CN101228265A - 克隆的犬科动物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了克隆的犬科动物及其生产方法。所述克隆的犬科动物的生产方法包括将犬科动物的卵母细胞的细胞核去除掉以制备去核的受体卵母细胞，在优化条件下采用犬科动物的体细胞作为核供体细胞，将核移植到去核的卵母细胞中以制备核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中。本发明提供了生产克隆的犬科动物的方法。因此本发明有助于兽医学、人类学和医学方面研究的发展，如优良犬科动物的繁殖、稀有或濒危犬科动物的保护、异种移植和疾病动物模型。

Description

克隆的犬科动物及其生产方法
技术领域
本发明涉及克隆的犬科动物及其生产方法。更具体地说，本发明涉及生产克隆的犬科动物的方法和用该方法生产的克隆的犬科动物，所述生产克隆的犬科动物的方法包括将犬科动物的成熟的卵母细胞的细胞核去除掉以制备去核的受体卵母细胞，在优化的条件下采用犬科动物的体细胞作为核供体细胞将核移植到去核的卵母细胞中以制备核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中。
背景技术
随着最新的通过细胞融合或胞质内细胞注射进行体细胞移植技术的发展，已经可以制备克隆的动物了。
体细胞核移植技术是使将要出生的活体后代不经历在生殖过程中通常存在的减数分裂及形成单倍体生殖细胞的方法，该方法通过将成年动物的二倍体体细胞移植到去核的细胞中形成胚胎并在体内移植该胚胎形成新的个体。一般地，在体细胞核移植技术中，在体外人工培养到减速分裂的中期II以后，使用待移植的受体卵母细胞和体细胞供体细胞核。然后，为了防止因体细胞核移植导致的染色体变异，在移植体细胞前，必须除去成熟的卵母细胞的细胞核。在将体细胞注射到成熟的卵母细胞的卵周隙或细胞质中后，用电刺激使去核的卵细胞和体细胞相互融合。用电刺激或化学物质激活融合体，并将该融合体移植到代孕母体中以生产活体后代。
在本领域可以广泛地采用这种体细胞核移植技术，例如，优良动物的繁殖，稀有动物或濒危动物的保护、某种营养素的生产、治疗用的生物材料的生产、用于器官移植的动物的生产、具有某种疾病或症状的动物的生产、用作替代如细胞和基因的治疗在内的器官移植的具有药用价值的动物的生产。
动物克隆技术首先由英国Roslin Institute的Wilmut博士实现的，Wilmut博士通过取出六岁的绵羊的乳腺细胞并将该细胞移植到去核的卵母细胞中以制备核移植胚胎，然后在体内移植该胚胎，从而得到克隆动物多莉(Dolly)。自那以后，通过使用成年动物的体细胞进行核移植得到了克隆奶牛、克隆小鼠、克隆山羊、克隆猪和克隆兔(WO 9937143A2，EP 930009A1，WO9934669A1，WO 9901164A1和US 5,945,577)。
与此同时，不仅仅是工业动物如奶牛和猪，宠物如狗的克隆也引起了许多人的兴趣。最近，在宠物中，猫首先被克隆出来，并且克隆狗的研究也在进行。
然而，还没有报道表明通过体细胞移植技术已经成功地克隆了犬科动物。
发明内容
因此，本发明的发明人进行了克隆犬科动物的生产方法的研究，结果，本发明的发明人首先用体细胞移植方法在优化的电融合条件、核移植胚胎激活条件和胚胎移植到代孕母体的条件下生产了克隆的犬科动物，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种采用体细胞核移植技术生产犬科动物的核移植胚胎的方法。
本发明的另一个目的是提供一种采用所述方法制备的犬科动物的核移植胚胎。
本发明的另一个目的是提供一种生产克隆的犬科动物的方法，该方法包括将所述核移植胚胎移植到代孕母体中以生产活体后代的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种采用所述方法生产的克隆的犬科动物。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种采用体细胞核移植技术制备犬科动物的核移植胚胎的方法。
另一方面，本发明提供一种采用所述方法制备的犬科动物的核移植胚胎。
另一方面，本发明提供一种生产克隆的犬科动物的方法，该方法包括将所述核移植胚胎移植到代孕母体中以生产活体后代的步骤。
另一方面，本发明提供一种采用所述方法生产的克隆犬科动物。
在下文中，将详细描述本发明。
术语定义
本文中使用的术语“核移植”是指通过人工地将一个去核的细胞和一个具有核DNA的细胞合并，以获得具有相同特征形式和性质的基因操作技术。
本文中使用的术语“核移植胚胎”是指注入或融合有核供体细胞的胚胎。
本文中使用的术语“克隆”是指制备具有与另一个体单位相同的基因组的新个体单位的基因操作技术。在本发明中，该术语尤其是指一个细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、和/或动物细胞具有与另一个细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、和/或动物细胞基本相似或相同的核DNA序列的事实。
本文中使用的术语“核供体细胞”是指被转移到受体卵母细胞的作为核受体的细胞或细胞核。
本文中使用的术语“受体卵母细胞”是指在去除核后接受核供体细胞的细胞核移植的卵母细胞。
本文中使用的术语“成熟卵母细胞”是指处于减速分裂中期II的卵母细胞。
本文中使用的术语“去核的卵母细胞”是指去除了细胞核的卵母细胞。
