CN117858943A - T细胞产品及其用途 - Google Patents
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- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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-
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/53—Liver
Abstract
提供一种用于向受试者施用的T细胞产品及其应用，所述产品包含至少一种异体T细胞，所述异体T细胞表达至少一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。所述T细胞产品可以扩大供体的范围并激活受试者的免疫反应。还提供了所述T细胞产品在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种T细胞产品及其用途。
当今的通用型CART细胞(UCART)的主要设计思路，以杀伤靶细胞为目的。在这个思路下，CART需要在体内长期生存。因而，在UCART的实际应用中，需要同时解决两个主要问题：UCART对接收施用的受试者的机体的杀伤(GVHD)，以及UCART因同种异体反应(alloreaction)而被受试者的机体所排斥。当前的UCART的设计思路主要集中在去除GVHD和同种异体反应上，以避免被机体所排斥的问题，但这样的设计可能会对肿瘤的治疗效率造成影响。
同时需要解决这两个问题，又能够有效改善肿瘤微环境，给当下UCART的细胞治疗带来挑战。
因此，亟待获得可以有效提高治疗效果的新型“通用型”T细胞产品。
发明内容
本申请提供了一种用于向受试者施用的工程化表达至少一种功能分子并极大的降低了GVHD可能性的T细胞产品及其应用。同时，所述T细胞产品中包含至少一种可以产生同种异体免疫反应的异体T细胞，该细胞表达至少一种MHC分子，所述MHC分子可以被受试者的至少一种T细胞识别为外源。在本申请中，所述T细胞产品具有以下特性中的至少一种：(1)对异体T细胞的来源的要求降低甚至没有要求，在某些情况下可以将不同供体来源的异体T细胞混合后使用；(2)对异体T细胞所表达的MHC分子(例如人HLA基因型)的类型的要求降低甚至没有要求；(3)减少了异体T细胞对受试者产生的移植物抗宿主病(GVHD)的风险；(4)特异保留异体T细胞可以引发同种异体反应的功能来有效提高受试者在瘤内的免疫反应(5)特异通过混合多个供体来源的保留了异体T细胞可以引发同种异体反应的功能来更有效提高受试者的免疫反应(例如TH-1免疫反应)；(6)可以进一步表达(例如使用非病毒方法转染后表达)一种或多种所需的蛋白；(7)有效改善受试者的体内肿瘤微环境；(8)可以进行瘤内注射；(9)可以显著降低制备成本。本申请还提供了所述T细 胞产品在制备药物组合物、制备治疗肿瘤的药物和/或改善肿瘤微环境中的用途。
一方面，本申请提供了一种用于向受试者施用的T细胞产品，所述产品包含至少一种异体T细胞，所述异体T细胞表达至少一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子，其中所述受试者的至少一种TCR识别所述MHC分子后引起同种异体反应(alloreaction)。
在某些实施方式中，所述至少一种异体T细胞未经过降低或消除免疫排斥反应的操作。
在某些实施方式中，所述降低或消除免疫排斥反应的操作包括敲除异体T细胞的CD52基因；和/或改变异体T细胞的HLA-Ⅰ分子。
在某些实施方式中，所述至少一种异体T细胞中能够引起受试者同种异体反应的分子未经修饰。
在某些实施方式中，所述能够引起受试者同种异体反应的分子包括所述异体T细胞的MHC分子。
在某些实施方式中，所述受试者包括肿瘤患者。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述异体T细胞来源于与所述受试者不同的来源。
在某些实施方式中，所述异体T细胞来源于与所述受试者不同的两个以上供体。
在某些实施方式中，所述异体T细胞表达一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。
在某些实施方式中，所述异体T细胞表达两种以上被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。
在某些实施方式中，所述MHC分子包括MHC I和/或MHC II。
在某些实施方式中，所述异体T细胞包括辅助性T细胞(Th)和/或杀伤性T细胞(CTL)。
在某些实施方式中，所述受试者的至少一种所述TCR识别所述MHC分子促进所述受试者的TH-1免疫反应。
在某些实施方式中，所述的T细胞产品具有降低所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险的能力。
在某些实施方式中，与未经工程化改造的所述异体T细胞相比，经所述工程化改造的所述异体T细胞降低了所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险。
在某些实施方式中，所述工程化改造包括以下步骤：下调所述异体T细胞中CD3相关 的基因、TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经工程化改造的所述异体T细胞相比，经过所述工程化改造的所述异体T细胞中的CD3相关的基因，TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，所述工程化改造包括基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs、Sleeping beauty转座子系统和Meganucleases。
在某些实施方式中，所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用CRISPR/Cas系统。
在某些实施方式中，所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用靶向所述CD3相关的基因、TRAC基因和/或TRBC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，至少一种所述异体T细胞经修饰后表达抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子。
在某些实施方式中，至少一种所述异体T细胞经修饰后包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。
在某些实施方式中，所述修饰包括向所述异体T细胞转染所述核酸。
在某些实施方式中，所述转染包括病毒转染和/或非病毒转染。
在某些实施方式中，所述非病毒转染使用质粒。
在某些实施方式中，所述质粒为环状质粒或超螺旋质粒。
在某些实施方式中，所述质粒包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。
在某些实施方式中，所述核酸包括ssDNA和/或dsDNA。
在某些实施方式中，所述质粒包括由细菌产生的质粒。
在某些实施方式中，所述质粒包括纳米质粒(Nanoplasmid)和/或微环DNA(minicircle DNA)载体。
在某些实施方式中，所述转染包括稳定转染和/或瞬时转染。
在某些实施方式中，所述瞬时转染包括电转。
在某些实施方式中，所述瞬时转染包括mRNA转染。
在某些实施方式中，所述稳定转染使用转座子系统和/或使用基因编辑敲入。
在某些实施方式中，所述基因编辑的方法选自下组中的一种或多种：CRISPR/Cas系统、 RNA编辑系统ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。
在某些实施方式中，所述转座子系统包括Sleeping beauty转座子系统。
在某些实施方式中，所述质粒在所述基因编辑敲入中作为供体质粒。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约2％(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约5‰(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约1‰(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约2％(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约5‰(w/w)以下。
在某些实施方式中，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约1‰(w/w)以下。
在某些实施方式中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的大小为至少约1Mb。
在某些实施方式中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的大小为至少约10Mb。
在某些实施方式中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段来源于微生物。
在某些实施方式中，所述微生物选自下组中的一种或多种：细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体和螺旋体。
在某些实施方式中，所述微生物包括革兰氏阴性菌。
在某些实施方式中，所述微生物包括大肠杆菌。
在某些实施方式中，所述质粒被脱氧核糖核酸酶(DNase)处理过。
在某些实施方式中，所述DNase能够非特异性地切割线性DNA。
在某些实施方式中，所述DNase为核酸外切酶。
在某些实施方式中，所述处理包括在Mg
2+和Ca
2+的存在下使所述转染混合物与所述DNase接触。
在某些实施方式中，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
在某些实施方式中，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括双特异性抗体。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在某些实施方式中，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。
在某些实施方式中中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合一个或多个肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合GPC3和CD73。
在某些实施方式中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合GPC3和CD147。
在某些实施方式中，所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)。
在某些实施方式中，所述抗原结合结构域选自以下组：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、纳米抗体和其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述铰链区包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DR、CD8、Fc、IgG、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD1。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD27、CD7、PD1、TRAC、TRBC、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、
NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS和CD83的配体。
在某些实施方式中，所述信号传导结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD3ζ、FcRγ (FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、Igα受体、Igβ受体、BLV gp30(bovine leukemia virus gp30)、EBV(Ep-stein-Barr virus)LMP2A、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)PBj14Nef和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
在某些实施方式中，所述细胞因子选自下组：IL-1、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、CXCL1、CD38、CD40、CD69、IgG、IP-10、L-17A、MCP-l和PGE2。
在某些实施方式中，所述趋化因子选自下组：CCL1-CCL28和CXCL1-CXCL17。
在某些实施方式中，至少一种所述异体T细胞经转染后包含至少一种包含所述核酸的质粒。
在某些实施方式中，至少一种所述异体T细胞表达一种嵌合抗原受体(CAR)，或者，表达一种双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在某些实施方式中，至少一种所述异体T细胞表达两种以上蛋白。
在某些实施方式中，编码所述CAR的基因包含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO:11或12所示的序列。
在某些实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，至少两种表达不同种所述嵌合抗原受体(CAR)和/或细胞因子的所述异体T细胞按比例混合。
在某些实施方式中，所述T细胞产品还包含所述受试者自体来源的T细胞。
在某些实施方式中，所述T细胞产品还包含一种或多种其他经修饰的T细胞，所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其引起机体同种异体反应的能力降低。
在某些实施方式中，所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其MHC分子的表达和/或活性降低。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的T细胞产品和药学上可接受的辅料。
在某些实施方式中，所述辅料适用于注射。
在某些实施方式中，所述辅料适用于瘤内注射。
另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含本申请所述的T细胞产品和注射用器材。
另一方面，本申请提供本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解、治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述药物被配制为适于注射。
在某些实施方式中，所述药物被配制为适于瘤内注射。
另一方面，本申请提供一种改善肿瘤微环境的方法，其包含以下步骤：向受试者施用本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供一种预防、缓解、治疗肿瘤的方法，其包含以下步骤：向受试者施用本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒。
在某些实施方式中，所述施用包括注射。
在某些实施方式中，所述施用包括瘤内注射。
