CN116904522A - 体细胞克隆北极狼的方法 - Google Patents

体细胞克隆北极狼的方法 Download PDF

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CN116904522A CN202311028511.XA CN202311028511A CN116904522A CN 116904522 A CN116904522 A CN 116904522A CN 202311028511 A CN202311028511 A CN 202311028511A CN 116904522 A CN116904522 A CN 116904522A
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Abstract

本发明涉及体细胞克隆北极狼的方法。本发明以北极狼的体细胞作为核供体、以犬的卵母细胞作为供体卵母细胞构建克隆胚胎，并将克隆胚胎移植至受体母犬，成功获得了健康存活的克隆北极狼。本发明通过动物克隆技术保存了北极狼的遗传基因，实现了北极狼群体的快速扩大，提供了保护北极狼的有效途径。

Description

体细胞克隆北极狼的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用体细胞核移植技术克隆北极狼的方法。
背景技术
动物克隆技术是将动物体细胞作为细胞核供体，用去核的卵母细胞作为细胞质供体，构建克隆胚胎，生产与供体细胞具有相同DNA序列信息的动物个体。该技术的最大特点是，所出生的克隆动物具有与供体细胞完全一致的遗传信息。动物克隆技术可应用于宠物或者工作犬的克隆、基因编辑动物生产、优良家畜扩繁、濒危动物资源保存、进行治疗性克隆等。
首例体细胞克隆犬于2005年获得成功，由韩国科学家黄禹锡教授的科研团队完成，利用体内成熟的犬卵母细胞进行核移植，成功克隆了阿富汗猎犬“Snuppy”。犬体细胞克隆技术不仅可以应用于科研，在工作犬克隆方面也得到的广泛的应用。2007年底，韩国7头体细胞克隆警犬诞生，这7头拉布拉多猎犬是世界首批体细胞克隆的警犬，是利用一头名为“Chase”的拉布拉多猎犬的体细胞克隆成功的。这些克隆警犬在出生后不久即开始接受专业训练，并在训练中表现出很多缉毒犬所必备的优良特性。
北极狼是食肉目、犬科、犬属动物，属于灰狼种，北极狼亚种。北极狼主要分布在北极地区，包括加拿大北部、格陵兰岛北部、梅尔维尔半岛、努纳武特地区、斯维德鲁普群岛和埃尔斯米尔岛及一些邻近岛屿。北极狼在国内多家动物园均有饲养，是动物园常见兽类观赏动物的一种。北极狼的生殖特点是北极狼属于季节性发情，每年发情一次，发情时间为每年的12月至次年的2月，孕期60天左右，每胎2-6只。随着环境的变化，北极狼的生存空间变小，北极狼的数量在减少。因此，亟需一种能够有效扩大北极狼群体的方法。
发明内容
本发明提供了一种利用动物体细胞克隆技术获得北极狼的方法。本发明首次以北极狼的体细胞作为核供体、以犬的卵母细胞作为供体卵母细胞构建克隆胚胎，并将克隆胚胎移植至受体母犬进行妊娠和分娩，成功获得了健康存活的克隆北极狼。本发明通过动物克隆技术保存了北极狼的遗传基因，实现了北极狼群体的快速扩大，提供了保护北极狼的有效途径。
在第一方面，本发明提供了体细胞克隆北极狼的方法，所述方法包括如下步骤：(1)北极狼体细胞的分离培养；(2)从受体母犬和/或供体母犬输卵管收集成熟的卵母细胞并去核，获得去核卵母细胞；(3)将北极狼体细胞导入所述去核卵母细胞的细胞质中，构建克隆胚胎；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬。
在一些实施方式中，在步骤(2)中，所述去核卵母细胞获自仅单侧冲卵的受体母犬冲卵的单侧输卵管；以及在步骤(5)中，将所述克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵那侧的输卵管中。
在另一些实施方式中，在步骤(2)中，一部分去核卵母细胞获自仅单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自双侧均冲卵的供体母犬的双侧输卵管；以及在步骤(5)中，将所述克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵那侧的输卵管中。
在一些实施方式中，在步骤(1)中，将分离的北极狼体细胞在38-39℃、4-6％CO2和饱和湿度下进行培养。在一些实施方式中，在步骤(1)中，将分离的北极狼体细胞在38.5℃、5％CO2和饱和湿度下进行培养。
在一些实施方式中，在步骤(2)中，制备去核卵母细胞时，需要先鉴定进入发情期的母犬，具体而言，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵胞素及黄体生成素，鉴定角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL的母犬作为处于排卵期的母犬以用作供体母犬和/或受体母犬。
