KR20160019509A

KR20160019509A - 신장 전구세포의 제조 방법 및 신장 전구세포를 포함하는 의약

Info

Publication number: KR20160019509A
Application number: KR1020167000639A
Authority: KR
Inventors: 켄지 오사후네; 타카후미 토요하라; 유키코 야마기시
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠; 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2016-02-19
Also published as: AU2014279065B2; JPWO2014200115A1; US20160137985A1; RU2015156492A; BR112015030918A2; RU2015156492A3; EP3020803A4; ES2794074T3; TW201536917A; SG11201510201PA; RU2696315C2; CN105283542A; IL243023B; US11225642B2; TWI629360B; KR102145967B1; JP6450311B2; WO2014200115A1; EP3020803B1; CA2915085C

Abstract

본 발명은 중간 중배엽 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포의 제조 방법, 및 상기 방법으로 제조된 신장 전구 세포, 상기 세포를 포함하는 약학 조성물, 및 상기 세포를 포함하는 신장 질환 치료제를 제공한다.

Description

신장 전구세포의 제조 방법 및 신장 전구세포를 포함하는 의약{METHOD FOR PRODUCING RENAL PRECURSOR CELLS, AND DRUG CONTAINING RENAL PRECURSOR CELLS}

본 발명은 만능 줄기 세포로부터 신장 전구세포를 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그렇게 얻어진 신장 전구세포를 포함하는 신장 질환 치료제에 관한 것이다.

신장은 생체 내에서 대사 활동에 의해 발생하는 유해 물질 등의 노폐물을 혈액에서 여과하여 제거하고 신체의 건강 유지를 도모 할 수 있도록 기능하는 중요한 장기 중 하나이다. 신장 질환으로, 신부전 등을 들 수 있고 치료 방법으로는 인공 투석을 들 수 있다. 그러나 이 치료에 필요한 의료비 부담이 크기 때문에 의학적 뿐만 아니라 의료 경제면에서도 여전히 세계적인 문제이다. 또한 다른 치료로 신장 이식을 들 수 있지만 심각한 기증자 장기 부족 상태이다.

한편, 배아 줄기세포(ES 세포)와 체세포에 미분화 세포 특이적 유전자를 도입함으로써 얻을 수 있는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 등 만능성을 갖는 세포가 지금까지 보고되고 있다(특허문헌 1 및 2). 그래서 신부전 치료 방법으로 이러한 만능 줄기 세포로부터 분화 유도된 신장 세포를 이식하는 치료법이 검토되고 있다. 또한 이러한 만능 줄기 세포 유래의 균일한 신장 세포를 이용해 치료제를 개발하는 것도 반영되고 있다.

포유류의 신장은 전신(pronephros), 중신(mesonephros), 및 후신(metanephros)의 3 단계를 거쳐 형성되어 있으며, 그 중 후신은 중간 중배엽의 후방 영역에 발생하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 신장 형성을 위해 마우스 만능 줄기세포로부터 중간 중배엽으로 분화 유도 방법이 검토되고 있으며(비특허문헌 1), 중간 중배엽의 특징적인 마커로 OSR1이 확인되고 있다. 또한 세균 인공 염색체(BAC) 벡터를 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 내생의 OSR1 대립 유전자의 상동 재조합으로 도입한 사람 iPS 세포(OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포)를 제작하여, 이 세포를 이용한 검토에 의해 Activin A, Wnt, BMP 및 각종 저분자 화합물을 이용하여 인간 만능 줄기세포로부터 중간 중배엽으로의 분화 유도에 성공하고 있다(비특허문헌 2, 특허문헌 3).

신장 조직에 이식을 고려하면 중간 중배엽보다 더 신장에 분화가 진행된 신장 전구세포를 유도하는 것이 바람직하고, 신장 전구세포를 특징 짓는 인자 중 하나로 SIX2가 알려져 있다(비특허문헌 4). 그러나 지금까지 중간 중배엽으로부터 신장 전구세포로 인위적으로 유도시키는 방법은 확립되어 있지 않다.

특허문헌 1 미국특허 제 5,843,780 호 특허문헌 2 국제공개 제 WO2007/069666 호 특허문헌 3 국제공개 제 WO2012/011610 호

비특허문헌 1 Mae S, et al. (2010), Biochem Biophys Res Commun. 393:877-82 비특허문헌 2 Mae S, et al. (2013), Nat Commun.4:1367 비특허문헌 3 Osafune K, et al. (2006), Development 133:151-61 비특허문헌 4 Kobayashi A, et al. (2008), Cell Stem Cell 3:169-81

본 발명의 과제는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포를 분화 유도 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는 만능 줄기세포에서 유도된 중간 중배엽 세포를 또 신장 전구세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포를 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포를 분화 유도할 수 있는 것을 처음 발견하였다. 본 발명은 이러한 지식을 바탕으로 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 다음과 같은 특징이 있다:

[1] 중간 중배엽 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포를 유도하는 단계를 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포의 제조 방법.

[2] [1]에 있어서, 상기 신장 전구세포는 SIX2 양성 세포인 방법.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 OSR1 양성 세포인 방법.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 및 IDE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 BMP 억제제는 Dorsomorphin, Noggin, LDN193189 및 DMH1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.

[6] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1이고, 상기 BMP 억제제는 DMH1 인 방법.

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 만능 줄기 세포로부터 유도된 중간 중배엽 세포인 방법.

[8] [7]에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 방법으로 제조된 중간 중배엽 세포인 방법:

(i) 만능 줄기 세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산(retinoic acid) 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및

(ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.

[9] [8]에 있어서, 상기 단계 (ii)은 하기 단계 (ii-1) 및 (ii-2)를 포함하는 방법:

(ii-1) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및

(ii-2) 단계 (ii-1)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.

[10] [9]에 있어서, 상기 단계 (ii-1)는 BMP7 및 GSK-3β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이며, 상기 단계 (ii-2)는 TGFβ 신호 자극제와 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계인 방법.

[11] [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 GSK3β 억제제는 CHIR99021 인 방법.

[12] [8] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 레티노산 유도체는 AM580 또는 TTNPB 인 방법.

[13] [7] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포인 방법.

[14] [13]에 있어서, 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 방법.

[15] 만능 줄기 세포로부터 신장 전구세포를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는 방법:

(i) 만능 줄기 세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

(ii) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및

(iii) 단계 (ii)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계.

[16] [15]에 있어서, 상기 신장 전구세포는 SIX2 양성 세포인 방법.

[17] [15] 또는 [16]에 있어서, 상기 단계 (ii)에서 얻은 세포는 OSR1 양성 세포인 방법.

[18] [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 및 IDE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.

[19] [15] 내지 [18] 중 어느 하나에 있어서, 상기 BMP 억제제는 Dorsomorphin, Noggin, LDN193189 및 DMH1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.

[20] [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1이고, 상기 BMP 억제제는 DMH1 인 방법.

[21] [15] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (ii)은 하기 단계 (ii-1) 및 (ii-2)를 포함하는 방법:

(ii-2) 단계 (ii-1)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제와 레티노산 유도체에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.

[22] [21]에 있어서, 상기 단계 (ii-1)는 BMP7 및 GSK-3β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이며, 상기 단계 (ii-2)는 TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계인 방법.

[23] [15] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 GSK3β 억제제는 CHIR99021 인 방법.

[24] [15] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 상기 레티노산 유도체는 AM580 또는 TTNPB 인 방법.

[25] [15] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포인 방법.

[26] [25]에 있어서, 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 방법.

[27] [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포.

[28] [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를 포함하는 약학 조성물.

[29] [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를 포함하는 신장 질환 치료제.

[30] [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장 질환을 치료하는 방법.

[31] 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포.

[32] 신장 질환 치료용 약학 조성물의 제조에있어서 [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포의 사용.

본 발명에 따라 중간 중배엽으로부터 신장 전구세포에 인위적으로 유도하는 것이 처음으로 가능해 졌다. 또한, 본 발명에 따라 만능 줄기세포(예를 들어, iPS 세포)로부터 신장 전구세포에 인위적으로 유도하는 것이 처음으로 가능해졌다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 신장 전구세포는 신장 질환 모델 동물의 치료 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 본 발명의 방법으로 제조된 신장 전구세포는 신부전 등의 신장 질환의 치료 또는 재생 의료에 사용될 수 있다.

본 명세서는 본원발명의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2013-123072 호 (출원일 : 2013년 6월 11일) 및 2014-92108 호 (출원일 : 2014년 4월 25일)의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함하고 있다.

