KR20070013432A

KR20070013432A - 복제된 개과 동물 및 이의 생산 방법

Info

Publication number: KR20070013432A
Application number: KR1020050067736A
Authority: KR
Inventors: 황우석; 이병천; 강성근; 김민규; 장구; 오현주; 김혜진; 김정주; 후세인 샤밈 모하메드; 헤루 파이브리안토 유다
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-07-26
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2007-01-31
Also published as: US20100287635A1; CA2617047A1; EP1913132A1; CN101228265A; WO2007013763A1; KR100733012B1; JP2009502162A; RU2008102262A; AU2006273070A1; EP1913132A4; RU2391817C2

Abstract

본 발명은 복제된 개과 동물 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개과 동물의 성숙 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조한 다음 개과 동물의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여 상기 탈핵 난자에 최적화된 조건으로 핵 이식을 수행하여 핵 이식란을 제조하고, 이를 대리모의 난관에 이식하는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 복제된 개과 동물을 생산하는 효과가 있으며 이는 우량 개과 동물의 번식, 희귀· 멸종 위기의 개과 동물의 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.

복제, 개과 동물, 핵 이식, 체내 성숙 난자

Description

복제된 개과 동물 및 이의 생산 방법{Cloned Caninds And Method For Producing Thereof}

도 1은 본 발명에 따른 일 실시예에서 개로부터 난자를 회수하기 위하여 사용한 15 게이지 및 18 게이지 난자 회수용 니들 사진이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 생산된 복제견 Snuppy와 공여견의 사진(a) 및 복제견 Snuppy와 대리모의 사진(b)이다.

본 발명은 복제된 개과 동물 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개과 동물의 성숙 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조한 다음 개과 동물의 체세포를 공여 핵 세포로 이용하여 상기 탈핵 난자에 최적화된 조건으로 핵 이식을 수행하여 핵 이식란을 제조하고 이를 대리모의 난관에 이식하는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물에 관한 것이다.

최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵 이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어지고 있다.

체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다. 일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 체세포 공여 핵을 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다. 그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.

이러한 체세포 핵이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀·멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포·유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.

체세포 핵이식을 통한 동물복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).

한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다.

그러나, 아직까지 체세포 핵이식 방법에 의한 개과 동물의 복제가 성공된 사례는 보고 된 바 없다.

이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 개과 동물의 생산방법을 연구하던 중 전기융합 조건, 핵 이식란 활성화 조건 및 대리모 이식 조건을 최적화하여 최초로 체세포 핵이식 방법에 의해 복제된 개과 동물을 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 체세포 핵이식 기술을 이용한 개과 동물의 핵 이 식란 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용한 개과 동물의 핵 이식란 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 복제된 개과 동물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

용어정의

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 공여 핵 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 세포 및/또는 동물 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '공여 핵 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 공여 핵 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '성숙 난자'는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 난자를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 공여 핵 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 공여 핵 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 공여 핵 세포가 수핵 난자의 위란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 후 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.

본 발명에서 '개과 동물'로는 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리가 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066).

본 발명은 개과 동물의 체세포 핵 이식 기술을 사용한 복제시 핵 이식란의 전기융합 조건과 활성화 조건을 최적화하여 개과 동물의 핵 이식란을 제조하고, 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산함으로써 최초로 개과 동물의 복제를 수행하였다는 데에 특징이 있다.

구체적으로 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은 (a) 개과 동물의 성숙난자로부터 핵을 제거하는 단계;

(b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 공여 핵 세포를 미세주입하고 전압이 3.0∼3.5kv/cm인 조건으로 전기 융합시키는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 개과 동물의 핵 이식란 생산방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제1단계: 수핵 난자의 탈핵

수핵 난자는 개과 동물에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동물과는 달리 제1차 감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다. 개과 동물의 난자의 핵 성숙률이 매우 낮고, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서, 개과 동물의 수핵난자는 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 유도된 후 약 48∼72시간째, 보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 바람직 하다. 상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사(vaginal smear), 혈장 성 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다. 개과 동물의 발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액의 배출 여부를 통해 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈장 프로게스테론 농도 검사를 수행함으로써 무각화 상피 세포가 80% 이상이고 혈장 프로게스테론 농도가 약 4.0~7.5ng/mL일 때를 배란일로 간주하여 배란 후 48∼72시간, 바람직하게는 배란 후 약 72시간째에 난자를 회수하였다. 한편, 배란된 개과 동물의 난자의 성숙시기는 배란 후 48∼72시간으로 알려져 있으며 본 발명자들은 배란 후 48시간째, 60시간째 및 72시간째에 난자를 회수하여 확인해 본 결과 배란 후 약 72시간째 회수된 난자가 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 해당하는 성숙 난자임을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명에서 실제로 복제견의 생산에 성공한 난자도 72시간째 회수된 난자였다. 따라서, 개과 동물의 성숙 난자의 회수는 배란 후 약 72시간째가 가장 바람직함을 알 수 있었다.