本文中使用的术语“融合”是指核供体和受体卵母细胞的类脂膜的合并。例如，类脂膜可以是细胞质膜或细胞核膜。可以在将核供体和受体卵母细胞相互接近时或将核供体放置于受体卵母细胞的卵周隙空间时进行电刺激融合。
本文中使用的术语“激活”是指在核移植步骤之前、之中或之后刺激细胞使细胞分裂。
本文中使用的术语“活体后代”是指从子宫出来后存活的动物。“活体后代”的动物可以是从母体出来后存活了至少一秒钟、一分钟、一天、一周、一个月、六个月或超过一年的动物。“活体后代”的动物可以不需要在子宫环境的循环系统中生存。
本文中使用的术语“犬科动物”包括狗、狼、狐(fox)、豺、丛林狼(coyotes)、韩国狼和狸(raccoon dogs)，优选包括狗或狼。众所周知狗是由野生的狼驯养得到的，因此，狗和狼具有相同的染色体数并表现出相似的怀孕周期及性激素的变化(Seal US等，Biology Reproduction 1979，21：1057-1066)。
本发明的特征是首次通过体细胞核移植技术成功地克隆了犬科动物，所述体细胞核移植技术是在优化的电融合条件下制备犬科动物的核移植胚胎，然后激活核移植胚胎并将核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中生产活体后代。
本发明制备犬科动物的核移植胚胎的方法包括以下步骤：(a)将犬科动物的成熟卵母细胞的细胞核去除掉，以制备去核的受体卵母细胞；(b)从供体犬科动物的组织中分离体细胞，以制备核供体细胞；(c)将步骤(b)制备的核供体细胞微注射到步骤(a)制备的去核的卵母细胞中，并在3.0-3.5KV/cm的电压下对供体细胞和去核的卵母细胞进行电融合；(d)激活步骤(c)制备的融合的卵母细胞。
在下文中将详细描述本发明的犬科动物的核移植胚胎的制备方法的各步骤。
步骤1：受体卵母细胞的去核
对于用作受体卵母细胞，从犬科动物收集的未成熟的卵母细胞可以在体外成熟或收集在体内成熟的卵母细胞。一般地，哺乳动物(如，牛、猪和绵羊)的卵母细胞排出成熟的卵母细胞，即减速分裂中期II的卵母细胞，然而与其它动物不同，犬科动物排出的卵母细胞处于减速分裂中期I并在输卵管中停留48-72小时的期间内成熟。由于犬科动物的卵母细胞核的成熟速度非常慢并且犬科动物的排卵时间和生殖生理学与其它动物不同，因此，作为受体卵母细胞使用的犬科动物的卵母细胞优选在体内成熟。
更尤其是，从犬科动物收集成熟的卵母细胞优选在对犬科动物进行诱导排卵后48-72小时，且更优选在72小时后进行。对于犬科动物排卵的具体时间可以通过本领域已知的任何方法确定。对于确定犬科动物排卵的具体时间的实例包括但不限于阴道涂片试验、血清性激素水平的检测和使用超声记录诊断系统。动情期的开始可以通过外阴涨大和血浆血液的(serosanguionous)排放来确定。
在本发明的一个实施例中，进行了阴道涂片试验和血清中的孕酮浓度的分析；非角质化的上皮细胞超过80％且血清中的孕酮浓度达到约4.0-7.5ng/ml的那天被认为是排卵时间。根据这种排卵时间的确定方法，在排卵后48-72小时并优选在72小时收集卵母细胞。并且，从犬科动物排出的卵母细胞的成熟时间为排卵后的48-72小时；本发明的发明人分析了排卵后48小时、60小时和72小时收集的卵母细胞，结果表明在排卵后约72小时收集的卵母细胞与减速分裂中期II的成熟卵母细胞相对应。另外，实际上本发明中成功的生产了克隆狗的卵母细胞就是在排卵后72小时收集的卵母细胞。这提示最优选在排卵后72小时收集犬科动物的成熟卵母细胞。
作为一种收集在体内成熟的卵母细胞的方法，可以使用一种外科的方法，该方法包括麻醉动物以及随后进行的剖腹手术。更具体地说，在体内成熟的卵细胞的收集可以采用本领域中任何已知的方法进行输卵管切除术实现。输卵管切除术是一种用卵母细胞收集培养基对通过外科手术切除得到的输卵管进行向下冲洗，然后从冲洗物中收集卵母细胞的方法。
在另一种方法中，在体内成熟的卵母细胞可以通过在输卵管的粘膜皱襞分支(fimbriated end)插入一个导管，用针型留置导管向子宫输卵管结合处注射冲洗物而收集得到。这种方法的优点是不损害输卵管，因此，在卵母细胞供体动物的下一个动情周期到来时还可以使用该动物。
因此，在体内成熟的卵母细胞的收集方法优选为包括采用不会损害输卵管的导管的方法。并且，为了提高包括使用导管的卵母细胞的收集方法的速度，本发明的发明人开发了一种具有圆形前端的、易于插入到输卵管的入口处的卵母细胞收集(retrieval)针(参见图1)。更具体地说，使用本发明的发明人开发的针的收集卵母细胞的方法包括将具有圆形前端的卵母细胞收集针插入并扎结在输卵管中，然后用卵母细胞收集培养基向下冲洗子宫输卵管结合处以使冲洗物流入卵母细胞收集针中，并用显微镜观察冲洗物以选取成熟卵母细胞。
在收集到成熟的卵母细胞后，除去卵母细胞的单倍核。卵母细胞的去核可以采用本领域中任何已知的方法进行(见美国专利No.4994384；美国专利No.5057420；美国专利No.5945577；欧洲专利No.0930009A1；韩国专利342437；Kanda等，J.Vet.Med.Sci.57(4)：641-646，1995；Willadsen，Nature，320：63-65，1986；Nagashima等，Mol.Reprod.Dev.48：339-343 1997；；Nagashima等，J.Reprod.Dev.38：37-78，1992；Prather等，Biol.Repord41：414-418，1989，；Prather等，J.Exp.Zool.255；355-358，1990；Saito等AssisReprod Tech Andro，259：257-266，1992；Theriogenology 37：309，1992)。
