KR20180001673A - 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법 - Google Patents
혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 동물의 혈액유래 중간엽 줄기세포주의 구축 기술을 확립하고 상기 중간엽 줄기세포주를 이용하여 비침습적이며 생산효율이 높은 개과 복제 동물 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 동물의 혈액유래 중간엽 줄기세포주의 구축 기술을 확립하고 상기 중간엽 줄기세포주를 이용하여 비침습적이며 생산효율이 높은 개과 복제 동물 생산방법에 관한 것이다.
체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고되었다.
한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다.
그러나 개의 경우 발정이 오지 않은 암캐의 난소에서 미성숙 난자를 채취하여, 이 난자를 체외에서 성숙 배양하는 것은 매우 어렵다. 이것은 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 동물에 비해 체세포 핵 이식에 의한 복제가 매우 어려운 이유 중 하나이다.
현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다.
한편, 체세포 복제견을 포함한 체세포 복제동물 생산을 위해서는 귀 세포, 태아섬유아 세포, 연골세포, 난구세포뿐만 아니라, 지방, 골수유래 중간엽 줄기세포 등 다양한 세포가 활용되고 있으며, 비교적 조직 채취가 용이한 귀 세포를 이용한 복제동물 생산이 이루어지고 있다.
그러나, 동물로부터 외과적 방법으로 조직을 채취하는 것은 개체의 일부 손상 및 고통이 유발되는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 개과 동물 복제용 동물의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 개과 동물 복제용 동물의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포주를 이용하여 개과 복제 동물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽세포로부터 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골계 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 동물 혈액에서 분리된 중간엽 줄기세포가 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 계대배양되어 다음과 같은 특성을 가지는 중간엽 줄기세포주가 제공된다:
(a) AP에 반응하여 염색됨;
(b) Oct-4 및 Sox-2 유전자를 발현하고, Nanog 유전자는 발현하지 않음;
(c) CD45에 대하여 음성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD44, CD90, CD105에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;
(d) 배양접시 바닥에 부착하여 성장하며, 콜로니를 형성하며, 섬유아세포(fibroblast) 모양의 형태학적 특성을 나타냄; 및
(e) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포; 및 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 포함하는 중간엽 줄기세포주 배양액 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 동물의 혈액을 채취하는 단계; 상기 채취한 혈액을 피콜 그래디언트(ficoll gradient)을 이용하여 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계; 상기 펠릿을 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하여 배양세포를 수집하는 단계; 및 상기 수집한 배양세포로부터 혈액 유래 줄기세포주를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 방법에 의해 제조된 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포주가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 상기 기재된 줄기세포주 또는 상기 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 방법에 의해 제조된 개과 복제 동물 생산용 핵 이식란이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 상기 기재된 줄기세포주 또는 상기 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 개과 복제 동물 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽세포로부터 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골계 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에 의하면 동물 혈액유래의 중간엽 줄기세포주를 구축 기술을 확립하여 개과 동물 복제용 동물의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주 및 상기 개과 동물 복제용 동물의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주 생산 방법을 제공할 수 있다.
특히, 체세포 제공견의 일부 손상 및 고통을 수반하는 외과적 시술 없이 간편하게 혈액채취를 통해 체세포 복제 가능한 이점이 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 개과 동물 복제용 동물의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주를 이용하여 개과 복제 동물 생산 효율을 향상시킬 수 있다.
나아가, 본 발명에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽세포로부터 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골계 질환 치료용 세포치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 간편한 구축기술을 이용한 복제 동물의 생산 기술은 축산 분야에서 탐지견, 인명구조견, 경찰견, 군견 등 유적전적으로 검증된 유용동물의 대량생산 및 내병성 동물을 생산을 더욱 편리하게 하고, 나아가 치료용 단백질 생산, 장기이식용 동물생산 및 질환모델동물의 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 혈액 유래 중간엽 줄기세포주의 구축기술을 활용하여 혈액유래 중간엽 줄기세포의 기능 분석 등 기초연구를 통해 이에 대한 기초이해를 높이는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 개 혈액 유래 중간엽 줄기세포주를 구축하기 위한 혈액유래의 중간엽 줄기세포 배양사진을 나타낸다. 본 발명은 혈액유래 중간엽 줄기세포를 10% FBS 및 10 ng/ml IL-6가 첨가된 advanced DMEM배양액에서 배양하였으며, 이를 확인하기 위해 (A) 배양 7일째 (B) 배양 12일째 (C) passage-2에 혈액유래의 중간엽 줄기세포 배양한 실험결과이다.
