CN104593420A - 一种促胶质瘤干细胞分化的过表达bmp4的神经干细胞的制备方法及其临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BMP4基因片段，构建到病毒载体上，转染人神经干细胞制备成过表达BMP4的神经干细胞，体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，BMP-4与BMP受体结合活化，可以促进胶质瘤干细胞分化，体内实验中能转移到肿瘤病灶位，抑制胶质瘤的生长和转移复发；本发明还提供了过表达BMP4的神经干细胞及其治疗胶质瘤的临床应用，该神经干细胞将能诱导胶质瘤干细胞分化治疗，对胶质瘤降低恶性程度，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

Description

一种促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法及其临床应用

技术领域

本发明涉及一种制备促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的方法以及通过所述方法获得过表达BMP4的神经干细胞，特别地，本发明涉及的过表达BMP4的神经干细胞体外实验中BMP-4与BMP受体结合活化，可以促进胶质瘤干细胞分化，体内实验中能转移到肿瘤病灶位，抑制胶质瘤的生长和转移复发；本发明的过表达BMP4的神经干细胞可以用于临床治疗胶质瘤，针对性促肿瘤干细胞分化，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，降低胶质瘤恶性程度从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

背景技术

胶质细胞瘤中的胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见的致死性，恶性程度最强的颅内肿瘤。肿瘤细胞在脑内广泛迁移，病情恶性进展迅速。切除手术结合传统的放、化疗很难做到根治不复发，平均生存期不足1年。目前的治疗方法虽经多重改善，但对具有高侵袭性的GBM仍束手无策。原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSC)，近年来，将干细胞生物学理论用于人脑肿瘤的研究发现，人类GBM中存在一种具有干细胞特征的细胞亚群，被称为脑肿瘤干细胞或肿瘤起源细胞。

GBM中的脑肿瘤干细胞同神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)表达相同的膜抗原CD133和巢蛋白(Nestin)，它们在体外培养可形成神经球，能够自我复制、增殖并产生胶质瘤组织中其它分化类型的肿瘤细胞。GBM起源细胞的发现为GBM的高侵袭性、高复发性提供了新的解释。最近研究证明GBM中的脑肿瘤干细胞多存在于血管壁龛内，是造成肿瘤放、化疗抗性的主要原因。而目前应用的化疗药物及放射治疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对脑内正常NSCs的杀伤作用更大，因此极大地限制了它们的应用。靶向杀伤、抑制GBM中的脑肿瘤干细胞的治疗策略为GBM的治疗提供了新的思路。

本发明提供了一种在胶质母细胞瘤中基因沉默的骨形态发生蛋白4(bonemorphogen protein 4，BMP4)，BMP4/BMP受体系统抑制造成胶质瘤干细胞增殖和成球生长，使得胶质瘤生长和转移复发。然而，提高BMP4在胶质瘤中的表达，激活BMP4/BMP受体系统促进胶质瘤干细胞终末分化，抑制了GBM细胞的生长。本发明以人神经干细胞作为载体过表达BMP4，促进胶质瘤干细胞终末分化，能有效地抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，从而抑制GBM的生长与转移复发。人神经干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是基因表达理想的载体，因而，本发明促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞制备简单，能个体化临床治疗胶质瘤患者，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗胶质瘤。

发明内容

胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶，接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细胞培养基中能形成细胞球、极小数量接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤。GSCs的起源至今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更容易耐受。GSCs的这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的“种子细胞”，针对GSCs的研究或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研究治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。

本发明是我们长期通过基础研究的科研成果，发现BMP4在胶质瘤发生发展中发挥着重要作用，是胶质瘤干细胞赖以生存的抑制分子。我们研究发现BMP4可通过靶向多个基因，骨形态发生蛋白(BMPs)在调节正常NSCs分化的过程中发挥着十分重要的作用。对胚胎早期的NSCs，BMPs主要促进其增殖。相反，对于从胚胎后期或出生后动物分离到的NSCs，BMPs的作用是促其向星形胶质细胞分化。BMP4表达于成熟的星形胶质细胞，而在NSCs、神经元和少突胶质细胞中不表达，该结果提示BMP4是正常脑星形胶质细胞分泌的细胞因子，对正常脑组织是安全无害的，而且可以通过基因修饰在NSC中过表达。

