CN111183158A - Nk细胞上的基于脂质的抗原和t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本文呈现了经遗传修饰的NK细胞引发针对被微生物感染的细胞的免疫应答的组合物、方法和用途。在一些实施例中，可以用重组核酸对NK细胞进行遗传修饰，该重组核酸包括编码特异性结合CD1‑脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段的区段和编码细胞内活化结构域的另一个区段、以及那些区段之间的接头。在其他实施例中，可以用重组核酸对NK细胞进行遗传修饰，该重组核酸包括编码α链T细胞受体和β链T细胞受体的区段以及编码CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分的另一个区段。可以向感染了微生物的患者施用该经遗传修饰的NK细胞，以触发对被微生物感染的细胞具有特异性的免疫应答。

Description

NK细胞上的基于脂质的抗原和T细胞受体
本申请要求我们于2017年10月5日提交的具有序列号62/568785的共同未决的美国临时申请的优先权，将该美国临时申请以其全文并入本文。
技术领域
本发明的领域是免疫疗法，尤其是涉及表达嵌合T细胞受体的经修饰的NK细胞，该嵌合T细胞受体特异性识别由微生物产生的脂质抗原与特定CD1蛋白的复合物。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
外来病原体(例如细菌等)侵入宿主生物会典型地触发来自外来病原体的各种脂质抗原(尤其是对外来病原体具有特异性和/或独特的那些)经由CD1受体在宿主抗原呈递细胞表面上的呈递。更具体地，脂质抗原经细胞内加工并与内体中的CD1同种型(CD1a、b、c和d)之一结合，然后被转运至细胞表面。然后，细胞表面上的脂质抗原-CD1受体复合物与T细胞的T细胞受体相互作用，并触发T细胞介导的、针对被外来病原体感染的细胞的免疫应答。
T细胞受体包括两条高度可变的链(例如α链和β链)，这两条链负责识别在细胞表面呈递的抗原。与免疫球蛋白相似，T细胞受体链的高可变性(以及因此的特异性)是通过DNA的体细胞遗传重组来确定的。最近，通过将抗原特异性结合部分移植到信号传导部分上，从而驱动携带CAR的免疫细胞到达靶细胞(例如受感染细胞、癌细胞等)，已开发出经基因工程化的受体，即嵌合抗原受体(CAR)。然而，值得注意的是，这种方法传统上已用于MHC-I和MHC-II呈递的抗原的背景中。
因此，即使已知来自某些病原体的脂质抗原呈递的一些机制和使用经基因工程化的受体靶向特定细胞的多种方法，但仍未充分探索出先天免疫系统对特异性靶向呈递目的脂质抗原的细胞的调节。因此，仍然需要改进的方法和用途，以使用T细胞或抗体的抗原特异性来修饰NK细胞，以使其专门攻击受目的病原体影响的细胞。
发明内容
本发明主题涉及表达嵌合蛋白的经遗传修饰的免疫感受态细胞的各种组合物、方法和用途，该嵌合蛋白包含特异性识别CD1-脂质抗原复合物的细胞外结构域，并且进一步包含触发NK细胞对呈递该CD1-脂质抗原复合物的细胞的免疫应答的活化结构域。
因此，本主题的一个方面包括可以在NK细胞中转录的重组核酸。重组核酸包括编码特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段的第一核酸区段，和编码细胞内活化结构域的第二核酸区段。第一和第二核酸区段与第三核酸区段偶联，该第三核酸区段编码该细胞外单链变体片段和该细胞内活化结构域之间的接头。优选地，第一、第二和第三区段被布置成使得该细胞外单链变体片段、该细胞内活化结构域和该接头形成单个嵌合多肽。在另外的方面中，重组核酸是可以编码至少一个TCRα链和TCRβ链并且还可以另外编码CD3δ和CD3γ的mRNA。
优选地，细胞外单链变体片段包含针对CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。在此类实施例中，还优选的是，重组核酸进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。
在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮(mycoketide)、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
优选地，细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。在一些实施例中，细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分和/或CD28活化结构域的一部分。还优选地，接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
在本发明主题的另一个方面，诸位发明人预期一种用于在感染了产分枝菌酸微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的方法。在此方法中，提供了表达重组蛋白的经遗传修饰的NK细胞。最典型地，经遗传修饰的NK细胞选自或来源于由以下组成的组：aNK、haNK和taNK。重组蛋白具有特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段和细胞内活化结构域。此外，细胞外单链变体片段和细胞内活化结构域与跨膜接头偶联。以有效减少患者体内被微生物感染的细胞数量和/或减少患者体内的微生物数量的剂量和方案向患者施用经遗传修饰的NK细胞而继续该方法。典型地，通过静脉内注射施用经遗传修饰的NK细胞。
优选地，细胞外单链变体片段包含针对CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。在一些实施例中，细胞外单链变体片段进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
优选地，细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。在一些实施例中，细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分和/或CD28活化结构域的一部分。还优选地，接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
本发明主题的仍另一个方面包括可以在NK细胞中转录和/或翻译的重组核酸组合物。重组核酸包括编码α链T细胞受体和β链T细胞受体的第一核酸区段，该α链T细胞受体和β链T细胞受体被第一自切割2A肽序列分开。优选地，α链T细胞受体和β链T细胞受体中的至少一个特异性结合CD1-脂质抗原复合物。重组核酸还可以包括编码CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分的第二核酸区段，该CD3δ的至少一部分和该CD3γ的至少一部分被第二自切割2A肽序列分开。在一些实施例中，第一核酸区段和第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。
