JP2002523084A - 適合性組織適合遺伝子を有する霊長類の胚幹細胞 - Google Patents

適合性組織適合遺伝子を有する霊長類の胚幹細胞

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JP2002523084A JP2000567669A JP2000567669A JP2002523084A JP 2002523084 A JP2002523084 A JP 2002523084A JP 2000567669 A JP2000567669 A JP 2000567669A JP 2000567669 A JP2000567669 A JP 2000567669A JP 2002523084 A JP2002523084 A JP 2002523084A
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Abstract

(57)【要約】 特定のドナー個体にＭＨＣ調和される霊長類の胚幹細胞の製造方法が開示される。一局面では、ドナー霊長類の細胞核を、除核された霊長類の卵母細胞に伝達する。生じた核伝達生成物の胚盤胞段階への培養、続くその内部細胞塊からの霊長類のＥＳ細胞の単離を設計し、すべての核遺伝子について、その核の元のドナーと遺伝的に同一であるＥＳ細胞を製造できる。その霊長類のＥＳ細胞から誘導された分化型細胞は、移植のような治療目的で使用される場合、ドナーの免疫系によってほとんど拒絶されない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (関連出願に対するクロスレファレンス) 適用なし。 （連邦の後援による研究に関する記述） この発明は、以下の局によって与えられた米国政府支援によって為された：国
立保健研究所認可番号：RR11571；RR/AG00167；HD34215及び国立保健研究所認可
番号：RR12804。米国は、この発明の特定の権利を有する。
【０００２】 (発明の背景) 本発明は、特定のドナー個体にＭＨＣ調和される霊長類の胚幹(ＥＳ)細胞の製
造に関する。さらに詳細には、本発明は、すべての核遺伝子について、該ドナー
と遺伝的に同一であるように設計されるＥＳ細胞に関する。 発生能を維持して体のいずれの細胞型をも生成しながら、無制限の未分化型増
殖が可能である霊長類の胚幹細胞が開発されている。1996年１月18日提出の米国
出願番号08/591,246(特許証発行料金支払済み)、J.Thomasonら,92 P.N.A.S. USA
7844-7848(1995)、J.Thomasonら,55 Biol.Reprod. 254-259(1996)、J.Thomason
ら,38 Curr.Top.Dev.Biol. 133-165(1998)、及びJ.Thomasonら,106 AMPHIS 149-
157(1998)を参照せよ。これら出版物の開示、及び本明細書で参照されるすべて
の他の出版物は、参照によって、本明細書で全体的に述べたかのように取り込ま
れる。
【０００３】 未分化型の霊長類のＥＳ細胞から誘導されるこのような細胞が部分的に開発さ
れ、移植療法用の原材料を提供した。しかし、ＥＳ細胞に基づく移植療法につい
ての起こりうる問題は、移植細胞の免疫拒絶の可能性である。免疫拒絶応答を抑
制する多くの薬剤があるが、それらは一般に副作用があり、かつ非常に高価であ
る。このような薬剤の必要性を最小化し、又は排除する移植療法を提供すること
が好ましい。 分化型細胞由来の核を再プログラムするための卵母細胞の細胞質の能力は、脊
椎動物分類群間でかなり異なる。群(ウシ及びヒツジを含む)としての有蹄動物(u
ngulate)由来の卵母細胞は、胎性細胞から核を再プログラムする能力を有する。
J.Cibelliら,280 Science 1256-1258(1997)、A.Schniekeら,278 Science 2130-2
133(1977)、及びI.Wilmutら,385 Nature 820-813(1997)を参照せよ。
【０００４】 また、成体ヒツジの核からの成体ヒツジ(“Dolly”)のクローニングについて
の報告がある。I.Wilmutら,385 Nature 820-813(1997)を参照せよ。 最近、マウスのクローニングに成功した方法の報告があった。例えば、T.Waka
yamaら,394 Nature 369(1998)を参照せよ。また、核伝達によってアカゲザルを
