CN107058392A - 一种气动注射器的细胞抽核方法 - Google Patents

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刘曜玮
孙明竹
崔茂盛
王雪锋
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明提供了一种气动注射器的细胞抽核方法。该方法的特点是在抽核过程中，在微针的前端先吸入一段液体，再继续进行抽核。该方法包括：通过气动注射器对抽核用的微针内部施加正压；将微针浸入操作液中，减小微针中的正压通过毛细作用抽取卵母细胞操作液到微针前端；将微针刺入细胞，减小微针中的正压，通过毛细作用实现细胞的抽核行为，进而实现了此种减小细胞损伤的抽核过程。

Description

一种气动注射器的细胞抽核方法
技术领域
本发明属于细胞级别的显微操作技术领域。
背景技术
细胞的抽核过程是核移植、克隆等生物操作的关键步骤。通过学习，我们了解到当前的细胞抽核方法主要为液动注射器的细胞抽核方法，该抽核方法主要将注意力集中在了抽核成功率上，因液动注射器抽核方法无法对抽核过程中的压强实时反馈，难以判定抽核过程对于细胞的损伤，因而对于抽核操作本身对于细胞损伤的研究较少。但抽核操作本身对于细胞的损伤会对后续的细胞核移植、克隆等操作又会造成较大影响，因此设计一个能减小细胞损伤的细胞抽核方法十分必要。
发明内容
本发明目的是解决抽核操作本身对于细胞所造成的损伤问题，提供一种气动注射器的细胞抽核方法，以便减小细胞抽核所受的伤害，提高细胞抽核操作后的细胞发育潜力以及后期的克隆、核移植操作的成功率。
本发明提供了一种气动注射器的细胞抽核方法，所述方法特别在抽核用的微针前端吸取一些操作液，进而实现了在抽核过程中减小了对细胞所造成的损伤。
所述方法具体包括以下步骤：
第1、通过气动注射器对微针施加正压。
具体操作：在已经将待抽核的细胞准备好并固定住后，通过气动注射器对抽核用的微针施加正压，根据平衡压模型：
Pi＝Pout+2σcosα/R
其中，Pi表示平衡压，Pout表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管内壁半径。
通过气动注射器对微针施加的正压不能超过外界气压与针口位置毛细作用产生的压强的和，否则微针内部的气体会喷射出来；
第2、将抽核用的微针浸入操作液，减小微针中的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针前端。
具体操作：将抽核用的微针浸入操作液，并移动至显微视野当中，减小微针中给定的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针的前端，准备进行抽核；
第3、将微针刺入细胞中以进行后续的抽核操作。
具体操作：移动微针以及细胞使抽核用的微针以及细胞在一个显微视野范围内，将抽核用的微针刺入细胞内细胞核位置附近准备后续的抽核操作。
第4、减小微针中的正压，通过毛细作用实现细胞的抽核行为，进而实现了此种减小细胞损伤的抽核过程。
此时微针会通过毛细作用实现胞质以及细胞核的抽取。并且因为微针管内有一段液体，可以实现抽核过程中对细胞损伤的减小。
本发明的优点和积极效果：
本发明实现了一种气动注射器的细胞抽核方法。该方法较以往的细胞抽核方法，抽核成功率基本不变，其中，未吸取卵母细胞操作液到微针内部进行抽核操作的实验进行了4次，囊胚情况分别为：操作10个细胞获得1个囊胚，操作10个细胞获得1个囊胚，操作20个细胞获得2个囊胚以及操作20个细胞获得2个囊胚，囊胚率为10％，而吸取了卵母细胞操作液后进行抽核操作的实验得到的囊胚情况为：操作17个细胞获得4个囊胚，操作22个细胞获得4个囊胚以及操作14个细胞获得3个囊胚，囊胚率为21％。较以往抽核方法提高了2倍。实现了减小细胞损伤的抽核方法，为后续提高克隆成功率打下了基础。
附图说明
图1实验流程框架图。
图2为抽核方法的抽核流程图(左：原理图；右：实验图)。
图3为细胞电融合示意图。
图4为未吸取操作液和吸取操作液进行抽核的对照图(左：未吸取操作液；右：吸取
操作液)。
具体实施方式
实施例1
本实施例为克隆操作的抽核过程，其中所使用的卵母细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞，使用的核供体细胞为“加系”大白猪胎儿细胞。
卵母细胞的获取方法如下：
卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。卵母细胞从卵巢上的2到6毫米直径的小囊中抽取，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到的这些细胞为本例中所用卵母细胞。
核供体细胞的准备：在纯种“加系”大白母猪怀孕35日龄，屠宰取胎儿，放入盛有冰块的保温桶中带回实验室。无菌操作去除胎儿头和四肢后，将肌肉组织切碎，用组织培养液洗涤后，倒入细胞培养液进行组织块贴壁培养建立细胞系原代，在体外经次传代后用于体细胞核移植。
本发明的抽核方法实验采用NK-MR601显微操作系统进行，该装置系统构架中包括将在显微视野范围内放置细胞群的移动载物台，包括两个三自由度的操作臂，包括用于固定卵母细胞的吸持微针，包括用于对抽核用微针提供气压的气动注射器。其中，吸持微针的针口半径范围大致为50到80微米，抽核用微针的针口半径范围大致为9到12微米，气动注射器的精度为0.01psi。
本发明提供的减小细胞损伤的细胞抽核方法可以用于家猪克隆操作的抽核，具体实施情况如下：
1、图2a所示为具体步骤的第一步，通过气动注射器对微针施加正压：
将卵母细胞、供体细胞准备好并置入操作盘后，安装抽核用微针于NK-MR601显微操作系统，通过气动注射器对微针施加正压使微针内部的气液交界面达到刚好达到针口位置，根据平衡压模型：
Pi＝Pout+2σcosα/R
其中，Pi表示平衡压，Pout表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管内壁半径。
通过气动注射器对微针施加的正压不能超过外界气压与针口位置毛细作用产生的压强的和，否则微针内部的气体会喷射出来；
2、图2b所示为具体步骤的第二步，微针浸入卵母细胞操作液，减小微针中的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针前端：
移动操作平台的操作臂将微针浸入操作液，移动操作臂使微针至显微视野当中，减小气动注射器给定的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针的前端，准备进行抽核；
3、图2c所示为具体步骤的第三步，将微针刺入细胞中以进行后续的抽核操作：
移动操作臂以及卵母细胞使二者在一个显微视野范围内，将抽核用的微针刺入细胞内细胞核位置附近，准备进行抽核；
4、图2d所示为具体步骤中的第四步，减小气动注射器给定的正压，通过毛细作用实现细胞的抽核操作：
减小微针中给定的正压，此时，微针会通过毛细作用实现胞质以及细胞核的抽取。并且因为微针管内有一部分液体，可以实现抽核过程中对细胞损伤的减小。
在抽核完成后，后续进行了供体细胞的注入，电融合(图3)等克隆操作，并进行了对比实验：如图4所示，实验过程对比了未吸取液体到微针内部进行抽核操作和吸取了操作液到微针内部操作后的克隆结果。其中，未吸取液体到微针内部进行抽核操作的实验进行了4次，囊胚情况分别为：操作10个细胞获得1个囊胚，操作10个细胞获得1个囊胚，操作20个细胞获得2个囊胚以及操作20个细胞获得2个囊胚，囊胚率为10％，而吸取了操作液后进行抽核操作的实验得到的囊胚情况：操作17个细胞获得4个囊胚，操作22个细胞获得4个囊胚以及操作14个细胞获得3个囊胚，囊胚率为21％。该抽核方法得到的囊胚率为原来的2倍，说明了本方法减小了抽核过程中的细胞损伤，保留了细胞抽核操作后的发育潜力。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况，还可以做出各种变化，因此所有的等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由其权利要求限定。