优选地，CD3γ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，和/或CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
在本发明主题的仍另一个方面中，预期经遗传修饰的细胞毒性细胞优选地是经遗传修饰的NK细胞。细胞毒性细胞包括编码嵌合蛋白的重组核酸，该嵌合蛋白具有1)特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段，2)细胞内活化结构域，和3)将该细胞外单链变体片段与该细胞内活化结构域偶联的跨膜接头。
优选地，细胞外单链变体片段包含针对CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。在一些实施例中，重组核酸进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。
在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
在一些实施例中，细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。在其他实施例中，细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分和/或CD28活化结构域的一部分。另外，在一些实施例中，接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
在本发明主题的又另一个方面中，预期经遗传修饰的细胞毒性细胞包括编码蛋白复合物的重组核酸，该蛋白复合物具有α链T细胞受体、β链T细胞受体、CD3δ的至少一部分、和CD3γ的至少一部分。优选地，第一核酸区段和第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。
在一些实施例中，CD3γ的一部分和/或CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
在本发明主题的仍另外的方面，诸位发明人预期一种用于在感染了产分枝菌酸微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的方法。在此方法中，提供了表达蛋白复合物的经遗传修饰的NK细胞。蛋白复合物包括至少一个α链T细胞受体、β链T细胞受体、CD3δ的至少一部分、和CD3γ的至少一部分。典型地，经遗传修饰的NK细胞选自和/或来源于由以下组成的组：aNK、haNK和taNK。以有效减少患者体内被微生物感染的细胞数量的剂量和方案向患者施用经遗传修饰的NK细胞而进一步继续该方法。典型地，通过静脉内注射施用经遗传修饰的NK细胞。
优选地，第一核酸区段和第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。还优选地，CD3γ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，和/或CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在一些实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。在其他实施例中，CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。在此类实施例中，预期CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原。另外，在CD1-脂质抗原复合物可包含结核分枝杆菌的脂质抗原的情况下，结核分枝杆菌的脂质抗原可以是分枝菌酸。
此外，诸位发明人还预期上述重组核酸和/或经遗传修饰的细胞毒性细胞用于在感染了微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的用途。
本发明主题的各个目标、特征、方面和优点将根据以下关于优选实施例的详细描述以及附图而变得更清楚。
附图说明
图1说明了在细胞表面上表达的重组嵌合蛋白的三个示例性实施例。
图2说明了编码T细胞受体蛋白复合物的mRNA构建体的示例性实施例，以及CD1-脂质抗原复合物和T细胞受体蛋白复合物之间的相互作用。
图3A显示了描绘表达图1的重组嵌合蛋白的NK细胞针对在其表面上呈递脂质抗原的细胞的细胞毒性的图。
图3B显示了描绘细菌生存力的图，该细菌生存力是表达图3的T细胞受体蛋白复合物的NK细胞的函数。
具体实施方式
诸位发明人现已发现，可以通过遗传修饰免疫感受态细胞(优选细胞毒性免疫感受态细胞(并且特别是NK细胞))，并且将经如此遗传修饰的细胞毒性细胞施用至感染了微生物(该微生物产生可以由CD1分子呈递的脂质抗原)的患者来有效地且特异性地诱导针对受感染细胞的细胞介导的细胞毒性。为此，诸位发明人进一步发现，可以产生各种重组核酸组合物以修饰细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞)，使得这些细胞毒性细胞可以特异性结合受感染细胞，该受感染细胞呈递与其表面上的脂质抗原偶联的CD1配体。值得注意的是，此类经修饰的NK细胞可以像T细胞一样起作用，但可提供NK细胞的细胞毒性。
例如，细胞毒性细胞可以表达重组嵌合蛋白，该重组嵌合蛋白具有与scFv片段融合的胞质尾区和跨膜结构域，该scFv片段具有针对与脂质抗原偶联的CD1受体的选择性亲和力。预期此类经遗传修饰的细胞毒性细胞不仅展示出对微生物感染的细胞的特异性识别，而且展示出在与受感染细胞结合后的特异性活化，该受感染细胞在其表面上呈递脂质抗原。在另外的方面，还预期在肿瘤发生或针对宿主细胞的自身免疫发展之后，经遗传修饰的细胞毒性细胞识别在宿主细胞表面上呈递的脂质抗原。在识别CD1-脂质抗原复合物后，活化的细胞毒性细胞释放出针对受感染细胞、肿瘤细胞或受自身免疫影响的细胞的细胞毒性分子(例如颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素等)，并最终破坏那些细胞。
如本文所用，术语“免疫感受态细胞”是指可以引发任何类型的免疫应答的细胞，该免疫应答包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、T细胞免疫应答、体液免疫等。如本文所用，术语“结合”是指术语以KD等于或小于10-6M或等于或小于10-7M的高亲和力“识别”和/或“检测”两个分子之间的相互作用，并且可以与该术语互换使用。如本文所用，术语“提供(provide)”或“提供(providing)”是指并且包括制造、产生、放置、使得能使用或准备使用的任何行为。