도 2는 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위한 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 AP(alkaline phosphatase) 활성 분석결과를 나타낸다. 미분화 마커인 AP(alkaline phosphatase) 염색을 실시하여, 세포의 미분화 상태를 확인한 실험결과이다.
도 3은 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위한 개 혈액 유래 중간엽 줄기세포에서 초기전사인자 관련 유전자 발현 분석을 나타낸다. 본 발명은 RT-PCR을 통해 (1)개 골수유래 중간엽 줄기세포 및 (2,3) 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 Oct-4, Sox-2, Nanog의 mRNA 발현을 분석하였으며, 본원 발명이 구축한 중간엽 줄기세포에서 이들 중 Oct-4 및 Sox-2의 발현을 확인하였다.
도 4는 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포에서 세포표면인자 발현 분석 결과를 나타낸다. 본 발명은 중간엽 줄기세포 세포표면 인자인 CD44, CD45, CD90, CD105의 발현을 면역형광염색을 통해 확인하였으며, 그 결과 CD44, CD90, CD105가 발현됨을 확인하였다.
도 5는 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 골세포(osteocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 분화 배양액에서 배양을 실시하여 골세포로 분화를 유도한 후, alizarin염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과 골세포(osteocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 6은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 연골세포(chondrocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 연골세포로 분화를 유도한 후, alcian blue 염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과 연골세포(chondrocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 7은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 지방세포(Adipocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 지방세포로 분화를 유도한 후, oil red O 염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과는 지방세포(Adipocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 8은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 분화된 개 혈액유래 중간엽 줄기세포에서 골세포, 연골세포 및 지방세포 특이적 유전자 발현 분석 결과를 나타낸다. RT-PCR을 통하여 세포특이 유전자 발현을 확인하였으며, (A) 골세포로 분화된 세포에서 골세포 특이적 유전자인 오스테오칼신(osteocalcin) 및 runt 관련 전사인자-2 (runt-related transcription factor-2, Runx2) 유전자가 발현됨을 확인하였으며, (B) 연골세포로 분화된 세포에서는 연골세포 특이적 유전자인 collagen type II와 Sox-9 유전자가 발현됨을 확인하였으며, (C) 지방세포로 분화된 세포에서는 지방세포 특이적 유전자인 렙틴(leptin) 및 리포프로테인 리파아제(lipoprotein lipase, LPL) 유전자의 발현됨을 확인하였다.
도 9는 본 발명에 의해 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 복제견의 생산과정을 개략적으로 나타낸다.
도 10은 본 발명에 의해 구축된 개 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 생산한 복제견을 나타낸다. 본 발명에 의해 대리모견 6두에 총 78개(평균 13개)의 혈액 중간엽 줄기세포 유래 복제수정란을 이식하였으며, 대리모견 중 3두가 복제견을 3두 분만하였다.
도 2는 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위한 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 AP(alkaline phosphatase) 활성 분석결과를 나타낸다. 미분화 마커인 AP(alkaline phosphatase) 염색을 실시하여, 세포의 미분화 상태를 확인한 실험결과이다.
도 3은 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위한 개 혈액 유래 중간엽 줄기세포에서 초기전사인자 관련 유전자 발현 분석을 나타낸다. 본 발명은 RT-PCR을 통해 (1)개 골수유래 중간엽 줄기세포 및 (2,3) 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 Oct-4, Sox-2, Nanog의 mRNA 발현을 분석하였으며, 본원 발명이 구축한 중간엽 줄기세포에서 이들 중 Oct-4 및 Sox-2의 발현을 확인하였다.
도 4는 본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포에서 세포표면인자 발현 분석 결과를 나타낸다. 본 발명은 중간엽 줄기세포 세포표면 인자인 CD44, CD45, CD90, CD105의 발현을 면역형광염색을 통해 확인하였으며, 그 결과 CD44, CD90, CD105가 발현됨을 확인하였다.
도 5는 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 골세포(osteocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액 유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 분화 배양액에서 배양을 실시하여 골세포로 분화를 유도한 후, alizarin염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과 골세포(osteocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 6은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 연골세포(chondrocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 연골세포로 분화를 유도한 후, alcian blue 염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과 연골세포(chondrocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 7은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 개 혈액유래 중간엽 줄기세포의 지방세포(Adipocyte) 분화능을 확인한 실험결과이다. 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능 검정을 위하여 지방세포로 분화를 유도한 후, oil red O 염색을 통하여 분화를 확인하였으며, 그 결과는 지방세포(Adipocyte)로 분화되는 것을 확인하였다.
