CN103146645B - 诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导间充质干细胞（MSCs）成为软骨细胞的方法，包括的步骤有：获取MSCs和软骨细胞；将软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；将MSCs接种于插入式细胞培养皿中，再将所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养。该诱导方法能使得MSCs与软骨细胞可以模拟体内环境而发生协同作用，使得诱导MSCs分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子的协同作用，从而显著缩短诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞增殖率，并且同时提高了诱导分化后细胞的II型胶原的表达率与表达量和糖胺聚糖（GAG）的分泌量。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。
背景技术
目前修复软骨组织的传统方法是采用自体软骨细胞，此法必须在关节镜下切取非负重区的关节软骨，对其中的软骨细胞进行扩增，这种手术唯一的优点为无抗原性，但造成机体损伤很大。另外软骨组织中绝大部分为基质，软骨细胞数量少且难分离，体外传代次数有限，一般最多培养3～4代，所以难以获得大量细胞。
当前，骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞普遍采取高密度聚团诱导。该方法一般将扩增后的细胞离心成细胞团，再用成软骨细胞诱导培养基进行微团诱导。但是成软骨细胞诱导需要大量的骨髓间充质干细胞，为了获得大量的骨髓间充质干细胞，必须在体外进行长时间的传代培养，而随着细胞培养时间的延长，干细胞的多向分化潜能会出现程序性丢失，消化过程中使用的胰酶也会导致细胞活性的降低。
间充质干细胞（MSCs）是成体干细胞的一种，它具有多向分化潜能，为类风湿性关节炎，骨关节炎及先天性软骨发育不良等疾病的细胞治疗开辟了一条新的途径。并且最新研究表明，MSCs可以作用于抑制患者自身的炎症反应，以及缓解一些退行性疾病的症状。
目前采用MSCs分化成软骨细胞的方法一般是将MSCs培养至传代的MSCs后，再在含有定向诱导为软骨细胞的因子的培养基中进行诱导培养，将MSCs诱导成软骨细胞。但是由于MSCs的定向诱导分化受很多不同信号通路的影响，而且诱导培养MSCs的细胞微环境变化对于MSCs诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响。因此。导致现有的MSCs分化成软骨细胞的方法所需周期都较长，通常需要2-4周，并且诱导后II型胶原的表达效率较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种诱导时间短、诱导后II型胶原的表达效率高的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：
获取间充质干细胞和软骨细胞；
将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；
将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养；其中，所述软骨细胞诱导分化培养基中含有2×10-7～5×10-7mol/L的甲状旁腺激素相关蛋白1-34。
上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法采用插入式培养皿共同培养软骨细胞和间充质干细胞，使两种细胞可以模拟体内环境而发生协同作用，利用诱导MSCs分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子的协同作用，从而显著的缩短了诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞增殖率，并且同时提高了诱导分化后细胞的II型胶原的表达率与表达量，诱导分化后细胞的糖胺聚糖（GAG）的分泌也得到了明显提高。另外，MSCs与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长，有效的避免两细胞间的交叉污染，保证两细胞的纯度，从而利用MSCs的诱导和软骨细胞的增值。
附图说明
图1是本发明实施例诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法工艺流程示意图；
图2是本发明实施例1的步骤S11中分离培养的MSCs的流式检测结果分析图；其中，图2A为传代培MSCs的CD29、CD34、CD44和CD45表达率柱状图，图2B为MSCs的CD29表达率图，图2C为MSCs的CD34表达率图，图2D为MSCs的CD44表达率图，图2E为MSCs的CD45表达率图；
图3是本发明实施例1与对比实例1中MSCs诱导分化为软骨细胞中的阳性表达II型胶原细胞的流式检测图；其中，图3A为实施例1与对比实例1分别诱导第5和第8天时，MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原的细胞所占比率的柱状图；图3B为实施例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3C为对比实例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3D为实施例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图;图3E为对比实例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；
