CN103361351B - 人RUNX2基因的shRNA及其重组干扰载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人RUNX2基因的shRNA及其重组干扰载体和应用，shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2第5位至第52位所示，该序列能够干扰RUNX2基因表达，降低细胞成球能力、降低细胞克隆形成能力和降低细胞侵袭能力等，本发明公开的shRNA干扰RUNX2基因表达后还能降低转录因子Sox2，转录因子Oct4和转录因子Bmi1等干性转录因子表达，能延缓胃癌细胞侵袭转移，可以用于治疗胃癌的药物。

Description

人RUNX2基因的shRNA及其重组干扰载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及人RUNX2基因的shRNA，还涉及表达该shRNA的重组干扰载体和应用。

背景技术

全球范围内，胃癌是位居癌症死因第三位的恶性肿瘤。在亚洲地区，胃癌是发病率和死亡率居首的消化道恶性肿瘤。尽管目前已有包括消化内镜在内的多种早期检查诊断方法，但胃癌的早期诊断率仍然偏低，首诊即发现已有远处扩散与转移的胃癌患者比例高达60%。目前胃癌治疗所采用的方法主要为外科手术切除结合多种化疗药物治疗，近年来，随着诊断手段革新和治疗方法提高，胃癌的治疗效果得到一定程度的提升，但胃癌患者5年生存率在20%左右的较低水平。随着肿瘤发生、发展、侵袭和转移过程中分子生物学，分子病理学研究的深入，分子靶向治疗已成为继手术、化疗和放疗之后的一种新的治疗手段，具有靶向、高效和低毒等特点。

转录因子RUNX2为转录因子家族RUNX成员之一，具有一段家族成员共有的由128个氨基酸组成的DNA结合区——Runt结构域。RUNX2转录因子可与核心结合因子β（CoreBinding Factorβ，Cbfβ）结合形成异二聚体，并因此获得更强的与DNA结合能力。研究发现，转录因子RUNX2在成骨细胞和成骨样肉瘤细胞中表达，是调控成骨分化发育的特异性转录因子，并证实RUNX2突变与锁骨颅骨发育异常综合症密切相关。近年来研究还发现，RUNX2在与人肿瘤相关，在易于发生骨转移的肿瘤，如乳腺癌，前列腺癌和骨肉瘤中发挥着促进骨转移和溶骨作用。此外，在乳腺癌中，RUNX2与ERa的促增殖作用相互拮抗。2011年向春香等人报道了胃癌细胞SGC7901中存在RUNX2的表达，siRNA抑制RUNX2表达可抑制胃癌细胞的增殖，促进凋亡。但是目前并未见RUNX2与胃癌侵袭转移相关的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种人RUNX2基因的shRNA；本发明的目的之二在于提供含有上述shRNA的重组干扰载体；本发明的目的之三在于提供上述shRNA在制备降低RUNX2基因表达的试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供上述shRNA在制备降低细胞成球能力的试剂中的应用；本发明的目的之五在于提供上述shRNA在制备降低细胞克隆形成能力的试剂中的应用；本发明的目的之六在于提供上述shRNA在制备降低细胞侵袭能力的试剂中的应用；本发明的目的之七在于提供shRNA在制备降低转录因子表达的试剂中的应用。

为实现上述发明目的，技术方案为：

1.人RUNX2基因的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2第5位至第52位所示。

2.含有所述人RUNX2基因的shRNA的重组干扰载体。

优选的，所述重组干扰载体由如SEQ ID NO.2所示序列连入经AgeI和EcoRI酶切pLKO.1-TRC克隆载体制得。

3.所述shRNA在制备降低RUNX2基因表达的试剂中的应用。

4.所述shRNA在制备降低细胞的成球能力的试剂中的应用。

5.所述shRNA在制备降低细胞克隆形成能力的试剂中的应用。

6.所述shRNA在制备降低细胞侵袭能力的试剂中的应用。

7.所述shRNA在制备降低转录因子表达的试剂中的应用，所述转录因子为转录因子Sox2，转录因子Oct4或转录因子Bmi1。

本发明的有益效果在于：本发明公开了RUNX2基因的shRNA，该shRNA分子能够特异干扰靶位点，将RUNX2基因的shRNA与骨架载体连接构建重组干扰载体，经慢病毒包装后转染胃癌细胞株MGC803，获得了稳定下调RUNX2基因表达的胃癌细胞株MGC803-shRUNX2，降低胃癌细胞株中RUNX2基因表达后，胃癌细胞株的干性特性受损，因此干性基因表达下调；同时该细胞还具有细胞成球能力、细胞克隆形成能力和细胞侵袭能力均低的特性，利用此特性可以将RUNX2基因的shRNA用于制备降低细胞的成球能力、细胞克隆形成能力和细胞侵袭能力的试剂，并以此治疗胃癌，降低胃癌细胞的成球能力、克隆形成能力和细胞侵袭能力。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为经过嘌呤霉素筛选后，Real-Time PCR检测RUNX2表达结果图。