도 8은 본 발명에 의한 혈액유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 평가하기 위해 분화된 개 혈액유래 중간엽 줄기세포에서 골세포, 연골세포 및 지방세포 특이적 유전자 발현 분석 결과를 나타낸다. RT-PCR을 통하여 세포특이 유전자 발현을 확인하였으며, (A) 골세포로 분화된 세포에서 골세포 특이적 유전자인 오스테오칼신(osteocalcin) 및 runt 관련 전사인자-2 (runt-related transcription factor-2, Runx2) 유전자가 발현됨을 확인하였으며, (B) 연골세포로 분화된 세포에서는 연골세포 특이적 유전자인 collagen type II와 Sox-9 유전자가 발현됨을 확인하였으며, (C) 지방세포로 분화된 세포에서는 지방세포 특이적 유전자인 렙틴(leptin) 및 리포프로테인 리파아제(lipoprotein lipase, LPL) 유전자의 발현됨을 확인하였다.
도 9는 본 발명에 의해 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 복제견의 생산과정을 개략적으로 나타낸다.
도 10은 본 발명에 의해 구축된 개 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 생산한 복제견을 나타낸다. 본 발명에 의해 대리모견 6두에 총 78개(평균 13개)의 혈액 중간엽 줄기세포 유래 복제수정란을 이식하였으며, 대리모견 중 3두가 복제견을 3두 분만하였다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)는 본 명세서에서 자가-재생능을 가지며, 다른 중간엽 세포 계통 중에서 골모세포, 연골세포, 및 지방세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 다능성 줄기세포를 지칭한다. 이러한 특징 이외에 MSC는 후술된 바와 같이 하나 이상의 마커의 발현에 의해 동정될 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 개과 동물의 혈액유래 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 배양은 생물체나 생물체의 기관, 조직, 세포 등 일부를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도, 습도, 빛, 기체상의 조성(이산화탄소나 산소 및 질소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요하게 직접적인 영향을 주는 것은 배지로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.
본 발명에서 사용되는 용어 '배지' 또는 '배양액 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 개과 동물의 세포 핵 이식에 사용되는, 이식란의 착상율을 높이는 핵 공여 세포의 배양에 사용되는 배지이다.
본 발명에서 사용되는 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다. '핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 계대 배양(Subculture)은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 증식 및 보존하는 방법을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵 난자의 위란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개과 동물의 체세포, 배아세포, 태아세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개과 동물을 복제하는 기술에 관한 것이다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 동물 혈액에서 분리된 중간엽 줄기세포가 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 계대배양 되어 다음과 같은 특성을 가지는 중간엽 줄기세포주가 제공된다:
(a) AP에 반응하여 염색됨;
(b) Oct-4 및 Sox-2 유전자를 발현하고, Nanog 유전자는 발현하지 않음;
(c) CD45에 대하여 음성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD44, CD90, CD105에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;
(d) 배양접시 바닥에 부착하여 성장하며, 콜로니를 형성하며, 섬유아세포(fibroblast) 모양의 형태학적 특성을 나타냄; 및
(e) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
상기 혈액은 중간엽줄기세포주를 구축하기 위하여 가장 손쉽게 확보할 수 있는 재료로. 골수, 지방, 양막, 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포를 구축하기 위한 연구재료의 확보에 비해 보다 용이한 이점이 있다.
본 발명에서 사용하는 세포 배양용 배지는 상기 성분 이외에도 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 성장인자(growth factor), 아미노산, 저해제 또는 그 유사물질뿐만 아니라 소태아혈청(FCS: Fetal Calf Serum) 또는 소태아혈청을 비롯하여 미생물의 오염을 막기 위해 암포테리신B(amphotericin B), 젠타마이신(gentamycin), 또는 니스타틴(nystatin) 등의 추가적인 항생제 및 항진균제(antifungal agent) 등을 추가할 수 있다.
상기 배양접시는 동물세포 배양에서 통상적으로 이용되며 동물세포의 부착이 가능한 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 등이 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 중배엽 유래 세포는 골아세포, 연골세포 또는 지방세포이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 중간엽 줄기세포는 개과 동물 복제용일 수 있다.