当然，应当注意，本发明主题不限于NK细胞，而是预期了所有合适类型的免疫感受态细胞。最优选地，免疫感受态细胞是细胞毒性免疫细胞，包括自体或异源NK细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、包括NK-92衍生物的经遗传修饰的NK细胞，这些细胞毒性免疫细胞可以被修饰以具有降低或消除的至少一种杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的表达，这将使得此类细胞被组成型地活化(经由缺乏或减少的抑制)。因此，合适的经修饰的细胞可以具有一种或多种经修饰的杀伤细胞免疫球蛋白样受体，其经突变以减少或消除与MHC I类分子的相互作用。当然，应当注意，还可以使一个或多个KIR缺失或抑制其表达(例如，经由miRNA、siRNA等)。最典型地，多于一个KIR将被突变、缺失或沉默，并且特别预期的KIR包括具有两个或三个结构域、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，经修饰的、沉默的或缺失的KIR将包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、和/或KIR3DS1。此类经修饰的细胞可以例如使用本领域熟知的沉默方案、CIRSPR-CAS基因组编辑、或者敲除或敲低方案来制备。可替代地，此类细胞还可以作为aNK细胞(‘活化的自然杀伤细胞)从南圭斯特公司(NantKwest)(参见URL www.nantkwest.com)商购获得。然后可以进一步修饰此类细胞以表达针对宿主生物的NK细胞的一种或多种抑制性受体的一种或多种配体。
此外，经基因工程化的NK细胞还可以是经修饰以表达高亲和力Fcγ受体(例如CD16、V158)的NK-92衍生物。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域中熟知的，并且认为所有产生和表达的方式均适用于本文。据信这种受体的表达允许使用对患者的受感染影响的细胞(例如，通过自身免疫等)、患者的肿瘤细胞(例如，新表位)、具体的肿瘤类型(例如，her2neu、PSA、PSMA等)具有特异性的抗体，或与癌症相关联的抗体(例如，CEA-CAM)来特异性靶向肿瘤细胞。有利地，此类抗体是可商购的并且可以与细胞连同使用(例如，与Fcγ受体结合)。可替代地，此类细胞还可以作为haNK细胞(‘高亲和力自然杀伤细胞)从南圭斯特公司商购获得。然后可以进一步修饰此类细胞以表达针对宿主生物的NK细胞的一种或多种抑制性受体的一种或多种配体。
另外，经基因工程化的NK细胞还可以被基因工程化以表达嵌合T细胞受体。在尤其优选的方面，嵌合T细胞受体将具有scFv部分或其他针对炎症相关肽抗原、肿瘤相关肽抗原、肿瘤特异性肽抗原和癌症新表位具有结合特异性的胞外结构域。如前所述，存在许多基因工程化NK细胞表达这种嵌合T细胞受体的方式，并且认为所有方式均适用于本文。可替代地，此类细胞还可以作为taNK细胞(‘靶标-活化的自然杀伤细胞’)从南圭斯特公司商购获得。然后可以进一步修饰此类细胞以表达针对宿主生物的NK细胞的一种或多种抑制性受体的一种或多种配体。诸位发明人预期，haNK细胞或taNK细胞的使用可提供经遗传修饰的细胞毒性细胞的双重特异性(如下文所述)，以通过识别癌症特异性表位或自身免疫特异性表位并同时识别在那些细胞表面上呈递的脂质抗原来靶向任何癌细胞或受自身免疫影响的细胞。
在本发明主题的一个优选方面中，诸位发明人预期，可以通过将编码重组蛋白的重组核酸组合物引入细胞毒性细胞中，对细胞毒性免疫感受态细胞(例如NK细胞、NKT细胞、经基因工程化的NK细胞(aNK、haNK、taNK等)等)进行遗传修饰以特异性识别与CD1分子偶联的脂质抗原。图1示意性地显示了几种示例性重组蛋白。一般而言，重组蛋白包括细胞外单链变体片段、细胞内活化结构域、以及将该细胞外单链变体片段与该细胞内活化结构域偶联的跨膜接头。优选地，重组蛋白产生自从单个重组核酸翻译的单个嵌合多肽。然而，还预期重组蛋白包含至少两个分别从两个不同的重组核酸翻译的结构域，使得重组蛋白的至少一部分可以经由蛋白质-蛋白质相互作用基序与重组蛋白的其余部分可逆偶联。
因此，在一个优选的实施例中，其中重组蛋白由单个重组核酸编码，该重组核酸包括至少三个核酸区段：第一核酸区段(序列元件)，其编码特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段；第二核酸区段，其编码细胞内活化结构域；和第三核酸区段，其编码该细胞外单链变体片段和该细胞内活化结构域之间的接头。
在这个实施例中，编码细胞外单链变体片段的第一核酸区段包括编码免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的核酸序列。在一个优选的实施例中，编码重链可变区(VH)的核酸序列和编码轻链可变区(VL)的核酸序列被编码短间隔子肽片段(例如，至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸等)的接头序列分开。最典型地，由第一核酸区段编码的细胞外单链变体片段包括一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列决定与CD1-脂质抗原复合物的结合亲和力和/或特异性。因此，VH和VL的核酸序列可根据CD1分子和重组蛋白可靶向的脂质抗原的类型而变化。
预期了鉴定对CD1-脂质抗原复合物具有特异性的VH和VL的核酸序列的任何合适的方法。例如，可以从对CD1-脂质抗原复合物具有已知特异性和结合亲和力的单克隆抗体序列数据库中鉴定VH和VL的核酸序列。可替代地，可以经由候选序列的计算机模拟分析(insilico analysis)(例如，经由IgBLAST序列分析工具等)来鉴定VH和VL的核酸序列。在一些实施例中，可以通过任何合适的体外测定(例如，流式细胞术、SPR测定、动力排除测定(kinetic exclusion assay)等)经由大规模筛选对CD1-脂质抗原复合物具有各种亲和力的肽来鉴定VH和VL的核酸序列。尽管其可以根据CD1和脂质抗原的类型而变化，但优选的是，VH和VL的最佳核酸序列编码对CD1-脂质抗原复合物具有亲和力的细胞外单链变体片段，该亲和力至少为至少等于或小于10-6M、优选至少等于或小于10-7M、更优选至少等于或小于10-8M的KD。可替代地，还可以通过噬菌体淘选或RNA展示，或通过从已知结合CD1-脂质复合物的T细胞(TCR克隆18，如下文进一步更详细描述的)移植识别结构域来获得与CD1-脂质抗原复合物的合成结合物。
尽管优选的是第一核酸区段包括编码每个重链(VH)和轻链(VL)之一的核酸序列，但是还预期在其他实施例中，第一核酸区段包括编码多个重链(VH)和轻链(VL)(例如，两个重链(VH)和轻链(VL))的核酸序列，以生成二价(或甚至多价)单链可变片段(例如，串联单链可变片段)。在这个实施例中，编码每个重链(VH)和轻链(VL)之一的序列可以被线性复制(例如，VH-接头1-VL-接头2-VH-接头3-VL)。预期接头1、2、3的长度可以基本上相似或相同。然而，还预期接头2的长度与接头1和/或接头3的长度基本上不同(例如，更长或更短)。