本发明通过研究发现了研究中发现BMP4与其受体骨形态蛋白受体1B(Bone morphogen protein receptor 1B，BMPR1B)系统的活化能在体内外抑制GBM细胞的生长并诱导瘤细胞的分化，BMP4/BMPR1B系统在GBM细胞中的过表达和活化能明显抑制瘤细胞在裸鼠皮下和颅内的恶性增殖，延长荷瘤裸鼠的生存时间。对移植瘤的HE染色和免疫组化染色证明，BMP4/BMPR1B系统的过表达和活化可以抑制瘤细胞在脑内的迁移，促进GBM细胞的分化，减少肿瘤内小血管的增生，表现为GFAP的表达增强和小血管内皮细胞膜抗原CD34的表达减少。骨形态发生蛋白4也可以明显抑制人GBM中GSC的增殖，降低CD133⁺的GSC集落形成能力，减少GSC储备。并且发现经短暂BMP4诱导后的CD133⁺的GSC移植到裸鼠脑内，可以有效抑制胶质瘤的生长，明显延长荷瘤裸鼠的存活期，对移植瘤检测发现经BMP4诱导的GSC分化的更成熟，在裸鼠脑内的侵袭性降低。

本发明提供了一种促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BMP4基因片段，构建到病毒载体上，转染人神经干细胞制备成过表达BMP4的神经干细胞。BMP4基因片段通过正常组织中DNA聚合酶链式反应(DNA polymerase chain reaction，PCR)扩增或者化学合成法获得，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人神经干细胞，获得过表达BMP4的神经干细胞。

人神经干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，研究证实NSCs对恶性胶质瘤有明确的趋化性，可以传递特定的凋亡基因或药物前体基因至肿瘤细胞内部并追踪脑内转移的肿瘤细胞，达到导向杀伤肿瘤细胞的目的，有希望作为安全的细胞载体用于恶性胶质瘤的生物治疗，这种携带肿瘤靶向药物的NSC疗法为传统疗法难以攻克的恶性脑肿瘤的治疗带来了新的希望。用表达红色荧光蛋白(RFP)的腺相关病毒(AAV)感染人神经干细胞(hNSCs)、用表达绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒(LV)感染GBM细胞U251后，分别移植到BALB/c裸鼠左右纹状体，1个月后荧光显微镜观察显示，hNSCs能长距离定向迁移至对侧胶质细胞瘤区域。本发明利用其干细胞归巢趋化功能，可以定向迁移到脑部受损的部位，发挥着神经细胞修复和免疫调控的作用，是目的基因过表达理想的载体，能定位到治疗部位过表达BMP4，体内针对GSCs的BMP4高表达可以显著抑制胶质母细胞瘤的生长和减少肿瘤侵袭，从而达到治疗胶质瘤的作用。

由于人神经干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明提供所述的过表达BMP4的神经干细胞，体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，BMP-4与BMPR1B结合活化，促进胶质瘤干细胞终末分化，能有效地抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长。在胶质瘤动物模型体内杀瘤试验中，该神经干细胞能转移到肿瘤病灶位，过表达BMP4与BMPR1B结合激活，能够GSCs诱导Wnt信号通路活化而产生分化效应，使得胶质瘤大小显著缩小，并且转移明显得到抑制。

本发明还提供一种制备过表达BMP4的神经干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)人神经干细胞基础培养基；

2)包装好的BMP4过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人神经干细胞的来源为人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的BMP4过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供所述过表达BMP4的神经干细胞的应用。优选，其能用于促肿瘤干细胞分化，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

附图说明

图1表示荧光显微镜下实施例1中GFP阳性神经干细胞的绿色荧光图片

图2表示与实施例1中制备的BMP4过表达人神经干细胞共培养后胶质瘤干细胞MTT法检测增殖曲线

图3表示与实施例1中制备的pGC-BMP4-NSC共培养的GSC细胞检测CD133阳性经流式细胞图

图4表示与实施例1中制备的pGC-BMP4-NSC共培养的GSC细胞荧光定量PCR检测BMP4受体BMPR-IB与Wnt分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达变化图

图5表示荷胶质瘤SCID裸鼠模型用实施例1中制备的BMP4过表达人神经干细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线

图6表示动物模型体内实验实施例1中制备的pGC-BMP4-NSC治疗后荧光定量PCR检测BMP4受体BMPR-IB与Wnt分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达变化图