생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.

또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있는 장점이 있다.

따라서, 바람직하게는 생체 내 성숙 난자의 회수는 난관을 손상시키지 않는 카테터를 이용한 방법을 사용한다. 한편, 본 발명자들은 카테터를 이용한 난자 회수 방법에 있어서 회수율을 높이기 위해 니들의 앞부분이 둥글게 처리되어 있어 난관 입구에 장착이 용이한 난자 회수용 니들을 새롭게 개발하였다(도 1 참조). 보다 구체적으로 본 발명자들이 개발한 니들을 이용한 난자 회수방법은 앞부분이 둥글게 처리된 난자 회수용 니들을 난관 내에 삽입-결찰한 후 난관-자궁 접합부에 난자 회수용 배지를 관류시켜 상기 난자 회수용 니들에 관류액이 유입되도록 하고 상기 관류액을 현미경으로 검경하여 성숙한 난자를 수득하는 방법이다.

성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허 제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992).

바람직하게는, 수핵 난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipet)을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난자의 탈핵은 수핵 난자의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난자에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난자에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.

제2단계: 공여 핵 세포의 제조

공여 핵 세포로는 개과 동물로부터 유래된 체세포가 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개과 동물의 배아세포(embryonic cell), 태아세포(fetus cell), 유세포(juvenile cell), 성체세포(adult cell), 바람직하게는 성체세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 및 성체 섬유 아세포, 난구세포일 수 있다.

나아가, 본 발명에서 사용되는 공여 핵 세포는 상기 야생형 체세포에 특정 유전자를 삽입하거나 조작하여 염색체를 유전자 이식방법이나 유전자 적중법을 이용하여 형질전환시킨 것일 수 있다. 상기 유전자 이식방법이나 유전자 적중법은 당업계에 공지된 방법이므로 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.

공여 핵 세포로서 제공되는 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 공지된 방법을 사용하여 단일세포를 수득할 수 있다. 예를 들면, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 조직 배양용 배지에서 3∼4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 완전히 다 자라면 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 10번 계대 배양 이하를 전제로 하여 세포가 과도하게 커지는 것을 방지한다.

상기에서 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다.

제3단계: 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합

탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.

상기에서 공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압 3.0∼3.5kV/cm 조건으로 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 직류 전압 3.0∼3.5kV/cm 조건으로 10∼30㎲ 동안 1∼3회 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 직류 전압 3.0∼3.5kV/cm 조건으로 20㎲ 동안 2회 수행할 수 있다. 상기에서 전압이 3.0kV/cm 미만이거나 또는 3.5kV/cm을 초과하는 경우에는 매우 낮은 융합율을 보인다. 상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위(1.7∼2.0kv/cm) 보다 높은 특징이 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 전기융합시 최적 전압 범위를 결정하기 위하여 공여 핵 세포를 미세주입한 핵 이식란을 각기 다른 전압 범위에서 전기적으로 융합한 다음 현미경으로 검경하여 융합율을 조사하였다(실험예 2 참조). 그 결과, 낮 은 전압에서보다 높은 전압에서의 핵 융합율이 높게 나타남을 알 수 있었으며 전압 범위가 3.0∼3.5kV/cm인 경우 융합율이 75.2%로 가장 높게 나타남을 알 수 있었다(표 7 참조).

공여 핵 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 융합용 배지 내에서 수행할 수 있다. 상기 융합용 배지로는 만니톨, MgSO₄, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다.