在一些实施方式中，在排卵后72h-120h，进行冲卵获得成熟卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理，制备去核卵母细胞。
在一些实施方式中，所述去核处理包括将所述成熟卵母细胞在含有2-5mg/mL BSA和2-8μg/mL细胞松弛素B的显微操作液中孵育，再使用显微注射针移除所述成熟卵母细胞的细胞核，优选地，所述孵育的时间为20-30min。在一些实施方式中，所述纤维显微操作液为HEPES缓冲的含有2-5mg/mL BSA和2-8μg/mL细胞松弛素B(CB)的显微操作液。本发明发现，在步骤(2)的去核处理中，采用BSA代替现有技术通常使用的FBS更利于克隆胚胎的发育，FBS相比于BSA成分复杂，其含有葡萄糖，而高浓度葡萄糖会影响早期胚胎的发育。
在一些实施方式中，所述去核卵母细胞保存至添加5-10mg/mL BSA的SOF培养基中。在一些实施方式中，所述去核卵母细胞保存至添加8mg/mL BSA的SOF培养基中。
在一些具体实施方式中，所述去核处理包括将所述成熟卵母细胞放入HEPES缓冲的含有3mg/mL BSA和5μg/mL CB的CR2aa显微操作液中，孵育20-30min，使其细胞骨架软化，然后使用显微注射针将第一极体、相邻的的细胞质(少于5％)和卵母细胞核移除，然后将该去核卵母细胞保存在添加了8mg/mL BSA的SOF培养基中。
在一些实施方式中，在步骤(3)中，采用电融合将北极狼体细胞导入所述去核卵母细胞的细胞质中。
在一些实施方式中，所述电融合中使用渗透压为220mOSM-280mOSM的融合液。
在一些实施方式中，所述融合液包括0.2M-0.28M甘露醇、0.05-0.15mM MgSO4、0.2-0.8mM HEPES和0.02-0.08％BSA。在一些实施方式中，所述融合液包括0.24M甘露醇、0.01mM MgSO4、0.5mM HEPES和0.05％BSA。在一些实施方式中，所述融合液的组成为：0.24M甘露醇、0.01mM MgSO4、0.5mM HEPES和0.05％BSA。
在一些实施方式中，所述电融合采用1.6-1.8kV/cm的电压。本申请采用较小的电压进行电融合，在保证能够实现融合的同时，对克隆胚胎的伤害更小。
在一些实施方式中，在步骤(4)中，采用离子霉素和含6-(二甲基氨基)嘌呤(6-DMAP)的mSOF溶液激活克隆胚胎。在一些具体实施方式中，所述激活克隆胚胎包括采用10μmol/L的离子霉素激活4min，然后采用含2mmol/L的6-DMAP的mSOF溶液再激活4h。在一些具体实施方式中，所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素。
在一些实施方式中，本发明的北极狼体细胞可以是来自各种组织和器官，例如胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
在一些实施方式中，可用于本发明方法的体细胞的例子包括但不限于胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞或成骨细胞等。
现有技术中的体细胞克隆大多为同种克隆，而极少的异种克隆动物大多存在克隆效率极低、克隆动物的健康状态差或存活时间短的缺点。本发明首次采用北极狼的体细胞作为核供体，犬的卵母细胞作为卵母细胞供体，成功获得了克隆北极狼，本发明的方法具有较高的克隆效率，并且克隆北极狼的健康状态良好，出生60天体重可增长值4.5kg左右。通过本发明的方法获得了健康的北极狼个体，可以增加北极狼的繁育手段，快速扩大种群数量，保护北极狼的物种多样性。同时，采用本发明的方法也为通过体细胞克隆的方法扩繁濒危得犬科动物，为濒危犬科动物的保护提供了一种新的可行途径。
附图说明
图1示出了本申请实施例中的供体北极狼公狼的耳缘组织细胞图片。
图2示出了本申请实施例中的供体北极狼母狼的耳缘组织细胞图片。
图3示出了本申请实施例中的供体北极狼母狼的照片。
图4示出了本申请实施例获得的克隆北极狼2出生时、出生30天、出生44天和出生60天的照片。
图5示出了本申请实施例中的受体母犬和获得的克隆北极狼2的照片。
图6示出了本申请实施例中的的克隆北极狼2的体重增长曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
本文所用术语“克隆(Clone)”指的是采用相应的技术手段，生产与供核细胞具有相同DNA序列的动物个体。
本文所用术语“体细胞核移植(Nuclear Transfer，NT)”指的是将北极狼成体细胞移植入去核的犬卵母细胞中构建克隆胚胎的方法。
本文所用术语“供核细胞(Donor Cell，DC)”或“核供体”指的是包含有完整的遗传物质的细胞，将其移植入受体卵母细胞内用于制备体细胞克隆动物。
