CN102628045A - 一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞，针对BVDV的不同区域设计了不同的shRNA片段。shRNA在宿主细胞内转录后经剪切加工后形成siRNA，作用于病毒RNA的不同区域，干扰病毒的复制和表达。由于在牛肾脏细胞、睾丸细胞等存在BVDV细胞表面受体，因此BVDV对胎牛肾脏细胞、睾丸细胞最敏感，那么牛胎儿成纤维细胞做为体细胞核移植的供体细胞，进行诱导重编程之后形成的了转基因克隆牛完整的个体，其肾脏等BVDV敏感器官具有抑制该病毒表达的能力。

Description

一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种折叠的正链单股RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。BVDV可以造成牛群的终生持续感染，是引起养牛业重大经济损失的一个重要因素。BVDV的伴发症在临床发展中由轻到重，涉及呼吸系统、肠道、生殖系统、免疫系统及内分泌系统。尽管已经有商品化的BVDV疫苗，但是BVDV的抗原多样性多导致疫苗接种失败。此外，尽管选择性测验后大范围扑杀屠宰阳性牛，由BVDV引起的疾病仍然在牛群中广泛流行。

RNA干扰(RNAi)是一种通过21-23核苷酸对特异性序列siRNA靶向作用于mRNA致使动物或植物的基因转录后沉默(Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K，Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference incultured mammalian cells.Nature.2001 May24；411(6836)：494-8.)。通过人工合成的siRNA、质粒、病毒介导shRNA可以触发哺乳动物细胞的特定基因沉默。已经有报道可以通过以上RNA干扰方法抑制HBV、HIV、HCV、FMDV等病毒的复制。近来，Lambeth等人研究发现通过siRNA和shRNA介导的RNA干扰有效地抑制了BVDV NADL株的复制(Lambeth LS，Moore RJ，Muralitharan MS，Doran TJ.Suppression ofbovine viral diarrhea virus replication by smallinterfering RNA and short hairpinRNA-mediated RNAinterference.Vet Microbiol.2007 Jan 31；119(2-4)：132-43.Epub 2006 Sep 22.)。然而，BVDV具有抗原多样性，有两种基因型：BVDV-1型和BVDV-2型，包括至少13个BVDV-1基因型(BVDV-1a至BVDV-1l及一种未命名的)2个BVDV-2型(BVDV-2a和BVDV-2b)。对脊髓灰质炎病毒研究发现BVDV可能会形成抗siRNA的突变。避免出现逃避突变的替代策略是设计靶向BVDV基因组保留区的多重shRNA表达系统，或者使用siRNA组合。

随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，为动物抗病转基因育种提供了新思路。体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(Jang G，Bhuiyan MM，Jeon HY，Ko KH，Park HJ，Kim MK，Kim JJ，Kang SK，Lee BC，Hwang WS.An approach for producing transgenic clonedcows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitrypsin gene.Theriogenology.2006 Jun；65(9)：1800-12.Epub 2005 Nov 21.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(Wheeler MB，Walters EM.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology.2001 Nov 1；56(8)：1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山羊(Maga EA，Walker RL，Anderson GB，MurrayJD.Consumption of milk from transgenic goats expressing humanlysozyme in themammary gland results in the modulation ofintestinal microflora.Transgenic Res.2006 Aug；15(4)：515-9.)。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体及构建的重组细胞，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决生产对牛病毒性腹泻病毒有一定耐受力的转基因奶牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种干扰BVDV复制的shRNA，为SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.6所示的shRNA中的一种。

一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体，包括shRNA表达框，所述的shRNA表达框包括SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.4中的一种shRNA，在shRNA的上下游分别设有hU6启动子和Sv40终止子。

所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，包括两个shRNA表达框，两个shRNA表达框相向排列。

所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，包括由shRNA1构成的表达框和由shRNA2构成的表达框，两个表达框相向排列。

所述的两个表达框的元件排列为：hU6启动子-shRNA1-Sv40终止子-Sv40终止子-shRNA2-hU6启动子。

所述的包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体，还包含attB序列、抗生素筛选基因和标记基因。