상기 개과 동물(canidae)은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포; 및 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6(interleukin-6)를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 포함하는 중간엽 줄기세포주 배양액 조성물이 제공된다.
상기 배양액 조성물의 조혈모세포 증식에 관여하는 성장인자인 IL-6(interleukin-6)는 중간엽 줄기세포 증식을 향상시키기 위해 첨가된다.
상기 배양액 조성물은 바람직하게 1~40% FBS, 0.5~5% antibiotics -antimycotics 그리고 1~20 ng/ml IL-6를 유효성분으로 하는 low glucose DMEM 배양액일 수 있으며, 더욱 바람직하게 10% FBS, 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 그리고 10 ng/ml IL-6를 유효성분으로 하는 low glucose DMEM 배양액일 수 있다. 그리고 IL-6는 혈액 내 조혈모세포의 증식을 활성화시키는 것으로 알려진 세포성장인자이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혈액은 요측피정맥(Cephalic vein)을 통해 채취된다. 요측피정맥은 개의 앞다리 앞쪽에 위치한 혈관으로써 가장 손쉽게 혈액을 채취할 수 있는 부위이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 동물은 개인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 동물의 혈액을 채취하는 단계; 상기 채취한 혈액을 피콜 그래디언트(ficoll gradient)을 이용하여 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계; 상기 펠릿을 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하여 배양세포를 수집하는 단계; 및 상기 수집한 배양세포로부터 혈액 유래 줄기세포주를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 분리된 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 Collagen type1이 코팅된 배양접시에 배양한다. 상기 배양접시는 동물세포 배양에서 통상적으로 이용되며 동물세포의 부착이 가능한 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 등이 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양접시에 코팅된 세포외기질 물질인 Collagen type1은 중간엽 줄기세포가 배양접시에 보다 잘 부착되어 증식할 수 있도록 하기 위해 첨가된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 배양은 3~10% CO2, 3~10% O2, 75~95% N2, 및 35~40℃인 조건에서 배양된다. 바람직하게 상기 배양은 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 및 38.5℃인 조건에서 배양될 수 있다. 일반적인 세포배양을 위한 기체조건인 5% 이산화탄소 및 95% 공기조건은 산소함량이 약 20% 수준이다. 이러한 고농도 산소조건에서는 배양세포가 활성산소에 노출되어 세포자연사 유발이 증가될 확률이 높다. 따라서 본 발명의 일 실시예에서는 배양 중 세포 손상을 최소화하기 위하여 보다 체내조건과 유사한 저농도 산소 기체조건인 5% CO2, 5% O2, 90% N2에서 혈액유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 방법에 의해 제조된 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포주가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 상기 기재된 줄기세포주 또는 상기 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 방법에 의해 제조된 개과 복제 동물 생산용 핵 이식란이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 상기 기재된 줄기세포주 또는 상기 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 개과 복제 동물 생산 방법이 제공된다. 본 발명에서 상기 난자 공여 동물로부터 채취한 난자는 바람직하게는 개로부터 수득할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 일반적으로 복제견 생산에 많이 활용되는 귀 피부세포보다 복제견 생산효율이 높으며 이는 실시예에 의해 뒷받침된다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1.
혈액유래
중간엽
줄기세포주
확립
1-1. 개의
혈액유래
중간엽
줄기세포의 분리
수컷 비글견의 요측피정맥 (Cephalic vein)을 통하여 혈액을 채취하였으며, 채취된 혈액은 heparin이 첨가된 튜브에 투입한 후, ice에 보관하여 실험실로 운반하였으며, 채취된 혈액은 2% FBS와 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics)이 첨가된 PBS(W-PBS)로 1:1로 희석하였다.
혈액에서 중간엽 줄기세포가 포함된 단핵세포 분리를 위하여 SepMate tube (STEMCELL)에 Ficoll (GE Healthcare Life Sciences)을 넣은 후, 희석된 혈액을 Ficoll 상층에 조심스럽게 gradient한 다음 2,100rpm에서 30분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 완료 후, Ficoll grandient에서 단핵세포가 풍부한 Ficoll층을 원심분리 튜브에 회수한 다음 W-PBS와 혼합한 후 1,200rpm에서 10분간 원심분리하여 1차 세척을 실시하였다. 1차 세척 후 상층액 만을 제거한 다음 세포펠렛에 W-PBS를 투입하여 혼합한 다음 다시 1,200rpm에서 10분간 원심분리하여 2차 세척을 실시하였다. 그리고 10% FBS가 첨가된 low glucose DMEM 배양액으로 2회 세척을 실시하였다.
