KR20120035801A

KR20120035801A - 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 배양 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20120035801A
Application number: KR1020100097543A
Authority: KR
Inventors: 정형민; 문성환
Original assignee: (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2012-04-16
Also published as: US20130251691A1; US9969978B2; CN103237887A; KR101364965B1; WO2012047037A3; WO2012047037A2

Abstract

본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포의 배아체(embryoid body)를 무혈청 배지에서 배양하는 단계 및, (b) 상기 (a) 단계에서 생존한 세포를 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴세포/㎠의 밀도로 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포로 부터 분화된 심근세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에 의한 방법으로 제조되는 심근세포 및 DMEM, N2 및 항생제를 포함하는 인간 배아줄기세포의 배아체로부터 심근세포 분리용 무혈청 배지 조성물에 관한 것이다.본 발명에 따른 심근세포를 분리하는 방법, 본 방법에 의해 제조된 심근세포 및 심근세포 분리, 배양용 배지 조성물을 이용하면 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 등의 개발에 기여할 수 있다. 또한 본 발명의 분리 방법은 임상학적 관점에서 무혈청 배지를 사용하여 외래 혈청 등에 의한 오염의 위험이 없으며 최종적으로 분화된 성숙 세포를 고순도로 확보하는 데 활용되어 심장 관련 질병의 원인 및 치료법 개발에 이용할 수 있다. 아울러 본 발명에 의해 제조된 심근세포는 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효 검증 시스템 특히, 심근세포 분화 유도 물질 및 심장 기능 강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약제품화에 활용될 수 있다.

Description

인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 배양 및 정제 방법{Method for expansion and purification of human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte}

본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포의 배아체(embryoid body)를 무혈청 배지에서 배양하는 단계 및, (b) 상기 (a) 단계에서 생존한 세포를 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴세포/㎠의 밀도로 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포로 부터 분화된 심근세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기에 의한 방법으로 제조되는 심근세포, 및 DMEM, N2, 및 항생제를 포함하는 인간 배아줄기세포의 배아체로부터 심근세포 분리용 무혈청 배지 조성물에 관한 것이다.

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESCs) 유래의 심근세포(cardiomyocyte, CM)는 심혈관계 심장질환의 재생학적 치료에 사용될 수 있어서, 많은 연구자들에 의해 다양한 CM의 분화와 분리방법이 개발되었다. 그러나 낮은 CM의 획득으로 인해 이러한 방법들의 실제적인 적용이 제한적인 실정이다. CM은 마이크로 절개에 의해 수축성이 있는 배아체(human embryoid bodies, hEBs)로부터 분리되어 왔다. 일반적으로 hEBs의 형성은 분화되지 않은 hESCs로 부터 수축성 CM의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있으나 이러한 방법을 통한 CM의 생성에는 몇가지 단점이 존재한다. 첫번째, hEBs는 3차원 배양에서 3배엽의 특이한 분할패턴을 나타내지 않는다. 두번째로, 분화된 세포들은 다른 세포 계열의 세포들과 함께 섞여 있다. 세 번째로, 이 방법은 높은 농도로 CM을 분리하기 어렵다. 따라서, 많은 연구자들은 기계학적인 분리, 퍼콜 밀도 기울기 침전 및 KDR, CD15와 CD16를 이용한 방법으로 많은 양의 CM을 분리하고자 노력하였다. 그러나, 이러한 방법 또한 CM 세포를 완전히 순수하게 분리할 수 없기 때문에 실제 임상에 적용하기 어려운 단점이 존재한다. 또한, 기존의 배양 방법은 CM 표면의 특이적 마커의 부족으로 인해 CM 분리에 적용되기 어려운 실정이다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 재조합 렌티 바이러스 벡터 시스템을 이용한 형질도입으로 MLC-2v-유도-GFP-발현 hESCs를 제작하고, FACS 분리를 통해 hEBs로 부터 CM을 정제하기 위한 hESCs를 사용하였다. 그러나, 이러한 hESCs의 임상학적 적용은 바이러스 DNA가 체내의 DNA로 통합될 수 있기 때문에 매우 제한적으로 사용된다. 또한, 마이크로-절개에 의해 수축성 hEBs로부터 CM을 분리해 내었으나, CM은 외배엽 세포가 아닌 내배엽 세포와 함께 존재하는 특성으로 인해 내배엽 계열의 다른 세포들과 CM이 혼재하게 된다.

