PL220877B1 - Sposób klonowania somatycznego ssaków - Google Patents

Abstract

Sposób klonowania somatycznego ssaków, z wyjątkiem człowieka, polega na tym, że w pierwszym etapie pod osłonkę przejrzystą zygoty ssaka wprowadza się fibroblasty jako dawców jąder somatycznych. Po czym, w drugim etapie, usuwa się materiał genetyczny z zygoty metodą selektywnej enukleacji, przy czym selektywną enukleację prowadzi się na wczesnym stadium rozwoju przedjadrzy. Z kolei przeprowadza się fuzję w polu elektrycznym. Sposób jest przeznaczony zwłaszcza do klonowania świni.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób somatycznego klonowania ssaków, z wyjątkiem człowieka, przy użyciu zygot jako biorców jąder komórek somatycznych. Sposób jest przeznaczony zwłaszcza do somatycznego klonowania świni.

Klonowanie somatyczne jest sposobem powielania organizmów metodą transplantacji jąder komórkowych (SCNT - somatic cell nu clear transfer). W procedurze tej jądra komórek somatycznych, pochodzące z płodów oraz różnych tkanek dorosłych zwierząt wprowadzane są do pozbawionych uprzednio własnego materiału genetycznego komórek biorców. Komórkami tym są, praktycznie we wszystkich prowadzonych eksperymentach, niezapłodnione oocyty w stadium metafazy II podziału mejotycznego. Komórki somatyczne wprowadza się mikrochirurgicznie pod osłonkę przejrzystą, a następnie łączy się obie komórki (dawcę i biorcę jądra) metodą fuzji komórkowej, w przeważającej liczbie przypadków metodą elektrofuzji przy zastosowaniu impulsów prądu stałego. Owca Dolly (WilmutI, Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. 1997. Viable offspring derived from foetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-813) była pierwszym ssakiem uzyskanym metodą klonowania somatycznego. Do chwili obecnej tą metodą sklonowano wiele gatunków ssaków, w tym wszystkie podstawowe gatunki zwierząt gospodarskich. Klonowanie somatyczne jest jedyną procedurą umożliwiającą otrzymanie klonów osobników dorosłych o dużej liczebności. Zaletą tej metody jest praktycznie nieograniczony dostęp do komórek dawców jader, a ponadto w przypadku klonowania określonych osobników dorosłych (np. o szczególnych cechach użytkowych), biopsje tkanek przeprowadzać można wielokrotnie, uzyskując za każdym razem ten sam materiał genetyczny, a tym samym identyczne klony.

Od czasu uzyskania pierwszego prosięcia w wyniku klonowania somatycznego (Polejaeva I.A.,

ChenS.H. Vaught T.D. et al. 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells Nature 407, 89-90) w wielu ośrodkach na świecie podejmowano mniej lub bardziej udane próby uzyskania świń metodą transplantacji jąder komórek somatycznych. Jeden z wariantów tej metody polega na mikrochirurgicznym usunięciu (enukleacji) z komórki jajowej (komórka biorca) jej własnego materiału genetycznego i wprowadzeniu na jego miejsce - metodą mikrochirurgiczną lub metodą fuzji komórek w polu elektrycznym - obcego, czyli egzogennego jądra komórki somatycznej (komórka dawca).

Pomimo tego, że liczba prosiąt uzyskanych w wyniku klonowania somatycznego jest coraz większa, efektywność tej procedury w odniesieniu do świni jest nadal stosunkowo niska, co związane jest - w dużej mierze - ze specyfiką rozrodu tego gatunku. Uzyskanie urodzonych prosiąt wymaga przeszczepiania do biorczyń dużej liczby (według niektórych autorów co najmniej 10-200) zrekonstruowanych zarodków dobrej jakości. Z tego względu prowadzone są badania, które pozwoliłyby na uproszczenie metodyki klonowania świń, jak również umożliwiłyby uzyskanie zarodków lepszej jakości.

