KR100505124B1 - 개선된 난세포질내 정자 주입법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 통상적인 ICSI 방법이 가지는 문제점을 해소하고 수정율을 향상시키기 위해 개선된 ICSI 방법 및 이를 가능하게 하는 주입용 피펫에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 정자 두부 막의 기계적인 손상을 유발하도록 형성된 주입용 피펫을 사용하여 정상적인 수정 과정에 더 근접한 환경을 제공할 수 있는 새로운 ICSI 방법에 관한 것이다.

본 발명의 위와 같은 효과는 주입용 피펫의 내경을 주입하고자 하는 정자의 두부의 최대 직경보다 크지 않게 구성하고 주입과 동시에 기계적인 손상을 유발함으로써 가능하다.

Description

개선된 난세포질내 정자 주입법{An improved method of intracytoplasmic sperm injection}

본 발명은 난세포질 내 정자 주입법(intracytoplasmic sperm injection, 이후 'ICSI'로 약칭함)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 통상적인 ICSI 방법의 문제점들을 해결한 개선된 ICSI 방법 및 이것을 가능하게 하는 ICSI 주입용 피펫에 관한 것이다.

ICSI는 정자를 난세포질 내로 인위적으로 주입하는 방법을 말하는 것으로, 웅성 인자 불임(male factor infertility)을 극복하기 위한 목적으로 또는 수정의 근본적인 메카니즘에 대한 연구 목적으로 사람을 포함하는 동물에서 광범위하게 사용되고 있는 방법이다. ICSI가 처음으로 개발된 [Palermo et al., Lancet. 1992; 340: p17] 이래로, 이 방법을 사용하여 특히 사람에게서 매우 높은 수준의 수정 성공에 이르게 되었다 [Hsu et al., Fertil. Steril. 1999; 72: p679].

ICSI는 특정 유형의 남성 불임을 극복하기 위한 매우 유효한 도구가 될 뿐만 아니라, 수정 과정에서 반드시 필요로 하는 것과 그렇지 않은 것을 판단하여 연구하는데 유용한 수단이 되기도 한다 [Yanagimachi, In:Knobil E., Neill D (eds.), The Physiology of Reproduction, 2^nd ed., New York: Raven Press, 1994, p189]. 더 나아가, ICSI는 정자-매개 유전자 전달(Sperm-mediated gene transfer, 이하 'SMGT'로 약칭함)의 유용한 도구로 사용되고 있다 (Smith KR, Anim. Biotechnol. 10, 1998, p 1; 미국 특허 제6,376,743호).

생체 내에서 일어나는 정상적인 체내 수정에서, 정자가 투명대(zona pellucida; 이하 'ZP'로 약칭함)에 결합한 후, ZP를 투과하고 난막(oolemma)과 융합하는데 필요한 세포성 외포작용(exocytosis)의 한 형태인 첨체 반응(acrosome reaction)이 일어난다. 실질적인 융합 부위는 생체 내 조건에서 난막과 통합되는 정자 두부(sperm head)의 첨체 뒷부분 영역(postacrosome region)이다. 제 2 극체가 돌출된 후 모계 염색체는 응축되어 자성 전핵(female pronucleus, 이하 'FPN'이라 약칭함)을 형성한다. 배우체(gamete) 막 융합은 첨체 뒷부분 영역 절편의 전면 반쪽을 따라 일어나는 반면, 정자 두부는 외피 원형질(cortical plasma)의 설형 과정(tongue-like process)에 의해 함입된 후 식세포작용(phagocytosis)으로 도입된다. 단정자 수정에 있어서, 정자는 두부가 먼저 도입되고 꼬리는 일반적으로 지퍼형 방식(zipper-like fashion)으로 도입된다 [Sathananthan A.H. In: Handbook of in Vitro Fertilization. Trounso A. Gardner D.K. (eds). Boca raton, FL: CRC, p237]. 실제로, 유대 포유류(eutherian mammal)에서 첨체의 적도부(equatorial segment) 상부의 정자 세포막은 난세포막(oolemma)과 우선적으로 융합되고 [Bredford et al. In: Poste G., Nicolson G.L., eds. Membrane Surface Reviews (Membrane fusion), Amsterdam: North-Holland. 5, 1978, p65] 융합 후, 일반적으로 정자 두부가 함입된 후 전체 꼬리가 난세포질 내로 도입된다.

위와 같은 정상적인 수정 메커니즘을 밝혀냄으로써 이러한 과정을 모사한 보조생식기술의 연구가 활발하게 진행되었는데, 그 중의 하나가 ICSI 방법이다. 즉, ICSI는 위와 같은 정자와 난막의 인식, 결합, 투과 및 융합 과정을 우회하여 이러한 과정을 인위적으로 이루어지게 한 것이다.

위와 같이 생체에서의 정상적인 수정 과정을 모사하는 통상적인 ICSI 방법은 일반적으로 정자 꼬리를 손상시키는 과정(스코링(scoring)), 정자를 주입용 피펫(injection pipette) 내로 완전히 흡입하여 포획하는 과정 및 정자와 함께 난세포질성 물질들을 주입 피펫 내로 흡입하여 주입 정자와 난세포질을 혼합한 뒤 다시 난세포질 내로 주입하는 과정으로 이루어져 있다.

또한, 이러한 통상적인 ICSI 방법에서 수정율을 향상시키기 위한 연구가 계속되어 오고 있는데, 주로 정자에 운동성을 부여하는 꼬리 및 꼬리 막(tail membrane)을 적절히 처리하는 것을 중심으로 개선되어 왔다. 즉, 운동성 있는 정자의 조작에서의 용이성과 난세포 활성을 유도하는 가용성 정자 내 물질의 방출을 위해서 정자의 고정화(immobilization)와 세포막의 파괴는 성공적인 수정을 위해 필요한 것으로 여겨져 오고 있다 [Svalander et al., Fertil. Steril. 1995; 63: p828; Vanderzwalmen et al., Hum. Reprod. 1996; 11: p540; 및 Dozortsev et al., Hum. Reprod. 1997; 12: p2792]. 즉, 주입용 피펫이 정자 꼬리에 기계적인 손상을 주는 경우, 이의 세포막은 파괴되고 이로써 정자 두부 탈응축을 유도하는 난자내 세포질성 인자들이 정자 내로 도입될 수 있게 된다[Flaherty et al., Reprod. Fertil. Dev. 1995; 7: p197].