在某些实施方式中，所述施用包括一次以上的瘤内注射。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒，其用于预防、缓解、治疗肿瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1B显示的是不同的个体来源的T细胞与特异的一个异体PBMC会产生不同水平的同种异体反应。但多个供体来源混合的本申请所述异体T细胞会保证与所述的特异异体PBMC产生强烈的同种异体反应。
图2显示的是不同供体来源混合的本申请所述异体T细胞能够与异体PBMC产生同种异体反应。
图3显示的是一个或多个供体来源的本申请所述异体T细胞能够表达CAR分子。
图4显示的是本申请所述T细胞可以长期表达CAR分子。
图5A-5B显示的是本申请所述异体T细胞能够同时表达两种以上分子。
图6显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞可同时表达多个分子，并在杀伤肿瘤细胞后，释放除开特异表达的分子外别的细胞因子。
图7A-7F显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞能够特异性杀伤肿瘤细胞。
图8显示的是一个或多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤肿瘤细胞的能力相当。
图9A-9B显示的是一个或多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤肿瘤细胞后的上清，具有相当的募集免疫细胞的能力相当。
图10A-10B显示的是一个或多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤肿瘤细胞后的上清具有激活免疫细胞的能力相当(9A)，激活的PBMC具有杀伤K562细胞的能力。
图11A-11B显示的是多供体来源的经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞表达分子的能力。
图12显示的是经过程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混合物能够有效杀伤肿瘤细胞。
图13显示的是经过A工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混合物的上清，能够协助PBMC有效杀伤肿瘤细胞。
图14显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混合物在杀伤靶细胞后的上清，能够有效地激活T细胞和/或NK细胞。
图15A-15C显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞杀伤肿瘤细胞后的上清能够激活T/NK细胞。
图16显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞能够被靶细胞多次激活扩增、复苏和/或冻存。
图17显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。
图18显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞杀伤肿瘤细胞后的细胞上清液能够By-Stand激活PBMC中的T细胞。
图19显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞在多次激活扩增后，杀伤肿瘤细胞后的细胞上清液能够By-Stand激活PBMC中的NK细胞。
图20显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞能够有效减少体内的肿瘤体积。
图21显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混 合物在杀伤靶细胞后的上清液中表达XCL-1的量上升。
图22显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混合物杀伤靶细胞后的上清液能够有效募集cDC1细胞。
图23显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞的混合物杀伤靶细胞后的上清液能够有效募集T/NK细胞。
图24A显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤靶细胞后的细胞上清液能够By-Stand激活PBMC中的NK细胞。
图24B显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤靶细胞后的细胞上清液能够By-Stand激活PBMC中的T细胞。
图25显示的是经过工程化改造和/或修饰的多个供体来源的本申请所述异体T细胞杀伤靶细胞后的细胞上清液激活的PBMC能够显著提高杀伤K562细胞的效率。
图26显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞能够明显抑制肿瘤的生长的效果。
图27显示的是经过工程化改造和/或修饰的本申请所述异体T细胞通过瘤内多次注射能够有效杀伤体内肿瘤并减少肿瘤体积。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“T细胞产品”通常是指可以向受试者施用的，包含T细胞的治疗用产品。在本申请中，所述T细胞产品可以用于细胞治疗。例如，所述T细胞产品可以包含能够表达有治疗效果的蛋白质(例如，嵌合抗原受体、抗体或其抗原结合蛋白、细胞因子和/或趋化因子)的T细胞。在本申请中，所述T细胞产品可以用于治疗肿瘤。在某些情况下，所述T细胞产品可以通过注射(例如瘤内注射)等给药手段，向受试者施用。在本申请中，所述T细胞产品可以是个性化的，例如可以针对有需要的受试者的实际需求进行设计。
在本申请中，术语“T细胞”通常是指胸腺衍生的细胞。所述T细胞可以参与各种细胞介导的免疫反应。在本申请中，所述T细胞可以包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、不成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。在某些情况下，可以用一些标志物对所述T细胞进行分类。例如，所述T细胞可以包括辅助性T细胞(CD4
+T细 胞)、杀伤性T细胞(CTL；CD8
+T细胞)、CD4
+CD8
+T细胞和/或CD4
-CD8
-T细胞。例如，所述T细胞可以表达以下标志物中的一种或多种：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR。
在本申请中，术语“辅助性T细胞(Th)”通常是指效应T细胞，所述辅助性T细胞的可以促进其它B和T淋巴细胞和/或巨噬细胞的活化和功能。在本申请中，所述辅助细T细胞可以为CD4
+T细胞。所述辅助性T细胞在激活时可以促进机体进行适应性免疫反应。在某些情况下，所述辅助性T细胞可以参与抗原特异性免疫反应。所述辅助性T细胞可以进一步分化为不同的亚群，例如，可以通过不同的转录因子，分泌细胞因子和/或趋化因子。例如，可以招募不同的免疫细胞和/或协调不同的免疫反应机制。所述辅助性T细胞可以包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和/或调节性T细胞(Treg)。
在本申请中，术语“TH-1免疫反应”通常是指Th1细胞参与的免疫反应。Th1细胞可以识别主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子呈递的抗原。Th1细胞可以参与识别和/或清除细胞内的病原体(例如，存在于巨噬细胞中的吞噬小泡内的病原体)。在本申请中，所述TH-1免疫反应可以包括通过Th1细胞(例如通过Th1细胞表面的CD40L与巨噬细胞、B细胞或树突细胞表面表达的CD40发生相互作用)和/或其分泌的物质(例如IFNγ)，活化其他免疫细胞(例如巨噬细胞、B细胞、杀伤性T细胞)的功能(例如杀伤溶解功能)。在本申请中，所述TH-1免疫反应还可以涉及肿瘤的杀伤作用。例如，可以活化杀伤性T细胞，以靶向和杀伤肿瘤细胞；例如，可以增强杀伤性T细胞的存活能力和/或记忆能力。
在本申请中，术语“杀伤性T细胞(CTL)”通常是指CD8
+T细胞。所述杀伤性T细胞参与适应性免疫反应，可以在免疫防御细胞内的病原体和杀伤肿瘤中发挥作用。所述杀伤性T细胞的表面可以表达CD8
+共受体；所述杀伤性T细胞可以对MHC I类分子呈递的抗原进行免疫反应。例如，所述杀伤性T细胞可以结合表达于淋巴细胞和/或受感染的靶细胞上的Fas受体和/或Fas配体而诱导后者凋亡。例如，所述杀伤性T细胞可以产生多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα)。例如，肿瘤微环境中的所述杀伤性T细胞可以通过细胞因子的细胞毒性杀伤肿瘤细胞。在本申请中，所述杀伤性T细胞可以包括Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和/或CD8
+Treg。
在本申请中，术语“异体T细胞”通常是指来自于受试者不同的来源的T细胞。例如，所述异体T细胞可以来源于一个与所述受试者不同的供体。在某些情况下，所述异体T细胞可以来源于两个以上(例如2个、3个、4个或更多)与所述受试者不同的供体。在本申请中，所述异体T细胞可以表达MHC分子。在某些情况下，所述MHC分子中的至少一种可以被所述受试者的至少一种T细胞识别为“外源”(例如，可以被认为不属于所述受试者机体所产 生的)的MHC分子。在本申请中，所述异体T细胞可以为直接从供体中获得的T细胞。在某些情况下，所述异体T细胞可以经过改造。例如，可以通过工程化改造降低所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险的能力。例如，可以通过修饰使所述异体T细胞可以表达至少一种为治疗所述受试者的疾病所需的蛋白质。
在本申请中，术语“受试者”通常是指哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(例如猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者可以包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者可以包括动物疾病模型，例如小鼠模型，和本领域技术人员已知的其它动物模型。在本申请中，有需要的受试者可以包括患者，例如肿瘤患者。
在本申请中，术语“外源”通常是指任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。例如，所述异体T细胞所表达的至少一种MHC分子，可以被所述受试者的指示一种T细胞被识别为是所述外源的(例如，在所述受试者之外所产生的MHC分子)。
在本申请中，术语“MHC分子”通常是指主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)，是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC也可以叫做HLA(human leukocyte antigen，HLA)复合体。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC I类、MHC II类、MHC III类基因，分别编码MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子。在本申请中，所述MHC分子还可以包括那些参与将抗原传递给MHC呈递的蛋白。MHC I类分子可以分布于所述有核细胞的表面。MHC I类分子可以参与向CD8
+T细胞呈递抗原的过程。MHC II类分子可以分布于B细胞、单核-巨噬细胞和树突细胞等抗原呈递细胞的表面。MHC II类分子可以将处理过的抗原片段呈递给CD4
+T细胞。MHC II类分子可能会引起移植排斥反应。
在本申请中，术语“TCR”通常是指T细胞表面的特异性受体。所述T细胞受体是异源二聚体，可以由两个不同的亚基所构成。大部分的T细胞受体(例如，95％及以上，96％及以上，97％及以上等)由α亚基和β亚基构成，每条肽链又可分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞质区等部分。在本申请中，所述TCR可以包括任何TCR或功能性片段，如结合至在MHC分子中结合的特异性抗原性肽，即MHC-肽复合物的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指含有TCR的结构域的部分但结合全长TCR结合的抗原(例如，MHC-肽复合物)的分子。在某些情形下，抗原结合部分可 以含有TCR的可变结构域，如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于结合至特异性MHC-肽复合物的结合位点，如一般而言各链含有3个互补决定区的情况。
在本申请中，术语“供体”通常是指移植物来源的物种。例如，所述供体可以处于死亡状态，所述供体可以处于生存状态。在本申请中，所述供体可以为健康状态的。例如，所述供体可以不患有肿瘤。所述供体可以为哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(例如猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在本申请中，所述受试者和所述供体可以同时为相同的物种，例如，同时为人。例如，所述供体还可以包括与所述受试者在遗传上不相似的供体，与所述受试者交叉配型不相容的供体，和/或与所述受试者交叉配型相容的供体。
在本申请中，术语“同种异体反应(alloreaction)”通常是指由于来源于供体的器官、组织和/或细胞所产生的免疫反应。所述同种异体反应可以包括免疫系统响应于同种抗原或“同种异体抗原”或表达不同HLA单体型的细胞而引起的刺激和反应。在本申请中，所述同种异体反应可以包括来源于供体的器官、组织和/或细胞对受试者引起的刺激和反应；所述同种异体反应液可以包括受试者对来源于供体的器官、组织和/或细胞引起的刺激和反应。例如，所述同种异体反应可以包括移植物抗宿主病(GVHD)。例如，所述同种异体反应可以包括移植排异反应。
在本申请中，术语“移植物抗宿主病(GVHD)”通常是指由于外源的(例如来源于供体的)器官、组织和/或细胞对受试者引起的急性或慢性的免疫反应。例如，从同一物种的其他个体(在某些情况下甚至是HLA匹配的)获得的器官、组织和/或细胞可以使受试者经受所述移植物抗宿主病。所述GVHD可以在受试者的肠表皮和/或肝脏上产生症状。在某些情况下，所述GVHD可以引起皮肤，肝，胃和/或肠的炎症反应。在某些情况下，所述GVHD是慢性的，其常见的症状可以包括皮疹和/或口腔溃疡。所述GVHD目前在很大程度上并不能治愈。
在本申请中，术语“瘤内注射”通常是指直接施用于肿瘤细胞团和/或肿瘤微环境。在本申请中，所述肿瘤微环境可以包括肿瘤形成环境，其可以为肿瘤过程存活、扩展或扩散创造了结构和/或功能环境。肿瘤微环境可以通过细胞、分子、成纤维细胞、细胞外基质和血管构成，它们围绕并喂养形成肿瘤的一个或多个肿瘤细胞。肿瘤微环境中的细胞或组织的实例包括但不限于肿瘤脉管系统，肿瘤浸润淋巴细胞，成纤维细胞网状细胞，内皮祖细胞(EPC)，癌相关成纤维细胞，周细胞，其他基质细胞，细胞外成分基质(ECM)，树突状细 胞，抗原呈递细胞，T细胞，调节性T细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和其他靠近肿瘤的免疫细胞。影响肿瘤微环境的细胞功能的例子可以包括但不限于细胞因子和/或趋化因子的产生，对细胞因子的反应，抗原加工和肽抗原的呈递，白细胞趋化性和迁移的调节，基因表达的调节，补体激活，信号通路的调节，细胞介导的细胞毒性，细胞介导的免疫，体液免疫应答以及其他先天性或适应性免疫应答。测量调节这些细胞功能的效果。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指适合施用于患者、例如人患者的组合物。本申请中的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种本申请的抗体构建体。药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适的制剂。例如，组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指恶变前和恶性癌症。所述肿瘤可以包括原发性肿瘤(例如，其细胞未迁移至对象体内除原始肿瘤的部位以外的部位的那些)和继发性肿瘤(例如，那些因转移，肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的继发部位而引起的肿瘤)，复发性癌症和难治性癌症。所述肿瘤可以包括实体瘤和非实体瘤。