可替代地，诸位发明人还预期，细胞外单链变体片段可以被T细胞受体的细胞外结构域替换。例如，在一些实施例中，细胞外单链变体片段可以被T细胞受体的α链和/或β链的一部分替换。在其他实施例中，细胞外单链变体片段可以被α链和β链的组合替换。在此类实施例中，可以基于对CD1-脂质抗原复合物的测量的、估计的或预期的亲和力来选择T细胞受体的一个或多个细胞外结构域(尤其是α链和β链的一个或多个高可变区)的核酸序列。尤其优选的是，T细胞受体的细胞外结构域对CD1-脂质抗原复合物的亲和力至少为至少等于或小于10-6M、优选至少等于或小于10-7M、更优选至少等于或小于10-8M的KD。
重组核酸还包括编码重组蛋白的细胞内活化结构域的第二核酸区段(序列元件)。最典型地，细胞内活化结构域包括一个或多个ITAM活化基序(免疫受体酪氨酸活化基序，YxxL/I-X6-8-YXXL/I)，细胞内活化结构域在表达这些基序的细胞中触发信号传导级联。预期了包括一个或多个ITAM活化基序的任何合适的核酸序列。例如，活化结构域的序列可以来源于包括一个或多个ITAM活化基序(例如，杀伤活化受体(KAR)、NKp30、NKp44、和NKp46等的细胞内尾区结构域)的细胞毒性细胞受体(例如，NK细胞受体、NKT细胞受体等)。在另一个实例中，活化结构域的序列可以来源于T细胞抗原受体(例如，CD3δ、CD28等)的尾部部分。在一些实施例中，细胞内活化结构域的核酸序列可以被修饰以添加/去除一个或多个ITAM活化基序，从而调节表达重组蛋白的细胞的细胞毒性。
第一和第二核酸区段典型地经由编码重组蛋白的接头部分的第三核酸区段连接。优选地，重组蛋白的接头部分包括至少一个跨膜结构域。此外，诸位发明人预期，重组蛋白的接头部分进一步包括跨膜结构域和细胞外单链变体片段之间的短肽片段(例如，大小为1-5个氨基酸之间、或3-10个氨基酸之间、或8-20个氨基酸之间、或10-22个氨基酸之间的间隔子)，和/或跨膜结构域和细胞内活化结构域之间的另一个短肽片段。在一些实施例中，跨膜结构域和/或一个或两个短肽片段的核酸序列可以来源于相同或不同的分子，从该相同或不同的分子中获得细胞内活化结构域的序列。
例如，在细胞内活化结构域是CD3δ的一部分的情况下，整个第三核酸区段(编码跨膜结构域和短肽片段两者)可以来源于CD3δ(相同分子)或CD28(不同分子)。在其他实施例中，第三核酸区段是杂合序列，其中该区段的至少一部分来源于与该区段的其余部分不同的分子。在另外的实例中，在细胞内活化结构域是CD3δ的一部分的情况下，跨膜结构域的序列可以来源于CD3δ和连接跨膜结构域的短片段，并且细胞外单链变体片段可以来源于CD28或CD8。
在仍其他预期的实施例中，重组核酸包括编码信号肽的核酸区段，该信号肽将重组蛋白导向细胞表面。预期了任何合适的和/或已知的信号肽(例如，富含亮氨酸的基序等)。优选地，编码细胞外单链变体片段的核酸区段位于编码细胞外单链变体片段的第一核酸区段的上游，使得信号序列可以位于重组蛋白的N-末端。然而，还预期信号肽可以位于重组蛋白的C’末端或位于重组蛋白的中间。
因此，应当理解，可以对重组细胞毒性细胞，尤其是NK细胞进行基因工程化以表达嵌合抗原受体，在该嵌合抗原受体中细胞外识别结构域将识别CD1-脂质抗原复合物，并且该嵌合抗原受体进一步包括跨膜部分和一个或多个细胞内活化结构域。如将容易理解的是，这种嵌合抗原受体可以被构造成第1代、第2代、或第3代CAR，并且将优选地包含特异性识别CD1-脂质复合物的scFv结构域。
典型地，重组核酸还包括控制重组蛋白的表达的序列元件，并且认为所有控制方式均适用于本文。例如，在重组核酸是RNA的情况下，可以通过合适的翻译起始位点(例如，合适的帽结构、起始因子结合位点、内部核糖体进入位点等)和poly A尾(例如，在长度控制稳定性和/或周转的情况下)运用表达控制，而重组DNA表达可经由组成型活性启动子、组织特异性启动子、或诱导型启动子来控制。
关于CD1-脂质抗原复合物，诸位发明人预期，CD1可以是人CD1a、CD1b、CD1c、CD1d同种型中的任一种。此外，预期了尤其且例如在不健康状况下(例如，肿瘤细胞、受自身免疫影响的细胞等)，由外来生物(例如细菌、酵母、真菌、支原体等)产生的任何脂质抗原、营养物质(例如植物性食物、动物性食物等)、或由宿主生物产生的自体脂质。此类脂质抗原包括分枝杆菌磷脂、糖脂、糖鞘脂、分枝菌酸、脂肽、二酰化磺基糖脂、分枝杆菌酮、类异戊二烯、鞘脂(例如aGalCer、硫苷脂、iGb3等)、甘油脂(例如BbGL-2c、Glc-DAG-s2、LysoPC、心磷脂等)、和脂蛋白。例如，当宿主被分枝杆菌(例如结核分枝杆菌，其细胞壁中具有多种脂质组分)感染时，脂质抗原被装载到CD1的一个或多个同种型(CD1a、CD1b或CD1c)上，并且这种CD1-脂质抗原复合物在被感染的细胞表面呈递。虽然并非所有与CD1的同种型相关的脂质抗原都具有足够的免疫原性以引发T细胞介导的免疫应答，但当CD1-脂质抗原复合物(例如CD1b-分枝菌酸复合物)在细胞表面上呈递并被T细胞受体识别时，一些与CD1的同种型相关的脂质抗原(例如分枝菌酸，其包括α-分枝菌酸、甲氧基-分枝菌酸、或酮基-分枝菌酸等)可有效引发T细胞应答。以类似的方式，尽管并非所有的自体脂质都具有免疫原性，但一些肿瘤细胞可产生免疫原性脂质抗原(例如，α-半乳糖基神经酰胺等)，这些免疫原性脂质抗原可以装载到CD1d受体上并在肿瘤细胞表面上呈递。NKT细胞可以识别CD1d-脂质抗原复合物，随后，NKT细胞会触发针对呈递CD1d-脂质抗原复合物的细胞的细胞因子的释放。
另外地或可替代地，诸位发明人预期，还可以通过将编码蛋白复合物的重组核酸组合物引入细胞毒性细胞中，对细胞毒性免疫感受态细胞(例如NK细胞、经基因工程化的NK细胞、NKT细胞等)进行遗传修饰。如图2中所示，并且在一个尤其优选的实施例中，蛋白复合物包括至少一种或多种具有T细胞受体的细胞外结构域的不同的肽，和至少一种或多种具有T细胞共同受体的细胞内结构域的不同的肽。例如，一种优选的蛋白复合物包括T细胞受体α链、T细胞受体β链、CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分。在另一个实例中，蛋白复合物可以包括γ链T细胞受体和δ链T细胞受体，而不是T细胞受体的α链和β链。另外地或可替代地，蛋白复合物还可以包括一个或多个δ-链(其对于细胞毒性细胞或重组细胞而言可以是天然的)。此类核酸可以从识别游离分枝菌酸(GMM(葡萄糖-6-O-单霉菌酸酯)的去糖基化形式)的T细胞克隆的克隆18(克隆18)中分离(参见例如，Nature Communications[自然通讯]第7卷,文章编号：13257(2016)；Nat Immunol.[自然免疫学]2013年7月；14(7):706-713；或RCSB PDB条目4G8E)。