이러한 통상적인 ICSI 방법에서 운동성 있는 정자의 고정화와 정자꼬리 세포막 손상을 위해 정자 꼬리를 물리적으로 절단하거나 제거 또는 충격을 주는 방법, 피에조(piezo) 펄스 충격, 흡입 및 흡출의 반복 등의 방법을 동원해 왔다. 또한, 많은 연구자들은 위와 같은 조작을 위해 정자의 운동성을 떨어뜨려야 했고, 이를 위해서 그 효과상의 불리한 점에도 불구하고 정자의 운동성을 떨어뜨리는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, 이하 'PVP'라 약칭함)을 사용해 오고 있다. PVP 용액의 점성은 정자의 운동성을 극적으로 감소시키며 주입용 피펫 외부 및 내부로의 유체의 이동을 조절하는 것을 개선시키기 때문에 최근까지 통상적으로 PVP를 사용해 오고 있으며, 대부분의 연구자들은 PVP의 사용을 ICSI의 성공에 중요한 인자로 생각해 오고 있다.

또한, 통상적인 ICSI 방법에서 사용되는 주입용 피펫은 피펫 내부 및 외부로 정자가 이동하는데 어려움이 없는 정도의 충분한 직경을 가져야 하므로 조작하는 정자 두부의 직경보다 필연적으로 더 클 수 밖에 없다. 하지만, 주입용 피펫의 직경이 8㎛ 보다 넓은 경우에는 주입하는 동안 난자의 세포질이 너무 많이 파괴되는 문제점을 안고 있다[Payne D., Reprod. Fertil. Dev. 1995; 7: p185].

이상과 같이, 정자를 난세포질 내로 주입하는 보조생식기술 중 하나인 ICSI 방법은 1992년 최초로 개발된 이래 높은 수정율을 나타내며, 사람의 불임 시술에서 광범위하게 활용되고 있지만, 정자의 운동성이 미세조작 속도를 능가하기 때문에 정자의 주입을 위해서는 정자의 운동성을 떨어뜨려야 할 필요가 있었으며, 정자 주입 전에 주입용 피펫으로부터 벗어나는 것을 방지하기 위해 정자 꼬리를 무력화시켜야 했다. 또한, 주입된 정자의 난세포질 내에서 탈응축을 유도하고 함께 유입되는 배지의 양을 극소화시키기 위기 위해 정자 꼬리의 원형질 막을 손상시키거나 꼬리를 자르는 것이 불가피하였다.

위와 같이 통상적인 ICSI 방법에서의 PVP 사용, 꼬리 스코링, 꼬리 절단 등의 조작은 정상적인 수정 환경과 차이가 나게 하였으며, 주입용 피펫의 직경이 정자의 외경보다 더 큼으로 인한 PVP를 포함한 배지의 주입량이 많아지고, 난세포의 파괴가 일어나는 단점이 있어 왔다. 이미 밝혀진 연구 결과에 의하면 지금까지의 ICSI 방법을 통한 수정란의 생존율이 낮은 것은 주입 피펫의 크기가 너무 크기 때문임을 들고 있다 (Dozortsev et al., Zygote. 1998; 6: p143). 또한, 과다한 배지의 사용은 정자 두부 막을 둘러싸기 때문에 정자 두부의 세포질 내 물질과의 접촉을 방해하게 됨을 밝히고 있다 (Hsu et al., Fertil. Steril. 1999; 72: p679).

특히, 정상적인 수정의 경우 정자의 두부가 융합과 탈응축이 일어나는 부위임에도 불구하고 통상적인 ICSI 방법에서는 꼬리 막의 손상에만 관심을 집중해 온 한계가 있었다.

이에 본 발명자는 지금까지의 ICSI 방법이 가지는 위와 같은 문제점을 해소하여 수정율을 향상시킬 수 있는 새로운 접근 방법을 시도하여 그 성과를 밝힘으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

위와 같은 통상적인 ICSI 방법이 가지는 문제점을 해소하고 수정율을 향상시키기 위해 본 발명은 개선된 ICSI 주입용 피펫과 이를 사용한 새로운 ICSI 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 정상적인 수정 과정에 더 근접한 새로운 ICSI 방법을 제공하고자 한다.

구체적으로, 본 발명은 정자 두부 막(sperm head membrane)에 기계적인 손상을 유발하는 주입용 피펫과 이를 적용한 ICSI 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 개선된 ICSI 방법은 본 발명의 특징적인 주입용 피펫을 사용하여 수행될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 난자 내로 주입하고자 하는 정자 두부의 최대 직경보다 크지 않은 내경을 가지고, 팁의 말단에 다수의 작은 스파이크를 부가한 주입용 피펫을 형성하여, 주입용 피펫의 팁(tip)에 정자를 포획한 뒤 난세포질 내로 주입하고, 난세포질 내에서 세포질 물질과 혼합한 후 주입 피펫을 회수하는 과정으로 이루어진다.

이하, 본 발명의 구성에 대하여 구체적으로 설명한다.

주입용 피펫 (injection pipette)

본 발명의 주입용 피펫은 통상적인 ICSI에 사용되는 것과 같이, 양단이 열린(open) 모세관을 가공하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 사용되는 주입용 피펫은 난자 내로 주입하고자 하는 정자를 주입용 피펫의 팁에 포획할 수 있는 정도의 내경을 가지도록 구성된다. 또한, 본 발명의 주입용 피펫의 정자를 포획하는 팁은 그 말단에 다수의 짧고 작은 스파이크가 형성될 수 있다.

보다 구체적으로는 도 3에서 보는 바와 같이, 주입용 피펫의 내경은 조작하고자 하는 정자 두부의 최대 직경보다 크지 않으며, 이로 인해 정자가 주입 피펫 안으로 완전히 들어가지 못하고 피펫의 팁에 포획되도록 한다. 특히, 본 발명의 주입용 피펫의 내경은 정자 두부의 적도 영역(equatorial region)이 주입용 피펫의 팁에 부착되는 정도가 바람직하다.

한편, 다른 일단은 개방(open-end)되도록 형성되는데, 이로써 주입용 피펫 내부가 모세관 현상으로 음압(negative pressure)이 발생하게 된다. 이는 운동성의 정자의 포획을 용이하게 한다.