生産する試みについての報告があった(L.Mengら,57 Biol.Reprod. 454-459(1997
))。この著者は、核ドナーとして移植前の胚由来の未分化型割球核を使用した。
しかし、このドナー核は未分化型細胞であった。
【０００５】 組織培養中の細胞にインプリンティング遺伝子の状態変化が自然に起こり、ま
た、おそらく、正常な発生の際に特定の未分化型細胞内のインプリント遺伝子の
状態にランダムな変化が起こるようである。これらのインプリント遺伝子の状態
の変化は、正常の発生に適合しないので、インプリント遺伝子の状態の変化を伴
う核ドナー由来の胎児は、かなり流産されやすい。インプリント遺伝子の状態の
ランダムなドリフトは、未分化型細胞由来の核を用いた核伝達実験の高率な妊娠
の失敗に対する１つの有望な説明である。
【０００６】 WO 98/07841で、除核された有蹄動物の卵母細胞にヒトの核を移植することに
よる「細胞」の凝集塊の誘導についての報告があった。このＰＣＴは、これらの
「細胞」を「幹細胞様の」と言及しているが、これらが（細胞断片ではなく）生
存可能な細胞であるという証拠を提供しておらず、それらが実際にヒトの核を含
んでいるという証拠を何ら与えておらず(核型が完成されなかった)、かつそれら
が幹細胞を決定づける特徴(例えば、未分化型増殖を延長可能、３つの胎性胚葉
の分化が可能)を有することの証拠も何ら提供されなかった。 実際、他の報告は、明らかにこのような種間の核伝達生成細胞は、有蹄動物の
ミトコンドリアとヒトの核との間の完全な機能的非適合性のため生存できないだ
ろうと説明している。L.Kenyonら,94 P.N.A.S. USA 9131-5(1997)を参照せよ。
このＰＣＴ公報自体、彼らが４〜16の細胞分裂構造からＥＳ細胞コロニーを製造
することを試みていないと述べている。この公報は、同様の方法でヒトの細胞核
をヒトの卵母細胞に伝達することが可能だろうと推測しながら、その研究を行う
のに何を変える必要があるかについての実施例又は説明を何ら与えていない。さ
らに、そうでなくともハイブリッドに関してでさえ明らかに粗末な結果しか示し
ていない。 従って、組織適合遺伝子(好ましくは、すべての核遺伝子)を含む安定な霊長類
の胚幹細胞を開発する方法に対する要望が存在すると考えられる。
【０００７】 （発明の簡単な概要） 一局面では、本発明は、任意のドナーに対して少なくともＭＨＣ適合性である
霊長類の胚幹細胞を提供する。この細胞は、除核された霊長類の卵母細胞に、そ
のドナーの未分化型細胞由来の細胞核を移植して誘導された。この概念は、マカ
ク、マモセット及びヒトのような種々多様な霊長類で使用するためである。 ここで、かつこの特許のこれ以降において、「誘導される」は、その広い意味
で使用される。それは、直接的な誘導及び間接的な誘導の両方を包含する。「Ｍ
ＨＣ適合性」は、該細胞が任意のドナーの主要な組織適合性複合体と調和する主
要な組織適合性複合体を有することを意味する。
【０００８】 他の局面において、本発明は、（ｉ）インビトロ培養で増殖可能であり、(ii)
該培養で内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の誘導体に分化する可能性を維持し、
(iii)線維芽細胞の支持細胞層上で培養されると、分化が阻害され、かつ(iv)外
来源(例えばドナーから誘導されるもの)由来の主要な組織適合性複合体を有する
、霊長類の(好ましくはヒトの)胚幹細胞の精製調製品を提供する。好ましい形態
では、該細胞は、すべての核遺伝子に関して、特定核ドナーと遺伝的に同一であ
る。 無処置の全身動物と異なり、ＥＳ細胞は、インプリント遺伝子の状態の変化を
伴って生存可能である。従って、未分化型細胞核の除核された卵母細胞への伝達
によるＥＳ細胞の誘導は、その核が無処置の成体霊長類のクローニングを与えな
いであろう細胞由来の場合でさえ、組織適合性ＥＳ細胞の形成を与えるだろう。
【０００９】 本発明のさらに別の局面では、上述の細胞において、その細胞が、ドナーの分
化型細胞由来の細胞核の除核された霊長類の(好ましくはヒトの)卵母細胞への移
植によって誘導される細胞を製造するための方法が提供される。 ＥＳ細胞核状態に、特定の個体由来の分化型細胞の核を再プログラムすること
によって、その特定の個体にＭＨＣ調和されるＥＳ細胞を作ることができる。そ
のようにして、例えば、若年型糖尿病の患者由来の皮膚線維芽細胞又は他の細胞
を取り、除核された卵母細胞に伝達することによって分化型核を再プログラムし