因此，应注意的是，在重组细胞毒性细胞是NK细胞的情况下，T细胞受体α链和β链可以从重组核酸(优选地在单顺反子或多顺反子mRNA中)表达，以形成功能性T细胞受体，该功能性T细胞受体具有(a)在NK细胞中天然表达的CD3δ和CD3ε部分，和(b)将从重组核酸(再次优选地在单顺反子或多顺反子mRNA中)表达的CD3δ和γ部分。图2描绘了两个示例性mRNA构建体，其分别编码(a)TCRα链和β链以及(b)CD3δ和CD3γ。在本发明主题的又另一个方面中，所有四个重组组分也可以从单个mRNA构建体(Trex)表达，该单个mRNA构建体编码分子中的TCRα链和β链以及CD3δ和CD3γ。
尽管可以使用任何合适形式的重组核酸组合物来编码蛋白复合物，但是诸位发明人预期，蛋白复合物可以由包含多个区段的单个核酸编码，每个区段编码不同的肽。因此，在一个优选的实施例中，核酸组合物包括编码两种不同的肽：α链T细胞受体和β链T细胞受体(或可替代地，γ链T细胞受体和δ链T细胞受体)的第一核酸区段，以及编码两种肽：一种类型的T细胞辅助受体(例如CD3δ)的至少一部分和另一种类型的T细胞辅助受体(例如CD3γ)的至少一部分(或可替代地，编码一个或多个δ-链取代CD3δ的一部分或CD3γ的一部分)的第二核酸区段。预期由第一和第二核酸区段编码的每种不同的肽是全长蛋白质(例如，全长α和β链T细胞受体和辅助受体)。然而，还预期由第一和第二核酸区段编码的至少一种或多种不同的肽可以是截短的或全长蛋白质的一部分。
优选地，在一个实施例中(如图2中所示的18A/B)，第一和第二核酸区段是mRNA，其中的每个核酸区段包含mRNA的两个子区段，随后是poly A尾，这两个子区段编码T细胞受体(例如，子区段A是α链T细胞受体的mRNA，子区段B是β链T细胞受体的mRNA等)。进一步优选的是，mRNA的两个子区段被编码一种类型的2A自切割肽(2A)的核酸序列分开。如本文所用，2A自切割肽(2A)是指可以提供翻译效果(称为“终止-继续(stop-go)”或“终止-进行(stop-carry)”)的任何肽序列，使得相同mRNA片段中的两个子区段可以被翻译成两种分开且不同的肽。预期了任何合适类型的2A肽序列，包括猪捷申病毒-1 2A(P2A)、明脉扁刺蛾(thoseaasigna)病毒2A(T2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、口蹄疫病毒2A(F2A)、质型多角体病毒(BmCPV2A)、和软化病病毒(BmIFV 2A)。在一些实施例中，可以在第一和第二核酸区段的两个子区段之间使用相同类型的2A序列(例如，第一核酸片段：α链受体的mRNA-T2A-β链受体的mRNA；第二核酸区段：α链受体的mRNA-T2A-β链受体的mRNA)。在其他实施例中，可以在第一和第二核酸区段的两个子区段之间使用不同类型的2A序列(例如，第一核酸片段：α链受体的mRNA-T2A-β链受体的mRNA；第二核酸区段：α链受体的mRNA-P2A-β链受体的mRNA)。
此外，诸位发明人预期第一和第二核酸区段也可以存在于例如通过2A序列连接的单个核酸(mRNA)中。在这个实施例(如图2中所示的Trex)中，第一和第二核酸区段的子区段可以以任何合适的顺序排列(例如，α链-β链-CD3γ-CD3δ，β链-CD3γ-α链-CD3δ等)，伴有相同或不同2A序列的任何合适的组合(例如，α链-T2A-β链-P2A-CD3γ-F2A-CD3δ，β链-P2A-CD3γ-T2A-α链-F2A-CD3δ等)，随后是在单个mRNA的3’处的poly A尾。
关于第一和第二核酸区段的mRNA序列，优选的是基于靶细胞、抗原、和/或将表达第一和第二核酸区段的细胞的类型来选择mRNA序列。例如，优选的是，由第一核酸区段编码的肽对CD1-脂质抗原复合物具有实际或预测的亲和力，该亲和力至少为至少等于或小于10-6M、优选至少等于或小于10-7M、更优选至少等于或小于10-8M的KD。预期了鉴定对各个CD1-脂质抗原复合物具有高结合亲和力的第一核酸区段序列的任何合适的方法。例如，可以通过任何合适的体外测定(例如，流式细胞术、SPR测定、动力排除测定等)经由大规模筛选对CD1-脂质抗原复合物具有各种亲和力的肽来鉴定第一核酸区段的核酸序列。
通过任何合适的方式，将重组核酸(编码所述重组蛋白或蛋白复合物)引入免疫感受态细胞中，优选细胞毒性免疫细胞，更优选NK细胞、NK(或NK92)细胞衍生物或NKT细胞。优选地，重组核酸可被插入至合适的载体中，以被引入细胞毒性免疫细胞中并在细胞毒性免疫细胞中表达。取决于将重组核酸引入细胞中的方法，合适的载体包括但不限于任何哺乳动物细胞表达载体和病毒载体。可替代地，在一种或多种重组核酸是RNA的情况下，该核酸可以被转染到细胞中。还应该认识到，重组表达的方式不限于特定技术，只要经修饰的细胞能够以组成型或诱导型方式产生嵌合蛋白即可。因此，可以用线性DNA、环状DNA、线性RNA、具有编码嵌合蛋白的序列元件的DNA或RNA病毒等转染细胞。从不同的角度来看，转染可通过弹道法、病毒介导的方法、电穿孔、激光穿孔、脂质转染、基因组编辑、脂质体或聚合物介导的转染、与携带重组核酸的囊泡融合等进行。
例如，可以使用包含聚(β-氨基酯)的纳米颗粒进行转染。预期纳米颗粒适合携带作为纳米颗粒内的货物的多个mRNA分子(编码重组T细胞受体的重组核酸、或其转录物等)，如在Moffett等人,Nature Communications[自然通讯],第8卷,文章编号：389(2017)中示例性示出的，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，纳米颗粒是裸纳米颗粒(例如，无靶向性结构域等)。在其他实施例中，纳米颗粒可包括与细胞特异性分子(例如CD3、CD4等)结合的靶向性结构域(例如抗体、scFv等)，用于将重组核酸靶向递送至特定类型的免疫细胞。
因此，还应当理解，重组核酸可以被整合到基因组中(通过基因组编辑或逆转录病毒转染)，或者可以作为稳定的或瞬时的染色体外单元(其可以具有复制能力)存在。例如，可以将用于转染细胞毒性细胞的重组核酸配置为病毒核酸，并且用于转染细胞的合适的病毒包括腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、细小病毒、披膜病毒、痘病毒、疱疹病毒等。可替代地，重组核酸还可以被配置为染色体外单元(例如，质粒、酵母人工染色体等)，或被配置为适于基因组编辑(例如，适于CRiPR/Cas9、Talen、锌指核酸酶介导的整合)的构建体，或可被配置用于简单转染(例如配置为RNA、DNA(合成的或体外产生的)、PNA等)。因此，还应该注意，可以在体外或体内转染细胞。
关于重组病毒，预期所有已知的制备重组病毒的方式均被认为适用于本文，然而，尤其优选的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。在其他合适的选择中，腺病毒是特别优选的。此外，一般进一步优选的是，病毒是复制缺陷型和非免疫原性病毒，其典型地通过靶向缺失所选病毒蛋白(例如E1、E3蛋白)来实现。此类希望的特性可以通过缺失E2b基因功能来进一步增强，并且如最近报道的那样(例如，J Virol.[病毒学杂志]1998年2月；72(2):926-933)，可以使用经遗传修饰的人293细胞来获得高滴度的重组病毒。最典型地，所希望的核酸序列(用于从病毒感染的细胞表达)在本领域熟知的合适调节元件的控制下。