본 발명의 주입용 피펫은 모세관을 이용하여 제작될 수 있는데, 구체적으로는 원하는 정도의 내경이 나올 수 있는 모세관을 길게 뽑아내어 주입용 피펫의 팁으로부터 약 1mm 지점을 원하는 각도로 구부린 후 정자의 주입 직전 난자의 소적(drop) 내에서 제작할 수 있다 (도 1). 즉, 가늘게 뽑아진 모세관을 홀딩 피펫의 개구 내로 삽입하여(도1, A) 원하는 직경을 가지는 지점에서 피펫을 구부려 부러뜨려 주입용 피펫의 팁의 개구부를 형성한다 (도1, B,C). 그 후, 홀딩 피펫 내의 부러진 모세관 조각은 폐기된다. 이러한 본 발명의 주입 피펫의 제작방법은 주입 피펫의 팁의 말단에 다수의 작은 스파이크를 형성하게 할 수 있다.

본 발명에 있어서 주입용 피펫의 위와 같은 구성은 정자 포획과 정자 주입에 있어서 많은 이점을 제공하게 된다. 주입용 피펫 자체가 가지는 음압으로 인해 정자의 포획을 용이하게 할 수 있는데, 정자의 운동성을 떨어뜨리기 위한 PVP와 같은 별도의 화학물질의 사용을 필요로 하지 않게 된다.

또한, 정자를 주입용 피펫의 내부에 완전히 들어가지 않고 피펫 팁에 부착되도록 하는 직경을 가짐으로써 정자 전체의 흡입과 흡출이 가능한 큰 직경을 가진 통상적인 ICSI 방법에 사용되는 주입 피펫보다 그 크기가 작아 난세포질의 파괴를 줄임과 동시에 정자와 함께 유입되어 난세포질 내로 들어가는 배지의 양을 줄일 수 있다. 또한, 유입되는 배지 양을 감소하기 위해 정자의 꼬리를 절단하지 않아도 되는데, 이로 인해 본 발명의 ICSI 방법은 체내에서 일어나는 정상적인 정자 유입과 유사한 환경을 제공하게 된다.

또한, 주입 피펫 팁 말단의 다수의 스파이크는 정자 두부 막의 손상과 난세포질막의 통과를 용이하게 할 수 있다.

특히, 본 발명의 ICSI 주입용 피펫은 그 직경을 적절하게 변경함으로써 특정 종(species)의 정자의 조작 또는 포획에 제한되지 않고 광범위하게 사용될 수 있다.

본 발명의 ICSI 방법

본 발명의 개선된 ICSI 방법은 위 주입용 피펫을 사용하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 개선된 ICSI 방법은 본 발명의 특징적인 주입용 피펫을 이용하여 온전한 운동성을 가진 정자를 주입용 피펫의 팁에 포획하여 세포질 내로 주입한 후 주입용 피펫을 회수하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 주입된 정자와 난세포질을 혼합(mingling)하는 과정을 더 포함할 수 있다.

이하 구체적으로 각 과정을 상세히 설명한다.

정자의 포획

본 발명에서 정자의 포획은 본 발명의 주입용 피펫을 운동성 있는 정자의 미부 또는 두부 가까이로 이동시킴으로써 가능하다. 또는, 운동성 있는 정자가 주입용 피펫에 근접하는 경우에도 가능하다. 더 바람직하게는 도립 현미경 및 미세조작기 하에서 운동성 있는 정자와 주입용 피펫을 근접시킴으로써 정자의 포획이 가능하다.

위와 같이 정자의 운동성을 떨어뜨리지 않고 정자를 용이하게 포획할 수 있는 것은 모세관 현상으로 인해 음압이 발생하는 본 발명의 주입용 피펫의 특징 때문이다.

본 발명에서는 정자의 움직임이 아무리 빨라도 용이하게 포획되는데, 주입용 피펫을 소적 경계부 주위를 빠르게 유영하는 정자의 꼬리 근처에 접근시키면 정자 두부의 적도 영역이 주입 피펫의 팁에 끼일 때까지 쉽게 흡입될 수 있다.

주입용 피펫의 음압으로 인한 정자의 포획에 있어서 주입용 피펫에 정자의 두부가 먼저 이끌려 와서(head-first) 포획되거나 미부가 먼저 이끌려 와서 (tail-first) 포획될 수 있다.

난세포질 내 정자 주입

위와 같이 주입용 피펫의 팁에 포획된 정자는 본 발명의 ICSI 방법으로 난세포질 내로 주입될 수 있다. 즉, 포획된 정자는 주입용 피펫과 함께 직접 난세포질 내로 주입된다. 구체적으로 정자의 주입은 도 5에서 보는 바와 같이, 난자를 고정하고 있는 홀딩용 피펫과 정자를 포획한 주입용 피펫을 나란하게 하여 난자의 뒤틀림이 없도록 하여 수행될 수 있다. 특히, 본 발명의 주입 피펫 팁의 말단에 형성된 다수의 스파이크는 난세포질막을 용이하게 통과하는 것을 가능하게 한다.

주입용 피펫으로 정자를 난세포질 내로 주입한 후에, 입으로 압력을 조절해서 주입용 피펫에 음압과 양압(positive-pressure)을 순차적으로 가하여 줌으로써 주입용 피펫과 정자를 분리시킬 수 있다.

위와 같이 양압과 음압을 순차적으로 제공하여 정자를 난세포질과 혼합(mingling)시킨다. 바람직하게는, 현미경을 통해 보면서 입으로 불었다 빨았다하는 방식으로 압력을 조절하여 2~3회 반복하여 정자를 난세포질과 혼합시킬 수 있다.

이렇게 세포질 물질과 혼합된 정자는 주입용 피펫을 난세포질로부터 회수함으로써 주입용 피펫과 분리되어 정자만이 난세포질 내에 남게 할 수 있는데, 이는 난세포질 내의 점성으로 인해 정자가 주입용 피펫을 따라 난세포질이 밖으로 나오는 것이 방지되기 때문이다.

이와 같이, 포획된 정자의 난세포질 내로의 직접 주입은 ZP와 난막을 통과하는 동안의 정자 두부 막의 기계적인 손상과 더불어 완성되고, 세포질내에서 피펫내 음압과 양압을 입(mouth)으로 적절히 조절하여 세포질내로의 과도한 배지와 주입용 피펫내로의 과도한 세포질 물질의 유입없이 손상된 정자 두부와 세포질 물질과의 혼합을 완성할 수 있다.