优选情况下，受体卵母细胞的去核可以通过下述两种方法中任意一种方法进行，一种方法包括除去成熟受体卵母细胞的卵丘细胞；用微针切除受体卵母细胞一部分的透明带产生一个切口；和通过该切口除去第一极体、细胞核和附近的细胞质(尽可能少的量)。另一种方法包括除去受体卵母细胞的卵丘细胞；将卵母细胞染色；和用抽吸吸液管除去卵母细胞的第一极体和细胞核。对于卵母细胞的去核，更优选使用吸气的方法，因为通过目测评价发现采用抽吸方法能够使受体卵母细胞的存活率高，而采用形成缺口的方法，受体卵母细胞的存活率低。
步骤2：核供体细胞的制备
作为核供体细胞，可以使用犬科动物的体细胞。
具体地说，在本发明中使用的体细胞可以是犬科动物的胚胎细胞、胎儿细胞、少年细胞或成年细胞，体细胞优选来源于卵丘、皮肤或口黏膜、血液、骨髓、肝、肾、肌肉和生殖道等，可以从成年细胞获得。可以用在本发明的体细胞的实例包括但不限于卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。可以用在本发明的体细胞更优选包括胎儿成纤维细胞、成年成纤维细胞和卵丘细胞。
此外，可用于本发明的供体细胞可以是通过用某种基因采用基因转移方法或基因寻靶方法将野生型体细胞转型而获得的那些细胞。本领域任何技术人员可以容易地操作所述基因转移方法或基因寻靶方法，因为这些技术在本领域是公知的。
作为核供体细胞使用的体细胞可以通过制备外科样品或活组织检查样品的方法获得，并且可以通过本领域任何公知的方法从这些样品中获得单细胞。例如，一些待克隆的动物组织是在麻醉状态下被切除，形成外科样品或活组织检查样品，然后，这些样品被切碎，用胰酶处理后在组织培养基中培养。在组织培养基中培养3-4天后，确定细胞在培养皿中的生长情况。当细胞完全生长时，冷冻一些细胞并保存在液氮中供以后使用，将剩余的细胞传代培养以用于核移植。为了防治细胞过度生长，用于核移植的连续培养的细胞传代培养高达10次。
上述使用的组织培养基可以是本领域中公知的一种培养基，其实例包括TCM-199和DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)。
步骤3：核供体细胞的显微注射和融合
将核供体细胞显微注射到去核的卵母细胞是通过采用移液管将核供体细胞显微注射到去核的卵母细胞的细胞质和透明带之间来实现的。
用细胞操作器将用于核供体细胞显微注射的去核的卵母细胞和核供体细胞进行电融合。
电融合可以用直流电或交流电进行。电融合优选在电压为3.0-3.5KV/cm进行，更具体地说，可以用3.0-3.5KV/cm的直流电进行1-3次电融合，每次电融合10-30μs。电融合更优选用3.0-3.5KV/cm的直流电进行2次电融合，每次电融合20μs。如果电融合电压低于3.0KV/cm或高于3.5KV/cm，卵母细胞和核供体细胞之间的融合速度很低。上述电融合的电压范围的特征是，该电压范围比目前公知的一般使用的电融合电压范围(1.7-2.0V/cm)高。
在本发明的一个测试实施例中，为了确定最佳的电融合电压范围，将用于核供体细胞显微注射的核移植胚胎在不同电压范围下进行电融合，并用显微镜观察融合速度(见测试实施例2)。结果发现，核融合速度在高电压下比在低电压下快，并且在电压为3.0-3.5KV/cm范围内时获得最高达75.2％的融合速度(见表7)。
通过电刺激将核供体细胞融合到卵母细胞可以在融合培养基中进行。本发明使用的融合培养基可以是含有甘露醇、MgSO4、Hepes(4-羟乙基呱嗪乙磺酸)和BSA(牛血清白蛋白)的培养基。
步骤4：核移植胚胎的激活
核移植胚胎的激活是重新激活暂时终止的细胞周期的步骤。为了重新激活细胞周期，必须降低用于终止细胞周期的元素如MPF和MAP激酶等的细胞信号传递物质的激活作用。
一般地，激活核移植胚胎的方法包括电学方法和化学方法。在本发明中，优选采用化学方法激活核移植胚胎。化学方法比电学方法能更快地激活核移植胚胎。作为化学方法，存在一种使用下述物质处理核移植胚胎的方法，所述下述物质为乙醇；三磷酸肌醇(IP3)；二价离子(如，Ca2+或Sr2+)；微管抑制剂(如，细胞松弛素B)；二价离子载体；和包括6-二甲基氨基嘌呤、蛋白质合成抑制剂(如，环己酰亚胺)、佛波醇-12-十四烷酸酯-13-醋酸酯(PMA)在内的蛋白质激酶抑制剂。作为核移植胚胎的激活的化学方法，优选地，在本发明中可以用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤同时或逐步处理核移植胚胎。更优选地，先用5-10μM的钙离子载体在37-39℃下处理核移植胚胎3-6分钟，然后用1.5-2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤37-39℃下处理核移植胚胎4-5小时。
在本发明的一个测试实施例中，用电学方法和化学方法激活核移植胚胎后，观察该核移植胚胎的发育时期(见测试实施例3)。结果表明：化学激活方法能够促进核移植胚胎的发育潜力，化学方法激活的核移植胚胎能够使核移植胚胎发育到桑椹胚期(见表8)。