、その胚盤胞段階まで核伝達生成物を培養し、その内部細胞塊から未分化型ＥＳ
細胞を誘導し、そのＥＳ細胞を膵臓のβ細胞に分化し、かつそれらβ細胞を移植
療法に利用して、現在、全体的な膵臓移植がこの目的のために使用されていると
同一の方法で、糖尿病を治療することができる(ただし免疫抑制薬は必要ではな
いが)。
【００１０】 再プログラムされた細胞は、主要な組織適合性複合体(ＭＨＣ)の遺伝子を含む
核ドナーのすべての核遺伝子に対して遺伝的に調和するだろう。従って、その核
を供与した個体によるこれら細胞の免疫拒絶は、おそらくずっと少ない。 また、ＭＨＣ調和性ＥＳ細胞が、ドナー由来の分化型細胞の核体と、霊長類の
ＥＳ又は霊長類の胚性癌腫(ＥＣ)細胞の細胞質体との間の融合によって形成され
うることを提唱する。 ヒトの胚性癌腫(ＥＣ)細胞は、奇形癌腫の幹細胞である。ＥＣ細胞は、本質的
にＥＳ細胞に対する悪性な同等物であり、かついくつかのヒトのＥＣ細胞系は、
すべての３つの胎性胚葉を形成する可能性を維持する。
【００１１】 ヒトのＥＣ細胞は、高度な異数体(染色体の正常な補体を欠いている)であり、
それらは、ＥＳ細胞よりかなり制限された発生能を有する。しかし、それらの細
胞質は、分化型細胞から核を再プログラムするために同様に必要な因子を持って
おり、かつ当該核が正倍数体(染色体の正常な補体を有する)である場合は、その
ＥＳ細胞の細胞質体−分化型細胞の核体の融合生成物は、元のＥＣ細胞より大き
い発生能を持っているだろう。
【００１２】 従って、本発明の目的は、以下を提供することを包含する： （ａ）任意のドナーに対してＭＨＣ適合性を有する霊長類の胚幹細胞； （ｂ）連続的培養後に未分化状態で増殖が可能な、ドナー核に融合された除核
卵母細胞から誘導される霊長類の胚幹細胞； （ｃ）上記型の霊長類の胚幹細胞であって、該細胞が免疫易感染性マウスに注
入されると、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の胚葉から誘導される細胞に分化でき
る細胞；及び （ｄ）このような幹細胞の製造方法。 本発明のこれら及びさらに別の目的及び利点は、以下の記述から明かであろう
。以下の記述は、単に好ましい実施形態にすぎない。従って、特許請求の範囲に
注意して本発明の全範囲を理解すべきである。
【００１３】 （発明の詳細な説明） Ａ．卵母細胞からの誘導 卵母細胞の収集及び活性化 アカゲザル(又は他の霊長類)の卵母細胞は、常法に従った腹腔鏡検査法によっ
て過刺激された霊長類から得ることができ(R.Schramら,11 Hum. Reprod. 1690-1
697(1996)；R.Schramら,11 Hum. Reprod. 1698-1702(1996)；D.Wolfら,43 Mol.R
eprod. Dev. 76-81(1996)；D.Wolfら,27 Mol.Reprod. Dev. 261-280(1990))、中
期II(MII)分裂まで、修飾されたCMRL-1066(D.Boatman,The Mammalian Preimplan
tation Embryo,Plenum Press,New York,273-308(1987))中で培養される。 そして、霊長類の卵母細胞は、公知の浸透圧法(J.Levronら,3 Zygote 157-161
(1995))、電気的方法(V.Marshallら,9 Abctr.Serv. 98 J.Reprod. Fertil.(1992
))、化学的方法(6-DMAP/イオノマイシン、SR2+又はシクロへキサミド−G.Wu,55
Biol.Reprod. 260-270(1996)；L.Mengら,57 Biol.Reprod. 454-459(1997)；T.Wa
kayamaら,394 Nature 369(1998))、又は生物学的方法(精子因子の注入−H.Wuら,
46 Mol.Reprod.Dev. 176-189(1997)及びH.Wuら,49 Mol.Reprod.Dev. 37-47(1998
))で活性化することができる。活性化は、核体融合の前、同時、又は後に起こす
ことができる。I.Wilmut.ら,385 Nature 810-813(1997)を参照せよ。
【００１４】ドナー細胞の増殖 線維芽細胞又は他のドナー細胞型は、胎性又は出生後組織(例えば、皮膚の生
体組織検査)によって機械的破壊後、トリプシン処理し、DMEM-10%ウシ胎児血清(
ＦＣＳ)中で培養することによって調製できる。一般的には、E.Robertson,Terat