Do tej pory w klonowaniu somatycznym świni wykorzystywano, w przeważającej liczbie przypadków, niezapłodnione komórki jajowe (oocyty) jako biorców jąder. Oocyty używane jako komórki biorcy znajdowały się najczęściej w metafazie II podziału mejotycznego (oocyty MII) i uzyskiwane były poprzez dojrzewanie in vitro niedojrzałych oocytów pozyskiwanych z pęcherzyków jajnikowych jajników zwierząt rzeźnych, bądź też, znacznie rzadziej, wypłukiwane były po owulacji z jajowodów indukowanych hormonalnie samic. Z oocytów takich usuwano mikrochirurgicznie chromosomy zlokalizowane w płytce metafazowej II podziału dojrzewania (materiał genetyczny oocytu), a na ich miejsce wprowadzano jądro komórki somatycznej. Po rekonstrukcji enukleowanego oocytu jądrem komórki somatycznej, oocyty muszą być pobudzone do ich dalszego rozwoju. W warunkach fizjologicznych, czynnikiem pobudzającym (aktywującym) oocyt MII jest wniknięcie do niego plemnika. Natomiast w klonowaniu somatycznym rekonstruowane oocyty muszą być w sposób sztuczny pobudzone do dalszego rozwoju. Stosowanymi powszechnie czynnikami aktywującym oocyt są czynniki fizyczne (impulsy elektryczne prądu stałego) lub też czynniki chemiczne (np. etanol, jonomycyna, jonofor wapniowy). Jednak sztuczna aktywacja oocytów - niezależnie od tego, że wydłuża czasami znacznie proces ich rekonstrukcji - jest tylko substytutem naturalnej, fizjologicznej aktywacji komórki jajowej wywołanej wniknięciem plemnika.

Alternatywą użycia jako biorców egzogennych jąder jest użycie zygot, które powstały w wyniku procesu zapłodnienia oocytów dojrzewających w warunkach in vivo, zamiast dojrzewających in vitro i sztucznie aktywowanych oocytów. Jednak dotychczasowe próby wykorzystania, jako biorców jąder, naturalnie aktywowanych komórek, czyli enukleowanych interfazowych zygot w stadium przedjądrzy, dały jednoznacznie negatywne wyniki.

PL 220 877 B1

Rekonstruowane zygoty (niezależnie od gatunku), do których wprowadzane były jądra pochodzące zarówno z komórek zarodków starszych niż stadium 2-komórkowe, jak również z macierzystych komórek zarodkowych (embryonic stem cells) oraz z komórek somatycznych, przechodziły jedynie

1-2 podziały bruzdkowania. Prawdopodobnie nie dochodziło w nich do przemodelowania i przeprogramowania wprowadzonych jąder, co jest conditio sine qua non prawidłowego rozwoju rekonstruowanych zarodków. W badaniach tych jednak enukleację interfazowych zygot przeprowadzano stosując metodę McGratha i Soltera (McGrath J., Solter D., 1983. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science 220, 1300-1302), w której usuwane są całe przedjądrza (całkowita enukleacja; CE - complete enucleation), więc otoczka jądrowa z przytwierdzoną do niej chromatyną jądrową, płynna zawartość przedjądrzy (karioplazma) oraz jąderka.

Autorzy wynalazku uważają, że czynnik/czynniki odpowiedzialne za przeprogramowanie jąder wnikają z cytoplazmy do przedjądrzy w czasie ich wzrostu i są w nich na stałe zlokalizowane w okresie interfazy. Usunięcie przedjądrzy metodą całkowitej enukleacji powoduje zatem usunięcie tego czynnika/czynników, co skutkuje brakiem zdolności środowiska cytoplazmatycznego interfazowej zygoty do przeprogramowania egzogennych jąder.

W oparciu o to założenie została opracowana metoda enukleacji komórek interfazowych, określona mianem selektywnej enukleacji (SE - selective enucleation) w odróżnieniu od enukleacji całkowitej (CE - complete enucleation), która jest wspomnianą już wyżej procedurą polegającą na usunięciu z komórki całego jądra komórkowego. W metodzie SE z zygoty (lub z oocytu w stadium pęcherzyka zarodkowego) lub z blastomerów wczesnych zarodków usuwana jest jedynie chromatyna przytwierdzona do otoczki jądrowej.