한편, 성숙한 CM의 증식은 제한적이기 때문에, 심혈관 심장질환 치료제로 사용하기 위한 충분한 양의 CM을 획득하는 것도 중요한 변수가 된다. 이를 위해, 성장인자나 CM 증식과 분화를 제공하는 내배엽주 세포를 이용한 END-2 동시 배양 시스템을 사용한 다양한 분화 방법을 개발하여 왔다. 그러나 이러한 방법의 경우, 성장인자를 사용하였을때 경제적으로 불리한 단점이 존재하며, END-2 세포를 사용하면 동시 배양한 것에서 또다시 CM을 분리해야만 하는 단점이 존재한다. 따라서, 높은 효율 및 산출량을 제공하는 세포-기반의 치료를 위한 CM 생산 및 분리 방법이 요구된다.

이러한 배경하에, 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배아체로부터 CM을 높은 효율, 고순도로 분리, 획득하기 위하여 CM을 제외한 모든 세포 계열을 제거하기 위한 무혈청 배양 조건을 개발하였다. 또한, 다른 분화한 세포가 고밀도로 존재하면 세포사멸(apoptosis)등이 일어나는 등 세포 증식이 제한되는 것과 달리, CM의 경우 고밀도로 배양하면 밀도-의존적 방식으로 CM의 증식이 유도되어, 최종적으로 인간 배아줄기세포로부터 고수율로 순도 높은 심근세포를 분리, 획득할 수 있음을 발견하고, 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 인간 배아줄기세포의 배아체(embryoid body)를 무혈청 배지에서 배양하는 단계 및, (b) 상기 (a) 단계에서 생존한 세포를 2X10⁴ 세포/㎠내지 7X10⁴세포/㎠의 밀도로 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포로 부터 분화된 심근세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 개시되는 방법으로 제조되는 심근세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DMEM, N2, 및 항생제를 포함하는 인간 배아줄기세포의 배아체로부터 심근세포 분리용 무혈청 배지 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포의 배아체(embryoid body)를 무혈청 배지에서 배양하는 단계 및, (b) 상기 (a) 단계에서 생존한 세포를 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 밀도로 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포로 부터 분화된 심근세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, "인간 배아줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)을 가지는 세포를 의미한다.

본 발명에서, 인간 배아줄기세포로부터 유래한 배아체는 외배엽성 세포, 중배엽성 세포, 내배엽성 세포를 포함하고, 당업계에 공지된 방법에 따라, 바람직하게는 Zhang J, GF Wilson, AG Soerens, CH Koonce, J Yu, SP Palecek, JA Thomson and TJ Kamp. (2009). Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation research 104:e30-41에 기재된 방법에 따라 획득한 수축성(contracting) 배아체일 수 있다. 본 발명에서 용어, "수축성 배아체"는 인간 배아줄기세포에서 분화된 세포 중 수축성을 가진 심근세포를 포함하는 배아체를 말한다.

본 발명에서 용어 "무혈청 배지"란 외래종 또는 동종의 혈청을 포함하지 않는 임의의 세포 배양 배지를 의미하고, 혈청을 포함하지 않는 한 당업계에 공지된 세포배양 배지를 이용할 수 있다. 통상적인 성숙 분화세포의 배양에서는 배지에 혈청이 포함되는 것이 필요하지만, 본 발명에서는 무혈청 배지에서 CM은 생존하고 다른 계통 세포는 배양되지 못하는 것을 밝혀내었다. 또한, 상기와 같은 무혈청 배지의 사용은 혈청 배지 내에 존재하는 우태아혈청 (FBS) 또는 우혈청 (FCS)과 같은 소유래의 물질로 인한 광우병 바이러스 등을 비롯한 오염원을 포함하고 있을 가능성으로 인한 임상학적 적용에 있어서 발생할 수 있는 위험을 제거할 수 있다. 또한 무혈청 배지를 사용하는 경우, 혈청 내의 단백질이 항체 형성을 유도하여 이로 인한 이식된 세포의 이식 거부를 일으킬 위험 등을 제거할 수 있어서 본 발명의 방법에 의해 제조된 심근세포를 심장 관련 질환의 세포 치료제로 임상학적 위험 없이 적용할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 사용한 무혈청 배지는 DMEM, N2, 및 항생제를 포함하는 무혈청 배지일 수 있다.