所述的抑制BVDV复制的shRNA表达载体，所述的所述的attB序列的下游还设有CMV组成型启动子，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。

所述的包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体为：pARNG-2shRNA-BVDV，将两个相向排列的shRNA表达框克隆到pUC ori的下游。

一种包含干扰牛病毒性腹泻病毒复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，转染pARNG-2shRNA-BVDV表达载体，该载体先通过HindIII/EcoRI多克隆位点将由shRNA1构成的表达框克隆到pARNG载体上，再通过SacI/HindIII多克隆位点将由shRNA2构成的表达框克隆到其下游而得到。

所述的包含干扰牛病毒性腹泻病毒复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆核供体细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明针对BVDV的不同区域设计了不同的shRNA片段作用于BVDV基因组高度保守区域，将这些shRNA连接到pGenesil-1载体检测抗病毒活性，MDBK细胞(马达氏牛肾细胞系)转染shRNA表达载体，转染后16小时攻毒BVDV-1a(NADL国际标准株M31182)，观察细胞病变效应及测定攻毒后48h的实时定量反转录PCR和病毒滴度，结果显示shRNA片段能够降低病毒的RNA水平，尤其是shRNA1、shRNA2和shRNA4显著降低病毒产量，分别显著降低病毒RNA表达82％、85％和76％。

shRNA在宿主细胞内转录后经剪切加工后形成siRNA，作用于病毒RNA的不同区域，干扰病毒的复制和表达。由于在牛肾脏细胞、睾丸细胞等存在BVDV细胞表面受体，因此BVDV对胎牛肾脏细胞、睾丸细胞最敏感，那么牛胎儿成纤维细胞做为体细胞核移植的供体细胞，进行诱导重编程之后形成的了转基因克隆牛完整的个体，其肾脏等BVDV敏感器官具有抑制该病毒表达的能力。

2、虽然在攻毒实验中检测到每个shRNA片段都有干扰效果，但进一步的干扰效果表明两个片段的干扰效果优于一个片段。然而并不是片段越多越好，shRNA过多会对细胞造成一定的毒性。本发明进一步将shRNA1和shRNA2两个片段克隆到基础载体pARNG上，构建了包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体pARNG-2shRNA-BVDV，将其转染到牛胎儿成纤维细胞，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系；荧光显微镜观察标记基因RFP的表达情况，并经过G418筛选获得阳性细胞，并进行PCR鉴定证实干扰片段整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

3、以含干扰BVDV复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出能抑制牛病毒性腹泻病毒复制的转基因牛，该转基因牛可预防牛病毒性腹泻的发生。

附图说明

图1-1为用不同shRNA表达载体和阴性对照转染MDBK细胞48h后的细胞病变效应观察结果图；

图1-2为实时定量PCR检测不同shRNA片段抑制BVDV复制的水平的直方图；其中sh1～sh6为pGenesil-shRNA1～pGenesil-6，ctrl为pGenesil-ctrl；

图2为载体pARNG-2shRNA-BVDV构建流程示意图；

图3为载体pARNG的质粒图谱；

图4为pARNG-2shRNA-BVDV质粒图谱；

图5为荧光显微镜观察pARNG-2shRNA-BVDV载体阳性表达的重组牛胎儿成纤维细胞图；

图6为对整合了pARNG-2shRNA-BVDV的重组细胞株阳性PCR鉴定；其中M为Takara DL5,000 DNA Marker；泳道1为以H2O为模板的PCR产物；泳道2为以整合了pARNG-2shRNA-BVDV的重组细胞株为模板的PCR产物；泳道3为以正常的牛胎儿成纤维细胞为模板的PCR产物。

图7-1～7-2为转基因胚胎发育图。

具体实施方式

本发明首先构建含有两段抑制BVDV复制的shRNA片段和红色荧光蛋白(RFP)基因的表达载体pARNG-2shRNA-BVDV，然后用电转染法将外源性表达载体pARNG-2shRNA-BVDV导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因RFP的表达情况，并经过G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定，证实两段BVDV干扰序列shRNA整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将包含干扰BVDV复制的shRNA干扰片段的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。下面结合具体的载体的构建和检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、不同shRNA片段的制备及其对BVDV复制的抑制效果