Metoda selektywnej enukleacji realizowana jest w ten sposób, że przy użyciu pipety przytrzymującej, wybrane przedjądrze zygoty oraz koniec pipety enukleacyjnej ustawiane są w jednej płaszczyźnie, po czym - po przebiciu osłonki przejrzystej - koniec pipety enukleacyjnej wprowadzany jest, na poziomie płaszczyzny równikowej, w bezpośrednie sąsiedztwo otoczki przedjądrza. Otoczka przedjądrza jest nieznacznie zasysana do pipety enukleacyjnej, a następnie wycofywana, co powoduje przemieszczenie przedjądrza w strefę peryferyjną komórki, a więc w pobliże oolemmy. W tym momencie, otoczka przedjądrza jest mocno zasysana do pipety, która następnie powoli wysuwana jest poza obręb zygoty. W momencie przechodzenia otoczki przedjądrza przez wąski otwór w osłonce przejrzystej zygoty dochodzi - na skutek wzrostu ciśnienia wewnętrznego w zmniejszającym swoją objętość przedjądrzu - do przerwania ciągłości otoczki przedjądrza i wycieku karioplazmy oraz jąderek do cytoplazmy zygoty. W ten sposób cała zawartość przedjądrza jest uwalniana z powrotem do cytoplazmy zygoty, a usuwana jest jedynie otoczka jądrowa z przytwierdzoną do niej chromatyną zawierająca DNA jądrowy, czyli materiał genetyczny zygoty.

Metoda selektywnej enukleacji została zastosowana w odniesieniu do zygot mysich (Greda P., Karasiewicz J., Modliński J.A., 2006. Mouse zygotes as recipients in embryo cloning. Reproduction 132(5), 741-8). W pierwszym etapie z zygoty usunięto jedynie otoczki jądrowe przedjądrzy wraz z przytwierdzoną do nich chromatyną jądrową, w cytoplazmie pozostała natomiast płynna zawartość przedjądrzy (karioplazma) oraz pseudojądrka. Następnie przeprowadzono fuzję enukleowanych zygot z blastomerami 1/8 i uzyskano urodzone myszy. Był to pierwszy przypadek uzyskania urodzonych zwierząt po wprowadzeniu do enukleowanych zygot interfazowych jąder pochodzących z komórek zarodków starszych niż zarodki 2-blastomerowe.

Przedstawiona wyżej metoda stwarza jednak istotne problemy np. w przypadku zygot świni i bydła. W przeciwieństwie do wyraźnie widocznych przedjądrzy myszy zawierających duże jąderka, przedjądrza zygot świni mają bardziej „delikatną” strukturę. Po wirowaniu zygoty ujawniają się one jako przejrzyste pęcherzyki o bardzo cienkiej otoczce jądrowej zawierające liczne drobne jąderka. Ta „delikatna” struktura przedjądrzy w zygotach świni powoduje, że ich selektywna enukleacja musi być przeprowadzana zdecydowanie ostrożniej niż enukleacja zygot myszy. Silne zassanie otoczki grozi bowiem wciągnięciem całego przedjądrza do wnętrza pipety. Ważne jest także, że przedjądrza w zygotach świńskich rosną stosunkowo szybko i osiągają znaczny rozmiar. Usunięcie otoczek takich wyrośniętych przedjądrzy jest praktycznie niemożliwe. Z tego względu selektywna enukleacja zygot świni musi być przeprowadzana wtedy, kiedy mają one jeszcze małą średnicę. Ponadto zygoty świńskie mają znacznie grubszą niż zygoty myszy osłonkę przejrzystą, która dodatkowo ulega w jajowodzie procesowi tzw. twardnienia osłonki (zona hardening). Gruba i twarda osłonka przejrzysta wymaga zastosowania znacznej siły nacisku podczas wprowadzania komórek dawców jąder do przestrzeni okołożółtkowej zygoty.

PL 220 877 B1

Wspomniane wyżej problemy powodują, że klonowanie zygot z grubą i twardą osłonką przejrzystą przeprowadzone musi być w sposób istotnie odmienny niż w przypadku zygot myszy.