본 발명에서, 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 밀도의 세포 밀도로 배양하는 단계는, 상기 무혈청 배지에서 배양 후 생존한 CM의 증식을 촉진시키기 위한 단계이다. 통상의 성숙 분화 세포는 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 고밀도로 배양하는 경우, 증식이 제한될 수 있으나, CM의 경우 오히려 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴세포/㎠의 고밀도로 배양하는 경우, 세포-세포 접촉으로 인하여 증식이 촉진되는 것을 발견하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 저밀도(1X10⁴ 세포/㎠ 이하)로 배양하는 경우에 비하여, 1.2배 내지 1.5배 정도 증식이 촉진됨을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포의 모든 분화 단계의 세포를 제한 없이 포함하며, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의하여 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄 (MHC/MLC), α-엑티닌 (α-actinin), 트로포닌 I (cTn I), ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등을 들 수 있다. 또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄,α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 다능성 세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 사용한 심근세포의 마커는 cTnT 및 sMHC일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, DMEM, N2 및 항생제를 포함하는 무혈청 배지에서 배양된 hESCs 유래의 심근세포를 마이크로-절개에 의해 분리하였고, 이 때의 세포의 분화정도를 심근세포 특이적인 마커인 cTnT 및 sMHC를 이용하여 확인한 결과, 심근세포 특이적으로 분화가 유도된 것을 확인하였다(도 1A 내지 1I). 심근세포의 경우, 고밀도(5X10⁴ 세포/㎠)의 응집체 형태로 배양하였을 때, 높은 증식력을 나타내는 것을 확인하였다(도 3A 내지 도 3G). 또한, 심근세포를 배양하는 방법에 있어서, 2차원 부착배양 및 3차원 부유배양이 모두 가능하나, 2차원 부착배양의 형태보다 3차원의 부유배양 하는 경우, 보다 높은 수율로 심근세포를 수득할 수 있음을 확인하였다(도 4A 내지 4J).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에서 개시한 방법에 의해 제조되며, 하기의 특징을 가지는 심근세포: (ⅰ) 심근세포 특이적인 cTnT, 및 sMHC 분화마커를 발현함; (ⅱ) 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 또는 근육-유사 (muscle-like) 형태를 가짐; 및 (ⅲ) 박동하는 세포에 관한 것이다.

본 발명의 방법을 통해 인간 배아줄기세포로부터 제조된 심근세포는 심근세포의 형태학적, 생리학적 또는 면역학적 특징을 가지는데, 심근세포 특이적인 표지 인자들의 유전자 발현 정도가 증가될 수 있다. 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 경우, 심근세포 특이적인 표지 인자, 예를 들면 MLC-2α, MLC-2v, Cardiac Actin, cTnT, cTnl, α-actinin, MEF-2C, α-MHC 및 ANP 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다. 또한, 생쥐 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 경우, Nkx2.5, α-MHC, β-MHC, MLC-2v, GATA4 및 α-actinin 중 하나 이상의 유전자 발현 정도가 증가되는 특징을 가질 수 있다. 바람직하게 본 발명의 심근세포는 cTnT 및 sMHC를 발현하는 심근세포일 수 있다. 또한, 본 발명는 심근세포의 경우 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 또는 근육-유사 (muscle-like) 형태를 가지며 박동하는 세포일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로 본 발명은, DMEM, N2 및 항생제를 포함하는 인간 배아줄기세포의 배아체로부터 심근세포 분리용 무혈청 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "무혈청 배지"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 따른 배지 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태의 배양 배지에 최적의 농도로 당업자에 의해 적절하게 조절되어 첨가될 수 있다.

본 발명에서 생산되는 인간 배아줄기세포로부터 획득한 심근세포는 심장 관련 질환을 치료하기 위한 세포대체 요법용 세포조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 심근세포를 분리하는 방법, 본 방법에 의해 제조된 심근세포 및 심근세포 분리, 배양용 배지 조성물을 이용하면 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 등의 개발에 기여할 수 있다. 또한 본 발명의 분리 방법은 임상학적 관점에서 무혈청 배지를 사용하여 외래 혈청 등에 의한 오염의 위험이 없으며 최종적으로 분화된 성숙 세포를 고순도로 확보하는 데 활용되어 심장 관련 질병의 원인 및 치료법 개발에 이용할 수 있다. 아울러 본 발명에 의해 제조된 심근세포는 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효 검증 시스템 특히, 심근세포 분화 유도 물질 및 심장 기능 강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약제품화에 활용될 수 있다.