1-2
혈액유래
중간엽
줄기세포의 배양
세척이 완료된 세포는 10% FBS, 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 그리고 10 ng/ml IL-6가 첨가된 low glucose DMEM 배양액을 이용하여 Collagen typeⅠ이 코팅된 배양접시에서 배양을 실시하였으며, 배양 2일째 부착되지 않은 부유세포는 가볍게 세척하여 제거한 후 지속적으로 배양을 실시하였으며, 이때 배양조건은 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 그리고 38.5℃이었다. 그리고 세포배양액은 매 2일 마다 신선한 배양액으로 교체하였다. 세포가 배양접시에 가득 차게 되면, 1회 계대배양을 실시하여 세포를 추가 증식하였으며, 향후 활용 및 보존을 위하여 증식된 세포는 회수하여 세포동결보존액을 이용하여 동결한 후 액체질소에 보존하였다.
본 발명의 결과, 배양 3일째 배양접시에 부착되어 증식하는 세포를 확인할 수 있었으며, 배양 7일경에 세포 클로니가 형성되고, 배양 12-15일경 세포가 배양접시에서 가득차는 것(confluency)에 도달함을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
1-3
혈액유래
중간엽
줄기세포의 미분화 특성 분석
혈액유래 중간엽 줄기세포의 미분화 특성 분석을 위하여 미분화 마커인 AP(Alkaline phosphatase, BCIP/NBT Color Development Substrate, Promega) 염색을 실시하였다.
본 발명을 통하여 구축된 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 AP(Alkaline phosphatase)에 반응하여 염색됨으로써 중간엽 줄기세포의 미분화 특성을 가지는 것을 확인하였다(도 2 참조).
1-4
혈액유래
중간엽
줄기세포의 유전자 발현 분석
중간엽 줄기세포 특이 유전자 발현 분석을 위하여 본 발명에서 확립된 혈액유래 중간엽 줄기세포와 대조군으로 개 골수유래 중간엽 줄기세포를 회수하여 RNeasy plus mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA 추출을 실시하였고, SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix Kit (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, Oct-4, Sox-2, Nanog 및 대조유전자인 GAPDH 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 유전자 발현을 확인하였다.
본 발명을 통하여 구축된 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수 및 지방세포 유래 중간엽 줄기세포에서 발현하는 미분화 유전자인 Oct-4, Sox-2 유전자가 발현되고, 배아 및 만능유도 줄기세포에서 발현하는 미분화 유전자인 Nanog는 미발현되는 것을 확인하였다(도 3 참조).
1-5
혈액유래
중간엽
줄기세포의
세포표면인자
발현 분석
배양된 세포는 PBS로 3번 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 30분간 고정 시키고 PBS로 3번 세척하였다. permeabilization은 0.2% Triton X-100이 첨가된 PBS를 이용하여 상온에서 30분간 실시하였고, PBS로 3번 세척한 후, 4% bovine serum albumin (BSA)가 첨가된 PBS를 이용하여 상온에서 30분간 blocking을 실시하였다. 1차 항체인 anti-CD44, anti-CD45, anti CD-90 그리고 anti-CD105는 PBS로 희석시킨 후, 직접 세포에 상온에서 30분간 처리하였다. 세 번의 세척 후, 2차 항체를 상온에서 20분간 반응시켰다. 그리고 세포핵 염색 및 마운팅은 Vecta-shield mounting solution containing 4phenylindole (DAPI)를 이용하여 실시하였으며, 형광현미경을 통하여 세포표면인자 발현을 각각 관찰하였다.
본 발명을 통하여 구축된 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수 및 지방세포 유래 중간엽 줄기세포에서 발현하는 세포표면인자인 CD44, CD90, CD105는 발현되고, 골수 및 지방세포 유래 중간엽 줄기세포에서 미발현하는 CD45는 미발현 됨으로써, 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는 것을 확인하였다(도 4 참조).