Sposób klonowania somatycznego gatunków ssaków innych niż człowiek, według wynalazku charakteryzuje się tym, że w pierwszym etapie pod osłonkę przejrzystą zygoty wprowadza się fibroblasty jako dawców jąder somatycznych, po czym, w drugim etapie, usuwa się materiał genetyczny z zygoty metodą selektywnej enukleacji, przy czym selektywną enukleację prowadzi się na wczesnym stadium rozwoju przedjądrzy, po czym przeprowadza się fuzję pary komórek w polu elektrycznym.

Korzystnie sposób według wynalazku stosuje się do klonowania somatycznego świni.

Komórkami dawcami jąder są fibroblasty dorosłych osobników pochodzące z wczesnych pasaży hodowli in vitro, korzystnie z pasaży 2-4. Korzystnie stosuje się fibroblasty skóry lub fibroblasty płodowe.

Zgodnie z wynalazkiem zygoty inkubuje się w pożywce M2 zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B, a następnie wiruje przez 5 minut (18 000 r.c.f) w celu uwidocznienia przedjąrzy. Wirowanie powoduje przemieszczenie kropel lipidowych na jeden z biegunów zygoty i powstanie dużego obszaru przejrzystej cytoplazmy, w której widoczne są przedjądrza. Po wirowaniu zygoty inkubuje się przez kolejne 20 min. w pożywce zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B i 0.25 μg/ml nokodazolu (metylo[S-(2-tienylcarbonylo-1H-benzimidazol-2-yl]karbaminian), po czym pod osłonkę przejrzystą wprowadza się mikrochirurgicznie po jednej komórce-dawcy jądra. Cytochalazyna B, działając w specyficzny sposób na warstwę kortykalną powoduje, że błona komórkowa staje się bardziej elastyczna. Ułatwia to znacznie przeprowadzenie zabiegów mikrochirurgicznych oraz zwiększa odporność zygot na uszkodzenia wywołane zarówno zabiegami enukleacji, jak i mikrochirurgicznego transferu jąder. Uzyskiwanie i hodowla fibroblastów przeprowadzane są standardowymi, powszechnie stosowanymi metodami.

Po wprowadzeniu fibroblastów pod osłonkę przejrzystą przeprowadzany jest zabieg selektywnej enukleacji. Ważne jest że zgodnie z wynalazkiem selektywną enukleację prowadzi się za pomocą pipety o średnicy otworu wejściowego około 2-3 μm. Pipeta ma kształt stożka, a jej część robocza jest podzielona na dwa odcinki. Pierwszy z nich, od otworu wejściowego na długości do 20 mikrometrów rozszerza się tylko nieznacznie, natomiast w odcinku drugim pipeta rozszerza się gwałtownie. Kąt rozwarcia ścian mikropipety w części pierwszej wynosi od 4° do 6°, korzystnie 5°, natomiast w części drugiej od 35° do 45°, korzystnie 45°. Taka końcówka pipety, w połączeniu z jej stosunkowo wąskim otworem wejściowym umożliwia łatwą penetrację osłonki przejrzystej zygoty, a także skutkuje bardzo małą traumatyzacją zygoty podczas penetracji osłonki przejrzystej i błony komórkowej zygoty. Zastosowanie pipet o średnicy otworu wejściowego 2-3 μm umożliwia silne przyssanie otoczki przedjądrza do mikropipety. Otwór ten jednak jest na tyle niewielki, że nie powoduje wessania całego przedjądrza do wnętrza pipety. Gwałtowna zmiana średnicy w drugiej części pipety powoduje natomiast powstanie dużego podciśnienia, co umożliwia - po przyssaniu otoczki przedjądrza do końca mikropipety - przesunięcie przedjądrza do oolemmy, a następnie usunięcie otoczki jądrowej z zygoty.

Kształt mikropipety przedstawiony jest na Fig. 1.