1)针对病毒基因组不同的靶区设计了不同的shRNA，所针对的靶区及其作用区域的起始核苷酸位点分布如下：

针对BVDV病毒的靶区为N-Pro，起始位点734所设计的shRNA1为：

CGGATAGGGAGAGTAACTG；其合成引物如下：

shR F1：GATCCCGGATAGGGAGAGTAACTGA；

shR R1：AGCTTCAGTTACTCTCCCTATCCGG；

针对BVDV病毒的靶区为NS5A，起始位点8986所设计的shRNA2为：

CTACAGAGTCACCAAGTAT；其合成引物如下：

shR F2：GATCCCTACAGAGTCACCAAGTATA；

shR R2：AGCTTATACTTGGTGACTCTGTAGG；

针对BVDV病毒的靶区为5’UTR，起始位点98所设计的shRNA3为：GAGGCTAGCCATGCCCTTA；其合成引物如下：

shR F3：GATCCGAGGCTAGCCATGCCCTTAA；

shR R3：AGCTTTAAGGGCATGGCTAGCCTCG；

针对BVDV病毒的靶区为Erns，起始位点1384所设计的shRNA4：GACCAACTACACGTGTTGC；其合成引物如下：

shR F4：GATCCGACCAACTACACGTGTTGCA；

shR R4：AGCTTGCAACACGTGTAGTTGGTCG；

针对BVDV病毒的靶区为Erns，起始位点1421所设计的shRNA5：CGCCATGAGTGGAACAAGC；其合成引物如下：

shR F5：GATCCCGCCATGAGTGGAACAAGCA；

shR R5：AGCTTGCTTGTTCCACTCATGGCGG；

针对BVDV病毒的靶区为NS5A，起始位点9156所设计的shRNA6：CCAGGTTAGCTAAGAGATA；其合成引物如下：

shR F6：GATCCCCAGGTTAGCTAAGAGATAA

shR R6：AGCTTTATCTCTTAGCTAACCTGGG。

上述shRNA的合成方法如下(或者采用其他人工合成方法)：

a.将所设计的上下游引物用STE Buffer(10mM Tris pH＝8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)溶解，浓度1～5OD/100μl；

b.将上下游引物等摩尔混合。

c.94℃保温5分钟后，徐冷至室温，得到带有BamHI和HindIII酶切位点粘性末端的双链干扰片段shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5和shRNA6。

2)pGenesi-shRNA表达载体构建

将pGenesil-1载体(购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司)用BamHI/HindIII进行双酶切，将带有BamHI和HindIII酶切位点粘性末端干扰片段shRNA1～shRNA6分别连接在pGenesil-1载体骨架上，得到载体pGenesil-shRNA1、pGenesil-shRNA2、pGenesil-shRNA3、pGenesil-shRNA4、pGenesil-shRNA5和pGenesil-shRNA6，同时构建包含乱序shRNA的表达载体pGenesil-ctrl作为对照。

3)检测shRNA对病毒复制的抑制效果

a、细胞转染和病毒增殖

MDBK细胞培养液：10％FCS，2mM谷氨酰胺，10Mm hepes，添加青霉素(100U/ml)链霉素(100mg/ml)

电转：宿主细胞为MDBK细胞，密度为80％，消化后离心取细胞沉淀由PBS冲悬2×10⁷个/ml，质粒DNA(2.5μg)与0.4ml细胞悬液混合通过Bio-Rad电转仪电转染(1.1KV，25μF，无电阻，双脉冲)。电转后的细胞24孔板中培养，为攻毒实验做准备。

MDBK细胞转染shRNA表达载体，转染后16小时攻毒NADL。观察细胞病变效应，观察结果如图1-1所示，MDBK细胞经过NADL攻毒后产生的细胞病变特征为细胞变圆，胞浆出现空泡，细胞单层拉网，最后导致细胞死亡而从瓶壁上脱落下来，而正常的MDBK细胞形态饱满，折光性好。可以看到与对照组细胞(pGenesil-ctrl)相比转染了shRNA表达载体的细胞明显降低了攻毒后的细胞病变率。