제4단계: 융합된 핵 이식란의 활성화

융합된 핵 이식란의 활성화는 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 단계이다. 이를 위해서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키타제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야 한다. 일반적으로 핵 이식란을 활성화하는 방법은 전기적 방법 및 화학적 방법이 있다. 본 발명에서는 핵 이식란의 활성화를 위한 방법으로 화학적 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 화학적 방법은 전기적 활성화 방법에 비해 본 발명에 따른 핵 이식란의 활성화를 보다 많이 촉진할 수 있다. 상기에서 화학적 방법으로는 에탄올, 이노시톨 트리포스페이트, 2가 이온(예를 들어 Ca²⁺ 또는 Sr²⁺), 미소관 억제제(microtubule inhibitors, 예를 들어 사이토칼라신 B), 2가 이온 이오노포어(ionophore)(예를 들어, Ca²⁺ 이오노포어 이노마이신), 단백질 키나제 억제제(예를 들어, 6-디메틸아미노퓨린), 단백 질 합성 억제제(예를 들어, 사이클로헥시미드), 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 물질을 처리하는 방법이 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 핵 이식란의 활성화를 위한 화학적 방법으로는 칼슘 이오노포어와 6-디메틸아미노퓨린을 핵 이식란에 동시에 처리하거나 단계적으로 처리하는 방법을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 칼슘 이오노포어 5∼10μM을 37~39℃에서 3∼6분 동안 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린 1.5mM∼2.5mM을 37∼39℃에서 4∼5시간 동안 처리한다.

본 발명의 일 실험예에서는 상기 핵 이식란을 전기적 방법과 화학적 방법으로 각각 활성화한 후 핵 이식란의 발육정도를 측정하였다(실험예 3 참조). 그 결과, 핵 이식란의 활성에 있어서 화학적 방법이 전기적 방법에 비해 보다 더 우수함을 확인할 수 있었으며, 화학적 방법에 의해 핵 이식란을 활성화함으로써 상실배기까지 발육시킬 수 있음을 확인하였다(표 8 참조).

따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공한다. 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 개과 동물의 핵 이식란을 Snuppy(cloned canine embryo)라 명명하고, 2005년 7월 15일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 10831BP로 기탁하였다. 상기 핵 이식란은 동결 보존한 후 필요한 때에 이를 용해시켜 사용할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 개과 동물의 핵 이식란은 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 복제된 개과 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵 이식란의 대리모 이식은 대리모의 난관에 이식을 수행한다. 이식은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여 복제 배아를 이식할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식함으로써 복제견 Snuppy와 NT-2#을 처음으로 생산하였다(실시예 6 참조). 그러나, 본 발명의 일실험예에서 본 발명에 따른 핵 이식란을 대리모의 자궁에 이식한 경우에는 임신되지 않음을 확인하였다(실험예 4 참조). 따라서, 복제견의 생산에 있어서 핵 이식란의 이식은 대리모의 난관에 수행하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

한편, 상기 대리모 이식에 있어서 상기 핵 이식란은 1세포기(바로 만들어진 복제란)이거나 2 세포기 또는 4 세포기의 것일 수 있다. 또한 상기 핵 이식란은 대리모가 준비되기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25㎕ 미세유적(microdrop)에서 배양할 수 있다.

따라서, 본 발명은 복제된 개과 동물을 제공한다. 상기 복제된 개과 동물은 공여 핵 세포 또는 공여체와 완전히 동일한 유전적 특성을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 복제견을 생산하고 이의 유전적 특성을 마이 크로세틀라이트 분석방법을 이용하여 분석하였다(실험예 1 참조). 그 결과, 본 발명에 따른 복제견은 공여 핵 세포 또는 공여체와 완전히 동일한 유전적 특성을 가짐을 확인할 수 있었다(표 6 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

개로부터 수핵 난자의 회수

수핵 난자의 회수를 위해 사용한 개는 1∼3살의 잡종 암캐 131마리로 서울대학교의 사육관리 연구소에서 확립한 표준에 따라 사육하였다. 발정기가 시작된 개를 대상으로 질세포 도말검사(vaginal smear)와 혈청 프로게스테론의 농도를 매일 측정하여 배란일을 결정하고, 배란일로부터 48∼72시간 후의 성숙 난자를 회수하였다.

혈청 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득한 다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역 분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0∼7.5ng/ml가 되면 배란일로 간주하였다(Hase et al., J. Vet. Med. Sci., 62:243-248, 2000).

질세포 도말검사는 발정기의 초기 증후가 나타난 날로부터 매일 표본을 수득함으로써 수행하였다. 질세포 표본은 면봉을 외음부로 삽입함으로써 수집하였고 이를 슬라이드 글라스 위에 도말하였다. 그 다음 디프-퀴(Diff-Quik) 염색(International chemical co., Japan)으로 염색한 후 현미경으로 검경하여 표피세포가 상피세포 인덱스(cornified index, Evans J.M. et al., Vet. Rec, 7:598-599, 1970)의 80%이상인 경우를 배란시기로 간주하였다.

배란된 난자의 성숙 시기는 배란 후 48∼72시간째 인 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 배란 후 48∼72시간 째의 난자를 다음과 같은 방법으로 회수하였다.