Sposób rekonstrukcji komórek-biorców egzogennymi jądrami somatycznymi według wynalazku różni się od wariantu powszechnie stosowanego w klonowaniu somatycznym tym, że zabieg enukleacji przeprowadzany jest po wprowadzeniu komórki - dawcy jądra pod osłonkę przejrzystą, podczas gdy w znanych metodach zabieg enukleacji przeprowadza się przed wprowadzeniem dawcy jądra. Wprowadzenie w pierwszej kolejności komórki dawcy jądra do przestrzeni okołożółtkowej pod osłonkę przejrzystą ma tę zaletę, że błona komórkowa zygoty jest jeszcze na tym etapie nienaruszona przez wcześniejsze nakłucie mikropipetą podczas zabiegu selektywnej enukleacji. Zatem nawet silny nacisk pipety mikrochirurgicznej, konieczny podczas wprowadzania komórki przez twardą błonę osłonki przejrzystej nie powoduje wycieku „zawartości” zygoty. Dopiero po zakończeniu traumatyzującego komórkę zabiegu mikrochirurgicznego przeprowadza się etap selektywnej enukleacji, wymagający wprawdzie wprowadzenia pipety zarówno przez błonę osłonki przejrzystej, jak i przez błonę komórkową zygoty, jednak bardzo cienka mikropipeta enukleacyjna pozostawia w obu błonach niewielkie otwory. Przy braku późniejszego nacisku związanego z zabiegiem mikrochirurgicznym otwory po wkłuciu mikropipety służącej do enukleacji zasklepiają się szybko, a przeżywalność komórek jest znacząco wyższa. W przeprowadzonych przez autorów próbach przeżywalność komórek w procesie, w którym pierwszym etapem była selektywna enukleacja osiągała 25-30% (w zależności od serii doświadczeń i jakości zygot), podczas gdy w sposobie według wynalazku osiągnięto przeżywalność na poziomie 70-80% (w zależności od serii doświadczeń i jakości zygot).

PL 220 877 B1

Sposób według wynalazku nie tylko znacząco zwiększa przeżywalność komórek, ale pozwala na istotne skrócenie czasu całej procedury. Dzięki zastosowanej zgodnie z wynalazkiem kolejności etapów procesu powstała możliwość wykorzystania zygot jako biorców jąder komórek somatycznych i wyeliminowania tym samym procedury sztucznej aktywacji komórek-biorców, która jest konieczna, kiedy komórkami tymi są niezapłodnione oocyty.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładzie.

P r z y k ł a d

Dawczyniami zygot [komórek - biorców egzogennych (somatycznych) jąder komórkowych] były stymulowane hormonalnie loszki rasy Polskiej Białej Zwisłouchej Inseminację przeprowadzono dwukrotnie (o godz. 8.00 i 14.00) standardową dawką nasienia. Zygoty pozyskiwano chirurgicznie, poprzez przepłukanie jajowodów pomiędzy godz. 9.00 a 10.00 następnego dnia po inseminacji. Na tym etapie przeprowadzono wstępną selekcję zygot i do dalszych etapów procedury wybrano wyłącznie zygoty zawierające wyrzucone II ciałko kierunkowe, co świadczy o tym, że są one zapłodnione. Oocyty niezapłodnione lub zdegenerowane zostały usunięte. Do doświadczeń użyto wyłącznie zygoty prawidłowe. W zygotach świni ze względu na bardzo dużą zawartość lipidów w cytoplazmie przedjądrza są całkowicie niewidoczne. W celu ich uwidocznienia zygoty inkubowano przez 15 min w pożywce M2 zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B, a następnie wirowano 5 min. (18 000 r.c.f). Wirowanie powodowało przemieszczenie kropel lipidowych na jeden z biegunów zygoty i powstanie dużego obszaru przejrzystej cytoplazmy, w której widoczne były już przedjądrza. Po wirowaniu zygoty inkubowano przez kolejne 20 min. w pożywce zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B i 0.25 μg/ml nokodazolu (metyl[S-(2-thienylcarbonyl-1H-benzimidazol-2-yl]carbamate). Po inkubacji przeprowadzano kolejną selekcję zygot. Usuwano nieprawidłowe zygoty zawierające trzy lub więcej przedjądrzy, a także zygoty z uszkodzoną osłonką przejrzystą.

