CN110296962A - 一种基于dna四面体的用于细胞内成像的纳米探针制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于DNA四面体的新型纳米探针设计及其制备与应用。所述DNA四面体的新型纳米探针通过如下方法制备获得：将用于DNA四面体构建的四条DNA单链退火杂交；所述四条DNA单链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示；将前述四条DNA单链修饰不同荧光染料，所述荧光染料分别为Alexa555和Alexa647。本发明从设计DNA单链序列开始，利用合成生物学的方法，将四条带有不同荧光标记的DNA单链杂交成为一个DNA四面体结构，该DNA四面体机构具有FRET效应，能被细胞主动摄取且结构完整保存达48h，是一种无需转染、没有细胞毒性的细胞显微成像探针。

Description

一种基于DNA四面体的用于细胞内成像的纳米探针制备及 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于DNA四面体的新型纳米探针设计及其制备与应用。

背景技术

随着对生物大分子功能研究的深入,其形态、结构所发生的生化反应的成像需求日益增多。由于生物大分子在细胞内形成复杂的多分子复合物,普通生化方法缺少天然状态下完整复合物的功能研究和观察；生物大分子往往通过调节亚细胞器的功能或在细胞内转移定位对细胞功能产生影响；细胞内微环境的变化对分子之间相互作用的影响只有在细胞内才能得以研究；因此,需要以活体细胞研究生物大分子在细胞中所发生的各种生化反应和动态过程。

目前，活体细胞内分子检测与相关的成像技术主要有荧光显微成像技术和非标记技术。非标记技术无需引入外源性标记的方法就可实现在分子水平上观察和研究活体细胞的结构和功能,确定对细胞内特定分子的分布。现有的非标记检测技术主要包括拉曼散射技术、太赫兹技术和相干反斯托克斯拉曼散射技术。由于它们存在信号强度弱，数据采集时间长，所需激发光功率高等缺陷，不能广泛用于活细胞成像。荧光显微成像技术是利用较短波长的光(激发光)照射样品使样品受到高能量的激发，产生较长波长的荧光(发射光)。用来观察和分辨样品中产生荧光的物质和位置。荧光成像的主要优势是和活细胞具有很强的生物相容性，使得细胞能进行动态地微创成像。它主要的劣势是空间分辨率受限，一直以来，它的分辨率停留在200nm左右。近年来，STED，PALM，STORM等技术的发展将xy平面的分辨率缩小至20-30nm，轴向分辨率缩小至50nm。为细胞内结构的荧光定位提供了奠定了技术基础。

活细胞内光学成像主要采用生物发光(Bioluminescence)与荧光(Fluorescence)两种技术。生物发光是将luc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶,当外源给予其底物荧光素(Luciferin),即可产生发光现象。而荧光技术是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其它荧光报告基团。成像试剂标记后,利用荧光显微镜观测活体生物体内的细胞活动和基因行为。

DNA纳米技术是基于DNA的高精度碱基互补配对原则及序列的高度可设计性发展出来的一种新型的纳米技术，它高度的可编程性是其他任何材料都无法比拟的。基于DNA纳米技术的探针也引起了科研者的广泛研究，其中DNA探针的设计是关键，直接决定着发光性能，一般要求既要光子密度高又要特异性好。传统的单链DNA探针由于结构松散柔软，容易被细胞内核酸酶分解，不利于成像。且由于超分辨的随机激发原理，不适用于STROM等超分辨显微镜。基于DNA四面体结构的纳米探针有着独特的优势：(1)具有良好的生物相容性，能够被细胞以内吞方式主动摄取并稳定存在48h以上(2)具有良好的可编程性质，通过改变其大小进而改变荧光基团的密度(3)可以针对不同生物分子(如DNA，microRNA等)进行灵活设计，有望实现核酸水平的超分辨成像。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的需求，本发明的目的在于提供一种基于DNA四面体结构设计的用于细胞成像的纳米探针制备与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了一种DNA四面体探针，包括DNA四面体结构以及连接在所述DNA四面体上的荧光染料、所述DNA四面体包括四条DNA单链，所述第一条链包括5’端修饰的Alexa647染料；所述其余三条DNA单链包括5’端修饰的Alexa555染料；

在一种可能的实现方式中，所述四条DNA单链的长度为23nt。

在一种可能的实现方式中，所述四条DNA单链通过一步退火自组装步骤形成DNA四面体结构，其边长为7bp。

优选地，所述纳DNA四面体为现有技术，可以参考现有的文献制备。

本发明的第二方面公开了一种将所述DNA四面体探针应用于细胞成像的方法，包括如下步骤：将目标细胞和第一方面所述的DNA四面体探针混合孵育，再进行confocal显微镜成像。

优选地，所述目标细胞包括RAW264.7和HepG2。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)DNA四面体具有生物自适应性；从而解决了现有技术中存在的探针毒性等问题，大大提高了活体细胞成像的可能性，具有无毒、易制备等优势。