具体实施方式

本发明提供了一种促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取前体BMP4基因片段，构建到病毒载体上，转染人神经干细胞制备成过表达BMP4的神经干细胞。

BMP4基因片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293FT细胞，以(2～2.5)×10⁶细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用Lipofectamine^TM 2000转染进行病毒包装。转染分为2组：阳性组和对照组。48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5min后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染。将两组病毒上清分别感染人神经干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12(1∶1)完全培养基(含1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子)，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BMP4目的基因病毒转染人神经干细胞成功，获得过表达BMP4的神经干细胞。

人神经干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备促肿瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，例如pPACK-REV、pPACK-GAG和pVSV-G；pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0以及pspax2、pMD2G和pHBLVTM等，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。

本发明提供所述的过表达BMP4的神经干细胞，在体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，BMP-4与BMPR-IB结合活化，促进GSC向终末端分化，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；

在胶质瘤干细胞建立的动物模型中，体内试验该过表达BMP4的神经干细胞激活其受体BMPR-IB并结合，促进了胶质瘤干细胞向终末端分化，使得胶质瘤大小显著缩小，并且转移明显得到抑制。

本发明还提供一种制备过表达BMP4的神经干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)人神经干细胞基础培养基；

2)包装好的BMP4过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人神经干细胞的来源为人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的BMP4过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供所述过表达BMP4的神经干细胞的应用，能用于促肿瘤干细胞分化，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1 BMP4过表达人神经干细胞的制备

以基因组DNA为模板PCR扩增BMP4，将pFU-GW载体Xba I和Hpa I双酶切后，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，与双链BMP4于4℃12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞后进行阳性克隆PCR鉴定。测序鉴定正确后进行慢病毒包装，感染前24小时，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿。待细胞密度达70％-80％时，DNA溶液(pGC-LV-BMP4载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg，购自美国Invitrogen公司)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，加入离心管中，室温下温育5分钟。取100μLLipofectamine^TM 2000(购自美国Life公司)试剂在另一离心管中与2.4mLOpti-MEM(购自美国Life公司)混合，室温下温育5分钟。然后将分别含有DNA和脂质体溶液混合，轻柔混匀，室温下温育20分钟。将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有感染混合物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动培养瓶以洗涤残余的感染混合物，然后倒去。每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25mL，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时。收集感染后48小时的293T细胞上清液，于4℃、4000×g离心10分钟，除去细胞碎片。0.45μm滤器(购自美国BD公司)过滤上清液于40mL超速离心管中，再离心浓缩病毒液至所需浓度。收集病毒液，分装后-80℃长期保存。取其中1支用孔稀释法进行病毒滴度测定。

采用DMEM/F12(1∶1)(含1×B27，购自美国Gibco公司；20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子，购自美国peprotech公司)培养液从废弃脐带血中培养获得神经干细胞，取培养5代以上的NSCs，以2×10⁶cells/mL的密度接种至24孔板2mL，培养2天至细胞融合度达到30％-50％。在完全培养基中加入含有BMP4和GFP(绿色荧光报告基因)的慢病毒载体上清，加上终浓度为5mg/L的聚凝胺(polybrene)。共感染24小时，换新鲜培养基。感染后每天倒置荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并计数GFP阳性细胞的百分比，图1中A为明场下NSC成神经球生长图片，B为暗场下GFP荧光显色的NSC成神经球生长图片，结果显示荧光显微镜下GFP阳性神经干细胞可以达到95％，表明BMP4基因通过慢病毒系统转染成功了人神经干细胞(pGC-BMP4-NSC)，并在人神经干细胞中过表达。

实施例2 BMP4过表达人神经干细胞体外共培养抑制胶质瘤干细胞的作用

将上述实施例1中制备的BMP4过表达人神经干细胞培养于DMEM/F12(1∶1)(含1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子)培养液中，胶质瘤干细胞(来自临床胶质瘤母细胞瘤手术组织，经体外培养获得的)培养于DMEM/F12(1∶1)(含1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子)培养液中。采用Transwell(关国coming公司)共培养体系，取pGC-BMP4-NSC悬液(细胞数约为6×10⁵)接种到PBS浸润的上层小室中，用镊子将小室转移放于培养胶质瘤干细胞的孔板中，避免底部产生气泡，放回37℃、5％CO₂培养箱中培养，共培养进行下述实验。对照组为单独于DMEM/F12(1∶1)(含1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子)培养的胶质瘤干细胞。