1-6
혈액유래
중간엽
줄기세포의
분화능
평가
혈액유래 중간엽 줄기세포의 지방세포, 골세포 그리고 연골세포로 분화능력을 확인하기 위하여 혈액유래 중간엽 줄기세포를 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte) 그리고 연골세포(chondrocyte) 유도 배양액(Gibco)에서 각각 3주간 배양을 실시하였으며, 이때 배양조건은 5% CO2, 95% 공기 그리고 38.5℃이었다. 그리고 세포배양액은 매 2일 마다 신선한 배양액으로 교체하였다. 3주간 배양 실시 후에 지방세포로 분화된 세포는 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)로 실온에서 1시간 고정하였고, 골세포와 연골세포로 분화된 세포는 70% 에탄올로 1시간 고정하였다. 지방세포 분화 확인을 위해 0.5% oil red O 염색을, 골세포 분화 확인을 위해 40 mM alizarin 염색을 그리고 연골세포의 분화 확인을 위해 1% alcian blue 염색을 각각 30분간 실시하였으며, 위상차현미경을 통하여 염색여부를 확인하였다.
또한 분화세포 특이 유전자 발현을 확인하기 위하여 분화된 세포를 회수하여 RNeasy plus mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA 추출을 실시하였고, SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix Kit (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, 지방세포는 LPL, 렙틴유전자, 골세포는 Osteocalcin, Runx2 유전자, 연골세포는 Collagen type II, Sox-9 유전자 그리고 대조유전자인 GAPDH 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 유전자 발현을 확인하였다.
본 발명을 통하여 구축된 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 특성인 지방세포(Adipocyte), 골세포(Osteocyte), 연골세포(Chondrocyte)로의 분화능이 있음을 각각 oil red O, alizarin, alcian blue 염색을 통하여 확인하였다. 또한 분화된 각각 세포의 특이적인 유전자 발현분석을 통해서도 혈액 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화된 것을 재확인하였다(도 5 내지 도 8 참조).
2.
혈액유래
중간엽
줄기세포를 이용한
복제견
생산
2-1 공여세포(
혈액유래
중간엽
줄기세포)의 준비
중간엽 줄기세포의 특성이 확인된 혈액유래 중간엽 줄기세포는 10% FBS, 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 그리고 10 ng/ml IL-6가 첨가된 L-DMEM(low glucose DMEM) 배양액을 이용하여 Collagen typeⅠ이 코팅된 배양접시에서 배양을 실시하였으며, 이때 배양조건은 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 그리고 38.5℃이었다. 그리고 세포배양액은 매 2일 마다 신선한 배양액으로 교체하였다. 체세포 복제에 적합한 세포주기인 G0/G1 단계로 세포주기 동기화를 위해 세포를 가득 차는(confluency) 상태까지 배양하였다. 배양된 혈액유래 중간엽 줄기세포를 체세포 복제에 이용하기 위하여 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 0.05% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 분리 처리하여 conical tube에 옮긴 다음 0.1% BSA가 포함된 PBS를 첨가하여 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척을 실시하였다. 세척된 세포는 0.1% BSA가 포함된 PBS에 핵이식 전까지 보존하였다.
2-2 공여난자의 준비
난자 공여견은 암컷 잡종견을 활용하였다. 개의 요측피정맥 (Cephalic vein)을 통하여 혈액을 매일 채취하였으며, 채취된 혈액은 RIA(Radioimmunoassay)를 통하여 프로게스테론 농도가 4～8 ng/ml 이면 배란일로 예측하였으며, 예측한 배란일로부터 3일째 외과적 수술 및 난관관류 통하여 체내성숙된 개 난자를 채취하였다. 난자채취를 위한 수술은 Jang 등 (Jang G, Oh HJ, Kim MK, Fibrianto YH, Hossein MS, Kim, HJ, Kim JJ, Hong SG, Park JE, Kang SK, Lee BC. Improvement of canine somatic cell nuclear transfer procedure. Theriogenology 2008, 69, 146-154.)에 의해 보고된 방법을 이용하였다.
2-3
복제수정란
생산
회수된 난자는 0.1% hyaluronidase가 첨가된 holding 배양액 (Hepes-buffered TCM199 + 10% FBS) 내에서 반복적인 피펫팅을 통하여 난구세포를 제거한 다음 실체현미경 하에서 제 1극체가 방출된 성숙난자 만을 선별하여 복제수정란 생산에 활용하였다. 선별된 성숙난자는 10 μg/ml Hoechst 33342가 첨가된 holding 배양액에서 5분간 핵 염색을 실시하였다. 염색된 난자는 미세조작용 배양접시 상의 5 μg/ml CB(cytochalasin B) 가 첨가된 holding 배양액 소적(Micro-drop)에 침적하였다. 위상차 현미경에 장착된 미세조작기를 활용하여 염색된 난자의 제 1극체 및 중기 염색체를 마이크로피펫으로 흡입하여 제핵을 실시하였으며, 제핵난자는 핵이식 전까지 holding 배양액에 넣은 다음 5% CO2, 95% 공기 그리고 38.5℃의 세포배양기에 보관하였다.