不希望受任何特定理论的束缚，诸位发明人预期，通过添加针对被微生物感染的细胞或针对表达免疫原性自体脂质的细胞的细胞毒性介导的免疫应答，重组蛋白在细胞毒性细胞(例如，NK细胞、NKT细胞等)中的表达增强了免疫应答。更具体地，当NK细胞表达重组蛋白时，细胞外单链变体片段对CD1-脂质抗原复合物(例如，通过结核分枝杆菌感染得到的CD1b-分枝菌酸)的特异性识别和/或高亲和力结合经由细胞内活化结构域触发信号传导级联，该信号传导级联包括对ITAM序列进行的Src家族激酶介导的酪氨酸磷酸化，随后是酪氨酸激酶Syk和ZAP70与ITAM的结合，以及酪氨酸激酶对衔接子分子进行的一系列磷酸化。从不同的角度来看，可以将T细胞型适应性免疫应答工程化到NK细胞中，从而使NK细胞对携带CD1-亲脂性配体复合物的细胞具有高特异性的细胞毒性。由于NK细胞不仅裂解受感染细胞，而且由于NK细胞中存在的颗粒溶素而表现出抗微生物作用，因此这种反应对于治疗被结核分枝杆菌感染的细胞尤其有利。
诸位发明人还预期，可以将经如此基因工程化的细胞毒性细胞施用至感染了微生物、具有肿瘤、或患有自身免疫性疾病的患者(只要该患者的此类细胞呈递与CD1相关的脂质抗原)。预期可以将经基因工程化的NK细胞配制在任何药学上可接受的载体中(例如，优选配制成无菌注射组合物)，其中细胞滴度为至少1×103个细胞/ml、优选至少1×105个细胞/ml、更优选至少1×106个细胞/ml，并且至少1ml、优选至少5ml、更优选且至少20ml/剂量单位。然而，可替代的配制品也被认为适用于本文，并且本文预期了所有已知的施用途径和方式。如本文所用，术语“施用”经基因工程化的细胞毒性细胞是指直接和间接施用经基因工程化的细胞毒性细胞配制品，其中经基因工程化的细胞毒性细胞的直接施用典型地由医疗保健专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括将经基因工程化的细胞毒性细胞配制品提供给医疗保健专业人员或使医疗保健专业人员可获得该配制品以直接施用(例如，经由注射等)的步骤。
在一些实施例中，经由全身注射施用经基因工程化的细胞毒性细胞配制品，该全身注射包括皮下、皮下注射或静脉内注射。在其他实施例中，在全身注射可能无效的情况下(例如，对于脑肿瘤等)，预期经由肿瘤内注射来施用经基因工程化的细胞毒性细胞配制品。
关于经基因工程化的细胞毒性细胞配制品施用的剂量，预期该剂量可以根据以下而变化：被微生物感染的状态，微生物的类型(例如进展、严重程度等)，自身免疫性疾病的状态，症状，肿瘤类型、大小、位置，患者的健康状况(例如，包括年龄、性别等)以及任何其他相关条件。尽管可以变化，但是可以选择并调节剂量和方案，以使经基因工程化的细胞毒性细胞不会对宿主正常细胞产生任何显著的毒性作用，但足以有效诱导针对受感染细胞或肿瘤的细胞毒性作用，使得感染的微生物数量减少，受感染细胞被杀死/去除，和/或肿瘤细胞的大小减小等。
关于施用方案，预期该方案还可以根据以下而变化：被微生物感染的状态，微生物的类型，自身免疫性疾病的状态，症状，肿瘤类型、大小、位置，患者的健康状况(例如，包括年龄、性别等)以及任何其他相关条件。在一些实施例中，可以每天至少一次或每天两次(每次施用一半剂量)施用单次剂量的经基因工程化的细胞毒性细胞配制品至少一天、至少3天、至少一周、至少2周、至少一个月或任何其他所需方案。在其他实施例中，经基因工程化的细胞毒性细胞配制品的剂量可以在方案期间逐渐增加，或在方案期间逐渐减少。在仍其他实施例中，经基因工程化的细胞毒性细胞配制品的若干系列施用可以分隔一定的间隔时间(例如，每次一个系列施用连续3天，并且间隔7天再每次一个系列施用连续3天等)。
在一些实施例中，经基因工程化的细胞毒性细胞配制品的施用可以分两个或更多个不同阶段：初次施用和加强施用。预期初次施用的剂量高于随后的加强施用(例如，至少20％，优选至少40％，更优选至少60％)。然而，还预期用于初次施用的剂量低于随后的加强施用。另外，在有多次加强施用的情况下，每次加强施用具有不同的剂量(例如，增加的剂量、减少的剂量等)。
在一些实施例中，可以通过受感染细胞或癌细胞的细胞变化来微调并告知经基因工程化的细胞毒性细胞配制品施用的剂量和方案。例如，在向癌症患者施用一个或多个剂量的经基因工程化的细胞毒性细胞配制品后，获得癌组织的小的活检以评估由经基因工程化的细胞毒性细胞配制品诱导的应激引起的任何变化(例如，NKG2D配体的上调、细胞凋亡率等)。可以通过任何合适类型的技术进行细胞变化的评估，这些技术包括免疫组织化学方法(例如荧光标记、原位杂交等)、生物化学方法(例如蛋白质定量、翻译后修饰的鉴定等)或组学分析。基于评估的结果，可以修改经基因工程化的细胞毒性细胞配制品的剂量和/或方案(例如，如果观察到严重的细胞毒性，则降低剂量，等等)。
实例
基于以上和进一步的考虑，诸位发明人因此预期，表达α链T细胞受体、β链T细胞受体、CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分的蛋白复合物的NK细胞增加了特别针对呈递CD1-脂质抗原复合物的细胞的、细胞介导的细胞毒性，具体是在T细胞受体的α链和β链识别脂质CD1复合物的情况下。为此，诸位发明人将克隆18TCR(参见PDB条目4G8E)的α链和β链以及CD3δ和CD3γ克隆到基本上如图2所示的可表达的mRNA构建体中。
图3A显示了一组示例性结果，其中将如上所述表达重组T细胞受体的重组NK细胞与表达CD1d的树突细胞一起孵育。更具体地，对NK细胞进行了基因工程化，使其包括两个不同且分开的核酸区段(18A/B)：编码两种不同的肽(α链T细胞受体和β链T细胞受体)的第一核酸区段，以及编码两种肽(CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分)的第二核酸区段。然后在四种不同的条件下确定含有18A/B的经基因工程化的NK细胞的细胞毒性：使用或不使用分枝菌酸作为脂质抗原，以及两种不同的NK细胞:树突细胞(抗原呈递细胞)的比率(1:1和1:5)。诸位发明人发现，NK细胞对受感染细胞的细胞毒性是特异性且显著增加的(当分枝菌酸作为脂质抗原存在时，增加至少3-5倍)，这证实了经遗传修饰的NK细胞可以有效地用作杂合细胞，这些杂合细胞像T细胞一样识别CD1-脂质抗原复合物，并作为NK细胞毒性细胞引发对呈递CD1-脂质抗原复合物的细胞的细胞毒性。