在本申请中，术语“脱氧核糖核酸酶(DNase)”通常是指能够将DNA骨架上的磷酸双酯键切断的酶。所述DNase可以为核酸酶的一种。所述DNase可以(例如在弱碱性条件下)消化双链DNA为脱氧核苷酸。例如，所述DNase可以对环状或超螺旋的核酸分子或其片段(例如闭环的双链DNA和/或超螺旋的DNA)基本上没有活性(例如无法对其进行切断)。例如，所述DNase可以切割线性双链DNA。例如，所述DNase可以为DNA外切酶。例如，所述DNase可以为核酸外切酶V。例如，所述DNase可以为ATP-Dependent DNase，例如可以为Plasmid-Safe
TM ATP-Dependent DNase。
在本申请中，术语“瞬时转染”通常是指通过转染进入细胞的外源基因不被整合到所述细胞的自身基因组中的转染方式。所述瞬时转染可以实现外源基因短期(例如至少约1天、至少约2天)的快速表达。所述瞬时转染所转染进入细胞的外源基因可能随着所述细胞的生长和/或分裂而被逐渐丢失。所述瞬时转染可以具备选自下组的优势：操作简便、试验周期短、表达效率高、安全和无需筛选基因。所述瞬时转染的操作步骤可以为本领域技术人员所知悉。例如，所述瞬时转染可以通过脂质体介导转染法。例如，所述瞬时转染可以包括电穿孔转染法。所述瞬时转染可以使用转染试剂，例如可以使用FuGENE6。
在本申请中，术语“稳定转染”通常是指将外源的核酸分子导入并整合入被转染细胞的基因组中。例如，将所述外源基因整合入被转染细胞的基因组中。
在本申请中，术语“转染混合物”通常是指为进行转染所需的混合物。在本申请中，所述转染混合物可以包括希望引入的一种或多种材料(例如多核苷酸)。例如，所述转染混合物可以包含编码待转染的外源基因的核酸分子。例如，所述转染混合物可以包括包含所述核酸分子的载体。例如，所述转染混合物还可以包括杂质(在某些情况下，所述杂质可以包括核酸分子或其片段)。在本申请中，所述杂质可以包括微生物来源的核酸分子或其片段。所述载体所带有的杂质可以包括所述载体所带有的杂质(例如，与所述载体的骨架同源或异源的核酸分子或其片段)。
在本申请中，术语“核酸分子总含量”通常是指在所述转染混合物中，所有具有核苷酸的物质的总质量。例如，所述具有核苷酸的物质可以包括所述核酸分子或其片段和所述材料。
在本申请中，术语“微生物”通常是指来自古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和/或真核生物域(Eucarya)的真核和原核微生物物种。例如，所述微生物可以包括细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体和/或螺旋体。在本申请中，术语细菌通常是指任何类型的原核生物，包括原核生物界中所有门中的原核生物。所述细菌可以包括球菌、杆菌、螺旋菌、原生质球状体、原生质体。所述细菌可以包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。“革兰氏阴性”和“革兰氏阳性”是指使用革兰氏染色方法的染色样式，其是本领域内熟知的(参见例如Finegold和Martin,DiagnosticMicrobiology(诊断微生物学)，第六版，CV Mosby St.Louis，第13-15页(1982))。
在本申请中，术语“源自微生物的基因组的核酸分子或其片段”通常是指核酸分子或核酸分子的片段，其是来源于所述微生物的基因组的。源自微生物的基因组的信息可以参见A genomic catalog of Earth’s microbiomes，Nature Biotechnology(2020)。
在本申请中，术语“革兰氏阴性菌”通常是指是在革兰氏染色中未保留所使用的初次染料但是被复染剂染色的细菌。因此，革兰氏阴性细菌通常在革兰氏染色方法中呈现红色。所述革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖的含量较低，而脂类的含量较高。例如，所述革兰氏阴性菌的细胞壁可以具有脂多糖层。例如，所述革兰氏阴性菌可以包括大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌和/或类志贺吡邻单胞菌。
在本申请中，术语“大肠杆菌”通常是指Escherichia coli。大肠杆菌属于肠杆菌科埃希氏菌属。
在本申请中，术语“质粒”通常是指包含遗传材料的构建体。所述质粒可以被设计为能够 将遗传材料(例如一个或多个核酸序列)递送入细胞。所述质粒可以包含源自任何来源的单链或双链核酸(例如DNA或RNA)的自主复制序列。所述质粒可以在本申请中与术语“载体”互换使用。所述质粒可以具有不同的构型，例如可以为线性质粒、环状质粒或超螺旋质粒。所述线性质粒可以为线状的DNA分子。所述超螺旋质粒可以包含两条保持完整结构的核酸链(例如可以包含共价闭合环形DNA，cccDNA)，并呈超螺旋的构型。所述环状质粒可以为至少一条核酸链保持完整的环状结构。所述质粒可以是没有被整合入细胞的基因组中的。
在本申请中，术语“基因编辑”通常是指向基因组进行核酸插入、缺失和/或替换的操作。所述基因编辑可以通过同源定向修复(HDR)、非同源末端连接(NHEJ)或单碱基改变来实现。所述基因编辑可以使用本领域技术人员所熟悉的基因编辑工具，例如可以利用锌指核酸酶系统(ZFN)、TALEN系统和/或CRISPR技术。
在本申请中，术语“基因编辑敲入”通常是指一个基因工程过程(例如可以称为knock-in)，该过程涉及在遗传位点中对DNA序列信息进行一对一的替换或插入在内源位点内未发现的序列信息。所述基因编辑敲入可以利用基因同源重组。例如，利用基因同源重组，将外源有功能基因(基因组原先不存在、或已失活的基因)转入细胞并与基因组中的同源序列进行同源重组，使之插入基因组并在细胞内获得表达。例如，所述基因编辑敲入可以使外源基因可以至少部分置换细胞基因组。所述基因编辑敲入可以使用CRISPR技术，实现定点的“靶向敲入”。
在本申请中，术语“转座子系统”通常是指包含能够从供体多核苷酸(例如质粒)中切除且整合到靶点(例如细胞的基因组DNA)的系统。所述多核苷酸可以通过转座酶被整合至靶点。所述转座子系统可以包括转座酶。所述转座酶可以转座并介导转座的功能性核酸-蛋白质复合物。所述转座子系统可以包括转座子末端。所述转座子末端可以为仅展现对于与转座酶或整合酶形成复合物是必要的核苷酸序列。所述转座子末端可以为双链核酸DNA。在某些情况下，所述转座子末端可以在转座反应中，与转座子形成功能性核酸-蛋白质复合物。
在本申请中，术语“纳米质粒”通常是指nanoplasmid，即一个或多个基于脂质的纳米载体、聚合纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树状聚合物、巴克球(buckyball)、纳米线、病毒样颗粒、基于肽或蛋白的颗粒(如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料的组合物(例如，脂质-聚合物纳米颗粒)产生的纳米颗粒。在某些情况下，所述纳米质粒的大小可以为等于或低于约100纳米。
在本申请中，术语“微环DNA载体”通常是指一种亲本质粒(Parental Plasmid，PP)发生位点特异性重组的产物。所述微环DNA载体是一个超螺旋DNA分子。在重组酶的作用下，亲本质粒转变为两个环状DNA，一个含有大量的细菌骨架序列，称为微质粒(Miniplasmid，MP)；另一个则是仅含有目的基因的真核表达框架，即微环DNA(Minicircle，MC)。所述微环DNA载体可以由真核表达盒组成。
在本申请中，术语“抗体”通常是指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋白。抗体可以是来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如kappa(κ)或lambda(λ)的轻链。本申请的抗体可衍生自任何物种。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的某部分，该部分包含氨基酸残基，该氨基酸残基与抗原相互作用并赋予抗体对于抗原的特异性和亲和力。抗原结合片段的实例可包括但不限于Fab，Fab’，F(ab)
2，Fv片段，F(ab’)
2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab')
2”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH
2-VL-连接子-VH-COOH或NH
2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。在本申请中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如CD19)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,Jensen MC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr Opin Immunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。
在本申请中，术语“通用型”通常是指解决了本申请所述移植物抗宿主病(GVHD)问题的细胞。例如，所述通用型T细胞(U-T细胞)可以不引发受试者的移植物抗宿主病(GVHD)。例如，所述通用型T细胞(U-T细胞)可以用于所有的受试者(或host，宿主)。例如，所述通用型T细胞(U-T细胞)可以为相对于所述受试者的异源的T细胞。
在本申请中，术语“双特异性抗体”通常是指一种具有识别一种或多种抗原上的一个以上表位的可变区的抗体。双特异性抗体包括，但不限于，全长抗体、具有两个或更多VL和VH结构域的抗体、抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。在某些情况下，所述双特异性抗体可以识别相同或不同抗原上的两种不同表位。在某些情况下，所述双特异性抗体可以识别两种不同抗原。
在本申请中，术语“抗原结合结构域”通常是指能够与靶抗原结合的结构域。抗原结合结构域可包含能特异性结合抗原的钱和抗原受体及其片段，抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以能够与肿瘤相关抗原结合的结构域，所述肿瘤相关抗原可包括但不限于：CD19、CD20、CD22、CD123、CD33/IL3Ra、CD138、CD33、BCMA、CS1、C-Met、
EGFRvIII、CEA、Her2、GD2、MAG3、GPC3和NY-ESO-1。
在本申请中，术语“BiTE”通常是指双特异性T细胞接合体(engager)。所述BiTE可以为具有两个抗原结合结构域的单个多肽链分子，这两个抗原结合结构域之一与T细胞抗原结合且其第二个与靶细胞表面上存在的抗原结合(可以参见W005/061547；Baeuerle，P等人(2008)“
:A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells Drugs of the Future 33:137-147；或者Bargou等人(2008)“Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody/'Science 321:974-977)。
在本申请中，术语“约”通常是指在本申请涉及的指定值或数值范围30％以内、25％以内、20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内或0.05％以内。在本申请中，当所述“约”至于两个以上数值中的第一个数值以前，其适用于该系列中的每一个数值。
发明详述
T细胞产品和异体T细胞
一方面，本申请提供了一种用于向受试者(例如，有需要的受试者)施用的T细胞产品，所述产品包含至少一种异体T细胞，所述异体T细胞表达至少一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子，其中所述受试者的至少一种所述TCR识别所述MHC分子后引起同种异体反应(alloreaction)。
在本申请中，所述至少一种异体T细胞引起受试者同种异体反应的能力不被清除或降低。例如，在所述T细胞产品中，可包含至少一种保留了引起受试者同种异体反应能力的异体T细胞。
在本申请中，所述至少一种异体T细胞未经过降低或消除免疫排斥反应的操作。
在本申请中，所述降低或消除免疫排斥反应的操作可包括敲除异体T细胞的CD52基因。在本申请中，所述降低或消除免疫排斥反应的操作可包括改变异体T细胞的HLA-Ⅰ分子。
在本申请中，所述至少一种异体T细胞中能够引起受试者同种异体反应的分子未经修饰。
在本申请中，所述能够引起受试者同种异体反应的分子可包括所述异体T细胞的MHC分子。
在本申请中，所述受试者可以包括肿瘤患者。例如，所述肿瘤患者可以通过本申请所述的T细胞产品来治疗肿瘤(例如，遏制肿瘤细胞的增殖，和/或减缓肿瘤的病程)，和/或，缓解肿瘤的症状。例如，本申请所述的T细胞产品可以作为所述受试者所需的细胞治疗产品。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。例如，所述肿瘤可以包括肝癌。
在本申请中，所述T细胞产品也可以包含所述受试者自体来源的T细胞。
在本申请中，所述受试者的T细胞可以包括效应T细胞、原始T细胞、记忆T细胞、辅助性T细胞(Th)和/或杀伤性T细胞(CTL)。
在本申请中，所述受试者的T细胞可以表达TCR。例如，所述T细胞可以表达TCR，所述TCR可以参与识别MHC分子。在某些情况下，所述受试者的T细胞可以具有识别MHC分子的能力。
在本申请中，所述异体T细胞可以来源于与所述受试者不同的来源。在本申请中，所述来源可以包括来源于同一物种的不同个体。例如，所述供体可以为一个健康的人。例如，所述供体可以为一个不患有肿瘤疾病的人。在某些情况下，所述供体可以与所述受试者没有亲缘关系。在某些情况下，所述供体可以与所述受试者的HLA不匹配。例如，所述来源可以包括来源于与所述受试者同一物种的另一个不同的个体。
在本申请中，所述异体T细胞可以来源于与所述受试者不同的两个以上供体。例如，可以来源于与所述受试者同一物种的不同的至少2个、至少3个、至少4个或更多个供体。
在本申请中，所述异体T细胞可以表达一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。在本申请中，所述T细胞产品中对所述异体T细胞的MHC(人HLA)匹配可以没有任何要求。在某些情形下，所述T细胞产品可以对所述异体T细胞的所述供体的MHC(人HLA)匹配情况和/或供体的数量可以没有任何要求。本申请所述的T细胞产品可以扩大所述供体的来源。
在本申请中，所述异体T细胞可以具有选自下组的生物标记(Biomarker)：至多约0.5％(例如，可以为至多约0.4％、至多约0.3％、至多约0.2％、至多约0.1％、至多约0.05％或更低)CD3，约50％-约100％CD8(例如，可以为约50％-约95％、约50％-约90％、约50％-约85％、约50％-约80％、约55％-约100％、约60％-约100％或者约55％-约95％)，以及约0％-约40％CD4(例如，可以为约0％-约40％、约0％-约35％、约0％-约30％、约0％-约25％、约5％-约40％或者约10％-约40％)。在本申请中，所述的比例可以为通过流式细胞术检测得到的比例范围。在本申请中，所述异体T细胞可以基本上不表达CD3。例如，在所述异体T细胞中，可以至多约0.5％(例如，可以为至多约0.4％、至多约0.3％、至多约0.2％、至多约0.1％、至多约0.05％或更低)比例的细胞表达CD3。