RNA干扰NADL复制的效果可以通过攻毒后48h的实时定量反转录PCR进一步检测。BVDV稀释到200μl完全培养液中(MOI＝3)侵染转染16h后的细胞(密度90％)共同孵育1h，除去培养液，用DMEM冲洗细胞两遍。48h感染后培养液和细胞-80℃下反复冻融2次，去除细胞碎片，上清液用于RT-PCR。根据说明书用Trizol试剂盒提取RNA。1μg总RNA反转录：SuperScript II引物42℃ 1h.实时定量PCR按照说明书使用SYBR PremixEx Taq II，下列引物用于BVDV扩增：

NADL片段的扩增引物：

NADL-F：5-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTT-3’(上游)

NADL-R：5-CCTATCAGGCTGTATTCGTAA-3’(下游)

GAPDH(内参基因)的扩增引物：

GAPDH-F：5-GGTCACCAGGGCTGCTTT-3’(上游)

GAPDH-R：5-CT GTGCCGTTGAACTTGC-3’(下游)

PCR循环：变性95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s 40个循环，通过ΔΔCt方法检测BVDV RNA水平情况，实验重复三次。检测结果的直方图图1-2所示，可以看到6个shRNA均降低了病毒RNA表达水平，其中pGenesil-shRNA3、pGenesil-shRNA5和pGenesil-shRNA6没有显著降低病毒RNA表达水平。然而，与对照组相比pU6-sh1，pU6-sh2和pU6-sh4分别显著降低病毒RNA表达82％、85％和76％(P＜0.01)，这也与观察结果相一致。

由于所采用的毒株为细胞病变型BVDV毒株，其病毒基因组为一条单链RNA，在宿主细胞内复制转录产生大量的dsRNA引起细胞形成空泡、核固缩、溶解和死亡等病变。而shRNA在宿主细胞内转录后经剪切加工后形成siRNA，作用于病毒RNA的不同区域，干扰病毒的复制和表达，其中shRNA1、shRNA2和shRNA4分别抑制BVDV基因组的N-Pro、NS5A和Erns区域。

对转染shRNA表达载体的MDBK细胞攻毒后，观察细胞病变并通过实时定反转录PCR检测病毒RNA的表达水平。试验结果显示转染shRNA1、shRNA2和shRNA4表达载体的MDBK细胞的病变率明显低于其它实验组。

由于在牛肾脏细胞、睾丸细胞等存在BVDV细胞表面受体，因此BVDV对胎牛肾脏细胞、睾丸细胞最敏感，MDBK为一种已经商品化的牛肾细胞系，BVDV可以该细胞上良好增殖，因此可采用MDBK细胞转染载体后进行攻毒试验，检测病毒RNA水平的变化。而几乎所有的BVDV强毒株在上皮培养细胞中表现为非致细胞病变的生物型，尽管胎牛皮肤分离培养得到的成纤维细胞不适于做毒力试验；然而牛胎儿成纤维细胞做为体细胞核移植的供体细胞，进行诱导重编程之后形成的了转基因克隆牛完整的个体，其肾脏等BVDV敏感器官具有抑制该病毒表达的能力。

2、包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体的构建

参见图2所示的构建流程图，具体的构建过程如下：

1)将pGenesil-1载体用BamHI/HindIII进行双酶切，将带有BamHI和HindIII酶切位点粘性末端干扰片段shRNA1和shRNA2分别连接在pGenesil-1载体骨架上，得到载体pGenesil-shRNA1和pGenesil-shRNA2。

2)用SalI/HindIII双酶切载体pGEM-3Z(购自promega公司)和pGenesil-shRNA2，将包含hU6启动子和shRNA2片段的干扰元件克隆到载体pGEM-3Z上，得到载体pG3Z-shRNA2。hU6启动子的序列如SEQ.ID.NO.7所示。

3)用HindIII/EcoRI双酶切载体pARNG和pGenesil-shRNA1，将含hU6启动子和shRNA1片段的干扰元件克隆到pARNG载体上，得到载体pARNG-shRNA1。