Wprowadzenie fibroblastów pod osłonkę przejrzystą

Dawcami jąder somatycznych były fibroblasty płodowe lub fibroblasty skóry dorosłych zwierząt. Hodowle fibroblastów płodowych wyprowadzano z płodów (z reguły 25-dniowych). Były one w typowym dla tego etapu rozwoju stadium kończyn łopatkowych. Po starannym oczyszczeniu z błon płodowych, dekapitacji i usunięciu narządów wewnętrznych materiał cięto na drobne kawałki, a następnie dokonywano bądź mechanicznego rozdrobnienia kawałków poprzez przepuszczenie przez strzykawkę, bądź też poddawano je trawieniu trypsyną (0.25% w PBS+EDTA) przez dwie godziny w 4°C. Po przepłukaniu uzyskanego materiału pożywką DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS - fetal calf serum) zakładano w tej pożywce hodowlę z indywidualnych zarodków. Hodowlę prowadzono według standardowych metod w atmosferze 5% CO2 w powietrzu w 38°C. Hodowle fibroblastów skóry dorosłych zwierząt wyprowadzano w podobny sposób, z tym że fibroblasty uzyskiwano ₂ z niewielkich fragmentów (ok. 10 mm²) skóry (głównie ucha) pobranych metodą biopsji. Hodowle zamrażano po 1-3 pasażu stosując standardowe metody zamrażania komórek. W celu uzyskania zawiesiny fibroblastów, kolonie, po ich rozmrożeniu, poddawano trawieniu trypsyną (0.25% w PBS + EDTA), a następnie, w celu inaktywacji trypsyny, uzyskaną zawiesinę komórek przepłukiwano w pożywce z dodatkiem FGC. Zawiesina komórek przechowywana była, do momentu jej użycia w 4°C.

Usuwanie materiału genetycznego zygoty.

Po ustawieniu zygoty - przy pomocy pipety przytrzymującej - w taki sposób, aby przynajmniej jedno przedjądrze było dobrze widoczne - mikropipetę enukleacyjną przedstawioną na Fig. 1 ustawia się dokładnie w równikowej płaszczyźnie przedjądrza. Po penetracji osłonki i oolemmy mikropipetę przesuwa się do otoczki przedjądrza. Następnie - przy użyciu mikropompek - zastosowane jest podciśnienie powodujące przyssanie otoczki do końca mikropipety. Istotne jest, aby zastosowane podciśnienie związało silnie otoczkę z końcówką mikropipety, ale nie spowodowało wessania otoczki do jej wnętrza. Po przyssaniu otoczki do końcówki mikropipety wycofuje się ją w kierunku oolemmy. Kiedy przedjądrze dotrze do oolemmy, podciśnienie jest zwiększane, ale nadal w ten sposób, aby całe przedjądrze nie zostało wessane do wnętrza mikropipety. Po zwiększeniu podciśnienia otoczka jądrowa wraz z przytwierdzoną do jej wewnętrznej warstwy chromatyną jądrową (materiałem genetycznym) usuwana jest poza obręb komórki (zygoty), a następnie poza obręb osłonki przejrzystej. Często, zwłaszcza przy usuwaniu nieco większych przedjądrzy, konieczne jest zasklepienie powstałego w oolemmie otworu. W tym celu mikropipetę enukleacyjną wprowadza się (po usunięciu przedjądrza) przez utworzony podczas usuwania przedjądrza otwór w osłonce przejrzystej z powrotem w pobliże oolemmy, dokładnie w miejscu, przez które usunięte zostało przedjądrze. Krawędzie oolemmy wokół otworu powstałego po usunięciu otoczki przedjądrza są delikatnie zasysane do mikropipety, a następ6

PL 220 877 B1 nie - po nieco silniejszym zastosowaniu podciśnienia - pipetę wycofuje się poza obręb osłonki. Podczas tego zabiegu dochodzi do fuzji wewnętrznych warstw błony komórkowej zygoty, a tym samym do przywrócenia jej ciągłości i zasklepieniu otworu. Zabieg ten eliminuje praktycznie całkowicie wyciek cytoplazmy i będącą jego konsekwencją degenerację komórki. Po usunięciu jednego przedjądrza drugie przedjądrze usuwane jest w ten sam sposób.