도 1은 hESCs에서 유래된 CM의 분화와 분리를 나타낸 것이다. 분화된 수축성의 hEBs(A) 및 수축성의 hEBs에서의 cTnT의 발현 패턴(B 및 C), 수축성의 hEBs의 부착(D) 및 부착된 hEBs의 수축성 클러스터에서 cTnT 및 sMHC 발현패턴을 나타내는 도이다.
도 2는 혈청이 없는 N2-보충된 배지를 이용한 CM 정제를 나타내는 도이다. 10% 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 배지에서 배양된 수축성의 클러스터로부터 분리된 세포(A) 또는 혈청이 없는 N2-보충된 배지에서 배양된 수축성의 클러스터로부터 분리된 세포(D)를 나타낸다. 각각의 조건에서 발현된 CM 마커(B 및 C, E 및 F), 혈청이 있을 때와 없을 때 마커의 발현을 측정한 결과(G)를 나타내는 도이다.
도 3은 고밀도 배양시스템에서 고정제된 CM의 증식 잠재력을 나타내는 도이다. 고밀도 배양시스템내 단일(A, 흰색 화살표) 및 응집된 CM(A, 검은색 화살표), 응집된 CM에서의 CM 마커의 발현을 나타낸다(B 및 C). 단일 및 응집된 CM에서 Ki67의 발현패턴(D-F, 흰색 화살표) 및 Ki67발현된 CM의 측정을 통한 증식 측정을 나타낸다(G).
도 4는 3차원 배양시스템으로 증가된 증식률 및 성숙한 hESCs-CM의 동기화된 수축(synchronization)을 나타내는 도이다. 부유배양에서 단일 수축성 CM(A) 및 집합된 CM로부터 CBs(B)의 형성을 나타낸다. CB에서의 cTnT의 발현 패턴(C 및 D)을 나타낸다. 2차원 및 3차원 배양시스템에서 증식률을 측정한 결과를 나타낸다. 동기화된 수축성 CBs의 후-플레이팅(F)과 CM 마커의 발현패턴(G-I)을 나타낸다. 수축성 hEBs유도 시스템에 기초한 CM 분화정도의 측정을 나타낸다(J).

이하, 실시예를 통하여 본 발명은 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: hESCs 배양, hEBs 형성 및 수축성 hEBs 의 분화

미분화된 hESCs (CHA15-hESCs and H9-hESCs lines)를 체세포분열-비활성 영양공급세포(MEF)상에서 1Mm L-글루타민(Gibco), 1% 비필수적인 아미노산(Gibco), 100 mM 베타-머캅토에탄올(Gibco), 및 4 ng/mL bFGF (Invitrogen, Grand Island, NY)를 포함하는 기본 hES 배지 구성성분과 20%(v/v) 혈청 대체물(Gibco)을 보충한 DMEM/F12 (50:50%; Gibco BRL, Gaithersburg, MD)배지로 배양했다. 상기 배지는 24시간 마다 갈아주었고, hESCs는 절단 피펫으로 매 5-7일마다 새로운 공급자 세포위로 옮겨주었다. hEBs 형성을 위해, hESCs를 디스파제(Gibco)로 공급자 세포로부터 분리하였고, 초저부착성 플레이트로 옮겨주었다. 그 후 bFGF-제거 hESCs 배양 배지에서 2일 동안 부유배양시켰다. 그 다음에 수축성의 hEBs로 hESCs를 분화시키기 위해서, 배지는 15 내지 20일 동안 20% FBS를 보충한 DMEM 배지로 교체하였다.

실시예 2: 무혈청 조건을 사용한 수축성의 hEBs ( human embryo bodies )로부터 CM(cardiomyocyte)의 분리 및 정제

부유 배양에서 수축성의 hEBs로부터 CM를 분리하기 위해서, 첫 번째로 수축성의 hEBs를 0.1% 젤라틴-코팅 플레이트와 접촉시키고, 그 후 5일 동안 10% FBS (Gibco) 를 보충한 DMEM 배지에서 배양하였다(도 1D). 플레이팅 후에, 수축성의 덩어리 영역 세포는 미세분리를 이용해 분리하였다. 분리한 덩어리로부터 단일 수축성의 세포를 순차적인 5분간의 0.25% 트립신-EDTA 처리에 의해서 수득하였다. 0.1% 젤라틴-코팅 플레이트 상에 재플레이팅 하고, 상기 분리된 단일 세포를 2% FBS (EB2 배지)를 포함하는 DMEM에서 배양하였다(도1G). 무혈청 조건하에서 CM를 정제하기 위해, 분리된 단일 세포를 N2-보충된(Gibco) DMEM에서 혈청 없이 배양하였다(도 2D).