정자 두부 막 손상

본 발명의 위와 같은 정자의 주입 방법은 특징적으로 정자 두부의 손상을 일으키게 한다. 즉, 운동성 있는 정자가 주입 피펫의 날카로운 팁에 포획되는 경우 두부 막에 미세하게 기계적인 손상을 입게 되며, 또한 도 3 및 5 에서 보는 바와 같이, 주입용 피펫과 함게 ZP 및 난세포막을 통과하면서 정자 두부 막에 더 많은 손상을 입게 될 수 있다.

이는 체내에서의 정상적인 수정의 과정과 유사한 조건을 제공하게 되어, 난세포 활성을 유도하는 정자 내 물질을 방출하여 수정율을 향상시킬 수 있게 한다. 통상적인 ICSI 방법의 사용에서도 정자 꼬리에의 기계적인 손상이 심하면 심할수록 수정율이 향상된다는 사실(Palermo et al., Hum Reprod. 1996; 11: p1023)로부터 본 발명의 수정율 향상의 근거가 될 수 있다.

위와 같이, 본 발명의 주입용 피펫은 그 음압으로 인해 운동성 있는 정자의 포획이 용이하여 주입기 및 PVP와 같은 화학물질을 사용할 필요가 없어 정상적인 수정 환경과 더 근접하게 할 수 있으며, 통상적인 ICSI 방법에 사용되는 주입용 피펫보다 그 직경이 줄어들게 되어 난세포질의 손상을 줄이고, 난세포질 내로 주입되는 배양액 등의 이물질의 양을 감소시키는 이점을 제공할 수 있다. 특히, 정자의 주입 과정에서 정자의 두부 막의 기계적인 손상을 유발시킴으로써 수정율을 향상시킬 수 있다.

이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 본 발명과 그 구현예에 대하여 상세하게 설명한다. 본 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 본 실시예에 한정되지 않음에 유의해야 한다.

실시예 1 : 본 발명의 개선된 ICSI를 위한 피펫의 제작

(1) 홀딩용 피펫

본 발명에 따른 홀딩용 피펫을 제조하기 위한 모세관(G-1, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan)은 외부 직경(outer diameter; 이하, OD로 인용되기도 함) 1㎜ 및 내부 직경(inner diameter; 이하, ID로 인용되기도 함) 0.9㎜을 갖는 것이었다. 홀딩용 피펫은 약 5mm 길이의 유리피펫 구간을 약 120㎛의 외부 직경(OD)이 될 때까지 마이크로풀러 (micropuller, PC-10, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan) 상에서 당겼다. 사용된 프로그램 셋팅은 싱글 풀링(single pulling), 가열 101(heat 101) 및 무분동(no weight)이었다.

일단, 모세관을 가늘게 만든 후, 팁(tip)의 적합한 지점에서 또 다른 가는 모세관 말단과 함께 부드럽게 문질러 모세관의 팁을 부러뜨렸다. 이러한 파쇄부 표면은 수직이고 평편해야 하며, 균질하지 않거나 비스듬한 파쇄부를 갖는 피펫은 폐기되었다. 홀딩 피펫은 미세세공기(microforge, MF-900, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan)의 플라티늄-이리듐 필라멘트 상에서 복사열을 사용하여 열 연마하였다.

홀딩용 피펫의 연마된 부분의 ID는 약 30 내지 40㎛이며, 확실하게 난자를 고정시키는 것을 가능하게 하였다. 이후, 홀딩 피펫은 필라멘트에 대해서 약 30˚의 각으로 굽혔다.

(2) 주입용 피펫

1.0㎜의 OD 및 0.9㎜의 ID를 갖는 얇은 벽의 보로실리케이트 모세관(G-1, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan)의 약 5mm 길이의 유리피펫 구간을 마이크로풀러 (micropuller, PC-10, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan) 상에서 당겼다. 사용된 프로그램 셋팅은 더블 풀링(double pulling), 가열 1 (heat 67), 가열 2 (heat 80) 및 한 개의 가벼운 분동(one light weight)이었다.

끌어 당겨진 모세관의 날카로운 팁을 약 30°의 각까지 미세세공기(microforge)(MF-900, 제조원: Narishige, Tokyo, Japan)의 플라티늄-이리듐 필라멘트 상에서 비스듬히 굽혔다.

그리고, 도 1에서와 같이 가늘게 뽑아진 모세관을 홀딩용 피펫의 개구 내로 삽입하고(도 1, A), 그 후, 삽입된 모세관을 조금씩 구부려(B, C) 결국 피펫의 팁이 부러지도록 하였다. 이 과정은 난자의 소적 내에서 행하였으며, 홀딩용 피펫 내부의 부러진 모세관 조각은 폐기하였다.

실 시예 2 : 운동성 정자의 선별

(1) 정액의 준비

동결-해동된 수퇘지 정액을 사용하였다. 소량의 정액을 1분 동안 39℃에서 해동시켰다. 정액 100㎕을 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, 이하 PVA로 인용됨)을 보충한 1㎖의 둘베코 인산염 완충된 염수(DPBS; Gibco 141900-144, Grand Island, NY)를 포함한 2.5㎖의 원심분리관의 바닥에 조심스럽게 위치시키고, 스윔-업(swim-up) 과정을 위하여 뚜껑을 닫고 39℃, 5% CO₂ 배양기내에서 정치시켰다. 50분 후, 배지 0.5㎖을 관의 상부로부터 수거하고 2.5㎖ 원심분리관에서 3분 동안 350 x g에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 정자 펠렛을 ICSI에 앞서 39℃ 상태로 항온기에서 보관하였다.

(2) 운동성 정자의 선택

소량의 정자 펠렛을 정자 소적의 중심 내로 조심스럽게 위치시켰다. 정자가 디쉬(dish) 바닥에 정착한 후, 운동성 정자는 소적의 경계를 향해 공격적으로 이동하였다. 디쉬 내에 광유를 충전시키기 전에, 정자의 소적을 테이블에 대해 가볍게 두드려 얇은 소적을 만들었다. 경계 영역의 좁은 공간에서 아래위로 유영하는 운동성 있는 정자를 선별할 수 있었다.

실시예 3 : 체외성숙 난자의 준비

특별한 언급이 없는 한, 본원에서 사용된 시약들은 제조원(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, M.O., U.S.A.)의 것을 사용하였다.

(1) 미성숙난자의 체외 성숙

난소는 도살장에서 미경산돈으로부터 취득하였으며, 30 내지 35℃ 의 0.9%(w/v) NaCl 용액내에서 보관하여 실험실로 옮겼다. 난소를 3 회 세척한 후, 미성숙 난자를 5㎖ 1회용 주사기에 부착된 18 게이지 피하 주사용 바늘로 흡입하였다. 도 2의 A에서 보는 바와 같이, 난소의 피층에 많은 대소의 난포들이 보인다.