在本申请中，所述异体T细胞可以表达两种以上(例如，可以为至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个)被所述受试者的至少一种(例如，可以为至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种)T细胞识别为外源的MHC分子。
在本申请中，所述MHC分子可以包括MHC I和/或MHC II。
在本申请中，所述异体T细胞可以包括效应T细胞、原始T细胞、记忆T细胞、辅助性T细胞(Th)和/或杀伤性T细胞(CTL)。在本申请中，所述异体T细胞可以包括辅助性T细胞(Th)和/或杀伤性T细胞(CTL)。
在本申请中，所述受试者的至少一种所述TCR可以识别所述MHC分子后引起同种异体反应(alloreaction)。例如，所述受试者的至少一种所述TCR可以将所述异体T细胞上的至少一个分子识别为属于本申请所述的“外源”MHC分子。例如，在识别为所述外源后，所述受试者可以因存在所述的外源的MHC分子而产生所述同种异体反应。
在本申请中，所述同种异体反应可以包括所述受试者的免疫反应的激活。例如，所述同 种异体反应可以包括TH-1免疫反应。在本申请中，所述受试者的至少一种所述TCR识别所述MHC分子可以促进所述受试者的TH-1免疫反应。所述TH-1免疫反应可以促进所述受试者中肿瘤细胞的增殖被遏制，和/或肿瘤的病程被减缓。
在本申请中，所述同种异体反应可以包括所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险。例如，所述异体T细胞作为外源的细胞可能具有在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险。然而，所述异体T细胞可以通过改造来降低该风险。
例如，所述的T细胞产品可以具有降低所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险的能力。
在本申请中，与未经工程化改造的所述异体T细胞相比，经所述工程化改造的所述异体T细胞可以降低了所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险。例如，所述工程化改造可以通过破坏所述异体T细胞中TCR的结构和/或活性，降低所述异体T细胞在所述受试者中引起所述GVHD的风险。
在本申请中，所述工程化改造可以包括以下步骤：下调所述异体T细胞中CD3相关的基因、TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性。
在本申请中，所述CD3相关的基因可以包括能够编码选自下组的蛋白质的基因：CD3的γ链、CD3的δ链、CD3的ε链、CD3的ζ链和CD3的η链。
在本申请中，与野生型的所述异体T细胞相比，经过所述工程化改造的所述异体T细胞中的CD3相关的基因，TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性可以被下调。
在本申请中，通过工程化改造所述CD3相关的基因的表达和/或活性，可以阻碍CD3复合体的形成和/或下调CD3复合体的活性。
在本申请中，所述工程化改造可以包括基因突变和/或基因沉默。例如，可以通过基因突变和/或基因沉默(例如可以通过基因编辑)使所述异体T细胞中的CD3相关的基因，TRAC基因和/或TRBC基因的表达被下调。
在本申请中，所述工程化改造可以包括向所述异体T细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs、Sleeping beauty转座子系统和Meganucleases。
在本申请中，所述工程化改造可以使用核酸酶，只要该核酸酶可以实现本申请所述工程化改造即可。
在本申请中，所述工程化改造可以包括向所述异体T细胞施用CRISPR/Cas系统。
在本申请中，所述工程化改造可以包括向所述异体T细胞施用靶向所述CD3相关的基 因、TRAC基因和/或TRBC基因外显子部分的sgRNA。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞可以为通用型T细胞(U-T细胞)。例如，所述异体T细胞可以作为通用型T细胞被适用于向不同的所述有需要的受试者施用。例如，所述异体T细胞可以作为通用型T细胞，来源于不同于所述有需要的受试者的任何其他的来源。在某些情况下，所述异体T细胞可以作为通用型T细胞，进一步被制备为通用型CAR-T细胞。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞经修饰后可以表达抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞经修饰后可以包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。
在本申请中，所述修饰可以包括向所述异体T细胞转染所述核酸。
在本申请中，所述转染可以包括病毒转染和/或非病毒转染。例如，可以使用病毒进行本申请所述的异体T细胞修饰。例如，所述非病毒转染可以使用质粒。
在本申请中，所述质粒可以为环状质粒、超螺旋质粒或线性质粒。例如，所述质粒可以为环状质粒或超螺旋质粒。
在本申请中，所述质粒可以为DNA质粒。例如，所述DNA质粒可以为双链、闭环的DNA分子。例如所述DNA质粒可以为双链、线状的DNA分子。在本申请中，所述质粒可以是人工合成的。
在本申请中，所述质粒可以包括由细菌产生的质粒。在本申请中，所述质粒可以包括纳米质粒(Nanoplasmid)和/或微环DNA(minicircle DNA)载体。
在本申请中，所述质粒可以包括ssDNA和/或dsDNA。在本申请中，所述ssDNA和/或dsDNA可以是人工合成的。
在本申请中，所述质粒可以包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。所述核酸可以包括ssDNA和/或dsDNA。在本申请中，所述核酸分子可以是人工合成的。
在本申请中，所述转染可以包括稳定转染和/或瞬时转染。
在本申请中，所述瞬时转染可以包括电转。例如，所述瞬时转染可以使所述核酸进入所述异体T细胞中而被表达。在本申请中，所述瞬时转染可以包括mRNA转染。例如，所述瞬时转染可以使所述核酸(mRNA)被电转进入所述异体T细胞中而被表达。
在本申请中，所述稳定转染包括使用转座子系统和/或使用基因编辑敲入。
在本申请中，所述基因编辑的方法可以选自下组中的一种或多种：CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。
在本申请中，所述基因编辑的方法可以是本领域技术人员所已知的，只要可以达到基因编辑的目的即可，并不限于具体某种方法。在本申请中，所述基因编辑的方法可以选自下组中的一种或多种：CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。例如，所述基因编辑的方法可以为采用CRISPR/Cas系统。
在本申请中，所述基因编辑可以包括基因编辑敲除和/或基因编辑敲入。例如，所述基因编辑可以包括基因编辑敲入。例如，可以采用CRISPR/Cas系统进行所述基因编辑敲入。
例如，所述CRISPR-CAS系统可以包括一类成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPRs)和一些功能相关蛋白(CRISPR-associated，Cas)。其中所述Cas蛋白编码基因可以包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2。例如，可以为Cas9。所述CRISPR-CAS系统(例如CRISPR/Cas9系统)可以对DNA分子具有靶向的切割特异性。
例如，所述基因编辑敲入可以为使Cas蛋白靶向细胞中特异DNA序列处从而进行DNA序列的插入的过程。所述基因编辑敲入可以为Cas蛋白(例如Cas 9蛋白)介导的使所述供体质粒中的所述待敲入的外源基因与其所靶向的细胞中特异性DNA序列进行同源重组的过程。
在本申请中，所述质粒可以在所述基因编辑敲入中作为供体质粒。例如，所述供体质粒可以为双链DNA或单链DNA。所述供体质粒可以作为HDR修复机制的供体模板。
在本申请中，所述供体质粒可以包含同源臂。例如，所述同源臂可以与待基因编辑敲入的外源基因或其片段的末端同源。例如，所述供体质粒可以包含5'同源臂和/或3'同源臂。例如，所述外源基因的核酸分子或其片段的5’端和/或3’端可以分别与待转染的细胞的组DNA中待敲入的位置的5’端和/或3’端的核酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性的核酸序列。例如，所述同源臂可以为100-1000bp大小。例如，所述同源臂可以为约100bp-1000bp，可以为约150bp-1000bp，可以为约200bp-1000bp，可以为约300bp-1000bp，可以为约400bp-1000bp，可以为约800bp-1000bp。
在本申请中，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片 段的含量可以占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下(例如可以为约10％(w/w)以下、约9％(w/w)以下、约8％(w/w)以下、约7％(w/w)以下、约6％(w/w)以下、约5％(w/w)以下、约4％(w/w)以下、约3％(w/w)以下、约2％(w/w)以下、约1％(w/w)以下、约9‰(w/w)以下、约8‰(w/w)以下、约7‰(w/w)以下、约6‰(w/w)以下、约5‰(w/w)以下、约4‰(w/w)以下、约3‰(w/w)以下、约2‰(w/w)以下、约1‰(w/w)以下、约0.1‰(w/w)以下、约0.01‰(w/w)以下、约0.001‰(w/w)以下或更低)。
在本申请中，所述源自微生物的基因组的核酸分子的片段的大小可以为至少约48kb大小(例如，可以为至少约50kb、至少约100kb、至少约150kb、至少约200kb、至少约250kb、至少约300kb、至少约350kb、至少约400kb、至少约450kb、至少约500kb、至少约600kb、至少约700kb、至少约800kb、至少约900kb、至少约1Mb、至少约2Mb、至少约3Mb、至少约4Mb、至少约5Mb、至少约6Mb、至少约7Mb、至少约8Mb、至少约9Mb、至少约10Mb、至少约20Mb、至少约50Mb、至少约100Mb、至少约200Mb或更大。
在本申请中，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小(例如，可以为至少约50kb、至少约100kb、至少约150kb、至少约200kb、至少约250kb、至少约300kb、至少约350kb、至少约400kb、至少约450kb、至少约500kb、至少约600kb、至少约700kb、至少约800kb、至少约900kb、至少约1Mb、至少约2Mb、至少约3Mb、至少约4Mb、至少约5Mb、至少约6Mb、至少约7Mb、至少约8Mb、至少约9Mb、至少约10Mb、至少约20Mb、至少约50Mb、至少约100Mb、至少约200Mb或更大)的核酸分子或其片段的含量可以占转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下(例如可以为约10％(w/w)以下、约9％(w/w)以下、约8％(w/w)以下、约7％(w/w)以下、约6％(w/w)以下、约5％(w/w)以下、约4％(w/w)以下、约3％(w/w)以下、约2％(w/w)以下、约1％(w/w)以下、约9‰(w/w)以下、约8‰(w/w)以下、约7‰(w/w)以下、约6‰(w/w)以下、约5‰(w/w)以下、约4‰(w/w)以下、约3‰(w/w)以下、约2‰(w/w)以下、约1‰(w/w)以下、约0.1‰(w/w)以下、约0.01‰(w/w)以下、约0.001‰(w/w)以下或更低)。
在本申请中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量可以占转染混合物的核酸分子总含量的约10％以下、约9％以下、约8％以下、约7％以下、约6％以下、约5％以下、约4％以下、约3％以下、约2％以下、约1％以下、约9‰以下、约8‰以下、约‰以下、约6‰以下、约5‰以下、约4‰以下、约3‰以下、约2‰以下、约1‰以下、约0.1‰以下、约0.01‰以下、约0.001‰以下或更低。例如，所述至少48kb大小的核酸分子或其片段的含 量可以占转染混合物的核酸分子总含量的约2％以下；可以占转染混合物的核酸分子总含量的约5‰以下；可以占转染混合物的核酸分子总含量的约1‰以下。
在本申请中，所述至少约48kb大小(例如，可以为至少约50kb、至少约100kb、至少约150kb、至少约200kb、至少约250kb、至少约300kb、至少约350kb、至少约400kb、至少约450kb、至少约500kb、至少约600kb、至少约700kb、至少约800kb、至少约900kb、至少约1Mb、至少约2Mb、至少约3Mb、至少约4Mb、至少约5Mb、至少约6Mb、至少约7Mb、至少约8Mb、至少约9Mb、至少约10Mb、至少约20Mb、至少约50Mb、至少约100Mb、至少约200Mb或更大)的核酸分子或其片段与所述质粒存在于不同的核酸分子中。例如，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段在转染混合物(所述转染混合物可以包含质粒)中游离。例如，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段游离于所述质粒。所述游离可以为分离地，以不依附所述质粒的形式而存在。
在本申请中，所述至少约48kb大小核酸分子或其片段可以来源于微生物。例如，所述微生物可以选自下组中的一种或多种：细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体和螺旋体。
在本申请中，所述微生物可以包括革兰氏阴性菌。例如，所述微生物可以为适于制备载体的骨架载体的微生物。例如，所述微生物可以包括大肠杆菌。
在本申请中，所述质粒(例如线性质粒)可以经(例如脱氧核糖核酸酶，例如外切DNA酶，例如外切DNA酶Exonuclease V)处理后使本申请所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段(例如，可以为线状的核酸分子或其片段)的含量和/或本申请所述源自微生物的基因组的核酸分子或其片段(例如，可以为线状的核酸分子或其片段)的含量满足本申请所述的条件。在本申请中，所述处理可以不影响具有环状结构的核酸分子。
在本申请中，所述质粒可以被脱氧核糖核酸酶(DNase)处理过。例如，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量可以占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％以下。又例如，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量可以占转染混合物的核酸分子总含量的约10％以下。
在本申请中，所述转染混合物中所述核酸分子或其片段的含量可以被降低。在本申请中，所述降低可以指使所述转染混合物中的所述核酸分子或其片段的含量降低至符合本申请所述方法的要求。
在本申请中，所述降低可以包括纯化所述转染混合物。即可以通过所述纯化，使所述转 染混合物中所述核酸分子或其片段的含量降低至符合本申请所述方法的要求。
在本申请中，可以通过所述纯化，去除所述至少约48kb大小核酸分子或其片段；和/或，去除所述源自微生物的基因组的核酸分子或其片段。例如，所述纯化可以包括利用本领域技术人员所熟知的纯化DNA的方法，降低所述转染混合物中所述核酸分子或其片段的含量。在本申请中，所述纯化可以不影响所述质粒的DNA的完整性和/或活性。在本申请中，所述降低可以包括使用选自下组的试剂纯化所述转染混合物：DNA酶、SDS、TX-100、CTAB和氯化铯-溴化乙锭。例如，所述降低可以使用DNA酶。例如，可以使用DNA酶使得所述转染混合物中所述至少约48kb大小核酸分子或其片段的含量降低至符合本申请所述方法的要求；和/或，使得所述源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量降低至符合本申请所述方法的要求。例如，所述DNA酶可以不影响所述环状质粒的DNA的完整性和/或活性。