本文所用术语“胚胎移植(embryo transfer，ET)”指的是将克隆胚胎移植到代孕犬的输卵管中。
本文所用术语“饱和湿度”表示在一定温度下，单位容积空气中所能容纳的水汽量的最大限度。
本申请提供的利用动物体细胞克隆技术获得健康存活的北极狼包括如下的步骤：
(1)体细胞的分离培养
刮毛刀刮掉北极狼要采样组织周围的皮毛，利用75％酒精消毒，用灭菌后的剪刀剪取北极狼的皮肤组织约1cm2，然后置入含有100IU/mL的青霉素+100IU/mL链霉素的DMEM基础培养基中，于12h内带回实验室。
组织块首先利用PBS清洗3次或3次以上，再利用含5倍双抗(青霉素及链霉素)的DMEM培养基清洗3次，用眼科剪小心去除脂肪及软骨，达到露出真皮层的目的。将皮肤组织转到另一个无菌培养皿中，利用手术刀将其剪切割成l mm2大小的组织块。用眼科镊将组织块移至培养皿的皿底，用枪头将其铺散均匀，然后将培养瓶翻转，加入含有20％FBS及5倍双抗(青霉素及链霉素)的DMEM培养液，放入环境为38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。7-8小时后，待组织块帖服后进行翻瓶，使培养基完全浸没组织块后继续培养，每48小时换液一次。
用来进行体细胞核移植的细胞为F2-F5代，体细胞核移植前细胞长至接触抑制2天。体细胞核移植当天，将细胞从细胞培养皿中消化下来，用显微操作液重悬，待用。
(2)成熟卵母细胞的获得
经鉴定进入发情期的母犬，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵泡素及黄体生成素。当角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右时，认定母犬处于排卵期；排卵后72h-120h，采用手术法沿腹中线切开皮肤，暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部，然后将针管缝合固定；在宫管结合部输卵管处将插入注射针，用含有10％的FBS的TCM199培养基冲洗输卵管，将长度为3cm的塑料管穿刺入子宫内部，结扎固定后使用冲卵液从共管结合部冲洗卵母细胞。冲卵方向也可逆向进行，但接取冲卵液一端的针管直径要大于冲卵液进入的针管直径。冲卵仅进行一侧输卵管，另一侧保留为胚胎移植做准备。冲卵手术结束后，犬立即进行苏醒处理，胚胎移植时再进行麻醉。其他卵母细胞供体犬则进行双侧输卵管冲卵，获得的卵母细胞用于体细胞核移植。
(3)卵母细胞去核
体内或体外成熟的犬卵母细胞收集后，放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，在37℃热台上，利用移液枪反复吹打，将卵丘细胞移除。在倒置显微镜下，放大200倍观察，以挑选含有第一极体的成熟卵母细胞。
将挑选好的卵母细胞，放入HEPES缓冲的含有2-5mg/mL BSA和2-8ug/mL CB的CR2aa显微操作液中，孵育20-30min，使其细胞骨架软化，然后使用显微注射针将第一极体、相邻的的细胞质(少于5％)和卵母细胞核移除，然后将该去核卵母细胞保存在添加5-10mg/mL BSA的SOF培养基中。将显微注射针吸出的第一极体及胞质，放入Hochest33342溶液中染色，然后再荧光显微镜下观察所吸出的胞质是否含有细胞核，判断去核效率。如果去核率在90％以上，可进行体细胞注射，否则将采用Hochest33342对卵母细胞进行染色，在荧光显微镜将所显示细胞核去除干净。
(4)去核卵母细胞注核、融合及激活
将去核卵母细胞放在无CB的显微操作液中，然后将选取的供核细胞注射到卵母细胞透明带和细胞质之间，用注射针轻轻点压透明带，使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。将重构胚置于渗透压为220-280mOSM的融合液(包含0.24M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM HEPES和0.05％ BSA)中，然后放入融合槽的平行电极之间，采用ECM2001(BTX)在1.6-1.8kV/cm电压、2次脉冲、脉冲间隔10μs条件下进行电融合。融合后30min在体式显微镜下观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合情况，统计融合效率。判定为融合的重构胚用10μmol/L的离子霉素激活4min，然后采用含2mmol/L的6-DMAP的mSOF再激活4h，完成激活后进行胚胎移植。
(5)胚胎移植
受体犬麻醉后，选择未冲卵一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体体内。
实施例
(1)体细胞的分离培养
