CN111349606A - P60抑制剂与cart细胞联合应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Treg细胞抑制剂P60与CART细胞联合应用方法，主要包括以下步骤：1)Treg细胞抑制剂P60的构建；2)CART细胞构建；3)P60加入到CART细胞中并检测CART细胞增殖与功能。本发明制备的CART细胞增殖能力强，细胞功能好。

Description

P60抑制剂与cart细胞联合应用

技术领域

本发明涉及一种工程T细胞，其制备方法及其作为药物的用途，特别是用于免疫治疗。本发明的工程T细胞被设计用于局部表达调控T细胞(Treg)的分泌抑制剂。分泌抑制剂是叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3)的肽抑制剂，FoxP3是参与T细胞向调节性T细胞分化的特异性因子。所述T细胞优选具有针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(CAR)。因此本发明的工程化T细胞将其免疫活性导向特定的恶性或受感染细胞，同时阻止相邻的调节性T细胞调节免疫反应。。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

虽然细胞毒性T淋巴细胞(CTL；也称为细胞毒性T细胞)和T辅助细胞在细胞免疫应答中起重要作用，但调节性T细胞(Tregs)，以前称为抑制性T细胞，调节或抑制免疫反应，特别是预防自身免疫和维持对自身抗原的耐受性。由于它们的免疫调节功能，在癌症或感染部位存在调节性T细胞可能阻碍诱导针对癌症或感染性病原体的免疫应答(AandahlE.M.et al.(2004)；Cabrera R.et al.(2004)；Viguier M.et al.2004)；Woo E.Y.et al(2001))。因此，在某些致病情况下，例如慢性感染性疾病或癌症，可能需要抑制调节性T细胞的活性以允许发生更有效的免疫应答。另一方面，开发疫苗策略基于以下发现：通过降低调节性T细胞的活性可以改善疫苗功效，例如通过控制叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3)的活性。特别是FOXP3的一种肽抑制剂P60，被发现可以提高小鼠的疫苗效力(Casares etal.，2010)。

Lee,J.C.et al.Cancer Res 2011,71:2871-2881报道了Tregs对CD19CAR-工程化效应T细胞的抑制作用。然而，FOXP3的功能障碍与严重的自身免疫疾病如系统性红斑狼疮或X性连锁多内分泌腺病、肠病伴免疫失调综合征(IPEX)综合征相关，使得针对例如FoxP3的抑制剂的全身给药目前不被认为是免疫治疗中的合适选择。这些抑制剂在血液中甚至在局部释放可能通过释放未受原发性疾病影响的器官的自身免疫反应而导致毒性作用。

因此，需要新的治疗策略来促进有效的免疫反应，同时减少身体未受影响区域可能出现的毒性副作用。本发明通过提供调节性T细胞的特异性原位抑制作为CAR免疫疗法的一部分来解决这种需要。

发明内容

本发明涉及通过异源表达FoxP3的细胞穿透肽抑制剂来制备能够在病理细胞的密闭环境中中和调节性T细胞活性的工程化T细胞的方法。

根据本发明的另一个方面，该方法可以更具体地应用于通过嵌合抗原受体与病理细胞相互作用的T细胞。这种方法更具体地包括以下一个或几个步骤：

a)提供T细胞；

b)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包括针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；和

c)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含细胞穿透肽抑制剂FoxP3的核苷酸序列编码。

“调节性T细胞抑制剂”是指由T细胞分泌的所述分子的分子或前体，其允许T细胞逃避由调节性T细胞在其上进行的下调活性。通常，这种调节性T细胞活性抑制剂具有降低所述细胞中FoxP3转录活性的作用。

根据本发明，所述调节性T细胞活性抑制剂是FoxP3的细胞穿透性肽抑制剂，例如称为P60(Casares et al.，2010)。

根据优选实施例，工程T细胞同时在其表面表达CAR，该CAR结合病理细胞的表面抗原标记物。这种结合可以引起T细胞对病理细胞的免疫反应，导致细胞间空间内各种细胞因子和降解酶的脱粒。

根据具体实施例，该方法包括进一步将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体。引入上述核酸后，所述第二嵌合抗原受体可由所述T细胞表达。