图4是本发明实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后以及对比实例2中的MSCs中的阳性表达II型胶原的细胞的荧光表达测定结果图；
图5是本发明实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后以及对比实例2中的MSCs不诱导进行培养5天和8天后定量统计阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值柱状图；其中，图5A为实施例1、对比实例1和对比实例2在第5天时阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值柱状图，图5B为实施例1、对比实例1和对比实例2在第8天时阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值柱状图；
图6是本发明实施例1、对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞增殖率图；
图7是本发明实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后以及对比实例2中的MSCs不诱导进行培养5天和8天后软骨细胞分泌统的GAG含量柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种诱导时间短、诱导后II型胶原的表达效率高的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。该诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法的工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤S01.获取间充质干细胞和软骨细胞；
步骤S02.接种并培养软骨细胞：将步骤S01中获取的软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；
步骤S03.采用插入式细胞培养皿将间充质干细胞与软骨细胞进行共同诱导培养：将步骤S01中获取的间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养。
具体地，上述步骤S01中的间充质干细胞（MSCs）和软骨细胞可以是原代培养细胞或/和传代培养细胞。在优选实施例中，该MSCs和软骨细胞均选用传代培养细胞。选用传代培养细胞只需一次原代培养，而在传代的过程中能产生大量所需要的软骨细胞和MSCs，从而能有效避免后续步骤S03繁琐操作，缩短后续步骤S03中两细胞共同培养的时间，同时还能有效避免进行原代培养时对原代培养细胞来源的限制。
该MSCs和软骨细胞可以按照现有方法获取也可以按照如下经优化后的方法获取。其中，该MSCs优选按如下方法获取：
原代培养MSCs的获取：从手术台取足月正常产健康产妇已离体的脐带组织，PBS平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉及动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎成小组织块，反复用DMEM高糖培养液洗去血细胞，将组织块铺在培养皿中，组织块间隔开，放入37℃、5%CO2培养箱中贴壁后，在培养皿中加入含5～15v/v%的胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液，放入37℃、5%CO2的培养箱内进行培养，时间为10～15天，待细胞爬出组织，从而获得原代培养MSCs。
传代培养MSCs的获取：将上述细胞爬出组织并长满单层后原代培养MSCs进行传代培养，获得该传代培养MSCs。其中，该传代培养按照现有方法进行即可。如培养的温度37℃、5%CO2的培养箱内进行培养，时间为4～5天。
待MSCs经原代培养或传代培养后，可以将MSCs采用流式细胞仪检测细胞表型。以进一步验证和鉴定该分离得到的细胞为MSCs。
当然，上述MSCs的来源除了正常产健康产妇脐带组织之外，还可以来源于骨髓，脂肪，皮肤等组织。
上述步骤S01中的软骨细胞优选按如下方法获取：
原代培养软骨细胞的获取：
（1）无菌条件下取离体的非承重组织软骨细胞，置于DPBS中漂洗，将软骨剪碎后继续用DPBS液漂洗；其中，非承重组织可以来源于离体的耳廓，会厌及呼吸道等处。非承重组织获取按本领域常规方法进行获取即可；
（2）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置于37℃、5%CO2的培养箱内消化；
（3）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%II型胶原酶溶液，置于37℃、5%CO2的培养箱内继续消化，每1h更换一次酶溶液；
（4）过筛网，去除未被消化的组织块；
（5）用离心管留取各次消化液离心，去除上清液；
（6）用PBS液洗，再次离心，获取原代培养软骨细胞。
传代培养软骨细胞的获取：
将上述获取的原代培养软骨细胞用含5%～15%FBS的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，调细胞悬液浓渡为（5～8）×104个/ml；将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养，获得培养至传代的软骨细胞。
上述步骤S02中，软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养的时间优选为0～2天，如1天、2天等。将软骨细胞先进行培养是为了使得软骨细胞数量的增值，从而缩短下述步骤S03中共同培养的时间以及提高MSCs诱导成软骨细胞的效率。当然，软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养的时间为0天，也即是可以不对软骨细胞进行预先培养，而是将软骨细胞接种于软骨细胞培养液中后，直接与接种在插入式细胞培养皿中的间充质干细胞进行同时培养。
