), 3), 4)와 동일한 방법으로 시료가 준비된다.
2) 형질주입된 세포의 이미지를 얻기 위해 준비된 시료를 형광현미경(fluorescent microscope, Eclipse Ti(Nikon))을 이용하여 촬영하여, 그 결과는 도 10에 도시된다. 도 10의 DAPI와 GFP 항목은 서로 다른 필터를 사용한 형광 현미경 사진으로 DAPI 항목의 푸른색으로부터 핵의 위치를 알 수 있고, GFP 항목의 녹색 신호로부터 GFP 단백질 발현을 알 수 있고, Merged 함은 DAPI 및 GFP 항목의 사진을 합성한 것이다. 도 10에서 Control은 RNA 입자를 포함하지 않은 헬라 세포의 형광현미경 이미지를 나타낸다. 도 10을 보면, 실시예 3의 3)에 의해 제조된 RNA 입자가 첨가된 경우 녹색 형광이 거의 나타나지 않아, RNA 나노입자의 RNAi 작용으로 녹색형광단백질이 발현되지 않았음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> RNA particles and manufacturing method thereof <130> PDAHJ-14158 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding promoter DNA <400> 1 atagtgagtc gtatta 16 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for siRNA generation <400> 2 aaaacttcag ggtcagcttg ctt 23 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding promoter DNA <400> 3 atccct 6 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter DNA for circular DNA generation <400> 4 taatacgact cactataggg at 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for siRNA generation <400> 5 aagcaagctg accctgaagt ttt 23

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  10. siRNA 상보 염기서열을 포함하는 제1의 DNA를 생성하는 제1의DNA생성단계와; 상기 제1의 DNA의 siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 제2의 DNA를 생성하는 제2의DNA생성단계와; 상기 제1의 DNA 및 제2의 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써, 제2의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제2의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제1의 RNA와, 상기 제1의 RNA와 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 하는 제1의 RNA결합 위한 염기서열을 포함하는 제2의 RNA를 생성하며, 상기 제1의 RNA와 제2의 RNA가 부분적으로 상보적 결합하여 입자를 형성하는 상보적효소반응단계;를 포함하며, 상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열은 siRNA 염기서열을 포함하고,
    상기 상보적효소반응단계에서 RNA 중합효소의 농도를 조절함으로써, RNA 입자의 크기를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
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  13. 제10항에 있어서,
    상기 제1의 DNA 및 제2의 DNA는 환형의 형태를 가지며,
    상기 상보적효소반응단계는 상보적 롤링 서클 전사를 통해 RNA 입자를 생성하는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 제1의 RNA결합 위한 염기서열과 제2의 RNA결합 위한 염기서열이 상보적으로 결합하여 엉키면서 자가조립을 통해 RNA 입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 제1의DNA생성단계는
    특정 siRNA 상보 염기서열을 포함하는 제1의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 제2의DNA생성단계는
    siRNA 상보 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 제2의 ssDNA와 프로모터 DNA를 상보적으로 결합시키는 혼성화단계와, 상기 혼성화단계 후에 리가아제를 추가로 첨가하여 원형의 ssDNA의 Nick 부분을 리게이션하는 리게이션단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제1의 ssDNA는
    프로모터 DNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 입자의 제조방법.
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Lee, JB. et al., Nature Material, vol.11, 2012.4. pp.316-322

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