体细胞的供体北极狼为哈尔滨极地公园引进的野生北极狼。去皮肤组织时，首先用刮毛刀刮掉要采集的北极狼耳缘组织周围的皮毛，利用75％酒精消毒，用灭菌后的剪刀剪取北极狼的耳缘组织约1cm2，然后置入含有100IU/mL的青霉素+100IU/mL链霉素的DMEM基础培养基中，于12h内带回实验室。
组织块首先利用PBS清洗3次或3次以上，再利用含5倍双抗(青霉素及链霉素)的DMEM培养基清洗3次，用眼科剪小心去除脂肪及软骨，达到露出真皮层的目的。将皮肤组织转到另一个无菌培养皿中，利用手术刀将其剪切割成lmm2大小的组织块。用眼科镊将组织块移至培养皿的皿底，用枪头将其铺散均匀，然后将培养瓶翻转，加入含有20％FBS及5倍双抗(青霉素及链霉素)的DMEM培养液，放入环境为38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。7-8小时后，待组织块帖服后进行翻瓶，使培养基完全浸没组织块后继续培养，每48小时换液一次。
用来进行体细胞核移植的细胞为F2-F5代细胞，体细胞核移植前细胞长至接触抑制2天。体细胞核移植当天，将细胞从细胞培养皿中消化下来，用显微操作液重悬，待用。图1和图2分别示出了本实施例中的北极狼公狼和母狼的体细胞的供体细胞图片。表1示出了北极狼供体细胞的情况。
表1北极狼供体细胞培养
样本组织 采样日期 细胞建系日期 细胞冻存日期 细胞冻存数量
北极狼(公) 2020年11月6日 2020年11月6日 2020年11月25日 800万
北极狼(母) 2020年11月6日 2020年11月6日 2020年11月25日 900万
(2)母犬发情鉴定
本实施例共使用卵母细胞供体犬(比格犬)48只，发情鉴定采用阴道涂片及血清孕酮检测。进入发情期的母犬，每天抽取3mL血液，离心分离血清，采用孕酮检测仪器检测孕酮含量，当孕酮值达到4-7ng/mL是认为其处于排卵期。在进行孕酮检测的同时进行阴道涂片检测，采用长度为5cm的棉棒用生理盐水浸润后插入阴道，然后将提取物涂至载玻片，用吉姆萨染液染色后，在显微镜下技术阴道上皮细胞角化程度，角化程度大于80％时认为其处于排卵期，排卵后72-120h进行手术，冲取成熟卵母细胞。
(3)成熟卵母细胞的获取
母犬麻醉首先使用0.1mL的犬眠宝诱导麻醉，然后使用异氟烷及呼吸机维持麻醉。手术时沿腹中线切开皮肤，暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部，然后将针管缝合固定；在宫管结合部输卵管处将插入注射针，用含有10％的FBS的TCM199培养基冲洗输卵管，将长度为3cm的塑料管穿刺入子宫内部，结扎固定后使用冲卵液从共管结合部冲洗卵母细胞。冲卵方向也可逆向进行，但接取冲卵液一端的针管直径要大于冲卵液进入的针管直径。选为受体的母犬冲卵仅进行一侧输卵管，另一侧保留为胚胎移植做准备。冲卵手术结束后，犬立即进行苏醒处理，胚胎移植时再进行麻醉。其他卵母细胞供体犬则进行双侧输卵管冲卵，获得的卵母细胞用于体细胞核移植。
(4)卵母细胞去核
体内或体外成熟的卵母细胞收集后，放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，在37℃热台上，利用移液枪反复吹打，将卵丘细胞移除。在倒置显微镜下，放大200倍观察，以挑选含有第一极体的成熟卵母细胞。
将挑选好的卵母细胞，放入HEPES缓冲的含有3mg/mL BSA和5ug/mL细胞松弛素B(CB)的CR2aa显微操作液中，孵育20min，使其细胞骨架软化，然后使用显微注射针将第一极体、相邻的的细胞质(少于5％)和卵母细胞核移除，然后将该去核卵母细胞保存在添加了8％ BSA的SOF培养基中。将显微注射针吸出的第一极体及胞质，放入Hochest33342溶液中染色，然后在荧光显微镜下观察所吸出的胞质是否含有细胞核，判断去核效率。如果去核率在90％以上，可进行体细胞注射，否则将采用Hochest33342对卵母细胞进行染色，在荧光显微镜将所显示细胞核去除干净。
(5)去核卵母细胞注核、融合及激活
去核卵母细胞在无CB的CR2aa显微操作液中，然后将选取的供核细胞注射到卵母细胞透明带和细胞质之间，用注射针轻轻点压透明带，使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。将重构胚置于渗透压为220-280mOSM的融合液(包含0.24M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.5mM HEPES和0.05％ BSA)中，然后放入融合槽的平行电极之间，采用ECM2001(BTX)在1.7kV/cm电压、2次脉冲、脉冲间隔10μs条件下进行电融合。融合后30min在体式显微镜下观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合情况，统计融合效率。判定为融合的重构胚用10μmol/L的离子霉素激活4min，然后采用含2mmol/L的6-DMAP的mSOF再激活4h，完成激活后进行胚胎移植。