도 1은, 실시예 2 내지 4에 따른 분화 유도 후의 SIX2 양성 세포의 함유율을 나타낸다. 도 1A는 대조로 DMSO를 포함하는 배지에서 배양한 결과를 나타낸다. 도 1B는 유도 방법 1(실시예 2)에 의한 결과를 나타낸다. 도 1C는 유도 방법 2(실시예 3)에 의한 결과를 나타낸다. 도 1D는 유도 방법 3(실시예 4)에 의한 결과를 나타낸다. 도 중 tdTomato는 리포터 유전자를 나타낸다.
도 2는, 실시예 5에 따른 분화 유도 후의 SIX2 양성 세포의 함유율을 나타낸다. 도 2A는 대조적으로 DMSO를 포함하는 배지에서 배양한 결과를 나타낸다. 도 2B, C 및 D는 유도 방법 1의 단계 3에서 도르소몰핀(Dorsomorphin) 대신에 각각 노긴(Noggin), LDN193189 및 DMH1를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 2E 및 F는 유도 방법 1의 단계 3에서 TGFβ1 대신 각각 IDE1 및 IDE2을 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 2G는 유도 방법 1의 단계 3에서 TGFβ2 및 LDN193189를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 2H는 유도 방법 1의 단계 3에서 TGFβ3 및 LDN193189를 이용한 경우의 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 iPS 세포로부터 OSR1+SIX2+신장 전구세포를 제조하는 방법의 일례를 나타낸다. 도 3A는 EB (배양체) 삼차원 배양을 사용하는 OSR1+SIX2+신장 전구세포로의 분화 방법을 보여준다. 도 3B는 유동 세포 계측법에 의한 OSR1+SIX2+세포의 경시적인 분화 패턴 분석을 나타내고, 구체적으로는 세포 집단의 이차원 분포의 결과를 나타낸다(n=5). 도 3C는 분화 세포 집단 중에 표시한 각 유전자에 대한 mRNA 발현 시간 코스 분석을 나타낸다. 그래프는 Day1 ~ Day28에서 β-actin 발현에 상대적 발현량을 나타낸다(n=3). 도 3D는 실시예 7의 유동 세포 계측법에 의한 OSR1+SIX2+세포의 경시적인 분화 패턴 분석을 나타내고, 구체적으로는 상기 세포 집단의 시간 코스 분석 결과를 나타낸다(n=5). 도 3D 중 d1은 Day1에서 iPS 세포, d3는 CHIR99021 및 Activin A를 함유하는 배지(1 단계)에서 제작한 EB(Day3)의 결과를 나타낸다. 도 3D 중 d6 ~ d28은 Day6 ~ Day28까지의 DMSO 군(DMSO라고 기재) 및 TGFβ1+TTNPB 처리군(Tx라고 기재)의 결과를 나타낸다. 2 단계(Day3 ~ Day6)에서 CHIR99021 및 BMP7을 포함하는 배지에서 3 일간 배양 후 Day6에서 DMSO 군과 Tx 군으로 나누어 3 단계 및 4 단계에서 배양하였다. 또한, DMSO 군에서는 3 단계에서 TGFβ1 및 TTNPB 대신 DMSO를 포함하는 배지에서 배양(Day8에서 동일한 배지로 교환함)하여, 4 단계에서 TGFβ1 및 DMH1 대신 DMSO를 포함하는 배지에서 배양(3일에 1 번 같은 배지로 교환함)하였다. 도 3E는 배양 28 일째 4A6C3-10로부터 분화한 OSR1+SIX2+신장 전구세포의 신장 전구세포 마커 발현을 나타낸다.
도 4는 인간 iPS 세포로부터의 OSR1+SIX2+세포 유도에 대한 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제의 각 조합의 효과를 나타낸다. 데이터는 평균±S.E.M로 표시하였다(n=5).
도 5는 다양한 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포에서의 유도 방법 4에 의한 분화 유도의 결과(OSR1 발현량(도 5A) 및 SIX2 발현량(도 5B))를 나타낸다. 4A6C3-10에서의 발현량에 대한 각 세포의 OSR1및 SIX2의 상대적 발현량을 나타낸다.
도 6은 신장 전구세포의 평가 시험 결과를 나타낸다. 도 6A는 OSR1+SIX2+세포를 REGM 배지에서 7 일간 배양한 후 면역 스테인드 이미지를 나타낸다. 도 중 NEPHRIN은 신사구체 족세포(glomerular podocyte) 마커, AQP1 및 MEGALIN은 근위세뇨관(proximal tubule) 마커 및 UROMUCOID은 헨리의 고리(Henle’s loop) 마커를 나타낸다. 이러한 각 마커는 분홍색으로, 또한 핵은 파란색으로 각각 염색되어있다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. 도 6B는 OSR1+SIX2+세포의 세포 덩어리를 Wnt4을 발현하는 NIH3T3와 7 일간 함께 배양한 후 현미경 이미지(왼쪽) 및 면역 스테인드 이미지(오른쪽 3개의 도)을 나타낸다. 도 6C는 OSR1+SIX2+세포의 세포 덩어리를 E11.5 마우스 배아 척수와 7 일간 함께 배양한 후 현미경 이미지(왼쪽) 및 면역 스테인드 이미지(오른쪽 3개의 도)을 나타낸다. 도 6D는 OSR1+SIX2+세포의 세포 덩어리를 E11.5 마우스 배아 후신장 세포 및 기관 배양한 후 면역 스테인드 이미지를 나타낸다. 도 6E는 OSR1+SIX2+세포의 세포 덩어리를 NOD. CB17-Prkdc^scid/J의 부고환 지방 조직에 이식한 후 조직을 면역 염색한 형상을 나타낸다. 도 중 WT1 및 PODOCALYXIN(PODX)는 사구체 족세포 마커(각각 빨간색, 분홍색)을, LTL은 근위세뇨관 마커(적색)을 LAMININ 극성 상피 마커(핑크색)을 CDH1 은 원위 세뇨관 마커(distal tubule marker)(핑크색)를, 그리고 CDH6 신장 여포의 마커(renal vesicle marker)(핑크색)을 나타내고, HuNu은 인간 핵(녹색)을 나타내고, 마우스 핵은 파란색으로 염색되어 있으며 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. 도 6F은 iPS 세포 유래의 각 분획(OSR1-SIX2-, OSR1+SIX2-, OSR1-SIX2+ 및 OSR1+SIX2+)의 세포 덩어리(cell mass)를 E11.5 마우스 요관싹(ureteric bud)과 7 일 기관 배양한 후의 현미경 이미지(왼쪽) 및 OSR1+SIX2+세포 덩어리와 요관싹의 공동 문화의 면역 스테인드 이미지(오른쪽)을 나타낸다. 도 중 DBA는 요관싹 마커(적색)를 나타내고, 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. HuNu은 인간 핵(녹색), 마우스 핵은 파란색으로 각각 염색되어있다.
도 7은 마우스 신장 질환 모델에 이식 실험의 결과를 나타낸다. 도 7A 및 B는 OSR1+SIX2+세포의 세포 덩어리를 신장 실질에 이식 후 2 주에서 마우스 급성 신장 손상(AKI) 모델(도 7A) 및 마우스 만성 신부전 모델(도 7B)의 신장 절편 면역 스테인드 이미지를 나타낸다. LTL 및 AQP1은 근위 세뇨관 마커를 나타내며, 각각 녹색, 빨간색으로 염색되어있다. HuNu은 인간 핵(핑크색)을 나타내고, 스케일 바는 50μm를 나타낸다. 도 7C는 hiPSC-RP(n=10, iPSC-RPs, 삼각), 미분화 인간 iPS 세포(n=10, iPSCs, 사각형) 또는 생리 식염수 (n=10, Saline, 원형)의 신장 피막 아래 이식을 받은 AKI 모델 마우스에서, BUN 수준 및 혈청 Cr 수준의 시간 코스 분석을 나타낸다[*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs Saline]. 도 7D는 hiPSC-RP(iPSC-RPs) 또는 생리 식염수(Saline)를 이식한 마우스 유래의 신장 조직의 조직학적 소견을 나타낸다. 신장 조직을 허혈 재관류 후(I/R) 3 일째 과요오드산-시프(Periodic acid-Schiff)(PAS, 위) 또는 Masson’s trichrome(MT 아래) 염색으로 염색했다. 도 7E는 I/R 후 3 일째 숙주 신장의 원통을 수반하는 내강의 확장한 세뇨관(Dilated tubules with casts) 또는 섬유화(Fibrosis)의 면적의 측정 결과를 나타낸다[**P<0.01 vs Saline, 무리 당 n=3].

본 발명을 하기에 자세히 설명한다.

본 발명에서는 중간 중배엽 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 신장 전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 중간 중배엽 세포는 본 발명에서 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 신장 전구세포로 유도되는 모든 세포를 의미한다. 중간 중배엽 세포를 얻는 방법으로는 예를 들어, 마우스 및 인간 만능 줄기세포에서 중간 중배엽 세포로의 분화 유도 방법이 공지되어있다(비특허문헌 1 및 2, 특허문헌 3). 중간 중배엽 세포를 특징 짓는 마커로 OSR1 알려져 있으며, 본 발명의 방법에서 사용되는 중간 중배엽 세포의 예로 OSR1 양성의 중간 중배엽 세포를 들 수 있다. 예를 들어, OSR1 프로모터 통제하에 도입된 리포터 유전자(예: GFP)를 갖는 만능 줄기세포(예를 들어, 후기 실시예에 기재된 OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포)를 배양하여 상기 리포터 유전자의 발현을 지표 당해 분야에 공지된 방법(예를 들면, 세포 분류기를 이용하는 방법)에 따라 OSR1 양성의 중간 중배엽 세포를 분리할 수 있다. 또한 정량적 RT-PCR(Nat Commun 4, 1367 (2013)) 등의 유전자 발현을 분석하는 방법으로 중간 중배엽 세포의 OSR1의 발현을 확인할 수도 있다. 본 발명에서 OSR1 양성의 중간 중배엽 세포는 0SR1 단백질을 발현하는 세포 및 OSR1 프로모터 제어하의 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포가 포함된다. 본 발명에서 OSR1에는 NCBI의 어세션 번호로, 인간의 경우 NM_145260.2, 마우스의 경우 NM_011859.3에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자 및 그 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들 기능을 갖는 자연에 존재하는 돌연변이가 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 방법에서 사용되는 중간 중배엽 세포는 SIX2가 음성이며, OSR1가 양성인 세포이다.

본 발명에서 신장 전구세포는 네프론 전구세포와 유사한 세포로 간주되어, in vitro에서 신장의 사구체상 구조와 세뇨관상 구조 등의 기관 구조에 분화할 수 있는 세포이며, 기관 구조에의 분화능은 예를 들어, Osafune K, et al. (2006), Development 133 : 151-61에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다. 네프론 전구세포로의 상태를 유지하는 특징적인 요소로 SIX2 알려져 있으며(비특허문헌 4) 본 발명의 방법으로 유도된 신장 전구세포의 예로 SIX2 양성 신장 전구세포를 들 수있다. 예를 들어, SIX2 프로모터 통제하에 도입된 리포터 유전자(예: tdTomato)를 갖는 만능 줄기세포(예를 들어, 후기 실시예에 기재된 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포)를 배양하여 상기 리포터 유전자의 발현을 지표로 당해 분야에 공지된 방법(예를 들면, 세포 분류기를 이용하는 방법)에 따라 SIX2 양성 신장 전구세포를 분리할 수 있다. 또한 정량적 RT-PCR(Nat Commun 4, 1367 (2013)) 등의 유전자 발현을 분석하는 방법으로 신장 전구세포의 SIX2의 발현을 확인할 수 도 있다. 본 발명에서 SIX2 양성 신장 전구세포는 SIX2 단백질을 발현하는 세포 및 SIX2 프로모터 제어 하의 유전자로 코딩되는 단백질을 발현하는 세포가 포함된다. 본 발명에서 SIX2에는 NCBI의 어세션 번호로, 인간의 경우 NM_016932.4, 마우스의 경우 NM_011380.2에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자 및 그 유전자로 코딩되는 단백질, 및 이들 기능을 갖는 자연에 존재하는 돌연변이가 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 방법으로 유도된 신장 전구세포는 OSR1가 양성이며, 한편 SIX2가 양성인 세포이다.