(2)本发明提供的DNA四面体能够被细胞主动摄取，并在细胞内稳定存在48h以上，极大增加荧光浓度，提高分辨率。

(3)本发明提供的DNA四面体具有极大的编程性，能够在不同的顶点修饰不同类型、不同个数的荧光染料基团。操作简单、快速，成本低。

附图说明

图1DNA四面体探针设计原理示意图。其中方形团为荧光染料Alexa647，圆形团为Alexa555荧光染料。

图2DNA四面体探针跑胶验证结果。

图3DNA四面体探针的荧光FRET现象验证。灰色曲线代表四面体探针的荧光发射结果；黑色曲线代表修饰了Alexa555染料的单链DNA的荧光发射结果。

图4DNA四面体探针用于RAW264.7细胞的共聚焦成像结果。

图5DNA四面体探针用于HepG2细胞的共聚焦成像结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例提供了一种DNA四面体探针，其结构如图1所示。具体地，本发明实施例提供的一种DNA四面体探针，包括DNA四面体结构以及连接在所述DNA四面体上的荧光染料，所述DNA四面体包括四条DNA单链，所述第一条链包括5’端修饰的Alexa647染料；所述其余三条DNA单链包括5’端修饰的Alexa555染料；

在一个示例中，所述四条DNA单链的长度为23nt。

在一个示例中，所述四条DNA单链通过一步退火自组装步骤形成DNA四面体结构，其边长为7bp。

在一个示例中，所述第一条DNA单链由一种荧光基团修饰：所述第二、三、四条链的5’端由另一种荧光基团修饰。

在一个示例中，所述荧光基团为Alexa647，另一种荧光基团为Alexa555。在一个示例中，Alexa555被555nm的荧光激发，其发射的荧光又继续激发Alexa647，并产生发射光。

本发明实施例提供的DNA四面体聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示。接下来，在具体实施例中对本发明实施例提供的DNA四面体探针及其制备方法和应用进行举例说明。

实施例1

(1)材料及制备

TM buffer(20mM Tris,50mM MgCl²,pH 8.0)等试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司，所有试剂使用DEPC水配置。DNA oligo由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并由HPLC纯化，序列如SEQ ID NO.1-4所示，

本实施例采用的设备包括：荧光分光光度计(F-900,Edinburg)，冷冻高速离心机(Hitachi)，Nanodrop One，制冰机(上海安亭，ZBS-20)，凝胶显影仪(Tanon，1600)，涡旋震荡仪(IKA LAB DANCER S25)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(BIO-RAD，USA)，PCR仪(BIO-RAD，T100Thermal Cycler)，分析天平(METTLER TOLEDO，ME204E)，摇床(Kylin-Bell，TS-8)，超声波清洗机(宁波新芝，SB-5200DT)；

(2)DNA四面体的制备及表征

先将单链DNA溶解，在Nanodrop One下测定260nm处的吸收，摩尔消光系数从IDTDNA网站上获得，将形成四面体纳米结构的四条单链等比例混合在TM buffer，配成终浓度为1μM的四面体纳米结构。然后将配好的样品放入PCR仪中95℃持续10min然后迅速降温到4℃，并在4℃中持续30秒以上，得到四面体DNA纳米结构。采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(Native PAGE)初步表征得到的DNA四面体结构的产率、大小等。如图2，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示DNA四面体合成成功且产率在85％以上。

实施例2

DNA四面体探针FRET效应的验证

配置200nM，100μL体系，激发光设定为555nm，扫描波长范围设定545-700nm。使用荧光分光光度计测定上述设计的DNA四面体探针的FRET效应。并将此曲线与单独Alexa555标记的单链DNA的荧光曲线进行比较。结果用Origin软件处理作图。如图3，有两个明显的发射峰，证明FRET对构建成功。

实施例3

(1)DNA四面体探针的应用

1)培养巨噬细胞RAW264.7和HepG2细胞至铺满培养皿60％-70％，加入200mM的DNA四面体与蛋白质连接产物。

2)25℃培养箱孵育过夜。

3)吸取多余培养基，使用4％多聚甲醛固定细胞。

4)共聚焦显微镜下观察细胞内荧光情况。

为了考察DNA四面体进入细胞的能力，我们使用了RAW264.7巨噬细胞和HepG2细胞同时赋予Alexa555和Alexa647双标记的DNA四面体。成像结果为三通道成像叠加：明场，DAPI和Alexa555/647。结果显示，Alexa555/647标记的DNA四面体成功进入RAW264.7和HepG2细胞。总体来看，RAW264.7细胞中DNA四面体含量高于HepG2细胞。(图4、图5)

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>一种基于DNA四面体的用于细胞内成像的纳米探针

<130>2018

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

Alexa555-GAGCGTTA GCCACAC A CACAGTC

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

Alexa555-TTAGGCG A GTGTGGC A GAGGTGT

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

Alexa647-CGCCTAAA CAAGTGG A GACTGTG

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

Alexa555-AACGCTC A CCACTTG AACACCTC

Claims (5)

1.一种DNA四面体探针，包括DNA四面体结构以及连接在所述DNA四面体上的荧光染料，所述DNA四面体包括四条DNA单链，所述第一条链包括5’端修饰的Alexa647染料；所述其余三条DNA单链包括5’端修饰的Alexa555染料。

2.根据权利要求1所述的DNA四面体探针，其特征在于，所述DNA四面体探针与荧光染料相连。

3.根据权利要求2所述的DNA四面体探针，其特征在于，所述四条单链包括荧光染料Alexa647和Alexa555。

4.根据权利要求2或3所述的DNA四面体，其特征在于，所述单链的长度为23nt。

5.根据权利要求1所述的DNA四面体探针，其特征在于，所述荧光基团修饰于所述DNA单链的5’端。