图2为MGC803-shRUNX2的成球能力和克隆形成能力结果图（A：成球能力；B：克隆形成能力）。

图3为MGC803-shRUNX2细胞侵袭能力检测结果。

图4为MGC803-shRUNX2细胞相关转录因子Sox2，Oct4，Bmi1和Nanog表达结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、靶向人RUNX2基因特异性干扰序列的获得

根据NCBI公开的人RUNX2基因序列（Genbank：NM_001024630）设计shRNA序列，具体设计方法是利用美国Invitrogen公司网站（其网址为http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/sort.do）提供的RNAi在线设计软件，根据人RUNX2基因序列筛干扰的靶序列，经过比对筛选获得含21个碱基的靶序列，具体序列为：5’-gtggtcctatgaccagtca-3’（SEQ ID NO.1），然后利用靶序列设计shRNA序列，设计的序列交由上海英骏生物技术有限公司合成，shRNA序列具体如下：

RUNX2-Sh2正向：5’-ccgggtggtcctatgaccagtcacgggatccaatgactggtcataggaccacttttttg-3’（SEQ ID NO.2）；RUNX2-Sh2反向：5’-aattcaaaaaagtggtcctatgaccagtcattggatcccgtgactggtcataggaccac-3’（SEQ ID NO.3）；其中黑体表示与靶序列结合区，下划线为双链退火后形成的粘性末端，这两粘性末端分别能与AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切的粘性末端连接。

二、重组干扰载体的获得

将浓度为1mol/L的如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的序列，在95℃条件下解链4分钟，然后在75℃条件下退火10分钟，将单链序列退火形成带粘性末端的双链序列，然后将获得的4序列连接入经AgeI和EcoRI的pLKO.1-TRC克隆载体（质粒图谱见http://www.addgene.org/10878/），得重组干扰载体pLKO.1-puro-shRUNX2。将pLKO.1-puro-shRUNX2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩大培养后抽提质粒，并控制质粒浓度大于800ng/uL。

三.慢病毒载体病毒包装

取生长良好的293T细胞，经消化、洗涤，并用Opti-MEM选择培养基制成细胞悬液，然后分传到不同的培养皿中继续培养，备用；然后使用脂质体2000转染试剂转染以质量比计pRRE、pRev、pMD2.G和pLKO.1-puro-shRUNX2为1：1.5：0.75：2的转染质粒，转染步骤按说明书操作，转染后48-72小时，收集293T培养上清，过滤后提纯病毒原液，即得干扰shRUNX2的慢病毒液。

四、稳定下调RUNX2基因表达的人胃癌细胞株的获得

将人胃癌细胞株MGC803（高表达RUNX2）接种在6孔板中，培养至30%-50%细胞汇合度；加入浓度为5×106MOI的干扰shRUNX2的慢病毒液，并向培养基中按质量比为1:1000添加聚凝胺（polybrene）以增加转染效率，然后用无血清1640培养基培养；培养时间为8-12小时，培养后换上含血清的1640培养基继续培养，3天后，在培养基中加入浓度为300μg/μL的嘌呤霉素（puromycine）进行筛选，每天观察细胞活力状态，得MGC803-shRUNX2细胞。

同时用含无意序列的pLKO.1-TRC克隆载体质粒为阴性对照，记为mock质粒，其中无意序列识别的靶序列为：5’-cctaaggttaagtcgccctc-3’（SEQ ID NO.4），无意正向序列为：5’-ccggcctaaggttaagtcgccctccgggatccaagagggcgacttaaccttaggttttttg-3’（SEQ ID NO.5）；无意反向序列为：5’-ccgggagggcgacttaaccttaggcgggatccaacctaaggttaagtcgccctcttttttg-3’（SEQ IDNO.6）。然后依前述方法，将此mock质粒包装为慢病毒，并对MGC803细胞进行转染，得到MGC803-mock细胞株，作为对照组细胞。

1.检测获得的MGC803-shRUNX2细胞的干扰效率，具体使用Real-Time PCR检测，并以MGC803-mock细胞作阴性对照，具体检测方法如下：

将制备的MGC803-shRUNX2细胞提取总RNA（裂解液为Trizol，Takara公司，货号为：Takara Code:9109），然后对获得的RNA反转录合成cDNA（反转录试剂盒购自Fermentas公司，货号为：K1621），最后用进行荧光定量检测（荧光定量试剂盒购自Takara公司，货号为：DRR081A），同时以GAPDH作内参，具有引物如下：