在优选实施例中，该软骨细胞的接种量为0.5×104～1×104个/cm2。和/或在另一优选实施例中，用于培养该软骨细胞的软骨细胞培养液为含5%～15v/v%FBS的DMEM/F12培养液，也即是该软骨细胞的软骨细胞培养液以DMEM/F12培养基为基础，添加有占软骨细胞培养液体积百分比为5%～15%的胎牛血清。
在一具体实施例中，该软骨细胞的培养可以在细胞培养多孔板中进行，如将软骨细胞培养液加入细胞培养多孔板中，然后将软骨细胞接种至该软骨细胞培养液中，并在37℃、5%CO2的条件下进行培养2天。其中，细胞培养多孔板可以根据实际需要灵活选用，如24孔细胞培养板。当然也可以根据实际需要而选用6孔细胞培养板、12孔细胞培养板或96孔细胞培养板等。
上述步骤S03中，将接种在插入式培养皿中的MSCs与经上述步骤S02中培养后的软骨细胞在软骨细胞诱导分化培养基中共同培养过程中，MSCs与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长，且两者通过插入式培养皿的微孔膜结构共用软骨细胞诱导分化培养基，并使得软骨细胞诱导分化培养基中含有的诱导MSCs分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子对MSCs发生协同诱导的增效作用，即使得该两种细胞能够模拟体内环境而发生协同作用，从而实现显著缩短诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞的增殖率的目的。
在优选实施例中，MSCs接种于插入式细胞培养皿中的量为2×104～5×104个/cm2。该接种量能使得该软骨细胞外基质作诱导因子与诱导MSCs分化成软骨细胞因子更好的发挥协同作用，实现进一步缩短诱导MSCs的时间，提高软骨细胞的增殖率的目的。
在另一优选实施例中，该插入式细胞培养皿的微孔膜结构的孔径为0.22～0.8μm，在更优选实施例中，该插入式细胞培养皿的微孔膜结构的孔径为0.4μm。该优选孔径的插入式细胞培养皿更能有效的避免两细胞间的交叉污染，保证两细胞的纯度，从而更加利用MSCs的诱导和软骨细胞的增值。
在优选实施例中，上述软骨细胞诱导分化培养基配方是以DMEM高糖培养液为基础，以及含有如下组分：
甲状旁腺激素相关蛋白1-34 2×10-7～5×10-7mol/L。
在进一步优选实施例中，上述软骨细胞诱导分化培养基配方如下：
以DEM E高糖培养液为基础，
甲状旁腺激素相关蛋白1-34 3.5×10-7mol/L。
上述软骨细胞诱导分化培养基的优选实施例中，含有的各MSCs定向诱导为软骨细胞的因子以及甲状旁腺激素相关蛋白1-34之间协调作用，进一步缩短诱导MSCs成为软骨细胞的时间，提高MSCs的定向诱导效率，提高了软骨细胞增殖率。其中，与TGF-β2和TGF-β1相比，TGF-β3通过其受体激活某些特定的信号通路而启动软骨特异性基因的转录，从而上调Ⅱ型胶原和GAG表达与合成；地塞米松作为非特异的促MSCs向软骨细胞分化的因子，可与MSCs膜上的糖皮质激素受体结合，激活细胞表面受体，和MSCs分泌细胞因子协同作用，共同促进MSCs向软骨细胞分化，并可抑制MSCs向其他类型细胞分化；甲状旁腺激素相关蛋白1-34具有促进软骨细胞分裂增生的作用，并且刺激新生软骨细胞合成较多细胞外基质，另外甲状旁腺激素相关蛋白具有抑制软骨细胞向成熟肥大型软骨细胞的分化，阻碍软骨细胞凋亡的作用。
在优选实施例中，将上述MSCs和软骨细胞共同培养是在37℃、5%CO2的环境中培养。为了培养基的营养和功能成分稳定，优选在在共同培养的过程中，每2天更换一次培养基。培养的时间可以灵活调整，如5天、8天等。
由上所述，上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法采用插入式培养皿共同培养软骨细胞和MSCs，MSCs与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长，且两者通过插入式培养皿的微孔膜结构共用软骨细胞诱导分化培养基，并使得软骨细胞诱导分化培养基中含有的诱导MSCs分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子如TGF-β1、IGF、MMP及CDMP等对MSCs发生协同诱导的增效作用，即使得该两种细胞能够模拟体内环境而发生协同作用，从而显著的缩短了诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞增殖率，并且同时提高了诱导分化后细胞的II型胶原的表达率与表达量，诱导分化后细胞的糖胺聚糖（GAG）的分泌也得到了明显提高，具体请参见下文的图2至图7。另外，MSCs与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长，有效的避免两细胞间的交叉污染，保证两细胞的纯度，从而利用MSCs的诱导和软骨细胞的增值。因此，上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法有效克服了现有诱导MSCs分化成软骨细胞的方法诱导时间长，诱导后II型胶原的表达效率较低的不足。
现以具体的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法为例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S11.脐带MSCs的分离和培养：
从手术台取足月正常产健康产妇已脱离的脐带组织，PBS平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉及动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至lmm3人小组织块，反复用DMEM培养基洗去血细胞，将组织块铺在6cm直径的培养皿中，组织块间隔约1cm，放入37℃、5%CO2培养箱中贴壁1h。在培养皿中加入1ml含10%FBS的DMEM，小心放入37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。在细胞爬出组织并长满单层后进行传代培养。