15㎖ 코니컬 튜브에 난포 내용물을 모은 후, 상층액을 폐기하였다. 침전물 중 난구세포-난자 복합체(cumulus-oocyte complex, COC)를 0.01% PVA가 첨가된 타이로드(Tyrode's) 락테이트-Hepes(TLH) 배지(표 1)에서 3회 세정하였다. 균질하게 과립화된 난세포질을 갖고 3 개 층 이상의 밀집한 난포 세포에 의해 둘러싸여 있는 COC를 체외성숙(in vitro maturation, 이하 'IVM'으로 약칭함)용으로 선택하였다. 도 2의 B에서와 같이 미성숙난자가 난구세포로 조밀하게 둘러싸여 있음을 볼 수 있었다.

IVM 배지(표 2)는 26.2 mmol/l NaHCO₃, 3.05 mmol/l 글루코오스, 0.91 mmol/l 피루베이트산 나트륨, 0.57 mmol/l L-시스테인, 75 ㎍/ml 카나마이신, 20 ng/ml 표피 성장 인자(EGF), 5 IU/ml PMSG/hCG (제조원: Intervet) 및 10% (v/v) pFF로 보충되고 얼스 염(Earle's salts) 및 L-글루타민 (제조원: Gibco, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA)을 갖는 조직 배양 배지를 포함한다. pFF는 미경산돈의 난소 내 직경 3 내지 8mm의 난포를 흡입하여, 30분 동안 1900 x g에서 원심분리하고, 1.2 ㎛ 및 이후 0.45㎛ 주사기 필터(제조원: Gelman Sciences, Ann Arbor, MI, USA)를 통해 여과하여 사용할 때까지 -30℃에서 분획물로 보관하였다.

체외성숙은 10% pFF가 첨가된 성숙용배지에 30 내지 50 개의 미성숙난자를 39℃, 공기 중 5% CO₂의 포화 습도 하에서 처음 22 시간 동안 호르몬으로 보충된 4-웰 배양 디쉬 배지에서 배양하고, 그 후 22 시간 동안 호르몬 없이 보충된 4-웰 배양 디쉬 배지에서 배양하였다. 도 2의 C 에서 보는 바와 같이, 44 시간의 IVM 후에 잘 확장된 난구세포를 가진 성숙난자가 되었다.

PVA를 함유하는 타이로드 락테이트 HEPES-완충된 배지 조성

물질	농도
NaCl	114.0 mM
KCl	3.1 mM
CaCl2 ·H2O	2.0 mM
NaH2PO4 ·H2O	0.3 mM
MgCl2 ·H2O	0.5 mM
NaHCO3	2.0 mM
Na-락테이트	10.0 mM
Na-피루베이트	0.25 mM
1HEPES	10.0 mM
카나마이신	75 mg/L
2PVA	0.01 %(w/v)

¹ N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산].

² 폴리비닐 알코올.

돼지 미성숙난자의 체외성숙용 돼지 조직 배양 배지 조성

물질	농도
*TCM 분말 (Gibco 31100-027)	-
NaHCO3	26.2 mM
글루코오스	3.05 mM
Na-피루베이트	0.91 mM
L-시스테인	0.57 mM
1pFF	10% (v/v)

* 조직 배양 배지.

¹ 돼지 난포액.

(2) 주입 챔버의 준비

체외성숙된 난자를 0.1%(w/v) 히알루로니다제에 잠시 노출시킨 후 기계적인 피펫팅으로 난구세포로부터 분리시켰다. 제1극체 및 정상적인 외관을 갖는 난자를 2회 세척하고 0.01% PVA를 함유하는 TLH의 7㎕ 소적 내로 옮기며, 소량의 정자 펠렛을 광유하의 0.1% PVA를 함유하는 DPBS의 7㎕ 소적 중심에 놓았다.

실시예 4 : 난세포질 내 정자 주입

도립 현미경 및 미세조작기(LABOVERT FS, Leitz, Germany) 하에서, 운동성 정자를 정자 꼬리 또는 두부 가까이로 피펫 팁을 이동시켜 정자 두부의 적도 영역까지 자동적으로 주입용 피펫으로 흡입하게 하였다. 흡입되어 주입용 피펫의 팁에 포획된 형태는 도 3과 같다. 운동성 정자만이 소적의 경계 주변에서 쉽게 포획되었다 (도 4).

도 5에서와 같이, 포획된 정자를 난자의 소적으로 이동하여 정자를 세포질 내로 직접적으로 주입하였다. 이후, 개방된 튜브(open end tube)를 입으로 2 내지 3회 방출과 흡입을 반복하여 정자를 세포질 내 성분들과 혼합(mingling)하였다(도 6). 혼합이 끝난 후에 주입용 피펫을 난자로부터 제거하였다.

실시예 5 : 수정된 난자의 배양

정자가 주입된 모든 체외수정 난자들을 0.4% BSA로 보충된 노오쓰 캐롤라이나 주립대학-23 (North Carolina State University-23, NCSU-23) 배지(표 3)에 옮기고, MPN 형성 또는 정자 두부 탈응축의 확인과 확장 배반포(blastocyst)의 세포수의 검사를 위하여 5% CO₂, 7% O₂ 및 88% N₂, 39℃하에서 각각 18시간 및 168시간 동안 배양하였다.

체외 배양용 NCSU-23 배지 조성

조성	농도
	NCSU-D	NCSU-W
NaCl	108.73 mM	108.73 mM
KCl	4.78 mM	4.78 mM
CaCl2 ·H2O	1.7 mM	1.7 mM
KH2PO 4	1.19 mM	1.19 mM
MgSO4 ·H2O	1.19 mM	1.19 mM
NaHCO3	25.07 mM	4.0 mM
1HEPES	-	10.0 mM
Na-피루베이트	0.91 mM	0.5 mM
글루타민	1.0 mM	1.0 mM
타우린	7.0 mM	-
히포타우린	5.0 mM	-
카나마이신	75 mg/L	75 mg/L
2BSA	0.4 %(w/v)	0.4 % (w/v)

¹N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산].

² 소 혈청 알부민.