RUNX2上游检测引物：5'-gtttgttctctgaccgcctc-3'（SEQ ID NO.7）；

RUNX2下游检测引物：5'-ccagttctgaagcacctga-3'（SEQ ID NO.8）；

GAPDH上游检测引物：5’-aaggtgaaggtcggagtcaac-3’（SEQ ID NO.9）；

GAPDH下游检测引物：5’-ggggtcattgatggcaacaata-3’（SEQ ID NO.10）。

并按如下条件进行检测：预变性95℃预变性30s；95℃变性5秒，61℃退货30秒，72℃延伸30秒20℃，重复40个循环；最后进行溶解曲线分析，结果如图1所示。由图1可知，转染干扰shRUNX2的慢病毒液的细胞中RUNX2基因的表达量明显下降，表达下调大于80%，表明干扰shRUNX2的慢病毒液能够干扰RUNX2表达。

2.检测MGC803-shRUNX2细胞的成球能力和克隆形成能力，具体方法如下：

配制胃癌细胞成球培养基DMEM/F12+2%B27+5ng/mL EGF，然后将MGC803-mock与MGC803-shRUNX2两组细胞分别以104个/皿接种入低粘附细胞培养皿（培养皿购自Corning公司，货号为：3262），连续培养，同时在电镜下观察细胞球大小及个数，在培养至15-20天时统计细胞的成球能力，结果如图2A所示。结果显示干扰RUNX2表达的MGC803-shRUNX2细胞株成球能力下降，表明干扰RUNX2表达后细胞的自我更新能力显著受抑制。

将MGC803-mock与MGC803-shRUNX2两组细胞分别以200个/孔的密度接种入6孔板，连续培养；培养期间在电镜下观察，观察细胞集落克隆生长情况，然后统计统计克隆个数，分析结果，结果如图2B所示。结果显示与MGC803-mock组相比，干扰RUNX2表达的MGC803-shRUNX2细胞株克隆形成能力下降。

3.检测MGC803-shRUNX2细胞的侵袭能力，具体方法如下：

将预冷（冰浴）的Matrigel基质胶（购自BD公司）与无血清1640培养基以体积比为1:1配置成工作液状态；然后取10μL的工作液小心加入transwell中，铺满底部，在37℃培养箱中静置15分钟；分别消化培养的MGC803-mock细胞和MGC803-shRUNX2细胞，再以10⁴个细胞/200μL*transwell的比例加入transwell上室，下室加入600μL含血清的细胞培养基（血清为人小牛血清，购自兰州民海生物工程有限公司），37℃培养24小时；取出transwell小室，在质量分数为4%的多聚甲醛中固定15分钟；使用结晶紫燃料对transwell小室进行染色，染色时间为10分钟；然后在显微镜下采图，并统计穿到下室的细胞个数，分析结果如图3所示。结果显示，干扰人RUNX2后，与对照组MGC803-mock细胞相比，MGC803-shRUNX2细胞侵袭转移能力显著下降了，穿过基质胶到达下室的细胞数目显著减少。

4.检测MGC803-shRUNX2细胞相关转录因子表达情况，具体方法如下：

分别取MGC803-mock细胞和MGC803-shRUNX2细胞，然后提取总RNA（裂解液为Trizol，购自Takara公司的，货号为：Takara Code:9109），然后对获得的RNA进行反转录合成cDNA（反转录试剂盒购自Fermentas公司，货号为：K1621），最后进行荧光定量检测（荧光定量试剂盒购自Takara公司，货号为：DRR081A），同时以GAPDH作内参，内参引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。同时设计检测干性基因的引物，干性基因包括转录因子Sox2，转录因子Oct4，转录因子Nanog和转录因子Bmi1的荧光定量引物，具体如下：

检测Sox2的上游引物:5’-gcgactatgcacaacga-3’(EQ ID NO.11）；

检测Sox2的下游引物:5’-ccagagtggtgacggagaca-3’（SEQ ID NO.12）；

检测Oct4的上游引物:5’-gcagcgactatgcacaacga-3’（SEQ ID NO.13）；

检测Oct4的下游引物:5’-ccagagtggtgacggagaca-3’（SEQ ID NO.14）；

检测Nanog的上游引物:5’-tttgtgggcctgaagaaaact-3’（SEQ ID NO.15）；

检测Nanog的下游引物:5’-agggctgtcctgaataagcag-3’（SEQ ID NO.16）；

检测Bmi1的上游引物:5’-tcgttcttgttattacgctgtttt-3’（SEQ ID NO.17）；

检测Bmi1的下游引物:5’-cggtagtacccgcttttaggc-3’（SEQ ID NO.18）；

并按如下条件进行检测：预变性95℃预变性30s；95℃变性5秒，61℃退货30秒，72℃延伸30秒20℃，重复40个循环；最后溶解曲线分析，结果如图4所示。由图4可知，干扰RUNX2表达后，干性基因转录因子Sox2，转录因子Oct4，转录因子Nanog和转录因子Bmi1表达均下调。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.shRNA在制备降低干性基因表达的试剂中的应用，其特征在于：所述干性基因为转录因子Sox2，转录因子Oct4或转录因子Bmi1，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2第5位至第52位所示。