핵이식을 위하여 제핵난자는 미세조작용 배양접시 상의 100 μg/ml phytohemagglutinin이 첨가된 holding 배양액 소적에 침적하였으며, 위상차 현미경에 장착된 미세조작기를 활용하여 형태적으로 매끈한 표면을 가지는 혈액유래 중간엽 줄기세포를 선별하여 제핵난자에 하나씩 주입하였다. 제핵난자와 공여세포의 융합을 위하여 융합용 배양액 (0.26 M mannitol, 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM Hepes 및 0.05% BSA)에 난자-공여세포 복합체를 침전시키고, 난자와 공여세포 사이의 접촉면을 electrical rod 사이에 평행하게 위치시킨 다음 Electro-Cell Fusion 장비를 이용하여 직류 34V, 15 μsec 조건으로 2회 전기자극을 주어 난자-공여세포 융합을 유도하였다.
난자-공여세포 융합 유도 후 30분경에 실체현미경 하에서 융합된 복제란 만을 선별하였으며, 복제수정란 활성화를 위하여 10 μM calcium ionophore를 포함하는 mSOF 배양액에서 4분간 처리 후, 1.9 mM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine)이 첨가된 mSOF 배양액에서 4시간 동안 추가 배양하였다.
2-4
대리모견에
복제수정란
이식
대리모견은 자연발정으로 난자공여견과 발정동기화된 암컷 잡종견을 이용하였으며, 수정란 이식은 대리모견은 전신마취 후 외과적 수술을 통하여 시행하였다. 활성화 처리가 완료된 복제수정란은 mSOF 배양액으로 2번 세척을 실시한 다음 mSOF 배양액이 있는 배양접시에 침적하였다. 복제수정란은 최소의 mSOF 배양액이 함유되도록 하여 주사기가 장착된 Tomcat 카테터에 흡입하였으며, 개복상태의 대리모견의 난관팽대부에 Tomcat 카테터를 삽입한 후 복제수정란을 이식하였다.
2-5 임신 확인 및
복제견
생산
혈액 중간엽 줄기세포 유래 복제견 생산을 위하여 6두의 대리모견에 복제수정란을 이식하였으며, 임신여부는 수정란 이식 후 30일경에 초음파 진단을 통하여 확인한 결과 3두의 대리모 임신하였음을 확인하였다. 대리모견 2두는 수정란 이식 후 60일 경에 제왕절개 수술을 통하여 복제견 2두를 분만하였고, 대리모견 1두는 수정란 이식 후 60일째 자연분만을 통하여 복제견 1두를 분만하였다.
2-6
복제견의
친자 확인
복제견의 친자감별을 위하여 공여세포, 복제견의 탯줄조직, 대리모견의 혈액에서 게놈 DNA 추출 키트(Promega, USA)를 이용하여 Genomic DNA를 각각 분리하였다. 10개의 개 특이적인 DNA microsatellite 마커(FH2079, FH2097, FH2537, FH2584, FH2712, FH2998, FH3058, FH3372, REN51C16, REN62M06)는 다중(Multiplex) PCR 방법을 통하여 유전자 분석을 실시하였다(표 1 참조). 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 genomic DNA(20ng/㎕) 6㎕, 각각의 초위성체 조합별 형광염색 프라이머(10pmole) 세트당 0.3㎕～0.4㎕, Hot Start Taq DNA중합효소 (2Unit/㎕) 1㎕, 10X buffer 4㎕, 2.5mM dNTP 3㎕의 조성에 증류수를 채워 총 반응액은 25㎕가 되도록 하였다. 상기 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 95℃에서 15분간의 첫 반응을 시작으로 95℃에서 60초간 변성, 62℃에서 75초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 5cycle, 95℃에서 60초간 변성, 61℃에서 75초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 5cycle, 95℃에서 60초간 변성, 60℃에서 75초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 25cycle을 실시한 후, 마지막으로 65℃에서 30분간 최종 신장반응을 실시하였다. PCR 후의 증폭된 산물은 ABI-3730 DNA자동 염기서열 분석장치(Applied Biosysytems, USA)를 이용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하고, GeneMapper version 4.0(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 PCR산물의 크기와 표지인자의 종류별로 분류하여 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel, USA) 프로그램으로 자료를 수집한 후 비교분석으로 복제견 여부를 판별하였다.