실시예 6 : MPN의 평가 및 배반포 세포의 계수

ICSI 및 IVF 18시간 후, 모든 난자를 슬라이드 글라스에 올려놓고 34℃ 마이크로 웜 플레이트위에서 10분 동안 용액(아세트산:에탄올 = 1:3)에서 고정하였다. 이 후, 45%(v/v) 아세트산 용액 중 1% (w/v) 오르세인(orcein)으로 염색하고 400 배율의 광학 현미경 하에서 정자 탈응축 및 MPN 형성을 평가하였다(도 7). 도 7의 (A)에서와 같이 2 개의 전핵 및 2 개의 극체가 보였고, (B)에서 탈 응축된 정자 두부 및 자성 전핵이 보였다.

생존한 난자를 (1)하나의 자성 전핵(female pronucleus, 이후 FPN으로 약칭됨) 및 두 개의 극체(polar body, 이후 PB로 약칭됨)와 함께 존재하는 하나의 MPN, (2)FPN을 갖거나 갖지 않는 하나의 MPN, 및 (3)FPN을 갖거나 갖지 않는 하나의 MPN 또는 하나의 탈응축된 정자 두부(decondensed sperm head, 이후 DSH로 약칭됨)의 세 그룹으로 분류하였다.

ICSI 또는 IVF 48 또는 168시간 후, 각각 분할율과 비스벤즈이미드(Hoechst 33342) 염색에 의한 배반포의 생존율과 세포수를 조사하였다(도 8). 도 8의 (A)에서는 다수의 확장 배반포가 보였고, (B)는 비스벤지미드로 염색된 확장 배반포의 핵이 보였다.

실시예 7 : 통계 분석

그룹 간의 MPN 형성 및 발생의 차이(%)를 분산의 균일성을 유지하기 위하여 아크사인 함수(arcsine) 변환 후 일-방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다. LSD 시험을 사용하여 그룹 간의 차이를 확인하기 위해서 Post hoc 분석을 수행하였다. 다중 비교를 위한 Dunn 방법과 함께 Wilcoxon 시험을 사용하여 그룹 간 배반포 내 세포수의 유의한 차이점의 존재 여부를 결정하였다. 모든 데이터는 산술적 평균 ±SEM으로서 제시된다. 모든 분석은 SAS(SAS Institute version 8.1) 분석 프로그램을 사용하여 수행하였다.

비교 실험

비교 실시예 1 : 정자 및 난자의 준비 및 체외 성숙

동결-해동된 수퇘지의 정액을 생체외-성숙 난자의 수정을 위해 준비하였다. 정자의 준비 및 IVF를 위한 배지로 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염 및 변형된 Tris-완충 배지(mTBM)를 각각 사용하였다. 정자 세척을 위한 인산염-완충 식염은 136.9 mmol/l NaCl, 2.7 mmol/l KCl, 1.5 mmol/l KH₂PO₄, 8.1 mmol/l Na₂HPO₄, 0.5 mmol/l 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 5.6 mmol/l 글루코즈(glucose) 및 0.1% (w/v) BSA를 포함한다 (표 4).

변형된 Tris-완충 배지 (mTBM, 표 5)는 113.1 mmol/l NaCl, 3 mmol/l KCl, 7.5 mmol/l CaCl₂, 20 mmol/l Tris (T-1410, Trizma base; Sigma), 11 mmol/l 글루코즈, 5 mmol/l 소듐 피루베이트, 4 mmol/l 무수 카페인(caffeine anhydrous) 및 0.2% (w/v) BSA (A-3311, Fraction V, fatty acid free; Sigma)을 포함한다.

동결 정액을 물 중탕으로 1분간 39(C에서 해동시키고 10 ml의 PBS에서 희석하였다. 정자 현탁액은 350g으로 3분간 2회 원심분리하고, 최종 정자 펠릿을 1(10⁶ sperm/ml 농도가 되도록 mTBM에서 재현탁화하였다.

한편 IVM 후에, 난자를 둘러싸고 있는 확장된 난구 세포는 1% (w/v) 의 히아루로니다제(hyaluronidase) (Sigma)를 포함하는 성숙 배지에서 부드럽게 피펫팅하여 제거하고 mTBM에서 2회 세척하였다. 5 ㎕의 mTBM 내의 20 내지 30개의 난자를 광유로 덮혀진 40 ㎕의 수정 소적(fertilization drop) 내에 도입하였다. 그 후, 각 수정 소적 내에 정자 현탁액 5 ㎕를 첨가하여 최종 정자 농도가 1×10⁶ sperm/ml가 되게 하였고 포화습도 대기 중에서 5% CO₂ 조건으로 8시간 배양하였다.

정자 세척을 위한 인산염-완충 식염(saline)의 조성

조성	농도
NaCl	136.9 mM
KCl	2.7 mM
KH2PO4	1.5 mM
Na2HPO4	8.1 mM
Na-피루베이트	0.5 mM
글루코즈	5.6 mM
1BSA	0.1% (w/v)

¹ 소혈청 알부민

체외 수정용 변형된 Tris-완충배지의 조성

조성	농도
NaCl	113.1 mM
KCl	3.0 mM
CaCl2 ·HO	7.5 mM
글루코즈	11.0 mM
Na-피루베이트	5.0 mM
무수 카페인	1.0 mM
L-시스테인	0.57 mM
Tris	20.0 mM
1BSA	0.2 % (w/v)

¹ 소 혈청알부민

비교 실시예 2 : ICSI 방법의 차이에 따른 수정 효과 비교

(1) 통상적인 ICSI에 의한 수정

통상적인 ICSI에서 주입용 피펫은 휴마겐(Humagen, Inc.) (Charlottesville, VA; 10-MIC-S, 30°angled)에서 구입하였다. 50×9 mm 페트리디쉬(petridish)(Falcon) 위에 2 개의 7㎕ 미소적을 정렬시켰다. 미세조작기(Narishige, Tokyo, Japan)를 가진 도립현미경(inverted microscope) (Olympus IX50, Melville, NY, USA)을 사용하면서, 정자 꼬리를 스코링하여 운동성을 떨어뜨리고 주입용 피펫 내로 흡입하여(도 9, A) 난자를 포함하고 있는 소적으로 이동하였다 (도 9, B).

정자는 홀딩용 피펫으로 고정된 난자에 6시 또는 12 방향으로 주입하고 소량의 세포질과 혼합하였다 (Martin, Biol Reprod, 2000; 63: p109).(도 9)

(2) 본 발명의 ICSI에 의한 수정

본 발명의 개선된 ICSI는 <실시예4> 에서 설명된 바와 같이 난자를 수정시켰다.