MTT法检测胶质瘤干细胞增殖：在共培养1天后开始，取出培养pGC-BMP4-NSC的小室，向培养胶质瘤干细胞的孔板中每孔加入10μl 5mg/ml的MTT(美国Sigma公司)，无需换液；4h后，吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO终止反应，振荡器振荡5-10min，酶标仪490nm检测OD值，对数据进行统计和细胞增殖曲线分析。图2为胶质瘤干细胞MTT法检测增殖曲线，结果显示与实施例1中制备的BMP4过表达人神经干细胞共培养后胶质瘤干细胞增殖能力明显低于正常对照的胶质瘤干细胞，增殖能力显著抑制。

分别取1份50μL(1×10⁶个)与pGC-BMP4-NSC共培养36小时后的GSC和正常培养的GSC细胞悬液分别添加到一支含有20μL PE-CD133(美国BD公司)，另一支含有20μL PE-IgG1(美国BD公司)的1ml离心管中。混匀后置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得流式抗体染色后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测(美国BD公司)。图3中A为正常培养的GSC细胞经流式细胞仪检测的CD133阳性结果为61.17％，B为与pGC-BMP4-NSC共培养的GSC细胞经流式细胞仪检测的CD133阳性结果仅为1.63％，表明与pGC-BMP4-NSC共培养36小时后的GSC标志物CD133明显下降，胶质瘤干细胞逐渐终末端分化，干细胞特征逐渐削减。

分别取1份50μL(1×10⁶个)与pGC-BMP4-NSC共培养36小时后的GSC和正常培养的GSC细胞悬液经Trizol试剂(美国Invitrogen公司)根据使用说明书提取RNA，逆转录PCR成cDNA后荧光定量PCR检测BMP4受体BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达水平。图4为荧光定量PCR检测BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达结果图，与正常培养GSC比较，与pGC-BMP4-NSC共培养后GSC显著提高BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin的表达，表明NSC过表达BMP4后刺激了GSC中BMPR-IB表达上调并结合激活，促进了GSC分化信号通路基因的表达。

实施例3 BMP4过表达人神经干细胞在动物体内抗瘤实验中的作用

胶质瘤干细胞建立荷胶质瘤SCID裸鼠模型(参见“靶向人肿瘤血管和人癌症干细胞治疗的评估新模型”，Burgos-Ojeda D等人，癌症研究杂志，第445卷，第3555-3565页，2013年7月15日；A novel model for evaluating therapiestargeting human tumor vasculature and human cancer stem-like cells.Cancer Res.2013；73(12)：3555-3565.)，随机分为A、B和C 3组，每组6只：A组为上述实施例1中制备的BMP4过表达人神经干细胞治疗组；B组为人神经干细胞治疗组；C组为同体积生理盐水空白组。A组在第0天荷瘤鼠模型尾静脉注射2×10⁶个/mL BMP4过表达人神经干细胞，B组在第0天荷瘤鼠模型尾静脉注射2×10⁶个/mL人神经干细胞，各1mL，7天后再同样剂量治疗1次。治疗完之后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取荷胶质瘤SCID裸鼠模型肿瘤组织和眼眶静脉采血，计算鼠模型荷瘤大小(mm³，x±s)。图5中荷胶质瘤SCID裸鼠模型治疗完之后肿瘤大小变化曲线，结果显示空白组和治疗组B与治疗组A相比，治疗组A中胶质瘤大小大大缩少，明显地抑制胶质瘤干细胞成瘤的生长，因而有关实施例1所得BMP4过表达人神经干细胞引发了良好的体内杀瘤活性。

分别取1份治疗组A、治疗组B和空白组C 35天的胶质瘤组织，各1克，经Trizol试剂(美国Invitrogen公司)根据使用说明书提取RNA，逆转录PCR成cDNA后荧光定量PCR检测BMP4受体BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达水平。图6为动物模型治疗后荧光定量PCR检测BMP4受体BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin表达结果图，与NSC治疗组B和空白组C比较，BMP4过表达人神经干细胞治疗组A显著提高BMP4受体BMPR-IB与分化信号通路基因Wnt1和β-catenin的表达，表明动物体内NSC过表达BMP4后刺激了胶质瘤中BMPR-IB表达上调，活化了Wnt分化信号通路中Wnt1和β-catenin基因的表达，从而促使了GSC向终末端分化，抑制了GSC增殖和胶质瘤转移复发。