ocarcinomas And Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,IRL Press,Wash
ington,D.C. 71-112(1987)を参照せよ。 核伝達の直前に、細胞培養をトリプシン処理し、洗浄し、かつ伝達培地(TALP-
Hepes)中に再懸濁させることができる。一般的には、B.Bavisterら,28 Biol.Rep
rod. 983-999(1983)を参照せよ。
【００１５】卵母細胞の除核及び核伝達 除核前に30分間、細胞骨格阻害剤サイトカラシンＢ(7.5μg/ml)を含有する伝
達培地中で、MII卵母細胞をインキュベートすることが提唱される。一般的には
、L.Meng.ら,57 Biol.Reprod. 454-459(1997)を参照せよ。 除核は、ベベル型マイクロピペット(J.McGrathら,228 Exper.Zoo. 355-362(19
83)及びJ.McGrathら,220 Science 1300-1302(1983))で行い、除去された核体を
染料Hoechst 33342(３μg/ml)で染色して除核を確認し、かつ落射蛍光（epifluo
rescence）下で直接観察することが提唱される。一般的には、S.Sticsら,54 Bio
l.Reprod. 100-110(1996)を参照せよ。そして、単一のドナー細胞をマイクロピ
ペットで選択して、透明帯下に注入することが提唱される。
【００１６】融合 ドナー細胞と卵母細胞の細胞質体の融合は、ウイルス的(J.McGrathら,228 Exp
er.Zoo. 355-362(1983)及びJ.McGrathら,220 Science 1300-1302(1983))、化学
的(M.Simsら,91 P.N.A.S USA 6143-6173(1994)、又は電気的方法(L.Mengら,57 B
iol.Reprod. 454-459(1997))によって行うことが提唱される。 これとは別に、T.Wakayamaら,394 Nature 369(1998)に記載された注入法と同
様の方法で、核を直接細胞質体に注入することが提唱される。
【００１７】培養及びＥＳ細胞の誘導 S1/S2又はG1.2/G2.2培地(Scandinavian IVF Science AB,Oothenburg,Sweden)
のようなヒトのIVF診療所で使用される標準培地で、核伝達生成物を胚盤胞段階
まで培養することが提唱される。そして、生じた胚盤胞の内部細胞塊は、免疫手
術で除去し(D.Solterら,72 P.N.A.S. USA 5099-5102(1975))、かつ核分裂的に不
活性化された線維芽細胞上で培養すべきである。約９〜15日後、生じた細胞塊を
分離し、線維芽細胞上に再び塗布し、かつ特徴的な形態学によってＥＳ細胞を選
択して膨張させるべきである。J.Thomasonら,38 Curr.Top.Dev.Biol. 133-165(1
998)、J.Thomasonら,106 AMPHIS 149-157(1998)、及び1996年１月18日提出の米
国出願番号08/591,246を参照せよ。
【００１８】Ｂ．ＥＳ細胞の細胞質への直接的な核伝達 次の手順では、我々は、ＥＳ細胞(又は好ましくはＥＳ細胞の細胞質体)を利用
して成体核を再プログラムするアプローチを提唱する。第１の実験として、我々
は、アカゲザルのＥＳ細胞(ＸＸ核型)は、ハイグロマイシン抵抗性カセットで安
定的に形質移入され、かつ主要な胎性線維芽細胞(ＸＹ核型)は、ネオマイシン抵
抗性カセットで安定的に形質移入されることを提唱する。 それから、アカゲザルのＥＳ細胞及びこれらマーカーを含有する線維芽細胞を
、電子融合又は他の化学融合法で融合することを提唱する。一般的には、N.Duzg
unes 220 Methods Enzymol.(1993)を参照せよ。またハイグロマイシン／ネオマ
イシン抵抗性のためにヘテロカリオンが選択される。生成したクローンを膨張さ
せ、核型分析し、SCIDマウスに注入し、かつすべての３つの胎性胚葉の誘導体に
対する寄与を解析することが提唱される。このことは、未分化型ＥＳ細胞が、こ
の方法で分化型核を再プログラムして、四倍体ヘテロカリオンを生成できるかど
うかを決定する。
【００１９】 次に、我々は、アカゲザルのＥＳ細胞の細胞質体とネオマシン抵抗性線維芽細
胞の核体が、同様の方法で調製かつ融合されることを提唱する。一般的には、N.