(3) 각 ICSI 방법에 따른 수정 효과의 차이 비교 (실험 1)

본 실험1에서는 서로 다른 방법으로 수정된 난자의 웅성전핵(MPN) 형성을 비교하였다. 위 각 방법에 의해 수정된 수정란에 대하여 수정 18시간 후에, MPN율 및 정자 두부의 탈응축을 측정하였다. 또한, IVF 그룹에서 다정자 수정을 조사하였다.

수정된 난자의 생존, 분할 및 배반포 형성율을 수정 후 24시간, 48시간 및 168시간 별로 비교하였다. 배반포의 세포 수는 <실시예 6>에서 설명한 바와 같이 측정하였다.

(4) 본 발명의 ICSI 방법에서 정자 포획 형태에 따른 효과 차이 비교 (실험 2)

본 실험 2에서는 MPN 및 배반포로의 발달에 있어서 정자 포획 타입의 차이에 대하여 조사하였다.

본 발명의 개선된 주입용 피펫의 팁에 포획되는 정자 포획 타입은 <실시예 4>에서 설명한 바와 같이 2 가지 형태가 있다. 즉, 도 10의 A에서 보는 바와 같이, 꼬리가 먼저 포획된 정자의 난세포질 내로의 주입된 경우와 (화살표는 주입용 피펫의 밖에 정자 머리가 보인다 (×200)), 도 10의 B에서 보는 바와 같이, 머리가 먼저 포획된 정자의 난세포질 내로의 주입된 경우 (화살표는 정자 머리를 나타내고 꼬리는 주입용 피펫의 끝단 위에 걸려 있다(×200)). 운동성의 정자는 항상 정자 소적의 경계에서 포획되었다. (도 4).

(5) 비교 실험결과

실험 1: 수정 방법에 따른 차이

2 가지의 ICSI 방법 및 IVF에서의 MPN 형성율은 표 6에 나타내었다. IVF 그룹의 22개의 난자에서 다정자 수정이 발견되었는데, 이는 2 이상의 전핵 또는 정자 머리를 나타내었다 (표 6에 나타내지 않음).

개선된 ICSI 방법의 정상 수정(46.7%) 및 MPN 형성율(50.7%)은 통상적인 ICSI 방법(21.3% 및 27.9%)으로 수정하였을 때 보다 유의적으로 높았다(P<0.001). 또한, 본 발명의 개선된 ICSI 방법에 있어서 MPN을 포함하는 정자 두부의 탈응축 형성 (80.0%)는 IVF 그룹에서의 다정자 수정을 제외하고는, 통상적인 ICSI (55.7%) 및 IVF 그룹 (63.5%)보다 유의적으로 높았다 (P<0.001).

통상의 ICSI 및 개선된 ICSI 방법에 있어서의 웅성전핵 형성율의 비교

수정 방법	주입/침투된 난자의 수	난자의 수
		1MPN+1FPN+2PB	1MPN	1MPN or 1DSH
통상	61(7)a	13(21.3)b	17(27.9)b	34(55.7)b
개선	75(6)	35(46.7)c	38(50.7)c	60(80.0)c
체외수정	63(6)	24(38.1)c	25(39.7)c	40(63.5)b

특별한 언급이 없는 한 괄호안의 숫자는 백분율을 의미함

^a 실험 횟수.

^b,c 동일한 컬럼에 있는 다른 윗 첨자의 값은 유의적인 차이가 있음. P < 0.001.

MPN = 웅성 전핵; ICSI = 세포질내 정자 주입; PB = 극체;

FPN = 자성 전핵; DSH = 탈응축 정자 두부

다른 2 종류의 ICSI 방법 및 IVF에서의 수정란의 생존율, 분할율 및 배반포 형성율은 표 7에 나타내었다. 본 발명의 개선된 ICSI 방법의 생존율(71.7%)은 통상적인 ICSI 방법의 생존율(48.1%)에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.001). 또한, 본 발명의 개선된 ICSI 방법의 분할율(60.6%)은 통상적인 ICSI방법의 분할율(48.7%) 및 IVF 그룹의 분할율(53.2%) 보다 유의적으로 높았다 (P<0.001).

한편, IVF 그룹에서의 확장 배반포(expanded blastocyst)로의 발달율(19.4%)이 통상의 ICSI 방법의 경우(10.5%) 및 개선된 ICSI 방법의 경우(17.5%)보다 유의적으로 높음에도 불구하고(P<0.001), 배반포로의 다정자 발달을 고려할 때 본 발명의 개선된 ICSI 방법이 IVF 그룹과 비슷하거나 더 높은 것으로 여겨질 수 있었다. 또한, 그룹들 간에서 배반포의 세포 수에는 유의적인 차이를 발견할 수 없었다.

통상의 ICSI 및 개선된 ICSI 방법에 있어서의 분할 및 배반포로의 발달 비교

수정 방법	정자 주입된난자의 수	생존한 난자의 수 b	수정란의 수		배반포에서의 세포 수 (평균 ±SEM)
			분할c	배반포d
통상	81(6)a	39(48.1)e	19(48.7)e	2(10.5)e	18.5±6.5
개선	92(6)	66(71.7)f	40(60.6)f	7(17.5) f	26.1±2.6
체외수정	139(6)	139(100.0%)g	74(53.2) g	27(19.4) g	24.7±2.1

특별한 언급이 없는 한 괄호안의 숫자는 백분율을 의미함

^a 실험 횟수.

^b 주입된 중기 II(MII) 전체 난자 중에서

^c ICSI 및 IVF에서 전체 생존하고 정자 주입된 것 중에서

^d 전체 분할된 수정란 중에서; ^e,f 동일한 컬럼에 있는 다른 윗 첨자의 값은 유의적인 차이가 있음, P < 0.001;

ICSI = 세포질내 정자 주입

실험 2. 정자 포획 형태

본 발명의 개선된 ICSI 방법에 있어서, 두부가 먼저 포획된 경우 및 미부가 먼저 포획된 경우의 2 그룹간의 MPN 형성율은 표8에 나타내었다. 미부가 먼저 포획된 경우 (55.4, 59.8, 78.3 %)와 두부가 먼저 포획된 경우 (45.1, 54.9, 74.4 %)간의 정상수정, MPN 형성 및 탈응축율에서 차이가 없었다.