본 발명에서 중간 중배엽 세포 또는 신장 전구세포는 다른 세포종을 포함하는 세포 집단으로 제공될 수 있으며, 순화된 집단일 수 있다. 바람직하게는 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상, 10 %, 20 %, 28 % 또는 30 % 이상 상기 세포가 포함된 세포 집단이다.

본 발명의 방법에서 중간 중배엽 세포를 어떤 방식으로 실질적으로 분리 (또는 해리)하여 단일 세포의 상태, 또는 세포끼리 접착된 세포 덩어리 상태에서 부유 배양하여 배양하거나, 코팅 처리된 배양 접시를 이용하여 접착 배양하고 있다. 여기서 분리 방법으로는 예를 들어, 역학적 분리 및 단백질 분해 효소 활성과 콜라게나제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어, 트립신과 콜라게나제의 함유 용액 Accutase(TM) 및 Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)을 들 수 있다) 또는 콜라게나제 활성만을 갖는 분리 용액을 이용한 분리를 들 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 부유 배양은 세포를 배양 접시에 비접착 상태로 배양하는 것이며, 특히 제한되지 않지만, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들면, 세포외 기질 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것, 또는 인위적으로 접착을 억제하는 처리(예를 들면, 폴리 히드록시에틸메타크릴레이트(poly-HEMA)에 의한 코팅 처리)한 것을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 접착 배양은 코팅 처리된 배양 접시에서 배양하는 것이다. 코팅제로서, 예를 들어 마트릴겔(Matrigel)(BD Biosciences), Synthemax(Corning), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 또는 엔탁틴(entactin) 및 이들의 조합을 들 수 있으며, 바람직하게는 마트릴겔, Synthemax 또는 젤라틴이다.

본 발명의 중간 중배엽 세포의 배양 단계에 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 기초 배지에 TGFβ 신호 자극제와 BMP 억제제를 첨가하여 제조할 수 있다. 기초 배지로는 예를 들어, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지, Ham's F12 (F12) 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지는 혈청(예를 들어, 소태아혈청(FBS))이 함유되어 있을 수 있고, 또는 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement (KSR) (ES 세포 배양시 혈청 대체물) (Invitrogen), N2 보충 (Invitrogen), B27 보충제 (Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산 (NEAA), 비타민 증식 인자, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 및 이들의 등가물 등 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 하나의 실시예에서, 기초 배지는 DMEM과 F12의 1 : 1 혼합 배지(DMEM/F12)에 GlutaMAX, KSR, 비필수 아미노산, 2-머캅토 에탄올 및 항생제를 포함하는 배지이다.

본 발명에서 사용되는 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ 신호 경로를 활성화하는 것 인 한 특별히 한정되지 않고, TGFβ 신호 자극제로는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 등의 단백질(Peprotech, R&D 사 등에서 입수가능), IDE1((Z)-2-((2-(6-carboxyhexanoyl) hydrazono) methyl) benzoic acid) 및 IDE2(7-(2-cyclopentylidenehydrazinyl)-7-oxoheptanoic acid) (Borowiak M, et al, Cell Stem Cell 2009, 4: 348-58) 등의 화합물이 예시된다. IDE1 및 IDE2는 Stemgent 사, Tocris 사 등으로부터 입수 가능하다. 바람직한 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1이다.

본 발명에서 TGFβ 신호 자극제를 사용하는 경우의 농도는 사용하는 TGFβ 신호 자극제에 따라 당업자가 적절하게 선택 가능하며, 예를 들면, TGFβ 신호 자극제로 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 등의 단백질을 이용하는 경우의 농도는 0.1 ng/ml에서 100 ng/ml, 바람직하게는 1 ng/ml에서 10 ng/ml, 더욱 바람직하게는 5 ng/ml에서 10 ng/ml이다. 또한 IDE1 및 IDE2를 이용하는 경우의 농도는 1 μM에서 100 μM, 바람직하게는 25 μM에서 75 μM, 더욱 바람직하게는 40 μM에서 60 μM이다.

본 발명에서 사용되는 BMP 억제제는 BMP(Bone Morphogenetic Protein) 신호 경로를 억제하는 것인 한 특별히 한정되지 않고, BMP 억제제로는 Chordin, Noggin, Follistatin 등의 단백질성 억제제 Dorsomorphin(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo [1,5-a] pyrimidine) 및 그 유도체 (PB Yu et al. (2007 ), Circulation 116 : II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4 : 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE 3 (8) : e2904), DMH1(4-[6-(4-Isopropoxyphenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] quinoline, 4-[6-[4-(1-Methylethoxy) phenyl] pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl]-quinoline) 및 LDN193189 (4-(6-(4-(piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo[1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline)이 예시된다. Dorsomorphin 및 LDN193189는 시판되고 있으며, Sigma-Aldrich, Stemgent, Merck, Axon MedChem, Peprotech 사 등으로부터 입수 가능하다. 바람직한 BMP 억제제로는 DMH1, Noggin, LDN193189 및 Dorsomorphin을 들 수 있고, 보다 바람직한 BMP 억제제는 DMH1이다.

본 발명에서 BMP 억제제를 사용하는 경우의 농도는 사용하는 BMP 억제제에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어, BMP 억제제로 Chordin, Noggin, Follistatin 등의 단백질성 억제제를 이용하는 경우의 농도는 0.1 ng/ml에서 1000 ng/ml, 바람직하게는 1 ng/ml에서 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml에서 100 ng/ml이다. 또한 Dorsomorphin, DMH1 및 LDN193189를 이용하는 경우의 농도는 0.01 μM부터 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM에서 10 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 μM에서 1 μM이다.

본 발명의 중간 중배엽 세포의 배양 단계 시간은 장기간 배양하여 신장 전구세포의 생산 효율에 특히 영향이 없기 때문에 제한은 없지만, 예를 들어, 2일 이상 4일 이상, 6일 이상, 8일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상을 들 수 있다.

본 발명의 중간 중배엽 세포 배양 단계에서 배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양하여 CO₂ 농도는 바람직하게는 약 2 ~ 5%이다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 중간 중배엽 세포는 만능 줄기세포에서 유도된 중간 중배엽 세포이다. 이 경우, 유도된 중간 중배엽 세포를 일단 격리하여, 고립된 중간 중배엽 세포를 본 발명의 배양 단계에 의해 신장 전구세포로 유도할 수도 있다. 또는, 만능 줄기세포에서 중간 중배엽 세포를 유도하고 중간 중배엽 세포를 분리하지 않은 채 본 발명의 배양 단계에 제공함으로써 신장 전구세포로 유도할 수도 있다.

중간 중배엽 세포를 분리하는 경우, 내생의 OSR1 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 유전자를 가진 만능 줄기세포를 사용하여도 좋다. 만능 줄기세포의 OSR1 프로모터인 통제하에 리포터 유전자를 도입하는 방법으로는, 예를 들어 BAC 벡터 등을 이용한 상동 재조합을 들 수 있고 WO2012/011610 등에 기재되어 있다. 또한 유도된 신장 전구세포를 분리하기 위해 SIX2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 유전자를 가진 만능 줄기세포를 사용하여도 좋고, 상기와 같은 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 사용되는 리포터 유전자로는 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), tdTomato, 세포 표면 단백질 등의 공지된 리포터 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 이러한 만능 줄기세포에서 유도된 중간 중배엽 세포 또는 신장 전구세포는 해당 리포터 단백질의 발현을 지표로 세포 분류기를 이용하는 방법, 해당 세포 표면 단백질에 대한 항체를 사용하여 자기 구슬을 사용하여 자성에 의해 세포를 선별하는 방법 (MACS), 해당 항체 등이 고정화된 담체(예를 들면, 세포 농축 컬럼)를 이용하는 방법 등 해당 분야에서 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명에서 만능 줄기세포는 생체에 존재하는 많은 세포로 분화 가능한 다능성을 가지며 또한, 증식 능력도 겸비하는 줄기세포이며, 본 발명에서 사용되는 중간 중배엽 세포로 유도되는 모든 세포가 포함된다. 만능 줄기세포는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 배아 줄기 (ES) 세포, 핵 이식에 의해 얻어지는 복제 배아 유래 배아 줄기 (ntES) 세포, 정자 줄기세포 ("GS 세포"), 배아 생식 세포 (“EG 세포”), 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 배양 섬유 아 세포 및 골수 줄기세포 유래 다능성 세포 (Muse 세포) 등이 포함된다. 바람직한 만능 줄기세포는 제조 단계에서 배아, 난자 등의 파괴를 하지 않고 사용할 수 있다는 관점에서 iPS 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 iPS 세포이다.

iPS 세포의 제조 방법은 당해 분야에 공지된 사실이며, 모든 체세포에 초기화 인자를 도입함으로써 제조 될 수 있다. 여기서 초기화 인자는 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시될 수 있고 이러한 초기화 인자는 단독으로 이용할 수 있고, 함께 사용할 수도 있다. 초기화 인자의 조합으로는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008 ), Nat. Biotechnol., 26 : 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2 : 525-528, Eminli S, et al. (2008) Stem Cells 26 : 2467- 2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26 : 1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008 ), Cell Stem Cell, 3 : 475-479, Marson A (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11 : 197-203, RL Judson et al. (2009), Nat. Biotechnol., 27 : 459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci US A. 106 : 8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461 : 649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell 5 : 491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell 6 : 167- 74, Han J, et al. (2010) Nature 463 : 1096-100, Mali P, et al. (2010) Stem Cells 28 : 713-720, Maekawa M, et al. (2011) Nature . 474 : 225-9.에 기재된 조합이 예시된다.

체세포에는 비 한정적으로 태아(새끼)의 체세포, 신생아 (새끼)의 체세포 및 성숙한 건강한 혹은 질환성 체세포 모두 포함되고, 또한 일차 배양 세포 , 계대 세포 및 주화 세포 모두 포함된다. 구체적으로는 체세포, 예를 들면 (1) 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽 줄기세포, 치수 줄기세포 등의 조직 줄기세포(체세포 줄기세포), (2) 조직 전구세포, (3) 혈액 세포(말초 혈액 세포, 제대혈 세포 등), 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유 아세포 (피부 세포 등), 머리 세포, 간세포, 위 점막 세포, 장 세포, 비장 세포, 췌장 세포 (췌장 분비 세포 등), 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 분화된 세포 등이 예시된다.