Rekonstrukcja enukleowanych zygot

Fibroblasty wprowadzono do 272 z 306 zygot (88.9%). Zabieg selektywnej enukleacji przeżyło 221 zygot (81.3%). 215 par komórek (97.3%) enukleowana zygota - fibroblast poddano fuzji przy użyciu pola elektrycznego. Przed poddaniem komórek działaniu pola elektrycznego, pary komórek przepłukiwano dwukrotnie w 0.3M roztworze mannitolu w wodzie z dodatkiem 0.1 mM MgSO4 i 0.05 mM CaCl2, a następnie parę komórek umieszczano (indywidualnie) pomiędzy dwiema równoległymi elektrodami komory do fuzji (BTX-435) wypełnionej takim samym płynem. Odstęp pomiędzy elektrodami wynosił 0.05 mm. Pary komórek były umieszczane pomiędzy elektrodami w ten sposób, aby powierzchnia ich styku była prostopadła do wektora sił pola. Elektrofuzję przeprowadzano stosując impulsy DC, 60 μsec każdy, siła pola 1.6 kV.cm^- . Zabieg elektrofuzji przeżyło 210 rekonstruowanych zygot (97.7%), które następnie hodowano przez noc w pożywce NCSU 23. Następnego dnia rano od około 10% do około 30% rekonstruowanych zygot (w zależności od serii) było już zarodkami 2-komórkowymi, zaś w części rekonstruowanych zygot widoczne było tworzenie bruzdy podziałowej I podziału bruzdkowania. Pozostałe zygoty były jeszcze nie podzielone. Wszystkie rekonstruowane zygoty (210) przeszczepiano tego samego dnia przed południem do jajowodów zsynchronizowanych biorczyń. Jedna z biorczyń utrzymała ciążę do końca i urodziła dwa prosięta. Jest to pierwszy na świecie wynik opisujący uzyskanie urodzonych świń po transplantacji jąder komórek somatycznych do enukleowanych zygot.

Claims (8)

1. Sposób klonowania somatycznego ssaków, z wyjątkiem człowieka, z wykorzystaniem metody selektywnej enukleacji, znamienny tym, że w pierwszym etapie pod osłonkę przejrzystą zygoty ssaka wprowadza się fibroblasty jako dawców jąder somatycznych, po czym, w drugim etapie, usuwa się materiał genetyczny z zygoty metodą selektywnej enukleacji, przy czym selektywną enukleację prowadzi się na wczesnym stadium rozwoju przedjądrzy, po czym przeprowadza się fuzję w polu elektrycznym.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssakiem jest świnia.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórkami dawcami jąder są fibroblasty płodowe lub fibroblasty skóry pochodzące z wczesnych pasaży hodowli in vitro.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że selektywną enukleację prowadzi się za pomocą pipety o średnicy otworu wejściowego około 2-3 μm, w kształcie stożka, której część robocza na pierwszym odcinku od otworu wejściowego na długości do 20 μm ma kąt rozwarcia ścian od 4° do 6°, a na drugim odcinku kąt rozwarcia wynosi od 35° do 45°.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że kąt rozwarcia ścian mikropipety na pierwszym odcinku wynosi 5°, a na drugim odcinku 45°.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powstały po usunięciu przedjądrza, otwór w oolemmie zasklepia się mechanicznie przy użyciu pipety enukleacyjnej.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed wprowadzeniem fibroblastów zygoty inkubuje się w pożywce M2 zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B, a następnie wiruje w czasie od 3 do 7 minut, z szybkością 15 000-20 000 r.c.f, a po wirowaniu zygoty inkubuje się w pożywce zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B i 0.25 μg/ml nokodazolu.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po fuzji w polu elektrycznym rekonstruowane zygoty hoduje się przez 8-16 godzin w pożywce NCSU 23.