因此，本发明提供了通过上述方法制备的犬科动物的核移植胚胎。本发明的一个实施例制备的犬科动物的核移植胚胎被本发明的发明人命名为“Snuppy”(克隆的犬科动物的胚胎)。“Snuppy”(克隆的犬科动物的胚胎)已在2005年7月15日在国际保藏单位韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(Korean Collection for Type Cultures；Korean Research Institute of Bioscienceand Biotechnology，52，Oundong，Yusong-gu，Daejeon，Korea)进行了保藏，保藏编号为KCTC 10831 BP。
冻存核移植胚胎并在需要时可以将核移植胚胎熔化后使用。
而且，可以通过将本发明的犬科动物的核移植胚胎移植到代孕母体中生产活体后代而生产克隆的犬科动物。优选地，将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中。可以通过本领域任何公知的方法进行移植，优选地，可以使用导管来移植克隆胚胎。
在本发明的一个实施例中，首先通过将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中生产得到了克隆狗“Snuppy”和“NT-2#”(见实施例6)。然而，本发明的一个测试实施例表明如果将本发明的核移植胚胎移植到代孕母体的子宫中，代孕母体不会怀孕(见测试实施例4)。这说明在生产克隆狗时，优选将核移植胚胎移植到输卵管中。
并且，在将核移植胚胎移植到代孕母体中时，核移植胚胎可以处于1-细胞期、2-细胞期或4-细胞期。核移植胚胎在移植到代孕母体之前可以一直培养在25μl用矿物质油覆盖的mSOF微滴中。
因此，本发明提供了克隆的犬科动物。该克隆的犬科动物具有与核供体细胞或供体完全相同的基因特性。在本发明的一个实施例中，按照本发明的方法生产了克隆狗并且采用微卫星分析法分析了其基因特性(见测试实施例1)。结果发现：本发明的克隆狗具有与核供体细胞或供体完全相同的基因特性(见表6)。
如前文所述，本发明提供了一种生产克隆的犬科动物的方法。因此本发明有助于兽医学、人类学和医学方面研究的发展，如优良犬科动物的繁殖、稀有或濒危犬科动物的保护、异种移植和疾病动物模型。
附图说明
图1是本发明一个实施例中所使用的从狗体内收集卵母细胞的15量规和18量规针型卵母细胞收集器的照片；
图2(a)的照片显示了根据本发明的方法生产的克隆狗Snuppy和供体狗(a)；以及克隆狗Snuppy和它的代孕母亲(b)。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例对本发明进行详细地描述。然而，应当理解为：给出这些实施例仅仅是为了说明的目的而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：狗的受体卵母细胞的收集
用于收集受体卵母细胞的狗是按照首尔大学的实验动物管理认证(SeoulNational University for Accreditation of Laboratory Animal Care)建立的标准混合繁殖的131条狗龄为1-3年的雌性狗。排卵时间是根据对动情期狗的阴道涂片试验和血清中孕酮的浓度进行检测来确定的。成熟卵母细胞在排卵后48-72小时收集。
为了检测血清中孕酮的浓度，每天收集3-5ml的血并离心收集血清，通过DSL-3900 ACTIVE Progesterone Coated-Tube Radioimmunoassay Kit(Diagnostic Systerms Laboratories，Inc.TX)对血清进行分析。孕酮浓度首次达到4.0-7.5ng/ml的那一天被认为是排卵时间(Hase等J.Vet.Med.Sci.62：243-248，2000)。
为了进行阴道涂片试验，从刚出现发情前期迹象的那天开始每天收集涂片。通过将拭子插入外阴唇中收集涂片，然后将涂片滚涂到玻璃片上。用Diff-Quik染色(International chemical Co.Japan)后，用显微镜检测涂片；表面细胞超过表皮细胞角化指数的80％的时间被认为排卵时间(Evans J.M.等，VET.Rec.7：598-599，1970)。
已知在排卵后48-72小时是排出的卵母细胞的成熟时间。因此，本发明的发明人按照下述方式在48-72小时后收集卵母细胞。
首先，对已经达到体内成熟的卵母细胞的收集时间的雌性狗施以0.05mg/kg的硫酸阿托品和0.025mg/kg的马来酸乙烯丙嗪，并施以5mg/kg的氯胺酮进行麻醉。通过给与异氟烷维持麻醉状态。
将麻醉的雌性狗的腹部切开5-10cm，然后将具有圆形前端的卵母细胞收集针(见图1)插入到腹腔的输卵管中并用缝合用的线在原地缝合，然后用24量规IV导管将卵母细胞收集培养基(见表1)向下冲入到子宫输卵管结合处使冲洗物流到16量规的针型收集器中。将冲洗物转移到无菌的有盖培养皿(Petri-dish)中，然后在显微镜下观察以选择成熟的卵母细胞。
表1
卵母细胞收集培养基
 成分   含量
 1升的TCM粉(Gibco 31100-027)   9.9g
 P/S抗生素   1％(10000IU青霉素，10mg的链霉素)
 HEPES缓冲液   2.38g
 FBS(胎牛血清)   10％(v/v)
 NaHCO3   0.1680g
 BSA   5mg/L
结果表明，从每只狗中平均收集12个成熟的卵母细胞，一共收集1370个成熟的卵母细胞。
实施例2：受体卵母细胞的去核