실시예 3: 면역세포화학분석

세포를 20분간 4% 파라포름알데하이드로 고정하였고 0.1% Triton X-100 포스페이트-버퍼 살린(PBS, Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO)으로 5분 동안 투과시켰다. 5% 정상 염소 혈청을 가지고 30 분간 처리한 후에, 4℃에서 12시간 동안 심장계 마커인 cTnT 및 sMHC (Millipore, Billerica, MA)와, 내배엽계 마커인 FoxA2 (Abcam Inc., Cambridge, MA) 및 AFP (Abcam)와 같은 계열-특이적 마커를 인식하는 일차 항체와 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 세 차례 세척해주었고, 그 후 로다민 또는 FITC-결합의 이차 항체(Molecular Probes Inc., Eugene, OR)와 함께 1시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세 번 세척한 후에, 염색된 슬라이드를 2.5% 폴리비닐 알코올 및 1,4-디아자비사이클로 (2.2.2) 옥탄 및 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)(Sigma)을 포함하는 글리세릴-기반의 고정 용액으로 고정시켰다. 모든 이미지를 LSM 510 META 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)으로 분석하였다.

실험예 1: 수축성 hEBs 에서 CM 특이적 마커의 발현 양상

hEBs 형태의 미분화된 hESCs로 부터 수축성의 hEBs을 얻기 위하여, 미분화된 hESCs를 15일 동안 20% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 초처부착배양디쉬(ultra-low attachment culture dish)에서 부유 배양(suspension-culture)하였다.

그 결과, 전체 배양된 hESCs 중 15%(10개)가 수축성의 hEBs를 포함하였다(도 1A). 수축성의 hEBs의 CM 특성을 분석하기 위하여, 심근세포(cardiomyocyte)에 특이적인 cTnT 항체로 면역염색 하였다. 수축성의 hEBs중에서 많은 세포가 cTnT 항체로 강하게 염색됨을 확인할 수 있었다(도 1B, 흰색 화살표). 이러한 결과는 응축된 hEBs가 다른 세포 계열뿐 아니라 CM을 포함하는 것을 나타낸다 (도 1C).

실험예 2: 부착된 수축성의 hEBs 의 CM 특성 분석

수축성 hEBs로부터 정제된 CM을 분리하기 위하여, 먼저, 면역세포화학을 사용하여 젤라틴이 코팅된 플레이트에 부착된 수축성 hEBs의 CM 특성을 조사하였다. 부착된, 수축성 hEBs 집단에서 연속적으로 수축하는 세포가 발견되었다(도 1D, 흰색 화살표). CM 특이적인 마커인 cTnT와 sMHC가 응축된 집단 부분에서 뚜렷하게 발현되었다. 그러나, 응축집단에서 파생된 부분은 CM 특이적인 마커들이 발현되지 않았다(도 1E 및 1F).

실험예 3: 미세-분리( micro - dissection )를 사용한 수축성 집단의 분리 및 단세포 수준에서 CM 특성 분석

수축성 CM 분리체를 분리하기 위하여, 수축성 집단 부분을 미세-분리를 사용하여 나누고, 단독의 세포들로 만들기 위하여 0.25% 트립신-EDTA로 용해시켰다. 그리고, 상기 단독의 세포들을 젤라틴이 코팅된 플레이트에 옮겼다. 대략, 절반의 세포들은 연속적으로 수축되었으나, 나머지 세포들은 수축되지 않았다(도 1G), 이는 다른 계열의 세포들은 CM과 함께 존재함을 암시한다. 상기의 가설을 증명하기 위하여, CM 특이적인 마커와 삼배엽 특이적인 마커를 사용하여 면역세포화학을 수행하였다. 수축성 세포들은 CM-특이적인 마커인 cTnT 과 sMHC 양성 염색됨을 보였다. 이와 반대로, 다른 세포들은 내배엽 계통의 마커인 FOXA2와 AFP를 발현하였다(도 1H 및 1I). 중배엽 마커인 Brachyury 와 뉴런(신경세포) 마커인 TuJ1의 발현은 검출되지 않았다. 미세-분리 및 효소 처리를 통해 CM 특이적인 마커들을 발현하는 수축성 세포들을 배양하고 분리하였으나, 정제된 CM의 양은 낮았으며, 다른 계통에 특이적인 세포들은 분리된 세포중에 존재하였다.