먼저, 체내 성숙 난자의 채취시기에 이른 암캐에 아트로핀 설페이트(Atropin sulfate, 0.05mg/kg)와 아세프로마진 말레이트(acepromazine maleate, 0.025mg/kg)를 투여하고 케타민(ketamine, 5mg/kg)을 투여하여 마취시켰다. 상기 마취상태는 이소플루란(isoflurane)을 투여함으로써 유지하였다.

상기 마취된 개를 대상으로 무균적적으로 외과 수술을 수행하여 중간 복부 부분을 5~10cm를 절개하여 난관이 노출되도록 하였다. 그 다음 앞부분을 둥글게 처리한 니들(도 1)을 난관 복강구에 삽입하고 삽입된 니들이 고정되도록 일시적으로 봉합사를 이용하여 상기 니들을 고정시켰다. 그 다음 난관-자궁 접합부에 24 게이지 IV 카테터를 장착하여 난자 회수용 배지(표 1)를 관류시킴으로써 관류액이 16 게이지 니들 쪽으로 흘러 나가게 하였다. 상기 관류액을 멸균 페트리 디쉬에 회수하고 현미경으로 검경하여 성숙 난자를 선별하였다.

난자 회수용 배지

성분	함량
TCM powder 1L 용(Gibco 31100-027)	9.9g
P/S 항생제	1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
HEPES 완충액	2.38g
FBS	10%(v/v)
NaHCO₃	0.1680g
BSA	5mg/L

실험 결과, 1마리의 개에게서 평균 12개의 성숙 난자를 수득하였으며 총 1370개의 난자를 수득하였다.

<실시예 2>

수핵 난자의 탈핵

Ca² ⁺무첨가 CR2 배지(Charles Rosenkrans 2)(Rosenkrans et al., Biol . Reprod. 49, 459-462, 1993)에 헤페스-버퍼를 첨가하여 제조한 hCR2aa 배지(표 2)에 0.1%(v/v) 히알루로니다제(Sigma, USA)를 첨가한 후 상기 실시예 1에서 수득한 난자를 넣고 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 비스벤지미드(Hoechst 33342)로 5분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 ×200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다. hCR2aa 배지(표 2)에 10%(v/v) FBS와 5㎍/mL 사이토칼라신 B를 첨가한 후 상기에서 선별된 난자를 넣고 미세조작장치(micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체와 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)을 제거하였다. 상기 과정을 거쳐 탈핵된 난자는 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199 배지(표 3)에 넣어 보관하였다.

hCR2aa 배지 조성

성분		함량
NaCl 3.1 g/50ml KCl 0.1050 g KH₂PO₄ 0.0230 g P/S 5 ml Phenol-red 400㎕	mCR2-S	4ml
NaHCO₃1.0531 g/50ml	St-B	640㎕
HEPES 0.5958 g/10ml	St-E	1680㎕
NEAA		400㎕
Glycine 0.0275 g/10ml	Glycine	400㎕
BSA		0.12g

TCM-199 배지 조성

성분	함량
TCM199 liquid	89ml
pyruvic acid	0.0099g
P/S(항생제)	1ml
FBS	10%

<실시예 3>

공여 핵 세포의 제조

공여 핵 세포로는 개로부터 수득한 성체섬유아세포를 사용하였다. 이를 위해 먼저 아프간 하운드(Afghan Hound, 3살)의 귀 피부 조직을 분리하였다. 상기 귀 피부 조직 단편을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3회 세척하고 외과용 칼로 잘게 세절하였다. 상기 세절한 피부조직을 0.25%(w/v) 트립신 및 1mM EDTA가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지(DMEM Life Technologies, Rockville, MD)에 넣고 37℃로 1시간 동안 처리하였다. 트립신에 의해 분해 된 세포를 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 무첨가 DPBS로 1회 세적하고 300×g로 2분간 원심분리한 후 100mm 플라스틱 배양용 접시에 옮겼다. 그 다음 상기 세포를 10%(v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO₃ 및 1%(v/v) 최소 필수 배지 비필수 아미노산 용액(Life Technologies)이 첨가된 DMEM 배지에서 39℃, 5% CO₂의 조건 하의 포화습도 배양기 내에서 6∼8일간 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 나머지 세포는 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA를 이용하여 1분간 트립신 분해하여 4 내지 6일 간격으로 계대배양하였다. 그 다음 80%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 10%(v/v) FBS로 이루어진 냉동용 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다.