向hCR2aa培养基中(表2)加入0.1％(v/v)的透明质酸酶(Sigma，USA)，其中，hCR2aa培养基通过向不含Ca2+的CR2培养基中加入Hepes缓冲液而制备得到(CHARLES Rosenkrans 2；Rosenkrans et al.Biol.Reprod.49，459-462，1993)。然后，通过在上述培养基中反复吹打而除去由实施例1获得的卵母细胞中的卵丘细胞。然后用5μg/ml双苯甲亚胺(bisbenzimide)(Hoechst 33342)对卵母细胞进行染色5分钟，在装有落射荧光的倒置显微镜下放大200倍观察以选择只具有第一极体的卵母细胞。将10％(v/v)FBS和5μg/ml的细胞松弛素B加入到hCR2aa培养基(表2)中，用显微操作器(Narishige，Tokyo，Japan)在培养基中使选择的卵母细胞去核。也就是用控制(holding)微量吸液管(内径为150μm)固定卵母细胞，然后用抽吸吸液管除去第一极体、附近的细胞质(少于5％)和卵母细胞核。将去核的卵母细胞保存在添加10％的FBS的TCM-199培养基(表3)中。
表2
hCR2aa培养基的组成
Figure A20068002724600171
表3
TCM-199培养基的组成
  成分   含量
  TCM-199液体   89ml
  丙酮酸   0.0099g
  P/S(抗生素)   1ml
  FBS   10％
实施例3：核供体细胞的制备
使用狗的成年成纤维细胞作为核供体细胞。为了本目的，首先分离3岁狗龄的雄性阿富汗猎犬的耳部皮肤的活组织切片。用DPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)将小片的耳部组织片段冲洗3次，然后用外科刀片切碎。切碎的组织在含有0.25％(W/V)的胰蛋白酶和1mM的EDTA的Dulbecco’smodified Eagle’s medium培养基(DMEM；Life Technologies，Rockville，MD)中于37℃温度下分离1小时。胰蛋白酶消化的细胞在不含Ca2+和Mg2+的DPBS中通过300g离心2分钟冲洗一次，将细胞接种在100毫米的塑料培养皿中。随后将接种的细胞在添加有10％(V/V)的FBS、1mM的谷氨酰胺、25mM的NaHCO3和1％(V/V)最少量的必需介质(MEM)非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)的DMEM培养基中于39℃温度下、湿润的含5％的CO2和95％的空气的气氛中培养6-8天。除去未粘附的细胞簇或外植体后，通过0.1％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA消化粘附的细胞1分钟，以进一步对粘附的细胞进行4-6天的传代培养。将传代培养的细胞置于冻存的培养基中并保存在-196℃的液氮中。所述冻存培养基由80％(V/V)DMEM、10％(V/V)DMSO和10％(V/V)FBS组成。
实施例4：核供体细胞微注射到去核的卵母细胞和它们的融合
将实施例3制备的核供体细胞微注射到实施例2制备的去核的卵母细胞中。实施例2中的微操作器上的抽吸吸液管被移液管代替后，在hCR2aa培养基中，用浓度为100mg/ml的植物凝集素处理固定的细胞。用控制微量吸液管控制去核的卵母细胞的裂缝，然后将移液管插入。用移液管将实施例3中从成纤维细胞中分离的单细胞注入到去核的卵母细胞的细胞质和透明带之间。
将上述注射有核供体细胞的卵母细胞置于融合培养基(含0.26M的甘露醇，0.1mM的MgSO4，0.5mM的Hepes和0.05％的BSA)中，然后转移到装有不锈钢电线电极(BTX 453，3.2mm的间隙；BTX，San Diego，CA)的细胞融合腔中。在平衡3分钟后，用BTX电细胞操作器在3.0-3.5KV/cM的直流电压下作用偶合体(couplets)20秒钟，这样将供体细胞融合到卵母细胞中。如果在低电压(接近3.0KV/cM)下进行融合，收集的卵母细胞是弱的卵母细胞。而如果在高电压(接近3.5KV/cM)下进行融合，收集的卵母细胞是健康的卵母细胞。在电压平均为3.3KV/cM下进行融合。
用立体显微镜选出1,095个融合的核移植胚胎，并将该胚胎在如表4所示的改良的合成输卵管流体(mSOF)中培养3小时(Jang et a1.Reprod FenilDev，15，179-185，2003)。
表4 mSOF的组成
Figure A20068002724600191
实施例5：核移植胚胎的激活
将实施例4获得的核移植胚胎在含有10μM的离子载体的mSOF(表4)中在39℃下培养4分钟。将所述胚胎冲洗后在添加有1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF中培养4小时。
按照上述方法制备的一个犬科动物的核移植胚胎被本发明的发明人命名为“Snuppy”(克隆的犬科动物的胚胎)，该胚胎已在2005年7月15日在国际保藏单位KCTC(Korean Collection for Type Cultures；Korean ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology，52，Oundong，Yusong-gu，Daejeon，Korea)进行了保藏，保藏编号为KCTC 10831 BP。核移植胚胎在移植到代孕母体之前一直培养在25μl的矿物质油覆盖的mSOF微滴中。
实施例6：胚胎移植到代孕母体中并生产克隆狗