步骤S12.软骨细胞的分离及培养：
（1）无菌条件下取非承重组织软骨细胞，置于PBS中漂洗2次，并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小，继续用PBS液漂洗2次；
（2）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置于37℃、5％CO2的培养箱内消化30min；
（3）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%II型胶原酶溶液，置于37℃、5％CO2的培养箱内继续消化3h，每1h更换一次酶溶液；
（4）过120目筛网，去除未被消化的组织块；
（5）用离心管留取各次消化液离心2000rpm*10min，去除上清液；
（6）用PBS液洗1次，以同样方式再次离心；
（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓渡为7.5*104;将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。
步骤S13.以MSCs与软骨细胞共培养诱导MSCs分化为软骨细胞：
（1）将步骤S12获取的培养至传代的软骨细胞以1×104/cm2接种于24孔细胞培养板中，在软骨细胞培养液中培养2天；其中，该软骨细胞培养液为含10v/v%FBS的DMEM/F12培养基；
（2）将MSCs以2.5×104/cm2接种于0.4μm孔径的插入式培养皿中，并将插入式培养皿置于已培养软骨细胞的培养孔中；
（3）将培养基更换为软骨细胞诱导分化培养基，并在37℃、5%CO2的培养箱内下进行共同培养，并每2天更换一次培养基；其中，软骨细胞诱导分化培养基以DMEM高糖培养液为基础，在该DMEM高糖培养液中含有如下组分：
甲状旁腺激素相关蛋白1-34 3.5×10-7mol/L。
实施例2
诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S21.MSCs的分离并获取原代培养MSCs：
从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织，PBS平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉及动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至lmm3人小组织块，反复用DMEM培养基洗去血细胞，将组织块铺在6cm直径的培养皿中，组织块间隔约1cm，放入37℃、5%CO2培养箱中贴壁1h。在培养皿中加入1ml含10%FBS的DMEM，小心放入37℃、5%CO2的培养箱内进行培养，待细胞爬出组织后获得原代培养MSCs；
步骤S22.软骨细胞的分离并获取原代培养软骨细胞：
（1）无菌条件下取非承重组织软骨细胞，置于PBS中漂洗2次，并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小，继续用PBS液漂洗2次；
（2）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置于37℃、5％CO2的培养箱内消化30min；
（3）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%II型胶原酶溶液，置于37℃、5％CO2的培养箱内继续消化3h，每1h更换一次酶溶液；
（4）过120目筛网，去除未被消化的组织块；
（5）用离心管留取各次消化液离心2000rpm*10min，去除上清液；
（6）用PBS液洗1次，以同样方式再次离心，获取原代培养软骨细胞；
步骤S23.以MSCs与软骨细胞共培养诱导MSCs分化为软骨细胞：
（1）将步骤S22获取的原代培养软骨细胞以1×104/cm2接种于48孔细胞培养板中，在软骨细胞培养液中培养1天；其中，该软骨细胞培养液为含15%FBS的DMEM/F12培养基；
（2）将MSCs以5×104/cm2接种于0.22μm孔径的插入式培养皿中，并将插入式培养皿置于已培养软骨细胞的培养孔中；
（3）将培养基更换为软骨细胞诱导分化培养基，并在37℃、5%CO2的培养箱内下进行共同培养，并每2天更换一次培养基；其中，软骨细胞诱导分化培养基以DMEM高糖培养液为基础，在该DMEM高糖培养液中含有如下组分：
甲状旁腺激素相关蛋白1-34 5×10-7mol/L。
实施例3
诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S31.MSCs的分离并获取原代培养MSCs：
从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织，PBS平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉及动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至lmm3人小组织块，反复用DMEM培养基洗去血细胞，将组织块铺在6cm直径的培养皿中，组织块间隔约1cm，放入37℃、5%CO2培养箱中贴壁1h。在培养皿中加入1ml含10%FBS的DMEM，小心放入37℃、5%CO2的培养箱内进行培养，待细胞爬出组织后获得原代培养MSCs；
步骤S32.软骨细胞的分离并获取原代培养软骨细胞：
（1）无菌条件下取非承重组织软骨细胞，置于PBS中漂洗2次，并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小，继续用PBS液漂洗2次；
（2）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置于37℃、5％CO2的培养箱内消化30min；