<실시예 4>

탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합

상기 <실시예 2>에서 제조한 탈핵 난자에 상기 <실시예 3>에서 제조한 공여 핵 세포를 미세주입하였다. 상기 <실시예 2>의 미세조작장치 상의 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후 정치된 탈핵 난자를 100㎍/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)이 함유된 hCR2aa 배지를 처리하고 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 <실시예 3>에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다.

상기에서 공여 핵 세포가 주입된 난자를 융합 배지(0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO₄, 0.5mM 헤페스 및 0.05% BSA)에 넣고 스테인레스 스틸 전극이 장착된 세포 융합 챔버(BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA)로 옮겼다. 3분간 평형시킨 다음 BTX 전기-세포 조작장치(Electro-Cell Manipulator)를 이용하여 상기 난자를 전압 3.0~3.5kV/cM으로 20초간 직류 전류를 통전하여 핵 이식란을 융합시켰다. 상기에서 전압은 회수된 난자가 약한 난자인 경우에 낮은 전압으로(3.0kv/cM에 근접하도록), 건강한 난자인 경우에는 높은 전압(3.5kv/cM에 근접하도록)으로 융합을 수행하였으며, 평균 3.3kv/cM의 전압으로 융합을 수행하였다.

융합된 핵 이식란을 입체 현미경으로 검경하여 1,095개를 선별하였고 이를 mSOF(modified synthetic oviductal fluid)(표 4)에서 3시간 동안 배양하였다(Jang et al., Reprod Fertil Dev, 15, 179-185, 2003).

mSOF의 조성

성분		부피
NaCl(54.44) 2.900-3.100g/ml KCl(74.55) 0.2669g KH₂PO₄(136.1) 0.0810g Sod. Lactate 0.28ml Kanamycin 0.0375g Phenol-Red 0.0050g	Stock-T	2ml
NaHCO₃(84.01) 1.0531g/50ml 0.42124g/20ml	Stock-B	2ml
Sod. Pyruvate(110.0) 0.0182g/5ml	Stock-C	200㎕
MgCl₂6H₂O(147.0) 0.0996g/10ml	Stock-M	200㎕
CaCl₂2H₂O(203.3) 0.2514g/10ml	Stock-D	200㎕
Glucose(180) 0.27024g/10ml		200㎕
Glutamine(146.1) 0.14618g/10ml		200㎕
Citri Acid(192) 0.096g/10ml	Stock-CA	200㎕
HEPES(238.3) 0.5958g/10ml	Stock-E	200㎕
EAA(Gibco 11051-018)		400㎕
NEAA(Gibco 11140-019)		200㎕
ITS(I-3146)		100㎕
BSA(fatty acid free)		0.1600g
Hyaluronic Acid	0.5mg/ml
1N NaOH
D.W.		총 20ml
pH 7.2-7.4 삼투압 275-285 EAA, NEAA는 빛에 민감하므로 주의 Phenol-Red는 지시약이므로 배지에 첨가하는 양 중요하지 않음.

<실시예 5>

핵 이식란의 활성화

상기 <실시예 4>에서 수득한 핵 이식란을 10μM 이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF(표 4)에 넣고 39℃에서 4분간 배양하였다. 그 다음 상기 핵 이식란을 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF에서 4시간 동안 추가로 배양하였다.

본 발명자들은 상기에서 제조한 핵 이식란 중 하나를 Snuppy(cloned canine embryo)라 명명하고, 2005년 7월 15일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 10831BP로 기탁하였다.

상기 핵 이식란은 대리모에 이식하기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25㎕ 미세유적(microdrop)에서 배양하였다.

<실시예 6>

대리모 이식 및 복제견의 생산

상기 <실시예 5>의 핵 이식란을 외과적 수술방법에 의해 대리모의 난관에 이식하였다. 이식은 상기 <실시예 5>에서 핵 이식란을 활성화한 후 대리모의 준비상태에 따라 수행하였다. 즉, 대리모가 바로 준비되는 경우에는 이식을 바로 수행하였고 그렇지 않은 경우에는 핵 이식란을 활성화한 다음날(복제 배아 단계: 2 세포기 또는 4 세포기)에 이식을 수행하였다. 대리모로는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 잡종견 및 라브라도 리트리버로 이루어진 123마리의 개를 사용하였다. 상기 대리모에 상기 <실시예 5>의 핵 이식란 1,095개를 외과적 수술방법에 의해 이식하였다. 이를 위해 먼저 대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진(acepromazine)과 6mg/kg 프로포폴(propofol)을 혈관주사하여 마취시켰고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 배 중앙부분을 5~10cm 절개하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰 캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다. 핵 이식란의 주입여부는 현미경을 검경하였고 항생제를 혼합한 생리식염수 500ml를 복강 내 주입하였다. 복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하였고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일간 투여하였다.