载体pARNG为一种基于假attP位点整合的通用型表达载体(其质粒图谱如图3所示)，其中包括attB序列、neoR抗生素筛选标记和Cre/LoxP元件。

4)用SacI/HindIII双酶切载体pARNG-shRNA1和pG3Z-shRNA2，将包含hU6启动子和shRNA2片段的干扰元件克隆到载体pARNG-shRNA1载体上，得到最终载体pARNG-2shRNA-BVDV(其质粒图谱如图4所示)。

在所构建的载体中，包含两个shRNA表达框：每一个shRNA表达框都由一个hU6启动子、一个shRNA及一个Sv40终止子构成，两个完整的shRNA表达框相向的克隆入载体pARNG，即shRNA1表达框和shRNA2表达框，位于中pUC ori复制子上游。hU6启动子在细胞内组成型表达，无需诱导即可实现基因表达，hU6启动子是一种RNA聚合酶Ⅲ启动子，诱导shRNA在动物细胞中持续表达，且shRNA只能由RNA聚合酶Ⅲ启动子启动表达。

虽然在攻毒实验中检测到每个shRNA片段都有干扰效果，但进一步的干扰效果表明两个片段的干扰效果优于一个片段。然而并不是片段越多越好，shRNA过多会对细胞造成一定的毒性；而且载体构建时采用组成型表达的U6启动子，每个shRNA由一个U6启动子引导转录，U6个数越多引导表达的外源shRNA的表达量越高，细胞内本生的pre-miRNA依赖Exportin-5(一种细胞核内的miRNA运输蛋白)运出细胞核，Exportin-5的运载能力有限，shRNA与pre-miRNA竞争性的结合Exportin-5，导致细胞核内pre-miRNA不能运输到细胞质成为有活性的成熟miRNA，影响多种由miRNA参与的细胞调控。因此在进行载体构建选择两个干扰效果较好的片段构建载体。

3、pARNG-2shRNA-BVDV表达载体转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系

1).牛胎儿成纤维细胞的培养

从液氮中取一管荷斯坦奶牛的胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加1mL DMEM细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3mL细胞培养液接种于60mm细胞培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶-EDTA消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞变圆时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，移液器吹打，离心收集，悬浮，接种于6孔板，翻入CO2培养箱而培养。1-3代的牛胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到70％-90％汇合用于转染。

2).G418最小致死浓度的测定

在牛胎儿成纤维细胞(宿主细胞)的培养液(含血清的DMEM细胞培养液)中分别加入不同浓度梯度的G418筛选12天，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。

3).pARNG-2shRNA-BVDV表达载体转染牛胎儿成纤维细胞

待宿主细胞生长至90％汇合率，消化细胞后离心(1000r/min，5min)收集细胞，然后用Opti-MEM无血清培养液洗涤细胞2次，每次清洗过程中要轻轻吹打细胞；将电转液(cell盐∶opti＝3∶1 V/V；cell盐：KCl：120mm；CaCl2：0.15mm；K2HPO4：10mm；MgCl2：50mm；调pH至7.6；opti即opti-MEM无血清培养液)和表达载体pARNG-2shRNA-BVDV(20μg)的混合液(800μl)加到经离心弃去培养液的离心管中，轻轻吹打细胞，使其完全吹散，混匀。

将上述细胞悬液转移到BTX电转杯中(4mm间隙)，静止10min；将电转仪参数设置如下：电压：500V，脉冲时间：1ms，电击次数：3次，静止完成后进行电转试验。

转染完成后，细胞静置10min，然后将细胞悬液全部转移到60mm培养皿中；加入3ml含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液，将培养皿放置37℃、5％的CO₂培养箱中，待细胞贴壁后，弃去原培养液(培养液中含电转液影响细胞生长)，换成含有600μg/ml G418的DMEM细胞培养液进行筛选。

由于表达载体pARNG-2shRNA-BVDV包含G418抗性基因neoR，整合到基因组上的neoR基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会被该药物杀死。

转染细胞G418筛选12d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞在荧光显微镜下进行观测，观察荧光指示蛋白RFP是否表达。对既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆(如图5所示的观察结果)，待培养基的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，然后用胰酶-EDTA消化细胞，再添加不加抗生素的DMEM细胞培养液扩大培养。