또한 iPS 세포를 이식용 세포의 재료로서 사용하는 경우, 거부 반응이 일어나지 않는다는 관점에서 이식 대상 개체의 HLA 유전자형이 동일하거나 실질적으로 동일한 체세포를 이용하는 것이 바람직하다. 여기에서 "실질적으로 동일한"은 이식된 세포에 면역 억제제에 의해 면역 반응을 억제할 정도로 HLA 유전자형이 일치하는 것이며, 예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3 유전자 위치 또는 HLA-C를 더한 4 유전자 위치가 일치하는 HLA 형을 가진 체세포이다.

본 발명에서 만능 줄기세포에서 중간 중배엽 세포로의 분화 유도시 하기의 단계를 포함하는 방법을 사용할 수 있다:

(i) 만능 줄기세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및

(ii) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.

하기에 각 단계에 대해 추가 설명한다.

(i) 만능 줄기세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계:

본 단계에서는 만능 줄기세포를 해당 분야에 공지된 임의의 방법으로 분리하여 부유 배양 또는 접착 배양하여 배양할 수 있다. 만능 줄기세포의 분리 방법으로는 예를 들어, 역학적 분리 및 단백질 분해 효소 활성과 콜라게나제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어, Accutase(TM) 및 Accumax(TM) (Innovative Cell Technologies, Inc)을 들 수 있다) 또는 콜라게나제 활성만을 갖는 분리 용액을 이용한 분리를 들 수 있다. 바람직하게는 프로테아제 활성과 콜라게나제 활성을 갖는 분리 용액을 사용하여 분리되어 역학적으로 잘게 단일 세포로 분산하는 방법이다. 본 단계에서 사용하는 인간 만능 줄기세포로 사용한 접시에 70% ~ 80% 채워질 때까지 배양된 콜로니를 이용하는 것이 바람직하다.

본 단계 (i)에서 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 기초 배지에 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 첨가하여 제조 할 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 단계에서 사용되는 물질은 Activin A와 GSK-3β 억제제의 조합 또는 GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체의 조합이다. 기초 배지로는 예를 들어, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지, Ham's F12 (F12) 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이러한 혼합 배지 등이 포함된다. 배지는 혈청(예를 들어, FBS)이 함유되어 있어도 좋고, 또는 무혈정일 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 보충(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린 콜라겐 전구체 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비 필수 아미노산(NEAA), 비타민 증식 인자, 저분자 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 단계의 하나의 실시예에서, 기초 배지는 GlutaMAX 혈청 및 항생제를 포함한 DMEM/F12이다.

본 단계 (i)에서 Activin A는 인간과 다른 동물 유래의 Activin A, 및 이들의 기능적 변이체가 포함된 예를 들어, R&D systems 사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 단계에서 사용 Activin A의 농도는 1 ng/ml에서 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 ng/ml에서 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 50 ng/ml에서 200 ng/ml이다.

본 단계 (i)에서 GSK-3β 억제제는 GSK-3β의 기능, 예를 들어 키나제 활성을 저해할 수만 있다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 인디루빈 유도체인 BIO(일명 GSK-3β 저해제 IX; 6-bromoindirubin-3'-oxime), 말레인이미드(maleimide) 유도체인 SB216763(3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indole-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), 페닐-α-브로모 메틸 케톤 화합물인 GSK-3β 억제제 VII(α,4-dibromoacetophenone), 세포막 투과의 인산화 펩타이드인 L803-mts(일명 GSK-3β 펩타이드 억제제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2 : 서열 번호 1) 및 높은 선택성을 갖는 CHIR99021 (Nature (2008) 453 : 519-523)을 들 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, Stemgent 사, Calbiochem 사, Biomol 사 등으로부터 구할 수 있으며, 또한 제작할 수 있다. 본 단계에서 사용되는 바람직한 GSK-3β 억제제로는 CHIR99021를 들 수 있다. 본 단계에서 사용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어, GSK-3β 억제제로 CHIR99021를 사용하는 경우, 0.01 μM부터 100 μM 바람직하게는 0.1 μM에서 10 μM, 더욱 바람직하게는 1 μM에서 3 μM이다.

본 단계 (i)에서 레티노산 유도체는 천연 레티노산이 가지는 기능을 유지하는 인공으로 규정되어 있어도 좋은 레티노산이며, 예를 들면, 레티노이드 화합물 및 비타민 D3 화합물을 포함한다. 레티노이드 화합물의 예로는 레티노산, 3-디하이드로 레티노산, 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbonyl] amino]-Benzoic acid (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev. 32 : 17-26 (1990)) 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5, 5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid(TTNPB)(Strickland S, et al., Cancer Res. 43 : 5268-5272 (1983)) 및 Tanenaga, K. et al., Cancer Res. 40 : 914-919 (1980)에 기재되어 있는 화합물, 팔미틴산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로 레티놀, 3-디하이드로 레티날 등을 들 수 있다. 레티노산 화합물은 레티노이드 화합물 중 카르복실기를 갖는 화합물이며, 예를 들어, 레티노산, 3-디하이드로 레티노산, AM580, TTNPB 등을 들 수 있다. 비타민 D3 화합물의 예로는 Abe, E., et al., Proc.Natl.Acad.Sci (USA) 78 : 4990-4994 (1981) 및 Schwartz, ELet al., Proc.Am.Assoc .Cancer Res. 24 : 18 (1983)에 기재되어 있는 화합물을 들 수 있다. 본 단계의 하나의 실시예에서, 레티노산 유도체는 레티노이드 화합물 또는 비타민 D3 화합물이다. 본 단계의 다른 실시예에서, 레티노산 유도체는 레티노이드 화합물이며, 또 다른 실시예에서, 레티노산 유도체는 레티노산 화합물이다. 본 단계에서 사용되는 바람직한 레티노산 유도체로는 AM580 또는 TTNPB들 수 있다. 본 단계에서 사용 레티노산 유도체의 농도는 사용하는 레티노산 유도체에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어, 레티노산 유도체로 AM580 또는 TTNPB를 사용하는 경우, 0.01 μM부터 100 μM, 바람직하게는, 0.1 μM에서 10 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 μM에서 2 μM이다.

본 단계 (i)의 배지는 또한 ROCK 저해제를 포함하고 있다. 특히, 본 단계가 만능 줄기세포를 단일 세포로 분산시키는 단계를 포함하는 경우에는 중간에 ROCK 저해제가 포함되어 있는 것이 바람직하다.

ROCK 저해제는 Rho-키나제(ROCK)의 기능을 억제할 수만 있다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, Y-27632(예, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000) 참조) Fasudil/HA1077 (예, Uenata et al., Nature 389 : 990-994 (1997) 참조), H-1152 (예 Sasaki et al ., Pharmacol. Ther. 93 : 225-232 (2002) 참조) Wf-536 (예, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4) : 319-324 (2003) 참조) 및 그 유도체, 및 ROCK 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도 핵산 (예, siRNA), 우성음성 돌연변이(dominant negative mutants) 및 그 발현 벡터를 들 수 있다. 또한 ROCK 저해제로는 다른 공지의 저분자 화합물도 사용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0209261 호, 제 2005/0192304 호, 제 2004/0014755 호, 제 2004/0002508 호 제 2004/0002507 호, 제 2003/0125344 호, 제 2003/0087919 호 및 국제 공개 제 2003/062227 호, 제 2003/059913 호, 제 2003/062225 호, 제 2002/076976 호, 제 2004/039796 호 참조). 본 발명은 1 종 또는 2 종 이상의 ROCK 억제제가 사용되고 있다. 본 단계에서 사용되는 바람직한 ROCK 저해제로는 Y-27632을 들 수 있다. 본 단계에서 사용 ROCK 저해제의 농도는 사용하는 ROCK 저해제에 따라 당업자에 적절하게 선택 가능하다. 예를 들어 ROCK 저해제로서 Y-27632를 사용하는 경우, 0.1 μM에서 100 μM, 바람직하게는, 1 μM에서 50 μM, 더욱 바람직하게는 5 μM에서 20 μM이다.

본 단계 (i)에서 배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양이 진행된다. CO₂ 농도는 약 2 ~ 5 %, 바람직하게는 약 5 %이다. 본 단계의 배양 시간은, 예를 들어 2 일 이하의 배양이며, 바람직하게는 2 일이다.

(ii) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계:

본 단계에서는 상기 단계 (i)에서 얻어진 부유 배양 후 세포 집단을 그대로 코팅 처리된 배양 접시에서 어떤 배지로 접착 배양하여도 좋고, 또는 상기 단계 (i )로 접착 배양하여 얻은 세포를 배지 교환하여 배양을 계속할 수 있다.

본 단계 (ii)에서 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 기초 배지에 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 첨가하여 조제할 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 단계에서 사용되는 물질은 BMP7 및 GSK-3β 억제제의 조합, 또는 레티노산 유도체이다. 기초 배지로는 예를 들어, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지, Ham's F12 (F12) 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이러한 혼합 배지 등이 포함된다. 배지는 혈청(예를 들어, FBS)이 함유되어 있어도 좋고, 또는 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement (KSR) (ES 세포 배양시 혈청 대체물) (Invitrogen), N2 보충 (Invitrogen), B27 보충제 (Invitrogen), 지방산, 인슐린 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX (Invitrogen), 비 필수 아미노산 (NEAA), 비타민 증식 인자, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 및 이들의 등가물 같은 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 단계의 하나의 실시예에서, 기초 배지는 DMEM과 F12의 1:1 혼합 배지(DMEM/F12)에 GlutaMAX, KSR, 비 필수 아미노산, 2-머캅토에탄올 및 항생제를 포함하는 배지이다.

본 단계 (ii)에서 예를 들면, 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양한 다음에, 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 더욱 배양하여도 좋다. 바람직하게는, 본 단계 (ii)에서 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양한 다음에, 레티노산 유도체 및 TGFβ 신호 자극제를 포함하는 배지에서 더욱 배양한다.

즉, 본 단계 (ii)는 다음 단계 (ii-1) 및 (ii-2):

(ii-1) BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 기초 배지에서 배양하는 단계, 및

(ii-2) TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 기초 배지에서 배양하는 단계

의 2 단계로 분리하여 실시하여도 좋다.

보다 바람직하게는, 본 단계 (ii)에서 (ii-1) 단계는 BMP7 및 GSK-3β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이며, 한편 (ii-2) 단계는 TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이다.