(6)胚胎移植
受体犬麻醉后，选择未冲卵一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体体内。
参见表2，胚胎移植后25天进行B超检测，胚胎移植结果显示，采用本发明的方法制备克隆北极狼具有较高的怀孕率和克隆效率，其中，对于获自北极狼母狼的核供体，共移植受体7只，其中2只怀孕并产下合计2只克隆北极狼(母狼)。图3为本申请实施例中的供体北极狼的照片，图4为本实施例获得的克隆北极狼2出生时、出生30天、出生44天和出生60天的照片，图5示出了本实施例中的受体母犬和获得的克隆北极狼2的照片。由图3-5可以明显看出，由受体母犬生产的克隆北极狼具有供体北极狼相同的形态特征，比如两耳直立，无拇指和蝩垫，爪粗钝，不能弯缩，额部和头顶灰白有黑色，上下唇黑色，而这些特征与受体母犬比格犬明显不同。
新生克隆北极狼的生理指标参见表3，表明采用本发明方法制备的克隆北极狼健康，图6显示了其中克隆北极狼2的体重增长曲线，表明采用本发明方法制备的克隆北极狼能够稳定存活。
表2北极狼克隆效率
表3新生克隆北极狼的生理指标
新生指标 克隆北极狼1 克隆北极狼2
体重(克) 453 520
体长(厘米) 24 22
体温(℃) 35.9 36.1
心率(次/分) 170 136
呼吸频率(次/分) 36 24
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.体细胞克隆北极狼的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)北极狼体细胞的分离培养；
(2)从受体母犬和/或供体母犬输卵管收集成熟的卵母细胞并去核，获得去核卵母细胞；
(3)将北极狼体细胞导入所述去核卵母细胞的细胞质中，构建克隆胚胎；
(4)激活克隆胚胎；
(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述去核卵母细胞获自仅单侧冲卵的受体母犬冲卵的单侧输卵管，或者一部分去核卵母细胞获自仅单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自双侧均冲卵的供体母犬的双侧输卵管；
以及在步骤(5)中，将所述克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵那侧的输卵管中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将分离的北极狼体细胞在38-39℃优选38.5℃、4-6％CO2和饱和湿度下进行培养。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，鉴定角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL的母犬作为处于排卵期的母犬以用作供体母犬和/或受体母犬；
优选地，在排卵后72h-120h，进行冲卵获得成熟卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理，制备去核卵母细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述去核处理包括将所述成熟卵母细胞在含有2-5mg/mL BSA和2-8μg/mL细胞松弛素B的显微操作液中孵育，再使用显微注射针移除所述成熟卵母细胞的细胞核，优选地，所述孵育的时间为20-30min；和/或
所述去核卵母细胞保存至添加5-10mg/mL BSA的SOF培养基中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用电融合将北极狼体细胞导入所述去核卵母细胞的细胞质中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电融合中使用渗透压为220mOSM-280mOSM的融合液，优选地，所述融合液包括0.2M-0.28M甘露醇、0.05-0.15mM MgSO4、0.2-0.8mM HEPES和0.02-0.08％BSA。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电融合采用1.6-1.8kv/cm的电压。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述北极狼体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述北极狼体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞或成骨细胞。
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