在本申请中，所述降低可以包括使用选自下组的方法：DNA人工合成本申请所述的质粒和HPLC检测本申请所述的转染混合物。例如，可以根据质粒的核苷酸序列直接进行DNA人工合成，可以使所得到的质粒仅包含该质粒的核苷酸序列。例如，可以根据HPLC检测本申请所述的转染混合物，可以根据HPLC的检测结果，选择所述质粒所对应的特征峰，收集该特征峰所对应的组分，可以使所得到的质粒仅包含该质粒的核苷酸序列。
在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段可以包括双特异性抗体。
在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段可以包括双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在本申请中，所述CAR可以包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。例如，所述CAR可以由抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域组成。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合一个或多个肿瘤相关抗原。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合GPC3和CD73。
在本申请中，所述CAR的抗原结合结构域可以特异性结合GPC3和CD147。
在本申请中，所述抗原结合结构域可以特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)。
在本申请中，所述抗原结合结构域可以选自以下组：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、纳米抗体和其抗原结合片段。
在本申请中，所述铰链区可以包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DR、CD8、Fc、IgG、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD1。
在本申请中，所述跨膜结构域可以包含来自选自下述蛋白的多肽：CD27、CD7、PD1、 TRAC、TRBC、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS和CD83的配体。
在本申请中，所述信号传导结构域可以包含来自选自下述蛋白的多肽：CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、Igα受体、Igβ受体、BLV gp30(bovine leukemia virus gp30)、EBV(Ep-stein-Barr virus)LMP2A、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)PBj14Nef和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
在本申请中，所述细胞因子可以选自下组：IL-1、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、CXCL1、CD38、CD40、CD69、IgG、IP-10、L-17A、MCP-l和PGE2。在某些情况下，所述异体T细胞在与靶细胞(例如肿瘤细胞)共孵育后，可以产生细胞因子(例如IL-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8和/或IL-10)。例如，所述经修饰的异体T细胞可以表达除上述可以自行表达的细胞因子种类以外的细胞因子。
在本申请中，所述趋化因子可以选自下组：CCL1-CCL28和CXCL1-CXCL17。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞经转染后可以表达和/或包含一种嵌合抗原受体(CAR)。在本申请中，至少一种所述异体T细胞经转染后可以表达和/或包含一种双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞经转染后可以包含至少一种(例如，至少1种、至少2种、至少3种或更多种)包含所述核酸的质粒。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞可以表达两种以上蛋白。
在本申请中，至少一种所述异体T细胞经转染后可以表达和/或包含一种嵌合抗原受体，以及一种或多种细胞因子。例如，至少一种所述异体T细胞经转染后可以表达和/或包含一种嵌合抗原受体，以及IL15和IL-21。
例如，编码所述CAR的核酸分子可包含SEQ ID NO.2所示的核酸序列。
例如，编码所述CAR的核酸分子可包含SEQ ID NO.11或12所示的核酸序列。
在本申请中，所述至少一种异体T细胞在所述T细胞产品中的含量可以为约0.5％、约 1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
在本申请中，至少两种表达不同种所述嵌合抗原受体(CAR)和/或细胞因子的所述异体T细胞可以按比例混合。
在某些情况下，根据所述有需要的受试者的治疗目的，所述T细胞产品可以是所述异体T细胞的混合物。例如，一方面，所述异体T细胞可以来源于至少一个所述供体。
例如，另一方面，至少一种所述异体T细胞可以经修饰后表达所述受试者所需的至少一种蛋白质。在某些情况下下，至少一种所述异体T细胞可以经修饰后表达一种蛋白质，例如，可以表达一种嵌合抗原受体。在某些情况下，至少一种所述异体T细胞可以经修饰后使同一种所述异体T细胞表达至少2种(例如至少2种、至少3种、至少4种或更多种)蛋白质。例如，一种所述异体T细胞可以表达一种嵌合抗原受体，同时表达一种细胞因子。又例如，一种所述异体T细胞可以表达一种嵌合抗原受体，同时表达一种细胞因子和一种双特异性抗体。在某些情况下，所述T细胞产品可以包含这些表达不同种类的、不同数量的蛋白质的所述异体T细胞。例如，按照所述受试者的目的，在所述T细胞产品中，可以将这些来源于不同所述供体的、可以表达不同种类的、不同数量的蛋白质的所述异体T细胞，按照一定的比例进行混合。在某些情况下，可以根据所述受试者的目的，“定制”不同种类的、不同来源的所述异体T细胞，并将它们按所需比例进行混合。
在某些情况下，所述异体T细胞为经本申请所述的工程化改造，降低了在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险的能力。在此基础上，至少一种所述异体T细胞可以进一步地经修饰后表达至少一种蛋白质例如，可以表达一种嵌合抗原受体。在所述异体T细胞为通用型T细胞的基础上，在某些情况下，至少一种所述异体T细胞可以经修饰后使同一种所述异体T细胞表达至少2种(例如至少2种、至少3种、至少4种或更多种)蛋白质。例如，一种通用型所述异体T细胞可以表达一种嵌合抗原受体，同时表达一种细胞因子。又例如，一种通用型所述异体T细胞可以表达一种嵌合抗原受体，同时表达一种细胞因子和一种双特异性抗体。在某些情况下，所述T细胞产品可以包含这些表达不同种类的、不同数量的蛋白质的通用型所述异体T细胞。例如，按照所述受试者的目的，在所述T细胞产品中，可以将这些来源于不同所述供体的、可以表达不同种类的、不同数量的蛋白质的通用型所述异体T细胞，按照一定的比例进行混合。在某些情况下，可以根据所述受试者的目的，“定制”不同种类的、不同来源的通用型所述异体T细胞，并将它们按所需比例进行混合。
在某些情况下，可以先把不同供体的来源的所述异体T细胞(例如经本申请所述的工程化改造的异体T细胞)混合，向这些混合后细胞分别转染(例如电转，例如电转mRNA)至少一种编码蛋白质的核酸。例如，可以向这些混合后的细胞转染编码嵌合抗原受体的核酸分子，和/或编码细胞因子的核酸。然后，可以将这些转染后的细胞，根据所述受试者的目的，将它们按所需比例进行混合。
在某些情况下，可以先向所述异体T细胞(例如经本申请所述的工程化改造的异体T细胞)分别转染(例如电转，例如电转mRNA)至少一种编码蛋白质的核酸分子。例如，可以向所述异体T细胞转染编码嵌合抗原受体的核酸分子，和/或编码细胞因子的核酸分子。然后，可以将这些转染后的细胞(例如，可以来源于至少2个供体)，根据所述受试者的目的，将它们按所需比例进行混合。
在本申请中，所述的T细胞产品可以包括所述受试者来源的T细胞(即“自体”T细胞)。在某些情况下，所述受试者来源的T细胞可以经修饰，表达所述受试者所需的至少一种蛋白质(例如，可以表达所述嵌合抗原受体)。
与所述受试者来源的同体T细胞相比，本申请所述的T细胞产品可以在所述受试者中引起更剧烈的免疫反应。
在本申请中，所述T细胞产品的所述异体T细胞经修饰后表达蛋白质的水平可以不因所述异体T细胞的异体来源而受到影响。
在本申请中，所述T细胞产品还可包含其他类型的T细胞。在本申请中，所述T细胞产品也可以包含所述受试者自体来源的T细胞。在本申请中，所述T细胞产品也可以进一步包含一种或多种其他T细胞。例如，所述其他T细胞可以是经修饰的T细胞。例如，所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其引起机体同种异体反应的能力降低。例如，所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其MHC分子的表达和/或活性降低。例如，所述其他T细胞可以是异体的。
例如，所述经修饰的异体T细胞可以包括变异了MHC-Ⅰ的T细胞。例如，所述经修饰的T细胞可以包括MHC-Ⅰ被敲除的T细胞。例如，所述经修饰的T细胞可以包括敲除MHC-Ⅰ，但同时表达HLA-E或HLA-G的T细胞。例如，所述经修饰的T细胞可以包括任何现有技术已知的UCART。例如，所述经修饰的T细胞可以包含敲除CD52基因的T细胞。
药物组合物及应用
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的T细胞产品和药学上可接受的辅料。
在本申请中，所述辅料可以包括载体，例如，所述载体可以包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各类保湿剂、无菌溶液、脂质体。
在本申请中，所述辅料可以适用于注射。
在本申请中，所述辅料可以适用于瘤内注射和/或全身注射。例如，所述辅料可以包括无菌含水或非含水溶液、混悬液、和乳剂。非含水溶剂例如可以为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。
在本申请中，所述辅料可以包括可防腐剂和其他添加剂，例如，抗微生物、抗氧化、鳌合剂和/或惰性气体等。
在本申请中，所述药物组合物的给药剂量可由参与的医生和临床因素来确定。如现有医学技术所公知的，对于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、身体表面积、年龄、给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、综合健康情况、以及同时给药的其他药物。
在某些情况下，所述药物组合物可以包含其他的药物活性成分。所述药物活性成分的种类和/或含量可以根据所述受试者的情况所决定。
另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含本申请所述的T细胞产品和注射用器材。
例如，所述注射用器材可以包括注射器。所述瘤内注射可以先将注射器的针头进入肿瘤外的皮下，然后再进入肿瘤内。所述瘤内注射可以包括多点注射。
另一方面，本申请提供本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解、治疗肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤包括实体瘤。例如，所述肿瘤可以包括肺癌。
在本申请中，所述药物被配制为适于注射。
在本申请中，所述药物被配制为适于瘤内注射。
另一方面，本申请提供一种改善肿瘤微环境的方法，其包含以下步骤：向受试者施用本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供一种预防、缓解、治疗肿瘤的方法，其包含以下步骤：向受试者施用本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本申请所述的试剂盒。
在本申请中，所述施用包括注射。
在本申请中，所述施用包括瘤内注射。
在本申请中，所述施用包括一次以上的瘤内注射。所述瘤内注射的次数可以根据所述受试者的情况而决定。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的T细胞产品、本申请所述的药物组合物和/或本 申请所述的试剂盒，其用于预防、缓解、治疗肿瘤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1工程化改造和修饰异体T细胞可以有效敲除CD3阳性细胞
1.1工程化改造异体T细胞
(1)Dynal beads与CD3阳性细胞在X-vivo15+20U/ml培养液中以1：1的比例激活。收集来源于不同供体(供体1-供体3)的T细胞，分别命名为供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞；其中T细胞收集的步骤为：
(2)激活2-3天后，应用Cas9/CRISPR/sgRNA系统，分别敲除供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞中的CD3(靶向人CD3相关基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且5’端和3’端各有3个硫代和氧甲基修饰，购自金斯瑞生物科技,南京)；
(3)CD3敲除后2天，用CD3
+免疫磁珠(EasySep
TM Human CD3 Positive Selection Kit II((Catalog#17851，购自Stemcell Technologies)对步骤(2)敲除的细胞进一步进行清除CD3阳性细胞的筛选。
在步骤(2)、(3)处理后，分别用细胞流式术检测CD3阳性的细胞比例。结果如表1所示。细胞继续培养5-7天后，可供进一步基因修饰使用。
表1
| 步骤(3)处理后 | |
| 供体1-T细胞 | 0.2 |
| 供体2-T细胞 | 0.3 |
| 供体3-T细胞 | 0.3 |
1.2
mRNA的制备，应用Hiscribe T7 ARCA mRNA kit(NEB,#E20605)及产品所附带的制备程序来实现。将质粒克隆到pcDNA3.1中。质粒的线性化经由XhoI来实现。
将包含编码CAR的核酸分子(mRNA)，利用电转分别转染实施例1.1制备的敲除并清除了CD3阳性细胞的供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞。
其中，CAR靶向GPC3，编码CAR的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将这些经修饰的细胞分别称为D1-T、D2-T和D3-T。
1.3
GPC 3 CAR-2A-IL15-2A-IL21质粒的骨架质粒为pUC57-mini-Amp或pUC57-mini-Kan，克隆入包括编码GPC3 CAR-2A-IL15-2A-IL21的核酸分子(其中编码GPC3 CAR-2A-IL15-2A-IL21的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)。同时，使这些质粒包含与人TRAC基因的部分基因具有同源性的核酸序列。设计靶向人TRAC基因的化学合成的sgRNA(5’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且5’端和3’端各有3个硫代和氧甲基修饰，购自金斯瑞生物科技，南京)。购买的Cas9蛋白来源于义翘神州(货号：40572-A08B)。