본 단계 (ii)에서 BMP7은 인간 BMP7 (NCBI의 어세션 번호: NM_001719.2) 및 다른 동물 유래의 BMP7, 및 이들의 기능적 변이체가 포함된 예를 들어, Invitrogen, R&D 사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 단계에서 사용 BMP7의 농도는 1 ng/ml에서 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 ng/ml에서 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 50 ng/ml에서 200 ng/ml이다.

본 단계 (ii)에서 GSK-3β 억제제는 상기 단계 (i)에 대해 예시한 GSK-3β 억제제를 사용할 수 있으며, 바람직한 GSK-3β 억제제로는 CHIR99021를 들 수 있다. 본 단계에서 사용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어, GSK-3β 억제제로 CHIR99021를 사용하는 경우, 0.01 μM부터 100 μM 바람직하게는 0.1 μM에서 10 μM, 더욱 바람직하게는 1 μM에서 3 μM이다.

본 단계 (ii)에서 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ 신호 경로를 활성화하는 것 인 한 특별히 한정되지 않고, TGFβ 신호 자극제로는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 또는 IDE1 및 IDE2를 사용할 수 있는, 선호되는 TGFβ 신호 자극제로는 TGFβ1들 수 있다. 본 단계 (ii)에서 TGFβ 신호 자극제를 사용하는 경우의 농도는 사용하는 TGFβ 신호 자극제에 따라 당업자에 적절하게 선택 가능하다. 예를 들면, TGFβ 신호 자극제로 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 등 단백질을 이용하는 경우의 농도는 0.1 ng/ml에서 100 ng/ml, 바람직하게는 1 ng/ml에서 10 ng/ml, 더욱 바람직하게는 5 ng/ml에서 10 ng/ml이다. 또한 IDE1 및 IDE2를 이용하는 경우의 농도는 1 μM에서 100 μM, 바람직하게는 25 μM에서 75 μM, 더욱 바람직하게는 40 μM에서 60 μM이다.

본 단계 (ii)에서 레티노산 유도체는 상기 단계 (i)에 대하여 예시한 레티노산 유도체를 사용할 수 있으며, 바람직한 레티노산 유도체로는 AM580 또는 TTNPB들 수 있다. 본 단계에서 사용 레티노산 유도체의 농도는 사용하는 레티노산 유도체에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어, 레티노산 유도체로 AM580 또는 TTNPB를 사용하는 경우, 0.01 μM부터 100 μM, 바람직하게는, 0.1 μM에서 10 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 μM에서 2 μM이다.

본 단계 (ii), (ii-1) 및 (ii-2)에서, 배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양이 진행된다. CO₂ 농도는 약 2 ~ 5 %, 바람직하게는 약 5 %이다. 배양시간은, 장기간 배양하여 신장 전구세포의 생산 효율에 특별히 영향이 없기 때문에 제한은 없지만, 단계 (ii)의 배양 시간으로는, 예를 들어 3 일 이상 배양, 바람직하게는 3 일 이상 12 일 이하, 보다 바람직하게는 3 일 이상 9 일 이하를 포함한다. 단계 (ii)이 단계 (ii-1) 및 (ii-2)을 포함한 경우, 단계 (ii)의 배양시간로는 전술한 바와 같으나, 단계 (ii-1)의 배양시간로는, 예를 들어 1 일 이상 배양이며, 바람직하게는 2 일 이상 11 일 이하, 보다 바람직하게는 2 일 이상 6 일 이하를 들 수 있어, 단계 (ii-2)의 배양 시간으로는, 예를 들어 1 일 이상의 배양이고, 바람직하게는 2 일 이상 11 일 이하, 보다 바람직하게는 3 일 이상 6 일 이하를 들 수 있다. 이때 배지는 3 일마다 교체하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상술한 방법에 의해 얻어진 신장 전구세포, 상기 신장 전구세포를 포함하는 약학 조성물, 상기 신장 전구세포를 포함하는 신장 질환 치료제, 성가 산정 전구세포의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 신장 질환을 치료하는 방법, 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 신장 전구세포 및 신장 질환 치료용 약학 조성물의 제조에 있어서 상기 신장 전구세포의 사용을 각각 제공한다. 치료를 필요로 하는 환자에 대한 치료제의 투여 방법은 예를 들어, 얻어진 신장 전구세포를 시트화 하여 환자의 신장에 부착하는 방법, 얻어진 신장 전구세포를 생리 식염수 등에 현탁시킨 세포 현탁액 또는 삼차원 배양(예를 들어, Dev Cell. Sep 11, 2012; 23 (3): 637-651)하여, 얻어진 세포 덩어리를 환자의 신장에 직접 이식하는 방법, 마트리겔 등으로 구성된 스캐폴드에서 삼차원 배양하여 얻어진 신장 전구세포 덩어리를 이식하는 방법 등을 들 수 있다. 이식 부위는 신장 내이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 신장 피막 하이다. 신장 질환으로는 급성 신장 장애, 만성 신부전, 만성 신부전으로까지 이르지 않는 만성 신장 질환이 예시된다.

본 발명에서 신장 질환 치료제에 포함된 신장 전구세포의 세포 수는 이식 조각이 투여 후 생착 된다면 특별히 한정되지 않으며, 환부의 크기와 체구의 크기에 따라 적절히 증감하고 조절할 수 있다.

실시예

다음 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 그 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

[OSR1-GFP & SIX2-GFP knock-in 인간 iPS 세포주의 수립]

인간 iPS 세포 (201B7)는 교토대학(일본, 교토)의 Shinya Yamanaka 교수로부터 수령하여 기존의 방법으로 배양하였다(Takahashi K, et al. Cell 131 : 861-72). 이어서, Mae S, et al, Nat Commun 4 : 1367, 2013에 기재된 방법으로 내생의 OSR1의 발현과 연동하여 GFP를 발현하는 OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포주를 제작 하였다. 이어 Ma등(전출)과 같은 방법을 사용하여 IRES-tdTomato를 삽입한 BAC 클론 (RP11-819H19, Children's Hospital Oakland Research Institute)을 사용하여 해당 OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포주의 SIX2의 종결 코돈의 하류에 IRES-tdTomato를 상동 재조합에 의해 도입하고 내생의 SIX2의 발현과 연동하여 tdTomato을 발현하는 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 iPS 인간 세포주를 제작 하였다.

[실시예 2]

[SIX2 양성 세포의 유도 방법 1]

<1 단계>

실시예 1의 방법으로 얻은 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포주를 5 ng/ml bFGF (Wako)을 첨가한 영장류 ES/iPS 세포용 배지 (ReproCELL)을 포함하는 10 cm 접시에, SNL 세포 (McMahon, AP and Bradley, A. (1990) Cell 62; 1073-1085) (15.5 μg/ml의 미토마이신 (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)에서 2 ~ 3 시간 처리하여 3 × 105 세포/10 cm 접시에 파종)를 피더 세포(feeder cells)로 이용하여 37℃, 2 ~ 5 % CO₂ 분위기에서 채월질 때까지 배양하였다. 여기에 CTK 용액(2.5 % Trypsin (Invitrogen), 1 mg/ml Collagenase IV (Invitrogen), 0.1 M CaCl2, 10 mL KnockOut SR (Invitrogen), 29.5 mL H2O)를 첨가하여 분리시키고, 피더 세포를 제거한 후 , 1 μM CHIR99021 (Stemgent, 04-0004), 100 ng/ml Activin A (R & D systems, 338-AC), 1 % GlutaMAX (100X) (Invitrogen, 35050-061), 2 % FBS (Hyclone) 및 0.5 % PenStrep (Invitrogen, 10565)을 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁시켜, 비 접착 플레이트 (LOW CELL BIND 6WELL DISH (Nunc, 145383))에 1 uferu 당 10 cm 접시에서 얻은 세포 현탁액의 1/3 ~ 1/6 량을 옮겨 부유 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 2 일간 배양했다.

<2 단계>

1 단계에서 얻어진 세포 덩어리를 마트리겔(BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced (BD Biosciences, 356230))에 의해 코팅한 24 웰 또는 6 웰 디쉬(DMEM 중 0.2 mg/ml의 마트리겔 코팅하여 37℃에서 30 분 또는 4℃에서 하룻밤 처리) 또는 Synthemax (Corning Synthemax II-SC Substrate (Corning, 3535XX1))에 의해 코팅한 24 웰 또는 6 웰 디쉬(멸균수로 40 배 희석한 Synthemax로 코팅하여 실온에서 2 시간 처리)에 옮겨 1 μM CHIR99021, 100 ng/ml BMP7 (Recombinant human BMP7 (R & D systems, 3534-BP)), 0.1 % 2-머캅토에탄올 (1000X) (Invitrogen, 21985), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR (Invitrogen), 0.1 mM MEM NEAA (Invitrogen, 11140) 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12을 첨가한 배지로 교환하여 37℃, 5 % CO2 분위기 하에서 접착 배양에서 3 일간부터 6 일간 배양했다. 3 일 이상 배양 한 경우는 3 일째에 동일한 조건의 배지로 교환 하였다.

<3 단계>

2 단계에서 얻은 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 5 ng/ml TGFβ1 (Peprotech, 100-21C), 0.5 μM Dorsomorphin (AMPK Inhibitor, Compound C (Merck, 171260)) 0.1 % 2 -머캅토 에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12을 첨가한 배지로 교환하고, 부유 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 15 일간에서 22 일간 배양했다. 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환 하였다. 얻어진 세포 SIX2-tdTomato 양성 세포율을 유세포 측정기 (벡톤 디킨슨)을 사용하여 평가한 결과, 21.5 ± 2.0 %였다(도 1B).

[실시예 3]

[SIX2 양성 세포의 유도 방법 2]

<1 단계>

실시예 1의 방법으로 얻은 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포주를 유도하는 방법 1의 단계 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 SNL 세포를 피더 세포로 이용하여 10 cm 접시에서 채워질 때까지 배양하였다. 여기에 CTK 용액을 첨가하여 분리시키고, 피더 세포를 제거한 후 1 μM TTNPB (Sigma, T3757), 1 μM CHIR99021,1 % GlutaMAX (100X), 2 % FBS 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁시켜, 비 접착 플레이트(LOW CELL BIND 6WELL DISH) 1 well 당 10 cm 접시에서 얻은 세포 현탁액의 1/3 ~ 1/6 량을 옮겨 부유 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 2 일간 배양했다.