4)pARNG-2shRNA-BVDV载体阳性表达细胞的PCR鉴定

取扩大培养后的pARNG-2shRNA-BVDV阳性表达的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定shRNA片段是否整合到细胞基因组中，阴性对照为未转染的正常牛胎儿成纤维细胞

引物设计如下：

EGFP-C for primer：catggtcctg ctggagttcg tg

pUC_ori_rev primer：ggtctgacgc tcagtggaac g

PCR按以下条件进行：94℃ 5min，1个循环；94℃，30s、60℃ 30s、72℃ 1min，30个循环。

检测结果如图6所示，其中M为Takara DL5,000 DNA Marker；泳道1为以H₂O为模板的PCR产物；泳道2为以整合了pARNG-2shRNA-BVDV的重组细胞株为模板的PCR产物；泳道3为以正常的牛胎儿成纤维细胞为模板的PCR产物。

4、转基因克隆胚的获得

以上述包含干扰牛病毒性腹泻病毒复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚。

1)卵母细胞的成熟培养

卵巢采自西安市定点屠宰场，保存在25℃生理盐水中4～6h运送回实验室。抽取3～8mm直径的有腔卵泡收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的3层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。成熟培养液为TCM199(Gibaco)加10％胎牛血清，10ng/mL的表皮生长因子，培养条件为38.5℃，5％CO2、95％空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2％透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植实验。

2)转基因克隆胚的构建

显微操作液为含10％FBS，5μg/mL细胞松弛素B的PBS。用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质。以10μg/mLHoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞。采用电融合法进行体细胞核移植，过程如下：在显微镜下挑选直径为15μm左右的供体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触。注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法进行融合。融合前先将重组体放入融合液(含0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA)中预平衡4～6min。用与显微操作仪连接的微电极的尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予2次电脉冲进行电融合(28V，10μs)。融合后的重组体放入含10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，0.5～1h后观察融合情况。

3)克隆胚的激活及体外培养

融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/LIonomycin的mSOFaa培养液处理5min，然后在含2mmol/L 6-DMAP的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOF aa微滴中培养，培养密度为每个重构胚5μL，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养。每48h半量换液1次，第1次换液时检查卵裂率，检查胚胎发育情况。检测结果如图7-1、7-2所示，其中图7-1为在荧光显微镜激发光下的观察结果，图7-2为明场观察结果。

Claims (10)

1.一种干扰BVDV复制的shRNA，其特征在于，为SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.6所示的shRNA中的一种。

2.一种干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，包括shRNA表达框，所述的shRNA表达框包括SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.4中的一种shRNA，在shRNA的上下游分别设有hU6启动子和Sv40终止子。

3.如权利要求2所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，包括两个shRNA表达框，两个shRNA表达框相向排列。

4.如权利要求3所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，包括由shRNA1构成的表达框和由shRNA2构成的表达框，两个表达框相向排列。

5.如权利要求3或4所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的两个表达框的元件排列为：hU6启动子-shRNA1-Sv40终止子-Sv40终止子-shRNA2-hU6启动子。

6.如权利要求2所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体，还包含attB序列、抗生素筛选基因和标记基因。

7.如权利要求6所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的抑制BVDV复制的shRNA表达载体，所述的所述的attB序列的下游还设有CMV组成型启动子，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。

8.如权利要求2所述的干扰BVDV复制的shRNA表达载体，其特征在于，所述的包含干扰BVDV复制的shRNA片段的表达载体为：pARNG-2shRNA-BVDV，将两个相向排列的shRNA表达框克隆到pUC ori的下游。

9.一种包含干扰牛病毒性腹泻病毒复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，转染pARNG-2shRNA-BVDV表达载体，该载体先通过HindIII/EcoRI多克隆位点将由shRNA1构成的表达框克隆到pARNG载体上，再通过SacI/HindIII多克隆位点将由shRNA2构成的表达框克隆到其下游而得到。

10.权利要求9所述的包含干扰牛病毒性腹泻病毒复制的shRNA片段的重组牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆核供体细胞的应用。

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