使用CRISPR/sgRNA系统，将制备的质粒电转已用Dynal bead激活2-3天的人T细胞，得到3个供体D1，D2，D3敲入GPC-3 CAR-2A-IL15-2A-IL21的CART细胞(D5-CART,D6-CART,D7-CART，其中CD3阳性率如表2中敲入后所示，并冻存。复苏后，用CD3+免疫磁珠(EasySep
TM Human CD3 Positive Selection Kit II((Catalog#17851，购自Stemcell Technologies)对敲入CAR的细胞进一步进行清除CD3阳性细胞的筛选，获得敲入/CD3清除后残余CD3阳性细胞，如表2所示。
表2敲入CAR的三个donor，再进一步清除CD3+T细胞后残留CD3+细胞
实施例2异体T细胞引起同种异体反应
通过使用Calcein-AM标记的、未辐照的、来源于4个不同供体的PBMC来研究异体T细胞的同种异体反应。
2.1
将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T进行辐照(辐照条件为：60Gy X-射线，RS2000 Pro,Rad Source,美国)，并且分别与各自对应来源的同体PBMC(即D1-PBMC、D2-PBMC、D3-PBMC)或异体D4-PBMC共孵育；
此外，将D1-T、D2-T和D3-T进行混合，并且将混合的细胞与D4-PBMC共孵育，以保证最大限度可以产生同种异体反应。
共孵育过夜后，用流式细胞术检测PBMC中T细胞CD69的MFI值。结果如图1A所示(图中以P表示PBMC细胞)。其中D1-P表示来自于供体1的PBMC细胞。D1-T为实施例 1制备的表达GPC3 CAR的来自于供体1的CART细胞。D1-P+D1-T表示将相同数量的D1-T和D1-P混合后所得的结果，并且D1-P+D1-T的总数量与左侧的D1-P的数量相同。同理，D1+D2+D3(1/3)-T表示将相同数量的D1-T、D2-T和D3-T混合后所得的结果，其中三者各占1/3，并且D1+D2+D3(1/3)-T与D4-P的总数量与其左侧的D4-P的数量相同。同理，D1+D2+D3-T表示将D1-T、D2-T和D3-T混合后所得的结果，并且D1+D2+D3-T与D4-P的总数量与其左侧的D4-P的数量相同。图1A中其他横坐标的含义类似。
图1A的结果说明，异体间细胞(例如D1-T+D4-PBMC)相互作用产生的CD69的MFI比同体间细胞(例如D1-T+D1-PBMC)相互作用产生的CD69的MFI显著提高。从这3个不同供体来源的CART细胞的混合物与第4个供体(即相对于这3个供体的异体)的PBMC混育所产生的T/NK细胞激活的程度，能够说明多异体供体来源的CART可以保证以更大地程度产生本申请所述的同种异体反应。
2.2
将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T进行辐照(辐照条件为：60Gy X-射线，RS2000 Pro,Rad Source,美国)，并且分别与各自对应来源的PBMC(即D1-PBMC、D2-PBMC、D3-PBMC)或异体D4-PBMC共孵育；
此外，将D1-T、D2-T和D3-T进行混合，并且将混合的细胞与D4-PBMC共孵育。
共孵育过夜后，用CBA检测细胞培养上清液中的IFN-γ的含量。检测步骤遵照产品附带的流程。结果如图1B所示(图中以P表示PBMC细胞)。图1B中横坐标的含义与图1A相同。
图1B的结果说明，异体间细胞(例如D1-T+D4-PBMC)相互作用产生的IFN-γ的含量比同体间细胞(例如D1-T+D1-PBMC)相互作用产生的IFN-γ的含量显著提高。由于这3个不同供体来源的CART细胞的混合物与第4个供体(即相对于这3个供体的异体)的PBMC混育所产生的IFN-γ表达的显著上调，可见多异体供体来源的CART可以保证以更大地程度产生本申请所述的同种异体反应。
2.3
将实施例1.3制备的D5-CART、D6-CART和D7-CART进行辐照(辐照条件为：60Gy X-射线，RS2000 Pro,Rad Source,美国)，并分别单独或混合后与异体D8-PBMC共孵育过夜来产生异体反应。流式测量D8-PBMC中T细胞CD69MFI。结果如图2所示，结果显示仅仅D8-PBMC时，在D8-PBMC中的T细胞CD69的平均荧光值最低。当D8-PBMC与辐照的D5-CART、D6-CART，D7-CART，或D5-CART+D6-CART+D7-CART过夜孵育，D8-PBMC 的CD69的平均荧光强度都显著增强，意味着异体反应激活了T细胞。
实施例3不同供体来源的T细胞的混合物不影响电转表达分子的能力
3.1
用流式细胞术分别检测实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T，以及D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞中，CAR的表达情况。
结果如图3所示。其中，NoEP作为对照组，表示；没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞。
图3的结果说明，D1-T、D2-T、D3-T以及D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞中表达CAR的量没有明显差别。
3.2用非病毒定位敲入方法实现CAR分子的长期表达
GPC-3 CAR质粒的骨架质粒为pUC57-mini-Amp或pUC57-mini-Kan。克隆入包括编码靶向GPC-3 CAR的核酸分子。同时，使这些质粒包含与人TRAC基因的部分基因具有同源性的核酸序列。设计靶向人TRAC基因的化学合成的sgRNA(5’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且5’端和3’端各有3个硫代和氧甲基修饰，购自金斯瑞生物科技,南京)。购买的Cas9蛋白来源于义翘神州(货号：40572-A08B)。将该质粒称为质粒抗GPC-3CAR质粒，其包含SEQ ID NO.2所示的核酸序列。
将制备的GPC-3CAR质粒电转已用Dynal bead激活2-3天的人T细胞，得到敲入了抗GPC-3 CAR的GPC-3 CART细胞。
该GPC-3 CART细胞可以通过Huh-7靶细胞激活而在体外长期生存大于60天。60天体外扩增后的CART的CAR的表达量如图4所示。
图4的结果说明，GPC-3 CART细胞可在体外培养60天后仍具有很高的表达量。
3.3 T细胞可以同时表达CAR和其它分子
将包含编码CAR的核酸分子(mRNA)和编码细胞因子或趋化因子的核酸分子(mRNA)，均利用电转分别转染Dynal Bead:细胞＝1：1激活5-9天的T细胞。
其中，CAR靶向GPC3，编码CAR的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码细胞因子IL12a的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
编码细胞因子IL12b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
编码细胞因子IL1b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
编码趋化因子CCL5的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
编码趋化因子CXCL10的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
其中，同时表达GPC3 CAR和IL12a、IL12b、IL1b、CCL5和CXCL10的，称为GPC3+细胞因子细胞。
利用流式细胞术检测各细胞中CAR的表达量；用CBA检测各个细胞的培养上清液中，细胞因子或趋化因子的表达量；结果分别如图5A和图5B所示。
图5A，1-3分别表示了：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；实施例1制备的仅电转了GPC3 CAR的T细胞；实施例3制备的GPC3+细胞因子细胞中CAR的表达量。
图5B，1-3分别表示了：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；实施例1制备的仅电转了GPC3 CAR的T细胞；实施例3制备的GPC3+细胞因子细胞的细胞培养上清液中细胞因子的表达量。
3.4
没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；实施例1.2制备的仅电转了GPC3 CAR的T细胞；实施例3制备的GPC3+细胞因子细胞分别与HepG2靶细胞以效靶比为2：1的比例混合孵育。过夜后用CBA检测各个细胞的培养上清液中，细胞因子或趋化因子的表达量；结果如图5所示。图6中，1-3分别表示了：1：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；2：实施例1.2制备的仅电转了GPC3 CAR的T细胞；3：实施例3制备的GPC3+细胞因子细胞。
实施例4检测对肿瘤细胞的特异性杀伤功能
4.1
将包含编码CAR的核酸分子(mRNA)，其中，CAR靶向GPC3，编码CAR的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用电转分别转染以Dynal Bead:细胞＝1：1的比例激活了5-9天的T细胞。将电转的细胞以一定的效靶比分别与靶细胞SK-HEP-1、Huh7或HepG2混合。分别检测他们的杀伤效率并用流式细胞术检测靶细胞表面GPC3的表达情况。
结果分别如图7A-7F所示，其中图7A-7C分别显示了对靶细胞SK-HEP-1、Huh7或HepG2的杀伤效率；图7D-7F分别显示了靶细胞SK-HEP-1、Huh7或HepG2表面GPC3的表达情况。其中1-2分别表示：1：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；2：电转了CAR-mRNA的T细胞。
图7的结果说明，电转获得的CART细胞能够表达CAR从而可以特异性杀伤肿瘤细胞。
4.2不同供体来源的CART细胞或其混合物有相似的靶细胞杀伤功能
分别将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T，以及D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞以 一定的效靶比分别与靶细胞HepG2混合。其中靶细胞HepG2使用Calcein-AM标记。
用流式细胞术检测他们的杀伤效率。
结果如图8所示。图8中，1-5分别表示1：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；2：D1-T；3：D2-T；4：D3-T；5：D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞。
图8的结果说明，电转单一供体来源的异体T细胞和电转多个供体混合来源的异体T细胞可以得到相同的杀伤靶细胞的功能。
实施例5检测杀伤肿瘤细胞后激活免疫反应的能力
5.1募集免疫细胞
分别将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T，以及D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞，对照细胞：没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞；以及阳性对照细胞：电转了过量的GPC3 CAR的T细胞，分别以效靶比6:1与靶细胞HepG2共孵育。
次日收集上清液，将各组的500μL上清液加入Tranwell下室。将新鲜的PBMC用Calcein-AM标记，同时浓度调整为1e7/mL。取100μL加入Tranwell上室，放入培养箱1.5小时候检测下室中受趋化作用流下的细胞数量，并检测各类型百分比。
结果分别如图9A-9B所示，其中1-6分别表示：对照细胞、D1-T、D2-T、D3-T、D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞和阳性对照细胞的结果。
图9的结果显示，将单供体来源的电转获得的CART细胞和多供体混合来源的电转获得的CART细胞与靶细胞共孵育后，杀伤肿瘤细胞后所得的上清液(该上清液中可以包含多种细胞因子)均可以募集免疫细胞，且它们募集免疫细胞的能力相近。
5.2激活免疫细胞能力
同实施例5.1的步骤。
次日收集上清。取2e5 Calcein-AM标记的PBMC细胞分别加入100μL的各组上清液，培养过夜后流式检测PBMC中T细胞及NK细胞CD69平均荧光强度(MFI)。
结果如图10A所示。其中1-5分别表示：对照细胞、D1-T、D2-T、D3-T、D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞。其中对照细胞为没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞。
图10A的结果显示，将单供体来源的电转获得的CART细胞和多供体混合来源的电转获得的CART细胞与靶细胞共孵育后，杀伤肿瘤细胞后所得的上清液(该上清液中可以包含多种细胞因子)均具有相同水平的激活免疫细胞的能力。
5.3杀伤肿瘤细胞
分别将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T，以及D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞， 对照细胞，分别以效靶比6:1与靶细胞HepG2共孵育。过夜后收集上清。其中对照细胞为没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞。
取1.2e6 PBMC细胞分别加入600μL各组中所收集的上清液。培养过夜后，收集PBMC，并用PBMC来进行K562杀伤试验来验证PBMC是否在所收集的上清液中被活化。
结果如图10B所示，其中1-5分别表示：对照细胞、D1-T、D2-T、D3-T、D1-T、D2-T和D3-T的混合细胞。
图10B的结果显示，将单供体来源的电转获得的CART细胞和多供体混合来源的电转获得的CART细胞与靶细胞共孵育后，用杀伤肿瘤细胞后所得的上清液(该上清液中可以包含多种细胞因子)所培养的PBMC，具有相似的杀伤K562的能力，证明这些上清液具用活化PBMC的能力。
实施例6“武装”(Armed)的异体T细胞的制备和特征
6.1制备
将包含编码CAR的核酸分子(mRNA)和编码细胞因子，均利用电转转染实施例1.1制备的敲除CD3的供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞这些细胞的混合物。
其中，CAR靶向GPC3，编码CAR的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码细胞因子IL12a的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
编码细胞因子IL12b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
编码细胞因子IL1b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
编码BiTE的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
将经转染获得后同时表达GPC3 CAR和IL12、IL1b、BiTE的，敲除CD3的细胞，称为GPC3+IL12+IL1b+BiTE-1-T细胞，或者“武装”(Armed)-T细胞。