<2 단계>

1 단계에서 얻어진 세포 덩어리를 마트리겔로 코팅한 접시 또는 Synthemax 로 코팅한 접시(유도 방법 1의 단계 2에 기재된 방법으로 조제)에 옮겨 1 μM TTNPB, 0.1 % 2-머캅도에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12을 첨가한 배지로 교환하여 접착 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 3 일부터 9 일간 배양했다. 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환하였다.

<3 단계>

2 단계에서 얻은 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 5 ng/ml TGFβ1, 0.5 μM Dorsomorphin, 0.1 % 2-머캅도에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12을 첨가한 배지로 교환하고, 부유 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 12 일간에서 22 일간 배양했다. 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환하였다. 얻어진 세포에서 SIX2-tdTomato 양성 세포율을 유세포 측정기를 사용하여 평가한 결과, 20.6 ± 5.3 %였다(도 1C).

[실시예 4]

[SIX2 양성 세포의 유도 방법 3]

<1 단계>

실시예 1의 방법으로 얻은 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포주를 유도하는 방법 1의 단계 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 SNL 세포를 피더 세포로 이용하여 10 cm 접시에서 채워질 때까지 배양하였다. 여기에 CTK 용액을 첨가하여 분리시키고, 피더 세포를 제거하고 Accutase (TM) (Innovative Cell Technologies, AT-104)를 첨가하여 iPS 세포를 단일 세포로 분산시켰다. 이어서, 10 μM Y-27632 (Wako, 253-00513), 1 μM CHIR99021, 1 μM TTNPB, 1 % GlutaMAX (100X), 2 % FBS 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁시키고, 0.1 % 젤라틴 (Gelatin from porcine skin, Type A (Sigma, G1890))로 코팅한 접시에 상기 세포 현탁액 (1 × 105 세포/웰 (96 웰의 경우))를 옮겨 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 접착 배양으로 2 일간 배양했다.

<2 단계>

1 단계에서 얻어진 세포를 PBS로 세척하고 1 μM TTNPB 0.1 % 2-머캅토에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12을 첨가한 배지로 교환하여 접착 배양에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 3 일부터 9 일간 배양했다. 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환하였다.

<3 단계>

2 단계에서 얻은 세포에 Accutase (TM)를 첨가하여 분리시키고 OSR1 (GFP)을 지표로 FACS에 의해 OSR1 양성 세포를 정렬했다. 얻어진 OSR1 양성 세포를 5 ng/ml TGFβ1, 0.5 μM Dorsomorphin, 0.1 % 2-머캅토에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12를 첨가한 배지에서 비접착 플레이트 (LOW CELL BIND 6WELL DISH) 1 × 106 세포/웰을 옮겨 37℃, 5 % CO₂ 분위기에서 부유 배양에서 2 일간 배양했다. 얻어진 세포 덩어리를 마트리겔 (BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)로 코팅한 접시에 옮겨 5 ng/ml TGFβ1, 0.5 μM Dorsomorphin, 0.1 % 2-머캅토에탄올 (1000X), 1 % GlutaMAX (100X), 10 % KnockOut SR, 0.1 mM MEM NEAA 및 0.5 % PenStrep을 함유하는 DMEM/F12에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 2 일부터 13 일간 접착 배양하였다. 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환하였다. 얻어진 세포에서 SIX2-tdTomato 양성 세포율을 유세포 측정기를 사용하여 평가한 결과, 31.1 ± 10.0 %였다(도 1D).

[실시예 5]

[Dorsomorphin 대체물로써의 검토]

SIX2 양성 세포의 유도 방법 1의 단계 3에서 Dorsomorphin를 100 ng/ml Noggin (Peprotech), 0.5 μM LDN193189 (Axon MedChem, 1509) 또는 0.5 μM DMH1 (Tocris, 4126)로 변경하고 마찬가지로 분화 유도했는데, 각각 SIX2-tdTomato 양성 세포율은 7.5 %, 20.4 % 또는 15.4 %였다(각각 도 2B, C 및 D).

[TGFβ1 대안으로 검토]

SIX2 양성 세포의 유도 방법 1의 단계 3에서 TGFβ1를 50 μM IDE1 (Tocris) 또는 50 μM IDE2 (Tocris)로 변경하고 마찬가지로 분화 유도한 결과, 각각 SIX2-tdTomato 양성 세포율은 8.4 %, 39.4 % 였다(도 2E 및 F).

[조합하여 검토]

SIX2 양성 세포의 유도 방법 1의 단계 3에서 Dorsomorphin을 0.5 μM LDN193189로 변경하고 TGFβ1를 10 ng/ml TGFβ2 (Peprotech) 또는 10 ng/ml TGFβ3 (R & D)에 변경하여 마찬가지로 분화 유도한 결과, 각각, SIX2 양성 세포 율은 8.6 %, 9.3 %였다(도 2G 및 H).

[실시예 6]

[OSR1-GFP & SIX2-tdTomato knock-in 인간 iPS 세포주의 수립]

실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 Mae S, et al, Nat Commun 4 : 1367, 2013에 기재된 OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포주 (3D45)에서 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 iPS 인간 세포주 (4A6C3-10)를 제작하였다.

[실시예 7]

[SIX2 양성 세포의 유도 방법 4]

<1 단계>

실시예 6의 방법으로 얻은 OSR1-GFP & SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포주

4A6C3-10을 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 (Invitrogen) 및 5 ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF, Wako)을 첨가한 영장류 ES 배지 (ReproCELL)을 포함 10 cm 접시에서, 태생 12.5 일 ICR 마우스 배아 유래 마우스 배아 섬유 아세포(MEF) 또는 SNL 피더 세포(McMahon, AP and Bradley, A. (1990) Cell 62; 1073-1085) (15.5 μg/ml의 미토마이신 (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)에서 2 ~ 3 시간 동안 처리하고 2 × 105 세포/6 cm 접시에 파종)를 피더 세포로 이용하여 37℃, 2 ~ 5 % CO₂ 분위기 하에서 70 % ~ 80 %로 채워질 때까지 배양하였다. 세포를 포함하는 10 cm 플레이트를 PBS로 린스하고 CTK 용액(PBS 중 0.25 % Trypsin (Invitrogen), 0.1 % Collagenase IV (Invitrogen), 20 % KnockOut SR (KSR, Invitrogen) 및 1 mM CaCl2)에서 37℃, 4 분간 처리했다. CTK 용액을 PBS로 린스하여 제거한 후, 0.1 mM MEM NEAA (Invitrogen), 1000 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신, 0.55 mM 2-머캅토에탄올 (Invitrogen) 및 20 % KSR를 함유하는 DMEM/F12+Glutamax (Invitrogen)로 대체했다. 이어서, 세포를 셀 스크레이퍼로 긁어모아, 0.2 % 젤라틴 코팅된 6 cm 플레이트에 뿌려 피더 세포를 제거하였다. 1 시간 후, 세포를 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 및 2 % FBS (HyClone)을 함유하는 DMEM/F12+Glutamax[단계 1 배지]로 세척하고 100 ng/ml 재조합 인간/마우스/쥐 Activin A (R & D systems) 및 1 μM CHIR99021를 함유하는 1 단계 배지를 포함하는 초저 접착 접시 (Corning 3471)에 옮겨 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 2 일간 배양했다.

<2 단계>

세포를 중간 중배엽으로 분화시키기 위해 1 단계에서 얻어진 세포 덩어리 (배상체 (EB))를 Synthemax II (Corning)로 코팅한 24 웰 플레이트에 옮기고, 0.1 mM MEM NEAA, 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신, 0.55 mM 2-머캅토에탄올, 10 % KSR, 100 ng/ml BMP7 (recombinant human BMP7 R & D systems) 및 1 μM CHIR99021을 함유하는 DMEM/F12+Glutamax로 교체하고 37℃ 5 % CO₂ 분위기 하에서 3 일간 배양하였다.

<3 단계>

2 단계 후, 배지를 0.1 mM MEM NEAA, 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신, 0.55 mM 2-머캅토에탄올, 10 % KSR, 1 μM TTNPB (Sigma T3757) 및 5 ng/ml TGFβ1 (Peprotech)을 함유하는 DMEM/F12+Glutamax로 교체하고 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 5 일간 배양했다. 배양 개시 후 2 일째 (1 단계 시작 (1 일)부터 8 일)에 같은 조건의 배지로 교환했다.

<4 단계>

3 단계 후, 배지를 0.1 mM MEM NEAA, 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신, 0.55 mM 2-머캅토에탄올, 10 % KSR, 5 ng/ml TGFβ1 및 0.5 μM DMH1 (Tocris)을 함유하는 DMEM/F12+Glutamax로 교체하고 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 17 일간 배양 하였다(1 단계 시작 (1 일)에서 총 28 일간 배양 도 3A). 이 때, 3 일에 1 번 같은 조건의 배지로 교환했다. 얻어진 세포에서 OSR1 양성 SIX2 양성(OSR1+SIX2+) 세포율을 유세포 측정기를 사용하여 평가한 결과, 배양 28 일째에 32.8 %였다(도 3B). 또한 OSR1+SIX2+ 세포 비율은 배양 25 일째에 최대에 도달 후 배양 28 일까지 유지하고 있는 것으로 확인되었다(도 3D).

[실시예 8]

[다양한 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제의 조합으로써의 검토]

다양한 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제의 조합에 대한 상기 iPS 세포주 4A6C3-10에서 OSR1+ SIX2+ 세포로의 유도를 검토했다. 구체적으로는 다음에 설명하는 조건 1) ~ 10)에서 4A6C3-10에서 OSR1+ SIX2+ 세포로의 유도를 검토했다.