임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 22일째에 7.0 MHZ 리니어 프로브가 장착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다. 임신상태는 초기에 임신을 확인한 후 2주마다 모니터하였다. 그 결과, 3마리의 개에게서 임신 사실을 확인하였다. 그 중 한 마리는 유산하였고, 나머지 한 마리로부터 핵 이식란을 이식한지 60일 후에 2005년 4월 24일 제왕절개 수술로 복제견이 분만되었다. 복제견의 체중은 530g으로 건강하였다. 복제견의 이름은 "Snuppy"(Seoul National University puppy)로 명명하였다. 또한, 나머지 한 마리로부터 핵 이식란을 이식한지 60일 후에 2005년 5월 29일 제왕절개 수술로 복제견이 분만되었다. 복제견의 체중은 550g으로 건강하였으며, 이름을 NT-2#로 명명하였다.

<실험예 1>

본 발명의 방법에 따라 생산된 복제견의 유전적 동질성 조사

본 발명의 방법에 따라 상기 <실시예 6>에서 수득한 복제견 Snuppy와 복제견 NT-2#가 상기 <실시예 3>의 공여 핵 세포를 제공한 공여견인 아프칸 하운드와 유전적으로 동일한지를 조사하였다. 이를 위해 복제견, 대리모, 공여 핵 세포인 섬유아세포의 게놈 DNA를 분리하였다. 먼저, 복제견의 꼬리로부터 조직 단편을 회수하였고 공여견 및 대리모로부터는 혈액 시료를 회수하였다. 상기 조직 단편, 혈액 및 섬유아세포를 400㎍ 프로테이나제 K가 첨가된 용해 완충액[0.05M 트리스(pH 8.0), 0.05M EDTA(pH 8.0), 0.5% SDS]에 각각 넣고 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전을 수행하여 각 시료로부터 게놈 DNA를 분리하였다.

상기에서 분리된 DNA를 50㎕ TE에 용해시키고 이를 이용하여 8개의 개과 동물에 특이적인 마커[PEZ01, PEZ02, PEZ08, PEZ15(미국특허 제5874217호 참조), REN162B09, REN105L03, REN165M10, FH2140(http://www.fhcre.org/science/dog_ genome/dog.html 참조)](Francisco, L.V. et al. Mamm . Genome 7, 359-362 1996; Neff, M.W. et al. Genetics. 151, 803-820, 1999; Richman, M. et al. J. Biochem. Biophys. Methods 47, 137-149, 2001; Denise, S. et al. Animal Genetics. 35, 14-17, 2004)를 이용한 마이크로세틀라이트 분석을 수행하였다. 상기에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 공지된 마커들의 서열을 기초로 하여 제조한 형광 표지된 부위 특이적 프라이머(표 5)를 이용하여 PCR 증폭을 수행한 후 PCR 증폭 산물을 자동 DNA 서열분석기(ABI 373: Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 분석하였다. PCR 증폭 조건으로는 94℃에서 1분간 1회 전변성시킨 후 94℃에서 20초간 변성, 58℃에서 20초간 어닐링, 74℃에서 20초간 신장하는 단계를 30회 수행하고 74℃에서 5분간 1회 후신장 단계를 거치도록 하였다. 또한, PCR 산물의 크기를 분석하기 위하여 소프트웨어(GeneScan and Genotyper, Applied Biosystems)를 사용하였다.

PCR 증폭에 사용된 프라이머

프라이머		서열	서열번호
PEZ01	센스	5'-GGCTGTCACTTTTCCCTTTC-3'	1
PEZ01	안티센스	5'-CACCACAATCTCTCTCATAAATAC-3'	2
PEZ02	센스	5'- TCCTCTCTAACTGCCTATGC-3'	3
PEZ02	안티센스	5'-GCCCTTGAATATGAACAATGACACTGTATC-3'	4
PEZ08	센스	5'-TATCGACTTTATCACTGTGG-3'	5
PEZ08	안티센스	5'-ATGGAGCCTCATGTCTCATC-3'	6
PEZ15	센스	5'-CTGGGGCTTAACTCCAAGTTC-3'	7
PEZ15	안티센스	5'-CAGTACAGAGTCTGCTTATC-3'	8
REN162B09	센스	5'-CAAACTTGACAGTCTTTTCAGGA-3'	9
REN162B09	안티센스	5'-GCATTCAAGATGCACCAATG-3'	10
REN105L03	센스	5'-GGAATCAAAAGCTGGCTCTCT-3'	11
REN105L03	안티센스	5'-GAGATTGCTGCCCTTTTTACC-3'	12
REN165M10	센스	5'-AACAGCCAAATCATGGAAGC-3'	13
REN165M10	안티센스	5'-AGCACCTCCATCCTTTCCTT-3'	14
FH2140	센스	5'-GGGGAAGCCATTTTTAAAGC-3'	15
FH2140	안티센스	5'-TGACCCTCTGGCATCTAGGA-3'	16