利用流式细胞术检测实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞，以及实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞中CAR的表达量；结果分别如图11A和图11B所示。其中，图11A中，1-4依次表示对照细胞、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞电转2小时、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞电转1天、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞电转3天后CAR的表达量；图11B中，1-4依次表示对照细胞、实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞电转2小时、实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞电转1天和实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞电转3天后，CAR的表达量。其中对照细胞为没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞。
图11的结果显示，所述“武装”(Armed)-T细胞具有与仅表达GPC3 CAR的细胞具有 相近的表达CAR的能力。
6.2肿瘤杀伤能力
将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞，以及实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞分别以不同的效靶比与Calcein
-AM标记的靶细胞混合孵育，检查靶细胞杀伤情况。
孵育过夜后利用流式细胞术检测靶细胞杀伤程度。结果如图12所示。其中1-6分别表示：对照细胞与靶细胞孵育1天、对照细胞与靶细胞孵育2天、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞与靶细胞孵育1天、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞与靶细胞孵育2天、“武装”(Armed)-T细胞与靶细胞孵育1天“武装”(Armed)-T细胞与靶细胞孵育2天后对靶细胞的杀伤情况。其中对照细胞为没有经过电转的，不包含GPC3 CAR的T细胞。
图12的结果显示，“武装”(Armed)-T细胞具有与非武装的CART相似的体外特异性杀伤肿瘤细胞的能力。
6.3上清中分泌的分子对肿瘤杀伤能力
将实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞，以及实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞培养过夜后的上清液加入PBMC和Calcein
-AM标记的不同效靶比的HepG2靶细胞孵育系统中，检查靶细胞杀伤情况。
流式检测对靶细胞的杀伤效率。结果如图13所示。其中1-4分别表示：对照细胞与靶细胞孵育1天、对照细胞与靶细胞孵育2天、“武装”(Armed)-T细胞与靶细胞孵育1天、“武装”(Armed)-T细胞与靶细胞-孵育2天后对靶细胞的杀伤情况。
图13的结果显示，“武装”(Armed)-T细胞的细胞上清液可以帮助PBMC杀伤靶细胞。其中2天孵育的杀伤能力比1天孵育的杀伤能力强。
6.4激活免疫细胞的能力
将实施例1.1制备的供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞的混合细胞，实施例1.2制备的D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞，以及实施例6.1制备的“武装”(Armed)-T细胞分别以效靶比6:1与靶细胞HepG2孵育过夜。将孵育后收集的细胞上清液100μL与2e5PBMC细胞混合培养。培养过夜后检测PBMC中T细胞和NK细胞CD69的阳性率和MFI。
结果如图14所示。其中1-3分别代表供体1-T细胞、供体2-T细胞和供体3-T细胞的混合细胞、D1-T、D2-T和D3-T细胞的混合细胞、“武装”(Armed)-T细胞表达的CART细胞的结果。图14的结果说明，“武装”(Armed)-T细胞具有更有效激活T细胞和NK细胞的能力。
6.5肿瘤杀伤能力和激活免疫细胞的能力
将包含编码CAR和BiTE的核酸分子(mRNA)(其对应的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，利用电转分别转染以Dynal Bead:细胞＝1：1的比例被激活5-9天的T细胞成为CART及BiTE T。未进行电转的T细胞作为对照细胞。将对照细胞和CART及BiTE T细胞分别以效靶比6:1与靶细胞HepG2孵育。孵育后收集细胞上清液A。
将CART和BiTE T细胞分别单独培养过夜，分别收集对应的上清液B。在共150μL的PBMC和靶细胞以效靶比为15：1的混合细胞中，加入50μL上清液B。孵育过夜后，收集上清液D。
将150μL收集的上清液A和上清液D分别与Calcein-AM标记的2E5PBMC在96孔板中混育。过夜后，用流式检测Calcein-AM标记的PBMC中的T和NK细胞的激活代表分子CD69的阳性率及平均荧光强度MFI。
结果如图15A-15C所示。图14A-14C分别显示了CD69阳性率、CD69MFI和CD69的综合变化(即阳性率与MFI值之积)。其中1-3分别表示对照细胞、CART细胞和BiTE-T细胞所对应的上清的结果。
图15的结果说明，BiTE T有肿瘤细胞杀伤能力的同时，具有更好的By-Stand激活PBMC中T/NK细胞的能力。
实施例7检测冻存和复苏能力
7.1
将制备的GPC 3 CAR质粒(其中编码GPC3 CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，使用CRISPR/sgRNA系统，电转已用Dynal bead激活2-3天的人T细胞，得到敲入抗GPC-3 CAR的CART细胞D1-T、D2-T、D3-T。
用靶细胞HepG2激活该CART细胞。每4-7天刺激一次，刺激后4-7天冻存。
冻存的细胞复苏后检测细胞活率及增殖情况。
结果如图16所示。图16中，1-4分别表示：1：没有使用靶细胞激活的CART细胞；2：使用靶细胞激活1次的CART细胞；3：使用靶细胞激活2次的CART细胞；4：使用靶细胞激活3次的CART细胞。
图16的结果说明，本申请所述的异体T细胞可以经多次激活扩增、复苏和/或冻存。
7.2
用靶细胞HepG2对实施例7.1制备的CART细胞进行刺激(E:T＝2:1)，每4-7天刺激一次，刺激后4-7天冻存。测量细胞杀伤力时，将效应细胞按图中所示的效靶比与靶细胞混合， 孵育过夜后检测杀伤效率。除开特殊说明，细胞都是冻存复苏后的细胞。
结果如图17所示。图17显示了对肿瘤细胞的杀伤效率。图17中，1-8分别表示：1：对照细胞；2：实施例4.1制备的CART细胞；3：没有使用靶细胞激活的CART细胞；4：使用靶细胞激活1次的CART细胞；5：使用靶细胞激活2次的CART细胞；6：使用靶细胞激活3次的CART细胞；7：使用靶细胞激活3次(未冻存)的CART细胞；8：使用靶细胞激活4次(未冻存)的CART细胞。其中，所述对照细胞为没有经过电转，不表达CAR的T细胞。
取上述组1-8中以效靶比2：1与靶细胞混合孵育过夜后收集的上清液。取2e5PBMC细胞分别加入150μL各组上清液，培养过夜后流式检测T细胞及NK细胞平均荧光强度(MFI)。
图18和图19分别显示了对T细胞和NK细胞的激活效果。其中细胞激活用靶细胞HepG2对CART细胞进行刺激(E:T＝2:1)来实现。每4-7天刺激一次，刺激后4-7天冻存。图中1-9分别表示从以下细胞与HepG2靶细胞孵育后的上清液所对应的结果：1：对照细胞；2：实施例4.1制备的CART细胞；3：阳性对照(其为内控阳性对照样品，即分量冻存的CART与靶细胞共孵育后的上清，并被验证能激活PBMC中的T/NK细胞)；4：没有使用靶细胞激活的实施例7.1制备的CART细胞；5：使用靶细胞激活1次的实施例7.1制备的CART细胞；6：使用靶细胞激活2次的实施例7.1制备的CART细胞；7：使用靶细胞激活3次的实施例7.1制备的CART细胞；8：使用靶细胞激活3次(未冻存)的实施例7.1制备的CART细胞；9：使用靶细胞激活4次(未冻存)的实施例7.1制备的CART细胞。其中，所述对照细胞为没有经过电转，不表达CAR的T细胞。
图17-19的结果说明，本申请所述的敲入CAR的异体CART细胞1)有很强地肿瘤杀伤能力和By-Stand激活PBMC中T/NK细胞的能力；2)激活T/NK细胞的能力在靶细胞3次以后开始下降。
实施例8检测对体内肿瘤的杀伤能力
8.1制备CAR-Bite T细胞
将制备的GPC 3 CAR-BITE质粒(其中编码GPC3 CAR-BITE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，使用CRISPR/sgRNA系统，电转已用Dynal bead激活2-3天的人T细胞，得到敲入抗GPC-3CAR-BITE的CAR-BITE细胞。
8.2建立动物模型并检测对体内肿瘤的杀伤能力
使NCG小鼠皮下荷瘤HepG2细胞。肿瘤生长至100mm
3时，随机分组，每组4只老鼠。瘤内注射3e6复苏后的8.1制备的细胞。
检测对体内肿瘤的杀伤能力，结果如图20所示。图20中，1-5分别表示，Mock-CART(抗CD19的CAR T细胞)处理的4只老鼠的肿瘤增长均值，CAR-BiTE T处理的第一只老鼠，CAR-BiTE T处理的第二只老鼠，CAR-BiTE T处理的第三只老鼠，和CAR-BiTE T处理的第四只老鼠的肿瘤体积(mm
3)增长值。
图20的结果说明，本申请所述的异体T细胞可以通过瘤内注射有效地杀伤体内肿瘤并减少肿瘤体积。
实施例9检测杀伤肿瘤后激活免疫反应的能力
9.1靶细胞杀伤后上清液中XCL-1的表达量检测
将实施例1.3制备的3供体CAR-T细胞分别与靶细胞Huh-7共孵育过夜后，收取各自的上清液测量XCL-1。如图21所示，CART对靶细胞杀伤后的上清液中，XCL-1的表达明显高于培养液中的XCL-1的量。
9.2靶细胞杀伤后上清液募集cDC1细胞的效果检测
将实施例1.3制备的3供体CAR-T细胞分别与靶细胞Huh-7共孵育过夜后，收取各自的上清液。将各组的500μL上清液加入Tranwell下室。将去除了CD3和CD14的新鲜PBMC用Calcein-AM标记，同时浓度调整为1e7/mL。取100μL加入Tranwell上室，放入培养箱1.5小时候检测下室中受趋化作用流下的cDC1(XCR 1和CD141双阳性)细胞数量。如图22所示，靶细胞杀伤后的上清液明显募集更多cDC1细胞。
9.3靶细胞杀伤后上清液募集T/NK细胞的效果检测
将实施例1.3制备的3供体CART分别与靶细胞Huh-7共孵育过夜后，收取各自的上清液。将各组的500μL上清液加入Tranwell下室。将新鲜PBMC用Calcein-AM标记，同时浓度调整为1e7/mL。取100μL加入Tranwell上室，放入培养箱1.5小时候检测下室中受趋化作用流下的T/NK细胞数量。如图23所示，每个供体CAR-T细胞对靶细胞杀伤后的上清液能够明显募集更多的T/NK细胞。
9.4靶细胞杀伤后上清液对T/NK细胞的激活功能检测
将实施例1.3制备的3供体CAR-T细胞分别与靶细胞Huh-7和无关靶细胞SK-Hep1共孵育过夜后，收取各自的上清液。取2e5 Calcein-AM标记的PBMC细胞分别加入100μL的各组上清液，培养过夜后流式检测PBMC中T细胞及NK细胞CD69平均荧光强度(MFI)。
结果如图24A和24B所示，与靶细胞Huh-7孵育的上清液使得CD3 T细胞及CD56 NK细胞的CD69MFI升高。
9.5靶细胞杀伤后上清液对PBMC中的免疫细胞的激活效果检测
将实施例1.3制备的3供体CAR-T细胞分别与靶细胞Huh-7和无关靶细胞SK-Hep1共孵育过夜后，收取各自的上清液。将上清液与PBMC孵育过夜后，把收集的PBMC与K562孵育，来验证PBMC是否在所收集的上清液中被活化。如图25所示，CART与Huh-7孵育的上清对K562的杀伤，明显高于CAR-T细胞与无关靶细胞SK-Hep1孵育后的上清。说明靶细胞杀伤后的上清液可以激活PBMC中的免疫细胞。
实施例10检测对体内肿瘤的杀伤能力
10.1
将实施例1.2制备的GPC 3 mRNA-CAR和同时表达IL-12及IL-1b的GPC 3 mRNA-ArmedCAR(其中编码GPC3 CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，电转已用Dynal bead激活的人T细胞，得到敲入抗GPC-3 mRNA-CART和GPC 3 mRNA-Armed-CART细胞。
当NCG小鼠皮下荷瘤HepG2细胞肿瘤生长至100mm
3时，随机分组，每组4只小鼠。周内2次瘤内注射共注射4次3e6复苏后的GPC-3 mRNA-CART和GPC 3 mRNA-Armed-CART细胞。
编码细胞因子IL12a的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
编码细胞因子IL12b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
编码细胞因子IL1b的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
结果如图26所示，图中显示的是四只小鼠肿瘤体积的平均值。结果显示，无关CART对照(抗CD19的CAR T细胞)，GPC-3-mRNA-CART和GPC 3 mRNA-Armed-CART注射后，GPC 3 mRNA-Armed-CART组明显有肿瘤生长的抑瘤药效。
10.2
将实施例1.3制备的GPC 3 CAR-2A-IL15-2A-IL21质粒，使用CRISPR/sgRNA系统，电转已用Dynal bead激活2-3天的人T细胞，得到敲入抗GPC-3 CART细胞。抗GPC-3 CART细胞是由靶细胞Huh-7在效靶比E:T＝2:1下激活扩增而维持的新鲜细胞。其中，CAR靶向GPC3，编码GPC 3 CAR-2A-IL15-2A-IL21的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
当Nude小鼠皮下荷瘤HepG2细胞肿瘤生长至100mm
3时，随机分组，分为CART组，溶剂对照组，延长注射CART组。CART组，瘤内7天内注射一次，共注射5次CART细胞。延长注射CART组，成瘤到700mm
3体积后才开始注射，一周一次，共注射2次。
结果如图27所示，结果统计为4只实验小鼠的肿瘤增长均值。结果显示，本申请所述的相对于有残余免疫功能的Nude鼠的异体CART细胞，虽在鼠中生存时间相对于NCG鼠大 大降低，但仍可以通过瘤内多次注射有效地杀伤体内肿瘤并减少肿瘤体积，期待在其同时提供杀伤肿瘤后释放出的新生抗原。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
Claims (94)
- 用于向受试者施用的T细胞产品，所述产品包含至少一种异体T细胞，所述异体T细胞表达至少一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子，其中所述受试者的至少一种TCR识别所述MHC分子后引起同种异体反应(alloreaction)。
- 根据权利要求1所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞未经过降低或消除免疫排斥反应的操作。
- 根据权利要求2所述的T细胞产品，其中所述降低或消除免疫排斥反应的操作包括敲除异体T细胞的CD52基因；和/或改变异体T细胞的HLA-Ⅰ分子。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞中能够引起受试者同种异体反应的分子未经修饰。