조건 1) ~ 10)의 단계 1 ~ 2는 각각 실시예 7의 단계 1 ~ 2와 동일한 방법을 사용하였다. 조건 1) ~ 7) 및 10)의 3 단계는 실시예 7의 단계 3과 동일한 방법을 사용하였다. 조건 8)의 3 단계는 실시예 7의 3 단계에서 5 ng/ml TGFβ1 및 1 μM TTNPB을 5 ng/ml TGFβ2 (Peprotech)로 대체한 배지에서 배양 하였다. 조건 9)의 3 단계는 실시예 7의 3 단계에서 5 ng/ml TGFβ1 및 1 μM TTNPB을 5 ng/ml TGFβ3 (Peprotech)로 대체 배지에서 배양하였다. 각 조건의 4 단계에서는 실시예 7의 4 단계와 동일한 방법, 또는 실시예 7의 4 단계에서 5 ng/ml TGFβ1 및 0.5 μM DMH1를 다음 중 하나로 대체한 배지에서 배양하였다: 조건 1) DMSO, 조건 2) 5 ng/ml TGFβ1, 조건 3) 0.5 μM DMH1, 조건 4) 5 ng/ml TGFβ1 및 100 ng/ml Noggin (Peprotech), 조건 5) 5 ng/ml TGFβ1 및 0.5 μM Dorsomorphin (Merck), 조건 6) 5 ng/ml TGFβ1 및 0.5 μM LDN193189 (Axon MedChem), 조건 7) 5 ng/ml TGFβ1 (Peprotech) 및 0.5 μM DMH1 (실시예 7과 동일), 조건 8) 5 ng/ml TGFβ2 (Peprotech) 및 0.5 μM DMH1, 조건 9) 5 ng/ml TGFβ3 (Peprotech) 및 0.5 μM DMH1, 조건 10) 50 μM IDE2 (Tocris) 및 0.5 μM DMH1.

그 결과(도 4), OSR1+SIX2+ 세포로의 유도는 TGFβ 신호 자극제로는 TGFβ1을 BMP 억제제로는 DMH1을 이용하는 것이 효과적임이 확인되었다. 실시예 7의 4 단계에서 5 ng/ml TGFβ1 및 0.5 μM DMH1와 함께, TGFβ 수용체 1 억제제인 SB431542 (Tocris) (10 μM)을 포함하는 배지에서 배양한 경우 (조건 11)), OSR1+SIX2+ 세포로의 분화가 억제되었다.

[실시예 9]

[다양한 인간 iPS 세포와 인간 ES 세포에서의 검토]

15 종의 인간 iPS 세포 (말초 혈액 유래 iPS 세포 585A1, 585B1, 604A1, 604B1, 648A1, 648B1, 692D2; 제대혈 유래 iPS 세포 606A1, 606B1, 610B1; 성인 피부 섬유 아세포 (aHDF) 유래 iPS 세포 201B6, 201B7, 253G1, 253G4; 및 4A6C3-10) 및 3 종의 인간 ES 세포 (khES1, khES3, H9) (Proc Natl Acad Sci USA 109, 12538-12543 (2012) Stem Cells 31, 458-466 (2013))를 실시예 7에 기재된 방법과 동일한 방법으로 처리하고 정량적 RT-PCR (Nat Commun 4, 1367 (2013))에 의해 OSR1 및 SIX2의 유전자 발현을 분석했다. 실시예 7에 기재된 방법에 따라 4A6C3-10 이외의 여러 세포주에서 OSR1 및 SIX2의 발현이 확인되었다(도 5). 본 방법이 다른 iPS 세포와 ES 세포에도 적용 가능하다는 것이 확인되었다.

[실시예 10]

[발현 마커 분석]

실시예 7에서의 유도 과정에서 처리한 4A6C3-10의 각종 발현 마커를 RT-PCR 또는 정량 RT-PCR로 분석했다. 결과를 도 3C 및 E에 나타냈다. 1 단계 후 세포는 초기의 후방 중배엽 (posterior nascent mesoderm)의 마커인 BRACHYURY 및 TBX6의 발현이 확인되어 2 단계 후 세포가 중간 중배엽 마커 인 OSR1의 발현이 확인되었다(도 3C). 그 후, 후신간충직(metanephric mesenchymal)(간엽) 마커인 WT1, PAX2, SIX2 및 후방(posterior) HOX 유전자의 발현이 활성화되었다(도 3C). 배양 28 일째 OSR1+SIX2+ 세포에서 신장 전구세포 마커인 CITED1, EYA1, PAX2, WT1, SALL1, ITGA8, CDH11, GDNF, HOXA11 및 HOXD11이 발현되고, 한편 그 세포에서 간질 마커인 FOXD1, 중간 신장 관 마커, 요관아(ureteric bud)인 HOXB7은 검출되지 않았다(도 3E).

[신장 전구세포의 평가]

실시예 7에서의 유도 과정에서 처리한 배양 28 일째 OSR1+ SIX2+ 세포를 유동 세포 계측법으로 분리하고 Synthemax II로 코팅한 96 웰 플레이트에 3.0 × 104 세포/웰로 파종하고, 10 μM Y-27632을 첨가한 REGM 배지(LONZA)에서 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 7 일간 배양했다. 얻어진 세포를 NEPHRIN (glomerular podocytes marker), AQP1 및 MEGALIN (proximal tubule markers) 및 UROMUCOID (Henle’s loop marker)에 대한 면역 염색에 의해 각 마커의 양성 세포를 확인하였다(도 6A).

이어서, 동일한 OSR1+ SIX2+ 세포를 50 ng/ml BMP7 (R & D systems) 및 10 μM Y-27632 (Wako)을 첨가한 UBC 배양 상청(아래 참조)를 포함하는 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트 (Lipidure Coat, NOF)에 1.0 × 105 세포/웰에 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 24 시간 배양하였다. 이어 배지를 50 ng/ml BMP7, 0.5μM BIO (Wako) 및 10 μM Y-27632을 첨가한 UBC 배양 상청에 옮겨 2-3 일간 배양한 후 세포를 회수하고, 미토 마이신을 처리한 Wnt4을 발현하는 NIH3T3(Osafune K, et al. (2006), Development 133 : 151-61)에 3.0 × 104 세포/웰 (24 웰 플레이트)에 파종하여 5-7 일간 배양하였다. 얻어진 세포를 Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) (proximal tubule marker), LAMININ (극성 상피 세포 마커), CDH1 (말초 관모 마커) 및 PODOCALYXIN 및 WT1 (사구체 podocytes 마커)에 대하여 면역 염색하여 각 마커의 양성 세포를 확인하였다(도 6B).

또한 OSR1+SIX2+ 세포를 E11.5 마우스 배아 척수와 기관 배양하였다. 구체적으로, OSR1+SIX2+ 세포를 50 ng/ml BMP7(R & D systems) 및 10 μM Y-27632 (Wako)을 첨가한 UBC 배양 상청(아래 참조)을 포함한 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트 (Lipidure Coat, NOF)에 1.0 × 105 세포/웰에 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 24 시간 배양하였다. 이어 배지를 50 ng/ml BMP7, 0.5μM BIO (Wako) 및 10 μM Y-27632을 첨가한 UBC 배양 상청에 옮겨 2-3 일간 배양 한 후 세포를 회수하고 E11.5 마우스 배아 척수 함께 0.4 μm 구멍을 갖는 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 필터 (Millipore)에서 공기-배양액의 경계에서 37℃에서 배양하였다. 배양액 측에 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 및 10 % FBS를 첨가 한 DMEM (Nacalai tesque)을 이용하였다(Osafune K, et al. (2006) Development133 : 151-61). 일주일 후 얻은 세포를 LTL, LAMININ, CDH1, PODOCALYXIN 및 WT1에 대하여 면역 염색하여 각 마커의 양성 세포를 확인하였다(도 6C).

또한 OSR1 + SIX2 + 세포를 50 ng/ml BMP7 (R & D systems) 및 10μM Y-27632 (Wako)을 첨가한 UBC 배양 상청 (아래 참조)를 포함한 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트 (Lipidure Coat, NOF)에 1.0 × 105 세포/웰에 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 24 시간 배양하였다. 이어서 배지를 50 ng/ml BMP7, 0.5 μM BIO (Wako) 및 10 μM Y-27632을 첨가한 UBC 배양 상청에 옮겨 2-3 일간 배양한 후 세포를 회수하고 면역 결핍 마우스(NOD. CB17-Prkdc^scid/J (Charles river))의 부고환 지방 조직에 이식하고 30 일 후 이식 부위를 회수한 결과, LTL 및 LAMININ 양성의 근위 세뇨관 상 구조를 확인하였다(도 6E).

또한, 실시예 7에서의 유도 과정에서 처리한 배양 28 일째의 각 분획의 세포 (OSR1-SIX2-, OSR1+SIX2-, OSR1-SIX2+ 및 OSR1+SIX2+)를 E11.5 마우스 배아 요관싹(embryonic ureteric bud)과 기관 배양하였다. 구체적으로, iPS 세포 유래의 세포를 50 ng/ml BMP7 (R & D systems) 및 10 μM Y-27632 (Wako)을 첨가한 UBC 배양 상청(아래 참조)을 포함하는 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트 (Lipidure Coat, NOF)에 1.0 × 105 세포/웰에 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 24 시간 배양 하였다. 이어서 배지를 50 ng/ml BMP7, 0.5 μM BIO (Wako) 및 10 μM Y-27632을 첨가한 UBC 배양 상청에 옮겨 2-3 일간 배양한 후 세포를 회수하고 Accumax를 이용하여 분리했다. ICR 마우스에서 E11.5 마우스 배아 요관싹 을 추출했다. 얻어진 5.0 × 105 세포의 마우스 배아 요관싹을 5.0 × 105 세포의 상기 Accumax에서 분리한 OSR1-SIX2-, OSR1 + SIX2-, OSR1-SIX2+ 및 OSR1+SIX2+ 각 세포군과 혼합하여 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트에서, 10 μM Y-27632,500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 및 10 % FBS를 첨가한 DMEM 중에서 주야 배양하여 응집 덩어리를 형성시켰다. 얻어진 응집 덩어리를 0.4 μm 구멍을 갖는 polycarbonate 필터 (Millipore)에서 공기-배양액의 경계에서 37℃에서 배양하였다. 배양액 측에 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 및 10 % FBS를 첨가한 DMEM (Nacalai tesque)을 이용하였다(Uchino, S. et al. JAMA 294, 813-818 (2005)). 일주일 후 얻은 세포 응집 덩어리를 관찰 한 결과, OSR1+SIX2+ 세포의 응집 덩어리에서만 관 구조를 확인 하였다(도 6F 왼쪽). 또한 OSR1+SIX2+ 세포의 응집 덩어리 대해 DBA(요관 싹 마커)에 대한 면역 염색을 실시한 결과, 마우스 요관 싹 유래 파생 효과가 확인되었다(도 6F 오른쪽 도).

이상에서 실시예 7에 기재된 방법으로 분화 유도 한 OSR1+SIX2+ 세포는 신장 전구세포인 것으로 나타났다.