所述第二CAR针对所述调节性T细胞，主要是为了将所述调节性T细胞物理维持在T细胞(以及病理细胞)的近距离环境中，以获得对所述调节性T细胞的原位抑制。第二CAR也有助于激活T细胞的免疫反应。

根据任选的实施方案，该方法还包括通过灭活编码T细胞受体(TCR)的一种组分的至少一种基因来使T细胞非同种异体反应的步骤。这可以通过向细胞中引入靶向该基因的特定稀有切割内切核酸酶来实现，例如TAL-核酸酶，CAS9RNA引导的核酸内切酶，锌指核酸酶或大范围核酸酶。

因此，本发明优选地提供了工程T细胞，特别是基因工程分离的T细胞，包括:

a)一种外源性核酸分子，包括针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；和

b)外源性核酸分子，包括编码FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列，如P60(Casares et al.，2010)。

根据优选实施例，所述第一嵌合抗原受体和所述FoxP3细胞穿透肽抑制剂由所述T细胞表达。

根据其他实施例，该工程T细胞进一步包括c)外源性核酸分子，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于第二嵌合抗原受体，该受体针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原。根据具体实施例，所述第二嵌合抗原受体由所述T细胞表达。

本发明还进一步提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一个抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；以及FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列编码，优选FoxP3细胞穿透肽抑制剂，如P60(Casares et al.，2010)。根据某些实施例，所述核酸分子是载体，如病毒载体或质粒。更具体地说，所述核酸分子是载体，如病毒载体或质粒，所述核苷酸序列与一个或多个适于在T细胞中表达的启动子操作连接。

本发明还提供了一种组合物，该组合物包括一个或多个核酸分子，该核酸分子包含针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一个抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；以及FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列编码，如P60(Casares et al.，2010)。根据某些实施例，所述组合物包括由所述第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码组成的核酸分子；以及FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列编码。根据某些其他实施例，所述组合物包括第一核酸分子，该第一核酸分子包含所述第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码，该核苷酸序列编码针对在恶性或受感染细胞表面表达的至少一个抗原；和第二种核酸分子，包括编码FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列，如P60(Casares et al.，2010)。根据某些实施例，该组合物包括进一步的核酸分子，该核酸分子包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控t细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体。根据某些实施例，所述核酸分子为载体，如病毒载体或质粒。更具体地说，所述核酸分子是载体，如病毒载体或质粒，所述核苷酸序列与一个或多个适于在T细胞中表达的启动子进行操作连接。

总的来说，本发明涉及制备工程化T细胞的方法，所述工程化T细胞具有通过异源表达FoxP3的细胞穿透肽抑制剂来提高其对Treg的抑制的能力。

因为调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)在抑制免疫应答中发挥作用，特别是为了防止自身免疫和维持自身抗原的耐受性，所以希望在某些致病情况下抑制该细胞类型的活性，例如癌症或慢性传染病，以允许发生更有效的免疫反应。为了对调控T细胞进行局部抑制，工程T细胞将FoxP3的细胞穿透肽抑制剂分泌到工程T细胞的环境中。这种肽抑制剂将进入邻近的调节性T细胞，通过抑制FoxP3来阻止T细胞调节免疫反应。本发明的工程化T细胞对FoxP3肽抑制剂的局部递送具有极大的优势，可减少该抑制剂在体内其他部位出现毒性作用的可能性。

根据另一方面，T细胞被工程化以表达针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(CAR)，本文称为第一CAR，和细胞穿透肽抑制剂FoxP3。CAR将引导工程T细胞到肿瘤或感染部位，并允许T细胞杀死肿瘤或感染细胞。

因此，本发明提供了一种制备工程T细胞的方法，其步骤包括:

a)提供T细胞；

b)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包括针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；和

c)将含有编码FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列的外源性核酸分子引入该T细胞。

除了针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(CAR)之外，可能优选的是，由工程改造的T细胞表达另一种CAR，其针对在调节性T细胞(Treg)表面表达的至少一种抗原，例如表面抗原CD25。这将允许调控T细胞的结合，并促进细胞穿透肽抑制剂FoxP3的进入。因此，该方法可进一步包括将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体。引入上述核酸后，所述第二嵌合抗原受体可由所述T细胞表达。