将实施例5制备的核移植胚胎采用外科手术的方法移植到代孕母体的输卵管中。在实施例5中制备的核移植胚胎被激活后，移植取决于代孕母体的准备情况。即，如果代孕母体立刻被准备好，则可以立即进行核移植胚胎的移植；如果不是这样，在核移植胚胎(繁殖胚胎时期：2细胞期或4细胞期)激活后的第二天进行移植。使用由混合繁殖的狗和拉布拉多猎狗(LabradorRetrievers)组成的123只狗作为代孕母狗。选择的狗无任何疾病，具有正常规律的动情周期和正常的子宫状态。通过外科手术将1,095个由实施例5制备的重构胚胎移植到代孕母体中。为了实现这个目的，通过血管注射0.1mg/kg的乙烯丙嗪和6mg/kg的异丙酚使代孕母体麻醉，并用2％的异氟烷(isoflurane)维持麻醉状态。麻醉雌性狗在无菌条件下进行手术，用在普通的腹部手术中常用的在腹部的中心部位切开5-10cm，以露出输卵管。用手刺激腹腔以便于将卵巢、输卵管和子宫拉到切口处。小心处理拉出的卵巢的卵巢系膜以便于识别输卵管的开口，将装有1.0ml结核菌素注射器的3.5F雄猫导管(Sherwood，St.Louis，MO)插入到输卵管中以确保在导管的前端有足够的空间。在显微镜下观察核移植胚胎是否被成功地注射到输卵管中，然后将500ml生理盐水注射到腹腔中。用可以吸收的缝合线缝合腹部，然后缝合皮肤。为了预防手术后感染，注射3天广谱抗菌素。
将核移植胚胎移植到代孕母体中22天后，用附有7.0MHZ线性探针的SONOACE 9900(Medison Co.LTD，Seoul，Korea)超声扫描仪检测妊娠情况。在首次确定怀孕后，每2周用超声检测妊娠情况。结果表明有三只狗怀孕。其中，一只狗失败；在核移植胚胎移植后的60天，即2005年4月24日在剩余的两只狗中的一只狗中通过剖腹产得到第一只克隆狗。出生时的重量为530克且克隆的小狗显得很健康。克隆的小狗叫做“Snuppy”(Seoul NationalUniversity Puppy)。在对核移植胚胎进行移植后的60天，即2005年5月29日在剩下的另一只狗中通过剖腹产得到第二只克隆狗。出生时的重量为550克且克隆的小狗显得很健康。第二只克隆的小狗叫做“NT-2#”。
测试实施例1：本发明的克隆狗的基因身份的检测
根据本发明，对在实施例6中获得的克隆小狗“Snuppy”和“NT-2#”进行检测，以确定克隆小狗“Snuppy”和“NT-2#”是否与实施例3中供体狗阿富汗猎犬的核供体细胞具有相同的基因。
分离克隆小狗、供体狗、代孕母体和核供体的成纤维细胞的基因组DNA。为了实现该目的，从克隆小狗得到组织片段和收集供体狗和代孕母体的血液样本。将组织片段、血样本和成纤维细胞置于添加有400μg蛋白酶K的裂解缓冲液[0.05M Tris(pH 8.0)，0.05M EDTA(pH 8.0)，0.5％SDS]中孵育过夜。然后进行酚抽提和乙醇沉淀，以分离各样品中的基因组DNA。
将分离的基因组DNA样品溶解在50μl的TE中，然后用8个犬科动物的特定标记[PEZ01、PEZ02、PEZ08、PEZ15(见美国专利No.5874217)、REN162B09、REN105L03、REN165M10、FH2140(见http://www.fhcre.org/science/dog_genome/dog.html)]进行小随体分析(Francisco，L.V.等.Mann.Genome 7，359-3621996；Neff，M.W.等，Genetics.151，803-820，1999；Richman，M.等.J.Biochem.Biophys.Methods 47，137-149，2001；Denise，S.等.AnimalGenetics.35，14-17，2004)。以分离的基因组DNA作为模版，用根据公知标记序列制备的荧光标记的基因座位转移性的引物(表5)进行PCR扩增。用自动DNA序列分析仪(ABI373：Applied Biosystems，Foster City，CA)分析扩增产品。PCR反应条件为：在94℃预变性1分钟，接着在94℃变性20秒，58℃退火20秒，在74℃延长20秒，循环30次，最后在74℃延长5分钟。用专用软件(GeneScan and Genotype；Applied Biosytems)计算PCR产品的大小。
表5
用于PCR扩增的引物
Figure A20068002724600221
结果发现本发明生产的克隆狗“Snuppy”和“NT-2#”与供体狗阿富汗猎犬和从供体狗分离的成纤维细胞的基因完全相同。另一方面，本发明的克隆狗与代孕母体(拉布拉多猎狗或混合繁殖的狗)的基因相互不同(表6)。
表6
犬科动物特定微卫星基因座的分析
Figure A20068002724600231
测试实施例2：核供体细胞与去核的卵母细胞的电融合的条件的优化
为优化核供体细胞与去核的卵母细胞的电融合的条件，将核供体细胞按照实施例4的方式显微注射到去核的卵母细胞中，然后在不同的电压条件1.7-1.9KV/cm、2.1-2.5KV/cm和3.0-3.5KV/cm的条件下，使核供体细胞与卵母细胞相互融合。用立体显微镜观察重组胚胎的融合情况。
结果发现：在电压为3.0-3.5KV/cm的条件下，270个核移植卵母细胞中的203个是融合的。这表明在这种条件下融合效率比其它条件的融合效率高(表7)。
表7在本发明的电融合电压条件下的核移植胚胎的融合率
  使用的卵母细胞数   电压条件   融合的卵母细胞数
  30   1.7-1.9KV/cm、   10(33.3％)
  50   2.1-2.5KV/cm   22(44.0％)