（3）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%II型胶原酶溶液，置于37℃、5％CO2的培养箱内继续消化3h，每1h更换一次酶溶液；
（4）过120目筛网，去除未被消化的组织块；
（5）用离心管留取各次消化液离心2000rpm*10min，去除上清液；
（6）用PBS液洗1次，以同样方式再次离心，获取原代培养软骨细胞；
步骤S33.以MSCs与软骨细胞共培养诱导MSCs分化为软骨细胞：
（1）将步骤S22获取的原代培养软骨细胞以1×104/cm2接种于96孔细胞培养板中；
（2）将MSCs以5×104/cm2接种于0.22μm孔径的插入式培养皿中，并将插入式培养皿置于6孔细胞培养板的培养孔中；
（3）向6孔细胞培养板的培养孔中加入软骨细胞诱导分化培养基，并在37℃、5%CO2的培养箱内下进行共同培养，并每2天更换一次培养基；其中，软骨细胞诱导分化培养基以DMEM高糖培养液为基础，在该DMEM高糖培养液中含有如下组分：
甲状旁腺激素相关蛋白1-34 2.5×10-7mol/L。
对比实例1
传统方法诱导MSCs分化为软骨细胞：
步骤1：取培养至传代的MSCs，细胞数调整为5×105/ml，接种在T25培养瓶中，用含10%FBS的DMEM高糖培养液进行培养；
步骤2：待细胞贴壁后，用DMEM高糖培养液润洗细胞表面残留的培养基，将配置好的软骨细胞诱导分化培养液小心的加入培养瓶中，每瓶5ml，放入37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。
其中，步骤2中所用到的软骨细胞诱导分化培养液的配方如下：
以DMEM高糖培养液为基础，含有10%胎牛血清，100μg/ml青霉素，l00μg/ml链霉素，抗坏血酸50ug/ml、100nmol/L地塞米松、100μg/ml丙酮酸盐、40μg/ml脯氨酸、50mg/ml ITS+Premix和TGF-β310ng/ml。
对比实例2
直接取培养至传代的MSCs在以DMEM高糖培养液为基础，含有10v/v%胎牛血清，100μg/ml青霉素，l00μg/ml链霉素的条件下培养后进行下述检测分析。
实施例1与对比实例1、2的检测分析结果：
1.上述实施例1的步骤S11分离培养的MSCs的流式检测结果：
将上述实施例1的步骤S11分离培养的MSCs采用流式细胞仪检测传代培养后的MSCs细胞表型：常规流式方法测定MSCs特异性表达标记，该流式细胞检测所需试剂为：CollagenII（abcam ab79127）、CD44、CD45、CD29、CD34、CD271。检测的结果如图2所示，其中，图2A为传代培养MSCs的CD29、CD34、CD44和CD45表达率柱状图，图2B为MSCs的CD29表达率图，图2C为MSCs的CD34表达率图，图2D为MSCs的CD44表达率图，图2E为MSCs的CD45表达率图。由该图2可看出，MSCs分离纯化后，其特异性标记物CD44表达率为98.25%，CD29表达率为95.75%，两者的表达量均明显大于90%；其造血细胞标记CD34和CD45表达率分别为2.93%和2.13%，两者表达呈阴性。由此证明了实施例1的步骤S11分离纯化的MSCs此为间充质干细胞。
2.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原细胞的流式检测：
将实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞中的阳性表达II型胶原细胞进行流式检测。具体的是将实施例1与对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后，按照常规流式方法分别测定实施例1与对比实例1中阳性表达II型胶原的细胞所占比率，测定结果如图3所示。其中，图3A为实施例1与对比实例1分别诱导第5和第8天时，MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原的细胞所占比率的柱状图；图3B为实施例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3C为对比实例1中的MSCs诱导5天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图；图3D为实施例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图;图3E为对比实例1中的MSCs诱导8天时，阳性表达II型胶原细胞表达率图。由该图3可知，采用上述实施例1诱导的软骨细胞中，阳性表达II型胶原细胞的表达率与表达量高于传统方法中的阳性表达II型胶原细胞。具体地，上述实施例方法诱导第5天时，II型胶原阳性表达率为58.13%，而对比实例1中的II型胶原阳性表达率为43.27%；诱导第8天时，II型胶原阳性表达率为92.23%，而对比实例1中的II型胶原阳性表达率为72.57%。
3.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原细胞以及对比实例2中的阳性表达II型胶原细胞进行免疫荧光染色测定：
测定方法为：将实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后，对比实例2中的MSCs不诱导，按照现有免疫荧光染色测定方法分别对实施例1、对比实例1和对比实例2中的阳性表达II型胶原的细胞的荧光表达测定，测定结果如图4所示。其中，图4A为对比实例2第5天和第8天时的阳性表达II型胶原细胞的免疫荧光染色测定图，图4B为对比实例1诱导第5天和第8天时的阳性表达II型胶原细胞的免疫荧光染色测定图，图4C为实施例1诱导第5天和第8天时的阳性表达II型胶原细胞的免疫荧光染色测定图。由图4可看出第5天和第8天两次测定中，实施例1所诱导的软骨细胞在II型胶原的表达量上都明显高于对比实例1和对比实例2的II型胶原的表达量。