Claims (3)

1.一种气动注射器的细胞抽核方法，其特征在于该方法包括：
第1、通过气动注射器对微针施加正压；
第2、将抽核用的微针浸入卵母细胞操作液，减小微针中的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针前端；
第3、将微针刺入细胞中以进行后续的抽核操作；
第4、减小微针中的正压，通过毛细作用实现细胞的抽核行为，进而实现了此种减小细胞损伤的抽核过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据平衡压模型：
Pi＝Pout+2σcosα/R
其中，Pi表示平衡压，Pout表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管内壁半径；
第一步中，通过气动注射器对微针施加的正压不能超过外界气压(Pout)与针口位置求得的毛细作用产生的压强的和，否则微针内部的气体会喷射出来。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在抽核过程中，当抽出的胞质与细胞核体积已经达到细胞质总体积的四分之一时应立即停止继续抽核，否则即便抽核成功也无法实现减小细胞损伤的目的。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107909570A (zh) * 2017-11-10 2018-04-13 南开大学 一种测量细胞内应变的方法
CN109517871A (zh) * 2018-10-31 2019-03-26 南开大学 一种最佳去核压强的确定方法
CN110426949A (zh) * 2019-06-27 2019-11-08 南京航空航天大学 一种可用于细胞核提取的单细胞手术微纳控制方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007013763A1 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Seoul National University Industry Foundation Cloned canines and method for producing thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007013763A1 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Seoul National University Industry Foundation Cloned canines and method for producing thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵启立: "基于细胞力学性质的显微操作方法研究", 《南开大学博士论文》 *
赵启立等: "基于全局视野的批量核移植操作流程研究", 《中国自动化学会控制理论专业委员会D卷》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107909570A (zh) * 2017-11-10 2018-04-13 南开大学 一种测量细胞内应变的方法
CN109517871A (zh) * 2018-10-31 2019-03-26 南开大学 一种最佳去核压强的确定方法
CN110426949A (zh) * 2019-06-27 2019-11-08 南京航空航天大学 一种可用于细胞核提取的单细胞手术微纳控制方法

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