  270   3.0-3.5KV/cm   203(75.2％)
测试实施例3：核移植胚胎激活条件的优化
用电学方法和化学方法激活实施例4获得的核移植胚胎。然后观察核移植胚胎的发育时期。在电学方法中，将实施例4获得的核移植胚胎置于含有100nM的CaCl2的甘露醇培养基(含0.26M的甘露醇，0.1mM的MgSO4，0.5mM的Hepes和0.05％的BSA)中，然后转移到装有不锈钢电线电极(BTX453，3.2mm的间隙；BTX，San Diego，CA)的细胞融合腔中。在平衡3分钟后，用BTX电细胞操作器在3.0-3.5KV/cM的直流电压下作用偶合体20秒钟，这样将供体细胞融合到卵母细胞中。
在化学方法中，将实施例4获得的核移植胚胎置于含有10mM的离子载体(Sigma)的mSOF中，并在39℃下培养4分钟。然后，将冲洗后的胚胎在添加有1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF(表4)中培养4小时。培养结束后，将胚胎转移到TCM199培养基中(表3)。
用立体显微镜在放大100倍下，观察由电学方法和化学方法激活的核移植胚胎的每一个发育时期。
结果表明：采用化学方法激活的核移植胚胎提高了发育潜力。也就是说，如果用化学方法激活核移植胚胎，80％的卵母细胞发展到2-细胞期，而用电学方法激活核移植胚胎，只有约53％的卵母细胞发展到2-细胞期。并且还发现：用化学方法激活的核移植胚胎能够发育到桑椹胚期，而用电学方法激活的核移植胚胎仅发育到16-细胞期(表8)。
表8
按照本发明方法激活核移植胚胎的发育时期
  激活   卵母细胞数   分裂(2-细胞期)   4-细胞期   8-细胞期   16-细胞期   桑椹胚期   胚泡期
  化学激活   50   40   20   16   8   2
  电学激活   40   21   8   5   1
测试实施例4：将本发明的的犬科动物的核移植胚胎移植到代孕母体中 的移植条件的优化
将实施例5激活的核移植胚胎在置于38-39℃的二氧化碳培养箱的mSOF(表4)中进行培养，且培养的空气含5％的CO2和5％的氧气。然后将生长到8-细胞期的胚胎浸入到含0.1％的胎牛血清的PBS中，接着用细管将胚胎移植到20条代孕母体(混合繁殖的狗)的子宫角中。
在移植核移植胚胎后的第22天，按照实施例6的方法用超声扫描仪(Medison Co.LTD，Seoul，Korea)检测妊娠情况。
结果发现：将核移植胚胎移植到子宫中，没有导致妊娠。这提示优选按照实施例6所述的方法将核移植胚胎移植到输卵管中。
工业适用性
如上文所述，本发明提供了生产克隆的犬科动物的方法。因此本发明有助于兽医学、人类学和医学方面研究的发展，如优良犬科动物的繁殖、稀少或濒危犬科动物的保护、异种移植和疾病动物模型。
序列表
<110>首尔大学校产学协力财团
<120>克隆的犬科动物及其生产方法
<160>16
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ01正义链引物
<400>1
ggctgtcact tttccctttc         20
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ01反义链引物
<400>2
caccacaatc tctctcataa atac    24
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ02正义链引物
<400>3
tcctctctaa ctgcctatgc         20
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ02反义链引物
<400>4
gcccttgaat atgaacaatg acactgtatc   30
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ08正义链引物
<400>5
tatcgacttt atcactgtgg              20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ08反义链引物
<400>6
atggagcctc atgtctcatc              20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ15正义链引物
<400>7
ctggggct taactccaagtt c            21
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEZ15反义链引物
<400>8
cagtacagag tctgcttatc             20
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN162B09正义链引物
<400>9
caaacttgac agtcttttca gga         23
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN162B09反义链引物
<400>10
gcattcaaga tgcaccaatg             20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN105L03正义链引物