诸位发明人进一步发现，经基因工程化以包括两个不同且分开的核酸区段(18A/B)的NK细胞可以产生针对被结核分枝杆菌感染的细胞的细胞毒性作用，该细胞毒性作用与经基因工程化以包括单个核酸区段(Trex)(其编码蛋白复合物的所有四个组分)的NK细胞产生的细胞毒性作用一样有效。如图3B中所示，表达18A/B构建体或Trex构建体的NK细胞可以杀死受感染细胞中约70％-80％的细胞内结核分枝杆菌，换句话说，这些细胞在2天内将结核分枝杆菌生存力降低到至少20％-25％。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题不受限制，只是要在所附权利要求书的范围中。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式指代要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。如本文的说明书和贯穿随后的整个权利要求书中所使用，“一个/种(a/an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。在说明书权利要求书涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种某物的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个元素，而不是A加N、或B加N等。

Claims (65)

1.一种重组核酸，该重组核酸包含：
第一核酸区段，其编码特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链体片段；
第二核酸区段，其编码细胞内活化结构域；
第三核酸区段，其编码该细胞外单链变体片段和该细胞内活化结构域之间的接头；并且
其中该第一、第二和第三区段被布置成使得该细胞外单链变体片段、该细胞内活化结构域和该接头形成单个嵌合多肽。
2.如权利要求1所述的重组核酸，其中该细胞外单链变体片段包含针对该CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。
3.如权利要求2所述的重组核酸，其中该细胞外单链变体片段进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。
4.如权利要求1所述的重组核酸，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。
5.如权利要求1所述的重组核酸，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
6.如权利要求5所述的重组核酸，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
7.如权利要求6所述的重组核酸，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
8.如权利要求1所述的重组核酸，其中该细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。
9.如权利要求1所述的重组核酸，其中该细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分。
10.如权利要求1所述的重组核酸，其中该细胞内活化结构域进一步包含CD28活化结构域的一部分。
11.如权利要求1所述的重组核酸，其中该接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
12.一种重组核酸组合物，该重组核酸组合物包含：
第一核酸区段，其编码α链T细胞受体和β链T细胞受体，该α链和β链受体被第一自切割2A肽序列分开；
第二核酸区段，其编码CD3δ的至少一部分和CD3γ的至少一部分，该CD3δ的至少一部分和该CD3γ的至少一部分被第二自切割2A肽序列分开；并且
其中该α链T细胞受体和该β链T细胞受体中的至少一个特异性结合CD1-脂质抗原复合物。
13.如权利要求12所述的重组核酸组合物，其中该第一核酸区段和该第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。
14.如权利要求12所述的重组核酸组合物，其中该CD3γ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
15.如权利要求12所述的重组核酸组合物，其中该CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
16.如权利要求12所述的重组核酸组合物，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。
17.如权利要求12所述的重组核酸，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
18.如权利要求17所述的重组核酸，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
19.如权利要求18所述的重组核酸，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
20.一种在感染了产分枝菌酸微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的方法，该方法包括：
提供表达重组蛋白的经遗传修饰的NK细胞，该重组蛋白包含：
特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段，
细胞内活化结构域，
将该细胞外单链变体片段与该细胞内活化结构域偶联的跨膜接头；以及
以有效减少患者体内被该微生物感染的细胞数量的剂量和方案向患者施用该经遗传修饰的NK细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中该经遗传修饰的NK细胞来源于由以下组成的组：aNK、haNK和taNK。
22.如权利要求20所述的方法，其中该细胞外单链变体片段包含针对该CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。
23.如权利要求22中任一项所述的方法，其中该细胞外单链变体片段进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。
24.如权利要求20所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。
25.如权利要求20所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
26.如权利要求20所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
27.如权利要求26所述的方法，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
28.如权利要求20所述的方法，其中该细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。