其结果是获得工程改造的T细胞，其进一步表达针对在调节性T细胞(Treg)表面表达的至少一种抗原的第二种嵌合抗原受体。

本发明的FoxP3的肽抑制剂可以是任何能够抑制叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3，最好是人类FoxP3)活性的肽或多肽。叉头/翼状螺旋转录因子3是一种特定于调控T细胞的转录因子，是T细胞发育和功能所必需的。“抑制”是指调节性T细胞中FoxP3的活性降低至少10％，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％或100％。在这方面，“FoxP3的活性”意指转录活性。

此外，本发明的FoxP3肽抑制剂除具有FoxP3的抑制活性外，还具有穿透细胞膜的能力。这种功能可能是FoxP3肽抑制剂所固有的，也可能是将已知的细胞穿透肽(CPP)与具有FoxP3抑制活性的肽或多肽融合的结果。所述CPP序列可N端或C端连接到提供FoxP3抑制活性的氨基酸序列。CPP的合适实例包括但不限于：Tat，核转录激活蛋白，其是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒复制所需的101个氨基酸的蛋白，穿透素，其对应于果蝇中的同源异型蛋白触角的第三螺旋，Kaposi成纤维细胞生长因子(FGF)信号肽序列，整联蛋白β3信号肽序列；富含鸟嘌呤的分子转运蛋白，MPG，pep-1，甜箭肽，皮抑菌肽，转运蛋白，pVEC，人降钙素，小鼠朊蛋白(mPrPr)，聚精氨酸肽Args序列，来自单纯疱疹病毒的VP22蛋白，抗菌肽Buforin I和SynB(US2013/0065314)。

根据本发明的FoxP3肽抑制剂的非限制性实例是Casares等人描述的多肽P60。(2010年)。除了有FoxP3的抑制活性外，P60还能穿透细胞膜。该多肽的氨基酸序列为:RDFQSFRKMWPFFAM[SEQ ID NO:1]。该多肽的核苷酸序列编码用CGCGACTTTCAAAGTTTC-CGTAAGATGGGCCGTTTTGCAATG[SEQ ID NO:2]表示。然而，由于遗传密码的退化，任何其他适用于SEQ ID NO:1中氨基酸序列的核苷酸序列编码也被包含在本公开中。

因此，在本发明的某些实施方案中，FoxP3的细胞穿透肽抑制剂是包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽或其包含具有至少60％氨基酸序列的变体，例如在SEQ ID NO：1的整个长度上，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性。因此，根据这些实施方案，外源核酸分子包含编码包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其变体，其包含具有至少60％的氨基酸序列，例如，在SEQ ID NO：1的整个长度上与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性是引入T细胞的。与SEQ ID NO:1相比，该变体可能包含一个氨基酸序列，该序列具有一个或多个氨基酸替换，例如两个、三个、四个、五个或六个氨基酸替换。优选地，这种氨基酸替代是一种保守的替代，即一种氨基酸被另一种在大小和化学性质上相似的氨基酸所替代。这种保守的氨基酸替代可能因此对肽结构产生较小的影响，因此可以在不损害功能的情况下耐受。优选地，该变体能够抑制FoxP3的活性，能够穿透细胞膜。

根据某些实施方案，外源核酸分子因此可以包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列或由遗传密码的退化引起的任何其他核苷酸序列也编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

因此可以获得表达包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽或包含具有至少60％氨基酸序列的变体的工程化T细胞，例如与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的整个长度上具有至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性。