<400>11
ggaatcaaaa gctggctctc t            21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN105L03反义链引物
<400>12
gagattgctg ccctttttac c           21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN165M10正义链引物
<400>13
aacagccaaa tcatggaagc             20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>REN165M10反义链引物
<400>14
agcacctcca tcctttcctt             20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FH2140正义链引物
<400>15
ggggaagcca tttttaaagc    20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FH2140反义链引物
<400>16
tgaccctctg gcatctagga    20

Claims (18)

1.一种制备犬科动物的核移植胚胎的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将犬科动物的成熟的卵母细胞的细胞核去除掉，以制备去核的受体卵母细胞；
(b)从供体犬科动物的组织中分离体细胞，以制备核供体细胞；
(c)将步骤(b)制备的所述核供体细胞显微注射到步骤(a)制备的所述去核的卵母细胞中，并在3.0-3.5KV/cm的电压下对供体细胞和去核的卵母细胞进行电融合；和
(d)激活步骤(c)制备的融合的卵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成熟的卵母细胞为在体内成熟的卵母细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，所述在体内成熟的卵母细胞是在排卵后48-72小时从犬科动物收集得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中的所述体细胞为选自由卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞和胚胎细胞所组成的组中的一种细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞为成纤维细胞或卵丘细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中的所述电融合在3.0-3.5KV/cm的直流电压下进行1-3次，每次10-30μs。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中的激活步骤是通过用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤对融合的卵母细胞进行同时或逐步的处理而进行的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述激活方法是通过用5-10μM的钙离子载体将融合的卵母细胞在37-39℃下处理3-5分钟，然后用1.5-2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤将融合的卵母细胞在37-39℃下处理4-5小时而进行的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述犬科动物选自由狗、狼、狐、豺、丛林狼、韩国狼和狸所组成的组中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述犬科动物选自由狗、狼和狐所组成的组中。
11.一种核移植胚胎，该核移植胚胎是由权利要求1-10中任意一项所述的方法制备的。
12.根据权利要求11所述的核移植胚胎，该核移植胚胎保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC 10831 BP。
13.一种生产犬科动物的方法，该方法包括将权利要求11或12所述的核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中以生产活体后代的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述犬科动物选自由狗、狼、狐、豺、丛林狼、韩国狼和狸所组成的组中。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述犬科动物选自由狗、狐和狼所组成的组中。
16.一种克隆的犬科动物，该克隆的犬科动物是由权利要求13所述的方法生产的。
17.根据权利要求16所述的克隆的犬科动物，其中，所述克隆的犬科动物的基因型与权利要求1所述的核供体细胞或核供体动物相同。
18.根据权利要求16所述的克隆的犬科动物，其中，所述犬科动物选自由狗、狼、狐、豺、丛林狼、韩国狼和狸所组成的组中。
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