29.如权利要求20所述的方法，其中该细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分。
30.如权利要求20所述的方法，其中该细胞内活化结构域进一步包含CD28活化结构域的一部分。
31.如权利要求20所述的方法，其中该接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
32.如权利要求20所述的方法，其中通过静脉内注射施用该经遗传修饰的NK细胞。
33.一种在感染了产分枝菌酸微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的方法，该方法包括：
提供表达蛋白复合物的经遗传修饰的NK细胞，该蛋白复合物包含：
α链T细胞受体、β链T细胞受体、CD3δ的至少一部分、和CD3γ的至少一部分；
以有效减少患者体内被该微生物感染的细胞数量的剂量和方案向患者施用该经遗传修饰的NK细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中该第一核酸区段和该第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。
35.如权利要求33所述的方法，其中该CD3γ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
36.如权利要求33所述的方法，其中该CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
37.如权利要求33所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。
38.如权利要求33所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
39.如权利要求38所述的方法，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
40.如权利要求39所述的方法，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
41.如权利要求33所述的方法，其中该经遗传修饰的NK细胞来源于由以下组成的组：aNK、haNK和taNK。
42.如权利要求33所述的方法，其中通过静脉内注射施用该经遗传修饰的NK细胞。
43.一种经遗传修饰的细胞毒性细胞，该经遗传修饰的细胞毒性细胞包含编码嵌合蛋白的重组核酸，该嵌合蛋白具有1)特异性结合CD1-脂质抗原复合物的细胞外单链变体片段，2)细胞内活化结构域，和3)将该细胞外单链变体片段与该细胞内活化结构域偶联的跨膜接头。
44.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该细胞外单链变体片段包含针对该CD1-脂质抗原复合物的单克隆抗体的VL结构域和VH结构域。
45.如权利要求44所述的细胞毒性细胞，其中该细胞外单链变体片段进一步包含VL结构域和VH结构域之间的间隔子。
46.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c。
47.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
48.如权利要求47所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
49.如权利要求48所述的细胞毒性细胞，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
50.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该细胞内活化结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，该免疫受体酪氨酸活化基序触发自然杀伤细胞中ITAM介导的信号传导。
51.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该细胞内活化结构域包含CD3δ的一部分。
52.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该细胞内活化结构域进一步包含CD28活化结构域的一部分。
53.如权利要求43所述的细胞毒性细胞，其中该接头包含CD28跨膜结构域或CD3δ跨膜结构域。
54.一种经遗传修饰的细胞毒性细胞，该经遗传修饰的细胞毒性细胞包含编码蛋白复合物的重组核酸，该蛋白复合物具有α链T细胞受体、β链T细胞受体、CD3δ的至少一部分、和CD3γ的至少一部分。
55.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该第一核酸区段和该第二核酸区段被第三自切割2A肽序列分开。
56.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该CD3γ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
57.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该CD3δ的一部分包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
58.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d。
59.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含以下中的至少一种：分枝杆菌磷脂、糖脂、分枝菌酸、脂肽、分枝杆菌酮、以及类异戊二烯。
60.如权利要求54所述的细胞毒性细胞，其中该CD1-脂质抗原复合物包含结核分枝杆菌的脂质抗原。
61.如权利要求60所述的细胞毒性细胞，其中该结核分枝杆菌的脂质抗原是分枝菌酸。
62.如前述权利要求1-11中任一项所述的重组核酸用于在感染了微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的用途。
63.如前述权利要求43-53中任一项所述的经遗传修饰的细胞毒性细胞用于在感染了微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的用途。
64.如前述权利要求12-19中任一项所述的重组核酸用于在感染了微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的用途。
65.如前述权利要求54-61中任一项所述的经遗传修饰的细胞毒性细胞用于在感染了微生物的患者中诱导NK细胞免疫应答的用途。
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