根据本发明的某些实施方案，FoxP3的细胞穿透肽抑制剂是包含氨基酸序列MRDFQSFRKMWPFFAM[SEQ ID NO：3]的多肽或其包含具有至少60％的氨基酸序列的变体。例如，在SEQ ID NO：3的整个长度上与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。因此，根据这些实施方案，外源核酸分子包含编码包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其包含具有至少60％氨基酸序列的变体，例如，在SEQ ID NO：3的整个长度上与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少62.5％，至少75％或至少87.5％的序列同一性被引入T细胞中。在SEQ ID NO：3的整个长度上包含具有至少60％序列的氨基酸序列的多肽可以包含具有一个或多个的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：3相比的两个，三个，四个，五个或六个氨基酸取代。优选地，这种氨基酸替代是一种保守的替代，即一种氨基酸被另一种在大小和化学性质上相似的氨基酸所替代。这种保守的氨基酸替代可能因此对肽结构产生较小的影响，因此可以在不损害功能的情况下耐受。由于遗传密码的退化而编码的任何其他核苷酸序列也编码在SEQ ID NO：3中列出氨基酸序列。

因此，可以获得表达包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽或包含具有至少60％氨基酸序列的变体的工程化T细胞，例如在SEQ ID NO：3的整个长度上与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少62.5％，至少75％或至少87.5％的序列同一性。

在其他方面，本发明提供了适合于在T细胞中表达各种CAR、肽抑制剂FoxP3和内切核酸酶的核酸分子以及包含这种核酸分子的组合物和试剂盒。

因此，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列(所述嵌合抗原受体(CAR)针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原)和编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列。

核酸分子可以是DNA或RNA。在某些实施方案中，核酸分子是DNA。在某些其他实施方案中，核酸分子是RNA分子，特别是编码所述嵌合抗原受体和所述FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的mRNA。根据具体实施方案，编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列通过编码核糖体跳跃序列的核苷酸序列(例如作为编码2A肽的核苷酸序列)彼此有效地连接。这种核糖体跳跃机制在本领域中是公知的，并且已知由几种载体用于表达由单个mRNA编码的几种蛋白质。

根据某些实施方案，核酸是载体，例如病毒载体或质粒。为了允许T细胞表达编码上述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列，与一种或多种适于在T细胞中表达的启动子有效地连接。在某些情况下，可能需要FoxP3的细胞穿透肽抑制剂，只有在嵌合抗原受体识别并结合其特异性抗原时才表达。在这种情况下，FoxP3细胞穿透肽抑制剂的表达较好地受诱导启动子控制，如NFAT最小启动子。

包含一种或多种本文详述的核酸分子的组合物也包括在本发明的范围内。特别地，本发明提供了包含一种或多种核酸分子的组合物，所述核酸分子包含编码针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列；和编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列。根据某些实施方案，提供了一种组合物，其包含核酸分子，所述核酸分子包含编码所述第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列；和编码FoxP3的所述细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列。根据其他某些实施方案，提供了一种组合物，其包含第一核酸分子，所述第一核酸分子包含编码所述第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述第一嵌合抗原受体(CAR)针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原；和第二核酸分子，其包含编码所述FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列。根据具体实施方案，所述组合物可包含另一核酸分子，其包含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体针对在调节性T细胞(Treg)表面表达的至少一种抗原。根据其他具体实施方案，组合物可以包含另外的核酸分子，其包含编码稀切核酸内切酶的核苷酸序列，所述核酸序列能够通过DNA切割选择性地灭活至少一种编码T细胞受体(TCR)的一种组分的基因，和/或包含编码稀切核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够通过DNA切割选择性地使编码表面抗原CD25的基因失活。

组合物包含的核酸分子可以是DNA或RNA。在某些实施方案中，核酸分子是DNA。在某些其他实施方案中，核酸分子是RNA分子。根据某些实施方案，核酸分子或核酸分子是载体，例如病毒载体或质粒。为了使T细胞表达编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和/或编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列，与一种或多种适于在T细胞中表达的启动子有效地连接。

包含一种或多种核酸分子或本文详述的一种或多种组合物的试剂盒也包括在本发明的范围内。

应理解本文给出的细节，特别是关于第一嵌合抗原受体，FoxP3的细胞穿透肽抑制剂，第二嵌合抗原受体，能够通过DNA裂解选择性地灭活至少一个编码T细胞受体(TCR)成分的基因的稀切核酸内切酶，和能够通过DNA裂解选择性地灭活编码表面抗原CD25的基因的稀切核酸内切酶，也适用于本发明的这些方面。