Duzgunes,220 Methods Enzymol.(1993)を参照せよ。ネオマイシン抵抗性の一次
線維芽細胞上に、G418選択下、融合生成物を塗布し、ＥＳ細胞の形態学を有する
コロニーを膨張させて、発生能を調査する。
【００２０】Ｃ．ＥＳ細胞多能性の実証 ＥＳ細胞は、長期の培養後でさえ、すべての３つの胎性胚葉、内胚葉、中胚葉
、及び外胚葉の誘導体を分化する能力で特徴づけることができる。これは、自発
的な分化が起こる場合は、細胞を過剰増殖させ培養中に重層させることによって
、又はすべての３つの胚葉を提示する細胞で奇形腫が生成する場合は、免疫易感
染性マウスに注射することによって実証される。
【００２１】Ｄ．適用 本発明は、第１に治療目的で使用されることを意図する。例えば、病気(例え
ば、若年型糖尿病)を有する患者から細胞(例えば、皮膚の線維芽細胞又は他の細
胞)を取ることができる。そして、除核された卵母細胞への伝達によって分化型
細胞を再プログラムし、その核伝達生成物を胚盤胞段階まで培養し、その内部細
胞塊から未分化型ＥＳ細胞を誘導し、そのＥＳ細胞(例えば、膵臓のβ細胞に)を
分化し、かつそれらを移植療法のために使用して糖尿病を治療することができる
。
【００２２】 同様のアプローチが、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、
ＡＬＳ、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、肝臓病、心臓病、軟骨欠
乏症、火傷、及び癌のような他の病気の治療に関し、また他の治療目的のために
価値があるだろう。細胞の供給が必要なそれぞれの場合に、本発明は、安価かつ
拒絶の危険を少なくして、それらを提供することを意図する。 また、本発明は、早期発生遺伝子の研究及び他の研究目的で有用な細胞を提供
するためにも設計される。本発明は、診断目的に好適な細胞を提供することにも
、おそらく有益だろう。一般的には、WO 98/07841に記載されている用途を参照
せよ。
【００２３】産業上の適用性 本発明は、移植可能な細胞を発生する前駆体を提供するために設計される。こ
れら細胞は、治療及び他の目的に有用なものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 19/04 19/04 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 DA03 GA30 HA20 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC20 BA01 BA30 CA44 4C087 AA04 BB57 BB64 CA04 NA14 ZA02 ZA16 ZA22 ZA36 ZA75 ZA89 ZA96 ZB26 ZB35

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 任意のドナーにＭＨＣ適合性である霊長類の胚幹細胞であっ
    て、前記細胞が、前記ドナーの分化型細胞由来の細胞核を、除核された霊長類の
    卵母細胞に移植することによって誘導された細胞。
  2. 【請求項２】 前記細胞が、ヒトの卵母細胞と、ヒトの体細胞又はヒトの胚
    細胞由来の核とから誘導された、請求項１に記載の細胞。
  3. 【請求項３】 前記細胞が、すべての核遺伝子に関して、前記任意のドナー
    と遺伝的に同一である、請求項１に記載の細胞。
  4. 【請求項４】 霊長類の胚幹細胞の精製調製品であって、（ｉ）インビトロ
    培養で増殖可能であり、(ii)内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の誘導体に分化す
    る可能性を維持し、(iii)線維芽細胞の支持細胞層上で培養されると、分化が阻
    害され、かつ(iv) 特定核ドナーの主要な組織適合性複合体と同一の主要な組織
    適合性複合体をコードする遺伝子を有する調製品。
  5. 【請求項５】 前記細胞が、すべての核遺伝子について、前記特定核ドナー
    と遺伝的に同一である、請求項４に記載の調製品。
  6. 【請求項６】 前記細胞が、核体に融合されたＥＳ細胞の細胞質体から誘導
    された、請求項４に記載の調製品。
  7. 【請求項７】 請求項４に記載の調製品の製造方法であって、霊長類ドナー
    の分化型細胞由来の細胞核を、除核された霊長類の卵母細胞に移植して、前記ド
    ナーの主要な組織適合性複合体をコードする胚幹細胞を与えることを含んでなる
    方法。
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