另外，根据定量统计阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值，得出将实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后，对比实例2中的MSCs不诱导进行培养5天和8天后，各自的比值如图5所示。其中，图5A为实施例1、对比实例1和对比实例2在第5天时阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值柱状图，图5B为实施例1、对比实例1和对比实例2在第8天时阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值柱状图。由图5可知，对实施例1测定的结果与对比实例1、对比实例2测定的结果相比，实施例1在诱导第5天时，阳性表达II型胶原细胞的荧光强度与DAPI的荧光强度的比值相对对比实例1、对比实例2提高了14.86%。实施例1在诱导第8天时，相对对比实例1、对比实例2提高了19.66%。
4.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞增殖率的测定：
将上述实施例1和对比实例1中的MSCs分别诱导1天至8天时，测定每天分别对软骨细胞增殖率进行测定，测定结果如图6所示。由图6可知，在对数生长期时软骨细胞数量达到最大，实施例1和对比实例1两种诱导方法所得细胞的数量分别为1.145×105和1.238×105。
5.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化的软骨细胞分泌的GAG含量测定：
测定方法为：将实施例1、对比实例1中的MSCs分别诱导5天和8天后，对比实例2中的MSCs不诱导，按照现有GAG含量测定方法分别对实施例1、对比实例1和对比实例2中的GAG含量进行测定，测定结果如图7所示。由图7可知，在诱导第5天时，对比实例2，对比实例1与实施例1方法中分泌的GAG含量分别为78μg、246.75μg、319.75μg；在诱导第8天时，对比实例2，对比实例1与实施例1方法中分泌的GAG含量分别为91.5μg、351.75μg、426.5μg。
另外，上述实施例2、3中检测分析结果与对比实例1和对比实例2的关系跟上述实施例1与对比实例1和对比实例2关系趋同。
由对上述实施例1、2、3与对比实例1、2的检测分析结果可知，上述本发明实施例诱导方法使得MSCs和软骨细胞两种细胞能够模拟体内环境而发生协同作用，从而显著的缩短了诱导MSCs分化成软骨细胞的时间，提高了软骨细胞增殖率，并且同时提高了诱导分化后细胞的II型胶原的表达率与表达量，诱导分化后细胞的糖胺聚糖（GAG）的分泌也得到了明显提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：
获取间充质干细胞和软骨细胞；
将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；
将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养；其中，所述软骨细胞诱导分化培养基中含有2×10-7～5×10-7mol/L的甲状旁腺激素相关蛋白1-34；
在所述将软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基进行共同培养的步骤中，所述软骨细胞诱导分化培养基还包含如下配方组分：
作为基础成分的DMEM高糖培养液
2.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：在将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液的步骤中，所述软骨细胞的接种量为0.5×104～1×104个/cm2。
3.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：在将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中的步骤中，所述间充质干细胞的接种量为2×104～5×104个/cm2。
4.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：在将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液的步骤中，所述软骨细胞培养液以DMEM/F12培养基为基础，添加有占所述软骨细胞培养液体积百分比为5％～15％的胎牛血清。
5.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：在所述将软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基进行共同培养的步骤中，所述共同培养的条件为37℃、5％CO2。
6.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：所述插入式细胞培养皿的滤膜孔径为0.22～0.8μm。
7.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为原代培养间充质干细胞或/和传代培养间充质干细胞。
8.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：所述软骨细胞为原代培养软骨细胞或/和传代培养软骨细胞。
9.根据权利要求1～3任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其特征在于：在将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液进行培养的步骤中，所述软骨细胞在软骨细胞培养液进行培养0～2天。
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