- 根据权利要求4所述的T细胞产品，其中所述能够引起受试者同种异体反应的分子包括所述异体T细胞的MHC分子。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的T细胞产品，其中所述受试者包括肿瘤患者。
- 根据权利要求6所述的T细胞产品，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞来源于与所述受试者不同的来源。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞来源于与所述受试者不同的两个以上供体。
- 根据权利要求1-9中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞表达一种被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。
- 根据权利要求1-10中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞表达两种以上被所述受试者的至少一种T细胞识别为外源的MHC分子。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的T细胞产品，其中所述MHC分子包括MHC I和/或MHC II。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的T细胞产品，其中所述异体T细胞包括辅助性T细胞(Th)和/或杀伤性T细胞(CTL)。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的T细胞产品，其中所述受试者的至少一种所述TCR识别所述MHC分子促进所述受试者的TH-1免疫反应。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的T细胞产品，其具有降低所述异体T细胞在所述受试者中引起移植物抗宿主病(GVHD)的风险的能力。
- 根据权利要求1-15中任一项所述的T细胞产品，其中与未经工程化改造的所述异体T细胞相比，经所述工程化改造的所述异体T细胞降低了所述异体T细胞在所述受试者中引 起移植物抗宿主病(GVHD)的风险。
- 根据权利要求16所述的T细胞产品，其中所述工程化改造包括以下步骤：下调所述异体T细胞中CD3相关的基因、TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性。
- 根据权利要求16-17中任一项所述的T细胞产品，其中与未经工程化改造的所述异体T细胞相比，经过所述工程化改造的所述异体T细胞中的CD3相关的基因，TRAC基因和/或TRBC基因的表达和/或活性被下调。
- 根据权利要求15-17中任一项所述的T细胞产品，其中所述工程化改造包括基因突变和/或基因沉默。
- 根据权利要求16-19中任一项所述的T细胞产品，其中所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs、Sleeping beauty转座子系统和Meganucleases。
- 根据权利要求16-20中任一项所述的T细胞产品，其中所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用CRISPR/Cas系统。
- 根据权利要求16-21中任一项所述的T细胞产品，其中所述工程化改造包括向所述异体T细胞施用靶向所述与CD3相关基因、TRAC基因和/或TRBC基因外显子部分的sgRNA。
- 根据权利要求1-22中任一项所述的T细胞产品，其中至少一种所述异体T细胞经修饰后表达抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子。
- 根据权利要求1-23中任一项所述的T细胞产品，其中至少一种所述异体T细胞经修饰后包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。
- 根据权利要求24所述的T细胞产品，其中所述修饰包括向所述异体T细胞转染所述核酸。
- 根据权利要求25所述的T细胞产品，其中所述转染包括病毒转染和/或非病毒转染。
- 根据权利要求26所述的T细胞产品，其中所述非病毒转染使用质粒。
- 根据权利要求27所述的T细胞产品，其中所述质粒为环状质粒或超螺旋质粒。
- 根据权利要求27-28中任一项所述的T细胞产品，其中所述质粒包含编码抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子和/或趋化因子的核酸。
- 根据权利要求24-29中任一项所述的T细胞产品，其中所述核酸包括ssDNA和/或dsDNA。
- 根据权利要求27-30中任一项所述的T细胞产品，其中所述质粒包括由细菌产生的质粒。
- 根据权利要求27-31中任一项所述的T细胞产品，其中所述质粒包括纳米质粒(Nanoplasmid)和/或微环DNA(minicircle DNA)载体。
- 根据权利要求25-32中任一项所述的T细胞产品，其中所述转染包括稳定转染和/或瞬时转染。
- 根据权利要求33所述的T细胞产品，其中所述瞬时转染包括电转。
- 根据权利要求33-34中任一项所述的T细胞产品，其中所述瞬时转染包括mRNA转染。
- 根据权利要求33-35中任一项所述的T细胞产品，其中所述稳定转染包括使用转座子系统和/或使用基因编辑敲入。
- 根据权利要求36所述的方法，其中所述基因编辑的方法选自下组中的一种或多种：CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。
- 权利要求36-37中任一项所述的T细胞产品，其中所述转座子系统包括Sleeping beauty转座子系统。
- 根据权利要求27-38所述的方法，其中所述质粒在所述基因编辑敲入中作为供体质粒。
- 根据权利要求27-39中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
- 根据权利要求40所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约2％(w/w)以下。
- 根据权利要求40-41中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约5‰(w/w)以下。
- 根据权利要求40-42中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约1‰(w/w)以下。
- 根据权利要求27-43中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
- 根据权利要求44所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约2％(w/w)以下。
- 根据权利要求44-45中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中， 所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约5‰(w/w)以下。
- 根据权利要求44-46中任一项所述的T细胞产品，其中在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约1‰(w/w)以下。
- 根据权利要求44-47中任一项所述的T细胞产品，其中所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的大小为至少约1Mb。
- 根据权利要求44-48中任一项所述的T细胞产品，其中所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的大小为至少约10Mb。
- 根据权利要求44-49中任一项所述的T细胞产品，其中所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段来源于微生物。
- 根据权利要求50所述的T细胞产品，其中所述微生物选自下组中的一种或多种：细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体和螺旋体。
- 根据权利要求50-51中任一项所述的T细胞产品，其中所述微生物包括革兰氏阴性菌。
- 根据权利要求50-52中任一项所述的T细胞产品，其中所述微生物包括大肠杆菌。
- 根据权利要求27-53中任一项所述的T细胞产品，其中所述质粒被脱氧核糖核酸酶(DNase)处理过。
- 根据权利要求54所述的T细胞产品，其中所述DNase能够非特异性地切割线性DNA。
- 根据权利要求54-55中任一项所述的T细胞产品，其中所述DNase为核酸外切酶。
- 根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述处理包括在Mg 2+和Ca 2+的存在下使所述转染混合物与所述DNase接触。
- 根据权利要求57所述的T细胞产品，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，源自微生物的基因组的核酸分子或其片段的含量占所述转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
- 根据权利要求57所述的T细胞产品，经所述DNase处理后，在包含所述质粒的转染混合物中，所述至少约48kb大小的核酸分子或其片段的含量占转染混合物的核酸分子总含量的约10％(w/w)以下。
- 根据权利要求23-59中任一项所述的T细胞产品，其中所述抗体或其抗原结合片段包括双特异性抗体。
- 权利要求23-60中任一项所述的T细胞产品，其中所述抗体或其抗原结合片段包括双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
- 根据权利要求23-61中任一项所述的T细胞产品，其中所述CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。
- 根据权利要求62所述的T细胞产品，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)。
- 根据权利要求63所述的T细胞产品，其中所述抗原结合结构域特异性结合一个或多个肿瘤相关抗原。
- 根据权利要求62-64中任一项所述的T细胞产品，其中所述抗原结合结构域特异性结合GPC3和CD73。
- 根据权利要求62-65中任一项所述的T细胞产品，其中所述抗原结合结构域特异性结合GPC3和CD147。
- 根据权利要求62-66中任一项所述的T细胞产品，其中所述抗原结合结构域选自以下组：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、纳米抗体和其抗原结合片段。
- 根据权利要求62-67中任一项所述的T细胞产品，其中所述铰链区包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DR、CD8、Fc、IgG、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD1。
- 根据权利要求62-68中任一项所述的T细胞产品，其中所述跨膜结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD27、CD7、PD1、TRAC、TRBC、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
- 根据权利要求62-69中任一项所述的T细胞产品，其中所述共刺激结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS和CD83的配体。
- 根据权利要求62-70中任一项所述的T细胞产品，其中所述信号传导结构域包含来自选自下述蛋白的多肽：CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、Igα受体、Igβ受体、BLV gp30(bovine leukemia virus gp30)、EBV(Ep-stein-Barr virus)LMP2A、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)PBj14 Nef和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
- 根据权利要求23-71中任一项所述的T细胞产品，其中所述细胞因子选自下组：IL-1、IL- 7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、CXCL1、CD38、CD40、CD69、IgG、IP-10、L-17A、MCP-l和PGE2。
- 根据权利要求23-72中任一项所述的T细胞产品，其中所述趋化因子选自下组：CCL1-CCL28和CXCL1-CXCL17。
- 根据权利要求24-73中任一项所述的T细胞产品，其中至少一种所述异体T细胞经转染后包含至少一种包含所述核酸的质粒。
- 根据权利要求61-74中任一项所述的T细胞产品，其中至少一种所述异体T细胞表达一种嵌合抗原受体(CAR)，或者，表达一种双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
- 根据权利要求1-75中任一项所述的T细胞产品，其中至少一种所述异体T细胞表达两种以上蛋白。
- 根据权利要求23-76中任一项所述的T细胞产品，其中至少两种表达不同种所述嵌合抗原受体(CAR)和/或细胞因子的所述异体T细胞按比例混合。
- 根据权利要求1-77中任一项所述的T细胞产品，其还包含所述受试者自体来源的T细胞。
- 根据权利要求1-78中任一项所述的T细胞产品，其还包含一种或多种其他经修饰的T细胞，所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其引起机体同种异体反应的能力降低。
- 根据权利要求1-79中任一项所述的T细胞产品，其中所述其他经修饰的T细胞与相应的未经修饰的T细胞相比，其MHC分子的表达和/或活性降低。
- 药物组合物，其包含权利要求1-80中任一项所述的T细胞产品和药学上可接受的辅料。
- 根据权利要求81所述的药物组合物，其中所述辅料适用于注射。
- 根据权利要求81-82中任一项所述的药物组合物，其中所述辅料适用于瘤内注射。
- 试剂盒，其包含权利要求1-80中任一项所述的T细胞产品和注射用器材。
- 权利要求1-80中任一项所述的T细胞产品、权利要求81-83中任一项所述的药物组合物和/或权利要求84所述的试剂盒在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解、治疗肿瘤。
- 根据权利要求85所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
- 根据权利要求85-86中任一项所述的用途，其中所述药物被配制为适于注射。
- 根据权利要求85-87中任一项所述的用途，其中所述药物被配制为适于瘤内注射。
- 改善肿瘤微环境的方法，其包含以下步骤：向受试者施用权利要求1-80中任一项所述的T细胞产品、权利要求81-83中任一项所述的药物组合物和/或权利要求84所述的试剂盒。
- 预防、缓解、治疗肿瘤的方法，其包含以下步骤：向受试者施用权利要求1-80中任一项 所述的T细胞产品、权利要求81-83中任一项所述的药物组合物和/或权利要求84所述的试剂盒。
- 根据权利要求90所述的方法，其中所述施用包括注射。
- 根据权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述施用包括瘤内注射。
- 根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中施用包括一次以上的瘤内注射。
- 权利要求1-80中任一项所述的T细胞产品、权利要求81-83中任一项所述的药物组合物和/或权利要求84所述的试剂盒，其用于预防、缓解、治疗肿瘤。
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