본 발명을 통하여 생산된 복제견의 친자확인 결과, 태어난 복제견 3두 모두 혈액제공견에서 유래된 강아지임을 확인하였다(표 1 참조). 하기 표 1은 본 발명에 의해 구축된 개 혈액 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 생산한 복제견의 유전자 분석결과를 나타낸다.
2-7. 공여세포로서 혈액
중간엽
줄기세포 및 귀
피부세포
비교
동일 비글견에 채취 및 확립된 혈액 중간엽 줄기세포와 귀 피부세포를 이용하여 각각 복제수정란을 생산 및 수정란 이식 후, 대리모견의 임신율 및 복제견 생산율을 비교하였다.
혈액 중간엽 줄기세포 복제수정란은 대리모견 6두에 이식하여 3두가 임신하였으며, 총 3두의 복제견을 생산(대리모견 당 1두 생산)하였다. 이에 반하여 복제견 생산에 많이 활용되는 귀 피부세포를 이용하여 복제수정란을 생산 후 대리모견 4두에 이식하였으나 임신된 대리모견이 하나도 확인되지 않았다. 이상의 결과로 볼 때, 공여세포로서 혈액 중간엽 줄기세포가 복제견 생산 효율이 높은 것으로 사료되며, 향후 복제견 생산을 위한 공여세포로 활용가치가 높은 것으로 생각된다.
본 발명에 의한 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 공여세포로 이용하여 체세포 복제견을 세계 최초로 생산하였으며, 이러한 결과는 타 동물에서도 보고된 바가 없는 것으로 알고 있다.
이상으로 본 발명을 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명을의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 동물 혈액에서 분리된 중간엽 줄기세포가 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 계대배양되어 다음과 같은 특성을 가지는 중간엽 줄기세포주:
(a) AP에 반응하여 염색됨;
(b) Oct-4 및 Sox-2 유전자를 발현하고, Nanog 유전자는 발현하지 않음;
(c) CD45에 대하여 음성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD44, CD90, CD105에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;
(d) 배양접시 바닥에 부착하여 성장하며, 콜로니를 형성하며, 섬유아세포(fibroblast) 모양의 형태학적 특성을 나타냄; 및
(e) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
- 제1항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골아세포, 연골세포 또는 지방세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포주.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 개과 동물 복제용인 중간엽 줄기세포주.
- 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포; 및
FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 포함하는 중간엽 줄기세포주 배양액 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 혈액은 요측피정맥(Cephalic vein)을 통해 채취된 것을 특징으로 하는 배양액 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 동물은 개인 것을 특징으로 하는 배양액 조성물.
- 동물의 혈액을 채취하는 단계;
상기 채취한 혈액을 피콜 그래디언트(ficoll gradient)을 이용하여 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계;
상기 펠렛을 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics) 및 IL-6를 유효성분으로 하는 L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하여 배양세포를 수집하는 단계; 및
상기 수집한 배양세포로부터 혈액 유래 줄기세포주를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 생산하는 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 분리된 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 콜라겐 typeⅠ(Collagen typeⅠ)이 코팅된 배양접시에 배양하는 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 배양은 3~10% CO2, 3~10% O2, 75~95% N2, 및 35~40℃인 조건에서 배양되는 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 동물 혈액 유래 중간엽 줄기세포주.
- 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포주 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
- 제11항에 방법에 의해 제조된 개과 복제 동물 생산용 핵 이식란.
- 난자 공여 동물로부터 채취한 난자를 그 핵을 제거하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포주 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 줄기세포주와 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 핵 이식란을 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는 혈액 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 개과 복제 동물 생산 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160079608A KR20180001673A (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160079608A KR20180001673A (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=61002043
Family Applications (1)
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| KR1020160079608A KR20180001673A (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 혈액유래 중간엽 줄기세포주 및 이를 활용한 개과 복제 동물 생산 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20180001673A (ko) |
-
2016
- 2016-06-24 KR KR1020160079608A patent/KR20180001673A/ko not_active Application Discontinuation
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