Claims (10)

1.一种促肿瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过获取BMP4基因片段，构建到病毒载体上，转染人神经干细胞制备成过表达BMP4的神经干细胞；在体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，BMP-4与BMP受体结合活化，可以促进胶质瘤干细胞分化；在体内实验中能转移到肿瘤病灶位，抑制胶质瘤的生长和转移复发。

2.根据权利要求1所述过表达BMP4的神经干细胞的制备方法，其特征在于，通过正常组织中PCR扩增或者化学合成前体BMP4基因片段，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人神经干细胞，获得过表达BMP4的神经干细胞。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的制备方法，其特征在于，人废弃脐血、胎盘血或自体骨髓经体外培养获得所述人神经干细胞；其具有表达巢蛋白的神经干细胞标志物特征；优选地，所述人神经干细胞来源于人自体骨髓。

4.根据权利要求2-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的病毒表达系统为慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、逆转录病毒表达系统；优选地，选择慢病毒表达系统。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BMP4的神经干细胞，在体外与胶质瘤干细胞共培养，CD133表达下降，使得胶质瘤干细胞增殖能力和成球生长能力明显地降低。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BMP4的神经干细胞，在动物体内杀瘤试验中CD133表达显著下降，使得胶质瘤大小显著缩小并且转移明显得到抑制。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，BMP4基因片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293FT细胞，以(2～2.5)×10⁶细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用Lipofectamine^TM2000转染进行病毒包装；转染分为2组：阳性组和对照组；48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5min后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染；将两组病毒上清分别感染人神经干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况；GFP显色超过90％以上，表明携带BMP4目的基因病毒转染人神经干细胞成功，获得过表达BMP4的神经干细胞；所述DMEM/F12完全培养基含1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子。

8.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，以基因组DNA为模板PCR扩增BMP4，将pFU-GW载体Xba I和Hpa I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，与双链BMP4于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞后进行阳性克隆PCR鉴定；测序鉴定正确后进行慢病毒包装，感染前24小时，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿；待细胞密度达70％-80％时，DNA溶液与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，加入离心管中，室温下温育5分钟；取100μL LipofectamineTM 2000试剂在另一离心管中与2.4mLOpti-MEM混合，室温下温育5分钟；然后将分别含有DNA和脂质体溶液混合，轻柔混匀，室温下温育20分钟；将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养8h后倒去含有感染混合物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动培养瓶以洗涤残余的感染混合物，然后倒去；每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25mL，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时；收集感染后48小时的293T细胞上清液，于4℃、4000×g离心10分钟，除去细胞碎片；0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中，再离心浓缩病毒液至所需浓度；收集病毒液，分装后-80℃长期保存；取其中1支用孔稀释法进行病毒滴度测定；其中，所述DNA溶液含：pGC-LV-BMP4载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg；

采用DMEM/F12培养液从废弃脐带血中培养获得神经干细胞，取培养5代以上的NSCs，以2×10⁶cells/mL的密度接种至24孔板2mL，培养2天至细胞融合度达到30％-50％；在完全培养基中加入含有BMP4和绿色荧光报告基因GFP的慢病毒载体上清，加上终浓度为5mg/L的凝聚胺(polybrene)；共感染24小时，换新鲜培养基；感染后每天倒置荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并计数GFP阳性细胞的百分比；荧光显微镜下GFP阳性神经干细胞达到95％，表明BMP4基因通过慢病毒系统转染成功了人神经干细胞(pGC-BMP4-NSC)，并在人神经干细胞中过表达；

其中，DMEM/F12含：1×B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子。

9.一种制备权利要求1-8任一项所述过表达BMP4的神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人神经干细胞基础培养基；

2)包装好的BMP4过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-7任一项所述的方法；优选，所述BMP4过表达病毒载体包括慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、逆转录病毒表达系统，更优选地，选择慢病毒表达系统。

10.权利要求1-8所述任一项所述过表达BMP4的神经干细胞的应用；优选，其用于诱导胶质瘤干细胞分化治疗，降低胶质瘤恶性程度，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。