실험 결과, 본 발명의 방법에 따라 생산된 복제견 Snuppy와 NT-2^#는 공여견인 아프간 하운드 및 상기 아프간 하운드로부터 분리한 섬유아세포와 유전적으로 완전히 동일함을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명의 복제견과 대리모(래브라도 리트리버 또는 잡종견)는 유전적으로 상이함을 확인할 수 있었다(표 6).

개과 동물의 특이적인 마이크로세틀라이트 부위 분석

마커	공여견(아프간 하운드)				복제견 (Snuppy, 꼬리 조직 단편)		대리모 (래브라도 리트리버, 혈액 림프구)		복제견 (NT-2#, 꼬리조직단편)		대리모 (잡종견, 혈액 림프구)
	혈액 림프구		공여 핵 섬유아세포		복제견 (Snuppy, 꼬리 조직 단편)		대리모 (래브라도 리트리버, 혈액 림프구)		복제견 (NT-2#, 꼬리조직단편)		대리모 (잡종견, 혈액 림프구)
	피크1	피크2	피크1	피크2	피크1	피크2	피크1	피크2	피크1	피크2	피크1	피크2
PEZ01	110	118	110	118	110	118	118		110	118	119	123
PEZ02	123	230	123	230	123	230	114	126	123	230	126	134
PEZ08	230		230		230		232		230		215	219
PEZ15	214		214		214		208	217	214		214	244
REN162B09	191	195	191	195	191	195	181		191	195	182	192
REN105L03	235		235		235		235	243	235		248	252
REN165M10	187	191	187	191	187	191	177	187	187	191	179	187
FH2140	122		122		122		131		122		121	131

<실험예 2>

핵 이식란의 전기적 융합 조건의 최적화

핵 이식란의 전기적 융합 조건을 최적화하기 위하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 탈핵 난자에 공여 핵 세포를 미세주입한 후 전압조건을 각각 1,7∼1.9kv/cm, 2.1∼2.5kv/cm, 3.0∼3.5kv/cm의 조건으로 달리하여 융합시킨 다음 융합된 핵 이식란을 입체 현미경으로 검경하여 융합여부를 확인하였다.

실험 결과, 전압을 3.0∼3.5kv/cm으로 한 경우 핵 이식란 270개 중 203개가 융합된 것으로 나타나(융합율 75.2%), 다른 조건에 비해 융합 효율이 매우 높음을 확인할 수 있었다(표 7).

전기적 융합시 전압 조건에 따른 핵 이식란의 융합율

사용한 난자수	전압 조건	융합된 난자의 수
30	1.7~1.9 kV/cm	10 (33.3%)
50	2.1~2.5 kV/cm	22(44.0%)
270	3.0~3.5 kV/cm	203(75.2%)

<실험예 3>

핵 이식란의 활성화 조건의 최적화

상기 <실시예 4>에서 수득한 핵 이식란을 전기적 방법 또는 화학적 방법에 의해 활성화시키고 핵 이식란의 발육정도를 관찰하였다. 핵 이식란의 전기적 방법에 의한 활성화는 상기 <실시예 4>의 핵 이식란을 칼슘(CaCl₂) 100nM이 첨가된 만니톨 배지(0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO₄, 0.5mM 헤페스 및 0.05% BSA)에 넣고 스테인레스 스틸 전극이 장착된 세포 융합 챔버(BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA)로 옮겼다. 3분간 평형시킨 다음 BTX 전기-세포 조작장치(Electro-Cell Manipulator)를 이용하여 상기 난자를 전압 3.0~3.5kV/cM으로 20초간 직류 전류를 통전하였다. 화학적 활성화 방법으로는 <실시예 4>의 핵 이식란을 10μM 이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39℃에서 4분간 배양한 다음 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 4)에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 완료된 후 TCM199 배지(표 3)로 옮겨 핵 이식란의 발육정도는 입체 현미경으로 100배로 검경하여 확인하였다.