[UBC 배양 상청]

Ureteric Bud 세포 (UBC) 순화 배지를 문헌 (Am J Physiol 273, F757-767 (1997))에 기재된 방법을 개량한 방법으로 제작했다. UBC (Dr Sakurai에서 양수, Proc Natl Acad Sci USA 94, 6279-6284 (1997))를 10 % 소태아혈청 (FBS)을 함유하는 최소 필수 배지(MEM; Invitrogen)에서 배양 하였다. 80 %로 채워진 곳에서 세포를 PBS로 씻어 배지를 0.1 mM MEM NEAA, 500 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신 및 0.55 mM 2-머캅도에탄올, 10 % KSR를 함유하는 DMEM/F12+Glutamax로 대체했다. 이어서, 세포를 3 일간 배양하여 배양 상청을 생성했다. 배양 상청은 사용 전에 0.22 μm 필터로 여과하였다.

[실시예 11]

[인간 iPS 유래 신장 전구세포의 치료 효과]

실시예 7에 기재된 방법으로 분화 유도한 25 일 ~ 28 일 인간 iPS 유래 신장 전구세포(OSR1+SIX2+ 세포; RP-OS라고도 함) 또는 인간 iPS 유래 신장 전구세포를 포함한 세포군(OSR1+SIX2- 세포 및 OSR1+SIX2+ 세포; hiPSC-RP라고도 함)을 유동 세포 계측법으로 분리하여 50 ng/ml BMP7 (R & D systems) 및 10 μM Y-27632 (Wako)을 첨가한 UBC 배양 상청(위)을 포함하는 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트 (Lipidure Coat, NOF)에 1.0 × 105 세포/웰로 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 24 시간 배양 하였다. 이어 배지를 50 ng/ml BMP7,0.5μM BIO (Wako) 및 10 μM Y-27632을 첨가한 UBC 배양 상청로 바꾸고 또한 24 시간 배양하였다. 대조군으로 미분화 인간 iPS 세포 (4A6C3-10)를 10 μM Y-27632을 첨가한 영장류 ES 세포 배지 (ReproCELL)를 포함하는 spindle-shaped bottom low-adhesion 96 웰 플레이트에 1.0 × 105 세포/웰에 파종하여 37℃, 5 % CO₂ 분위기 하에서 48 시간 배양하였다. 배양 후 각 세포를 생리 식염수로 세척하고, 배지를 제거했다. 그 다음에 기재된 바와 같이 15 개의 hiPSC-RP의 세포 덩어리를 급성 신장 손상 (AKI) 모델 마우스의 신장 피막하에 이식했다. 또한 OSR1+SIX2+ 세포의 조직 분화를 확인하는 실험(도 7A 및 B)으로써, 다음에 기재된 바와 같이 5 개의 RP-OS의 세포 덩어리를 AKI 모델 마우스 및 만성 신부전 모델 마우스의 신장 실질 피펫으로 주입했다.

[마우스 급성 신장 손상 (AKI) 모델 시험]

마우스 허혈 재관류 AKI 모델을 공지의 방법 (Aging Cell 8, 192-200 (2009), J Am Soc Nephrol 20, 1544-1555 (2009), J Am Soc Nephrol 25, 316-328 (2014))에 따라 제작 하였다. 6 주령의 암컷 면역 결핍 마우스 (NOD. CB17-Prkdcscid/J (Charles river))를 isoflurane 흡입으로 마취하고 37℃에서 유지했다. 측면 배꼽 절개하고 오른쪽 신장 적출을 한 후 비외상(non-traumatic)으로 미세 혈관 클램프 (나츠메 제작소, 일본)를 사용하여 45 분 동안 왼쪽 신장 동맥을 폐색했다. 클램프를 분리한 후, RP-OS, hiPSC-RP 또는 4A6C3-10를 이식하였다(대조군 마우스에 식염수를 주입하였다). 마우스의 말초 혈중의 신장 기능 표지자인 혈중 요소 질소 (BUN) 및 혈청 크레아티닌 (Cr) 수준을 DRI-CHEM 7000VZ (후지 필름, 일본)를 사용하여 측정하였다. AKI 상태의 확립은 허혈 재관류 후 신장 경색을 동반하지 않고 2 일째 BUN 수준이 상승 (> 41 mg/dl)하고 있는 것으로 확인했다. 신장 조직의 해석에서는 허혈 재관류 후 (I/R) 3 일째에 과 요오드 산-Schiff (PAS) 또는 Masson’s trichrome (MT) 염색으로 염색했다.

[마우스 만성 신부전 모델 시험]

마우스 만성 신부전 모델(5/6 신장 적출 모델)을 공지의 방법 (Nephrol Dial Transplant 26, 832-838 (2011))에 따라 제작하였다. 6 주령의 암컷 면역 결핍 마우스(NOD. CB17-Prkdcscid/J)를 isoflurane 흡입으로 마취하고 37℃에서 유지했다. 오른쪽 신장 적출 한 후 왼쪽 신장의 상하 양극을 절제했다. RP-OS의 세포 덩어리를 수술 후 2 주에 이식했다. 이식 후 3 일 또는 2 주 후에 마우스를 도살하고 신장 조직 절편을 면역 염색에서 시험했다.

[결과]

RP-OS의 신장 실질 이식 후 2 주 째 AKI 모델 (도 7A) 및 만성 신부전 모델 (도 7B) 모두에서 이식한 RP-OS의 약간은 숙주의 신장에 내장된 근위뇨세관 마커 LTL 및 AQP1 양성 세포로 분화했다. 그러나 RP-OS의 신장 실질 이식은 두 모델에서 신장 기능에 대한 명확한 효과를 보이지 않았다(데이터가 표시되지 않음). 정맥 주사와 비교하여 신장 피막 아래에 이식함으로써 다수의 간엽 줄기세포를 손상된 신장에 직접 전달하는 것으로보고 되고있는 것으로부터(Transplant Proc 41, 947-951 (2009)) 본 발명자들은 hiPSC-RP의 신장 피막 아래에 이식에 의한 치료 효과를 시험했다. 그 결과 허혈 재관류 후 2, 4, 6 일째에 대조군 및 미분화 인간 iPS 세포 이식군과 비교하여 hiPSC-RP 이식군에서 BUN 수준 및 혈청 Cr 수치가 유의하게 감소했다(도 7C). 조직 학적 분석을 통해 신장 실질 영역의 원주를 따른 확장 관모가 대조군에 비해 hiPSC-RP 이식군에서 유의하게 작고, 섬유화 영역도 hiPSC-RP 이식 군에서는 작은 것이 확인되었다(도 7D 및 E). hiPSC-RP는 숙주의 신장에 포함되지 않은 것으로부터, 본 프로토콜에서 확인된 hiPSC-RP의 치료 효과는 주로 파라클라인 효과(paracrine actions)에 근거한 것으로 사료된다.

이상 상술 한 바와 같이, 본 발명은 중간 중배엽 세포에서 신장 전구세포를 분화 유도 방법을 제공한다. 따라서 본 방법으로 제조된 신장 전구세포는 신부전 등의 신장 질환의 재생 의료에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본원에 도입한다.

<110> Kyoto University Astellas Pharma Inc. <120> Method for producing kidney progenitor cell and medicine comprising the kidney progenitor cell <130> 2015FPI-10-005 <150> JP 2013/123072 <151> 2013-06-11 <150> JP 2014/092108 <151> 2014-04-25 <150> PCT/JP 2014/066081 <151> 2014-06-11 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L803-mts <220> <221> LIPID <222> (1) <223> MYRISTATE <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> PHOSPHORYLATION, <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> AMIDATION, <400> 1 Gly Lys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro 1 5 10

Claims

중간 중배엽 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포를 유도하는 단계를 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구세포의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 신장 전구세포는 SIX2 양성 세포인 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 OSR1 양성 세포인 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 및 IDE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 억제제는 Dorsomorphin, Noggin, LDN193189 및 DMH1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1이고, 상기 BMP 억제제는 DMH1 인 방법.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 만능 줄기 세포로부터 유도된 중간 중배엽 세포인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 중간 중배엽 세포는 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 방법으로 제조된 중간 중배엽 세포인 방법:
(i) 만능 줄기 세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산(retinoic acid) 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및
(ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
제 8항에 있어서, 상기 단계 (ii)은 하기 단계 (ii-1) 및 (ii-2)를 포함하는 방법:
(ii-1) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및
(ii-2) 단계 (ii-1)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
제 9항에 있어서, 상기 단계 (ii-1)는 BMP7 및 GSK-3β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이며, 상기 단계 (ii-2)는 TGFβ 신호 자극제와 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계인 방법.
제 8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GSK3β 억제제는 CHIR99021 인 방법.
제 8항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 유도체는 AM580 또는 TTNPB 인 방법.
제 7항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포인 방법.
제 13항에 있어서, 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 방법.
만능 줄기 세포로부터 신장 전구세포를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는 방법:
(i) 만능 줄기 세포를 Activin A, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7, GSK-3β 억제제 및 레티노산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및
(iii) 단계 (ii)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
제 15항에 있어서, 상기 신장 전구세포는 SIX2 양성 세포인 방법.
제 15항 또는 16항에 있어서, 상기 단계 (ii)에서 얻은 세포는 OSR1 양성 세포인 방법.
제 15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 및 IDE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.
제 15항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 억제제는 Dorsomorphin, Noggin, LDN193189 및 DMH1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 방법.
제 15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGFβ 신호 자극제는 TGFβ1이고, 상기 BMP 억제제는 DMH1 인 방법.
제 15항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)은 하기 단계 (ii-1) 및 (ii-2)를 포함하는 방법:
(ii-1) 단계 (i)에서 얻은 세포를 BMP7 및 GSK-3β 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및
(ii-2) 단계 (ii-1)에서 얻은 세포를 TGFβ 신호 자극제와 레티노산 유도체에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.
제 21항에 있어서, 상기 단계 (ii-1)는 BMP7 및 GSK-3β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계이며, 상기 단계 (ii-2)는 TGFβ 신호 자극제 및 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계인 방법.
제 15항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GSK3β 억제제는 CHIR99021 인 방법.
제 15항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 유도체는 AM580 또는 TTNPB 인 방법.
제 15항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포인 방법.
제 25항에 있어서, 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 방법.
제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포.
제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를 포함하는 약학 조성물.
제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를 포함하는 신장 질환 치료제.
제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포를, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장 질환을 치료하는 방법.
신장 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포.
신장 질환 치료용 약학 조성물의 제조에 있어서, 제 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 신장 전구세포의 사용.