附图说明

图1P60对CART细胞发挥作用模式图

具体实施方式

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：Treg抑制试验

用抗CD3/CD28珠子活化人原代T细胞。在第3天，用编码foxp3抑制肽p60(SEQ IDNO：1)的信使RNA转染它们，所述mRNA与突变的鸡溶菌酶信号肽融合。在第4天，将转染的T细胞与人调节性T细胞(Treg)混合，并根据Collison，L.W等人描述的测定法追踪它们的增殖(In vitro Treg suppression assays,Methods Mol.Biol.,2011,707:21-37)。本实验表明，经p60mRNA转染的T细胞与调节T细胞接触后，增殖速度快于经mock RNA转染的T细胞(打乱的p60-SEQ ID NO:9)。结果表明，p60肽的表达使T细胞能够抵抗Treg的抑制。

实施例2：细胞毒活性试验

用抗CD3/CD28珠子活化人原代T细胞。在第3天，用编码如SEQ ID NO：5所示的嵌合抗原受体抗-CD19的病毒载体以及与突变的鸡溶菌酶融合的Foxp3抑制肽p60(SEQ ID NO：1)转导活化的T细胞。在第5天，根据Yang，Z.Z.等描述的方法测定转导的T细胞在存在或不存在Tregs的情况下针对相关靶细胞系的细胞毒活性。(CD4(+)CD25(+)调节性T细胞在B细胞非霍奇金淋巴瘤(2006，Cancer Res.)中对CD8(+)T细胞功能的衰减)。

实验表明，调节性T细胞通常对CAR+T细胞的细胞毒能力有抑制作用，而T细胞表达的p60肽通过解除这种抑制而恢复细胞毒活性。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技有限公司

<120> P60抑制剂与cart细胞联合应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 1

Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro Phe Phe Ala Met

1 5 10 15

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 3

Met Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro Phe Phe Ala Met

1 5 10 15

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 4

Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gly

Claims (11)

1.一种制备工程T细胞的方法，包括以下步骤:

a)将包含核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入已提供的T细胞，该核苷酸序列编码用于针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)；和

b)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含编码细胞穿透肽抑制剂FoxP3的核苷酸序列。

2.根据权利要求1的方法，其中FoxP3的细胞穿透肽抑制剂是包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽或其包含具有至少60％氨基酸序列的变体，例如，在编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的SEQ ID NO：1序列的整个长度上，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

3.根据权利要求1或2的方法，进一步包括以下步骤:

a)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体；

b)将含有核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入该T细胞，该核苷酸序列编码用于一种罕见切割的内切核酸酶，该内切核酸酶可通过DNA裂解选择性失活T细胞受体(TCR)某一组分的至少一个基因编码；

c)将含有核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入该T细胞，该核苷酸序列编码用于一种罕见切割内切酶，该内切酶可通过DNA裂解表面抗原CD25的基因编码而选择性失活；和/或

d)扩增产生的工程T细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞源自细胞毒性T淋巴细胞。

5.一种工程T细胞，包括：

a)外源核酸分子，其包含编码第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述第一嵌合抗原受体(CAR)针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原；和

b)外源核酸分子，其包含编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列。

6.根据权利要求5的工程化T细胞，其中FoxP3的细胞穿透肽抑制剂是包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽或其包含至少具有氨基酸序列的变体。在SEQ ID NO：1的整个长度上，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有60％，例如至少80％的序列同一性。

7.根据权利要求5或6的工程改造的T细胞，其中所述第一嵌合抗原受体和所述FoxP3的细胞穿透肽抑制剂由所述T细胞表达。

8.工程T细胞根据权利要求5至7的任何一项，进一步包括:

一种外源性核酸分子，由编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列组成，该序列针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一种抗原。

9.根据权利要求8的工程改造的T细胞，其中所述第二嵌合抗原受体由所述T细胞表达。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的工程改造的T细胞，其中所述细胞还包含编码T细胞受体(TCR)的一种组分的至少一种基因的缺失或突变。

11.根据权利要求5-10中任一项的工程改造的T细胞，其用于治疗癌症或病毒感染。

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