실험 결과, 핵 이식란의 활성화 방법에 있어서 화학적인 방법이 전기적 방법에 비해 보다 더 우수함을 확인할 수 있었다. 즉, 화학적 방법에 의해서 활성화한 경우 2세포기까지 도달한 난자는 80%였으나 전기적 방법을 사용한 경우에는 약 53%만이 2세포기에 도달하였음을 확인하였다. 또한, 화학적 방법을 사용하면 핵 이식란이 상실배기까지 발육되었으나 전기적 방법을 사용한 경우에는 16세포기까지 밖에 발육되지 않음을 알 수 있었다(표 8).

활성화 방법에 따른 핵 이식란의 발육

활성화방법	난자수	분할(2세포기)	4세포기	8세포기	16세포기	상실배기	배반포기
화학적방법	50	40	20	16	8	2
전기적방법	40	21	8	5	1

< 실험예 4>

본 발명에 따른 개의 핵 이식란의 대리모 이식 조건의 최적화

상기 <실시예 5>에서 활성화한 핵 이식란을 mSOF 배지(표 4)에서 38∼39℃의 5% 이산화탄소, 5% 산소가 유지되는 배양기에서 배양하여 8세포기 까지 자란 배아를 0.1% 소태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고 이를 스트로우에 장착한 다음 20마리의 대리모(잡종견)의 자궁각에 이식하였다.

임신여부는 상기 <실시예 6>과 동일한 방법으로 핵 이식란을 이식한 후 22일째에 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다.

실험 결과, 자궁에 핵 이식란을 이식한 경우에는 모두 임신이 되지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 핵 이식란은 <실시예 6>에 예시한 바와 같이 난관에 이식하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 복제된 개과 동물을 생산하는 효과가 있으며 이는 우량 개과 동물의 번식, 희귀·멸종 위기의 개과 동물의 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Cloned Caninds And Method For Producing Thereof <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ01 sense primer <400> 1 ggctgtcact tttccctttc 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ01 antisense primer <400> 2 caccacaatc tctctcataa atac 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 sense primer <400> 3 tcctctctaa ctgcctatgc 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 antisense primer <400> 4 gcccttgaat atgaacaatg acactgtatc 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ08 sense primer <400> 5 tatcgacttt atcactgtgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ08 antisense primer <400> 6 atggagcctc atgtctcatc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ15 sense primer <400> 7 ctggggctta actccaagtt c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ15 antisense primer <400> 8 cagtacagag tctgcttatc 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN162B09 sense primer <400> 9 caaacttgac agtcttttca gga 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN162B09 antisense primer <400> 10 gcattcaaga tgcaccaatg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN105L03 sense primer <400> 11 ggaatcaaaa gctggctctc t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN105L03 antisense primer <400> 12 gagattgctg ccctttttac c 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN165M10 sense primer <400> 13 aacagccaaa tcatggaagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REN165M10 antisense primer <400> 14 agcacctcca tcctttcctt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2140 sense primer <400> 15 ggggaagcca tttttaaagc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2140 antisense primer <400> 16 tgaccctctg gcatctagga 20

Claims

(a) 개과 동물의 성숙난자로부터 핵을 제거하는 단계;

(b) 개과 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하여 공여 핵 세포를 제조하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 공여 핵 세포를 미세주입하고 전압이 3.0∼3.5kv/cm인 조건으로 전기 융합시키는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 개과동물의 성숙난자는 생체 내로부터 회수된 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 생체 내로부터 회수는 개과 동물의 배란일로부터 48∼72시간에 수행하는 것임을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 전기융합은 직류 전압 3.0∼3.5kV/cm 조건으로 10~30㎲ 동안 1~3회 수행하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 활성화시키는 단계는 칼슘 이오노포어 및 DMAP(6-dimethylaminopurine)를 융합된 난자에 동시에 처리하거나 단계적으로 처리하는 것을 특징으로 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 칼슘 이오노포어 5∼10μM을 37~39℃에서 3∼5분 동안 처리한 다음 DMAP(6-dimethylaminopurine) 1.5mM~2.5mM을 37∼39℃에서 4∼5시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대 및 여우로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 핵 이식란.
제11항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10831BP인 핵 이식란.
제11항 또는 제12항의 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산 방법.
제13항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산 방법.
제13항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대 및 여우로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산 방법.
제13항의 방법에 따라 생산된 복제된 개과 동물.
제16항에 있어서, 상기 복제된 개과 동물이 제1항의 공여 핵 세포 또는 공여동물과 동일한 유전형질을 갖는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물.
제16항에 있어서, 상기 개과 동물이 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 복제된 개과 동물.