개선된 ICSI 방법에서 미부 및 두부가 먼저 흡입된 경우의 MPN 형성의 비교

정자포획 형태	성공적으로 주입된 난자의 수	난자의 수
		1MPN+1FPN+2PB	1MPN	1MPN or 1DSH
미부-먼저	92(6)a	51(55.4)	55(59.8)	72(78.3)
두부-먼저	82(6)	37(45.1)	45(54.9)	61(74.4)

특별한 언급이 없는 한 괄호안의 숫자는 백분율을 의미함

^a 실험 횟수.

MPN = 웅성 전핵; ICSI = 세포질내 정자 주입; PB = 극체; FPN = 자성 전핵;

DSH = 탈응축 정자 두부

또한, 본 발명 ICSI 방법에 있어서, 2 그룹간의 생존율, 분할율 및 배반포 형성율을 표 9에 나타내었다. 미부가 먼저 포획되는 경우와 두부가 먼저 포획되는 그룹간에서 생존율의 큰 차이가 없었다 (79.8 및 73.7 %). 개선된 ICSI에서는 정자와 함께 주입된 배지의 최소량은 정자가 주입된 난자의 생존에 영향을 미치지 않았다.

분할율에서 차이가 없었지만, 확장 배반포로의 발달에서 두부가 먼저 포획된 경우가 미부가 먼저 포획된 경우보다 약간 높았지만 (66.2 및 57.1 %, 4.3 및 12.5 %), 유의적인 차이는 없었다. 확장 배반포에서도 세포수는 유의적인 차이가 없었다 (39.5 및 32.8).

개선된 ICSI 방법에서 미부 및 두부가 먼저 흡입된 경우의 배반포로의 발달 비교

정자포획 형태	주입된 난자의 수	생존한 난자의 수 b	수정란의 수		배반포에서 세포수 (평균 ±SEM)
			분할c	ExBLd
미부-먼저	89(6)a	71(79.8)	47(66.2)	2(4.3)	39.5±4.5
두부-먼저	76(6)	56(73.7)	32(57.1)	4(12.5)	32.8±10.1

특별한 언급이 없는 한 괄호안의 숫자는 백분율을 의미함

^a 실험 횟수.

^b 주입된 중기 II(MII) 전체 난자 중에서

^c 생존한 전체 난자 중에서

^d 분할된 전체 난자 중에서

ExBL = expanded blastocyst.

본 발명의 개선된 ICSI 주입용 피펫 및 이를 이용한 ICSI 방법은 통상의 ICSI 방법이 가지는 문제점을 해소하여 훨씬 월등한 MPN 형성율과 배반포 발생율을 나타내는 등의 향상된 수정 성공율을 제공한다.

도 1은 본 발명 주입용 피펫의 제조 과정을 나타낸다.

도 2는 돼지 미성숙난자의 변화를 나타낸다.

도 3은 주입용 피펫의 팁(tip)에 포획된 정자를 도식한 것이다. (A) 꼬리가 먼저 포획된 경우. (B) 머리가 먼저 포획된 경우.

도 4는 본 발명 주입용 피펫의 팁에 운동성 있는 정자가 포획된 것을 나타낸다.

도 5는 정자를 포획한 본 발명의 주입용 피펫을 이용하여 정자를 성숙난자 내로 주입하는 것을 보여준다.

도 6은 세포질의 가운데에서 주입용 피펫의 압력을 조절하여 주입된 정자를 세포질과 혼합하는 과정을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 개선된 ICSI 방법으로 수정한 후 아세토-오르세인으로 염색한 수정란을 나타낸다. (A) 2 개의 전핵 및 2 개의 극체가 보임. (B) 탈 응축된 정자 두부 및 자성 전핵이 보임.

도 8은 생체 외 배지에서 본 발명의 개선된 ICSI로 수정한 168시간 후의 배반포를 나타낸다. (A) 다수의 확장 배반포가 보임. (B) 비스벤지미드(bisbenzimide)(Hoechst 33342)로 염색된 확장 배반포의 형광 핵.

도 9는 통상적인 ICSI로 성숙난자에 정자를 주입하는 방법을 나타낸 것이다. (A) 주입용 피펫 팁 아래의 정자 꼬리가 스코링(scoring) 됨. (B) 주입용 피펫 내의 정자가 난세포질 내로 주입됨.

도 10은 본 발명의 주입용 피펫으로 정자를 포획하여 성숙난자 내로 주입되는 2 가지 타입을 보여준다. (A) 정자의 꼬리가 먼저 포획된 경우. (B) 정자의 머리가 먼저 포획된 경우.

Claims (9)

1. 난세포질내 주입법에 사용되는 주입용 피펫에 있어서,

   난세포질 내로 주입하기를 원하는 정자 두부의 최대 직경보다 크지 않으며 정자 미부의 최대 직경보다는 큰 내경을 가진 것을 특징으로 하는 주입용 피펫.
2. 제1항에 있어서, 상기 피펫의 말단에 다수의 스파이크가 형성된 것을 특징으로 하는 주입용 피펫.
3. 가늘게 뽑아진 모세관을 원하는 직경을 가지는 지점까지 홀딩용 피펫의 개구 내에 삽입한 뒤, 상기 모세관을 구부려 부러뜨리는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항에 따른 주입용 피펫의 제조 방법.
4. 주입용 피펫으로 정자 포획하여 난세포질 내로 주입한 후, 주입용 피펫을 회수하는 과정으로 이루어지는 난세포질 내 정자 주입방법에 있어서,

   상기 제1항 또는 제2항에 따른 주입용 피펫을 사용함을 특징으로 하는 난세포질 내 정자 주입방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 주입용 피펫의 팁 부분에서 정자의 두부가 포획되는 것을 특징으로 하는 난세포질 내 정자 주입방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 정자의 포획되는 두부의 구체적인 부분이 적도 영역인 것을 특징으로 하는 난세포질 내 정자 주입방법.
7. 제4항에 있어서, 주입용 피펫을 회수하기 전에 정자와 난세포질을 혼합하는 과정을 더 포함하는 난세포질 내 정자 주입방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 혼합하는 과정은 주입용 피펫의 타단에 가압하거나 감압을 교차로 적용하는 것을 특징으로 하는 난세포질 내 정자 주입방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 혼합하는 과정은 주입용 피펫의 타단을 입으로 조절하여 방출 및 흡입을 2 내지 3회 정도 반복하는 것을 특징으로 하는 난세포질 내 정자 주입방법.