실험예 4: 무혈청 배양 조건에서 매우 정제된 수축성 CM 의 분리

미세-분리 및 효소 처리를 통해 분리된 세포들로부터 오로지 CM만을 정제하기 위하여, 먼저, CM을 다른 세포 계열의 성장을 방해하는 무혈청 배양 조건에서 배양할 수 있는지 시험하였다.

그 결과, 혈청의 존재하에서는 절반 이상의 세포들이 수축되지 않으며, cTnT 또는 sMHC를 발현하지 않았다(도 2A 내지 2C). 이와 반대로, 무혈청 조건에서는 대다수의 세포들이 수축되고, cTnT 및 sMHC를 발현하였다(도 2D 내지 2F). 이러한 현상을 수량적으로 보이기 위하여, cTnT 및 sMHC을 발현하는 세포들의 수를 세고, DAPI(DAPI-expressing nuclei) 발현 핵의 전체 수와 비교하였다. 혈청 존재하에서 50% 미만이었으나, 무혈청 조건에서는 90% 이상의 세포들이 CM이었다. 이러한 결과는 무혈청 배양 기술이 다른 유형의 세포에서는 그렇지 않으나 CM을 배양 및 정제하는데 유리함을 나타낸다.

실험예 5: 세포-세포 상호작용을 통한 CM 의 향상된 증식 능력 분석

hESCs 유래 CM의 증식능력에 있어 CM 세포 밀도의 영향을 조사하기 위하여, 무혈청 조건의 배지에 저농도(1X10⁴ cells / ㎠) 또는 고농도 (5X10⁴ cells / ㎠)의 CM 세포를 접종하였다. 저밀도 조건에서, CM은 연속적으로 수축된 하나의 세포들로서 남아있었으나(도 2D), 고밀도 조건에서는 단독의 세포들(흰색 화살표) 또는 응집된(aggregated) 형태의 세포(검은색 화살표)가 나타났다(도 3A). 단독의 CM 및 합쳐진 CM은 CM 마커인 cTnT 및 sMHC를 연속적으로 발현하였다(도 3B 및 3C). 고밀도 조건에서의 이러한 CM의 응집은 이미 일어난 CM 이동(migration) 또는 CM 증식의 결과 때문일 것으로 생각된다. 상기의 가설을 증명하기 위하여, 세포 증식 특이적인 마커인 Ki67를 사용하여 CM의 증식 능력을 검사하였다. 세포-세포 접촉이 없는 단독의 CM은 Ki67를 발현시키지 않는다(도 3D). 반면, Ki67를 발현하는 세포들의 대다수는 합쳐진 CM에서 sMHC를 함께 발현하고 있음이 확인되었다(도 3E 및 3F, 흰색 화살표). 정량적인 분석을 보면, Ki67를 발현하는 세포들의 퍼센트 비율은 단독의 CM에서는 10% 미만이고, 합쳐진 CM에서는 50%를 초과하는 것으로 나타났다(도 3G). 결론적으로, hESCs 유래 CM의 높은 수율은 CM 증식 능력을 촉진시키기 위한 세포-세포 사이의 상호작용이 필요하다는 것을 알 수 있다.

실험예 6: 부유 배양 시스템( suspension culture system )에서 hESCs - CM 의 효과적인 증식 및 동기화

무혈청 배지에서 CM의 수를 모듈화하고, 초-저 부착 배양디쉬(ultra-low attachment culture dishes)에서 수축성의 CM 응집체(CBs)를 형성시키기 위하여 hanging drop system (3D)을 사용하여 세포를 배양하였다 (CBs: 0.5X10⁴ cells / 20㎕, 도 4A). 강력한 cTnT를 발현하는 수축성의 CBs의 다양한 크기가 관찰되었다(도 4B 내지 4D). CM 증식 및 분화에 대하여 2D와 3D 시스템에서 세포-세포 사이의 상호작용을 비교하였다. 대조군으로서 같은 수와 동일한 밀도의 CM을 저 2차원 배양 시스템(low 2D culture system, 1X10⁴ cells)에서 7일간 배양시키고, 같은 수와 동일한 밀도의 CM(5X10⁴ cells)을 2차원과 3차원 시스템에서 7일간 배양하였다. 고농도의 세포가 배양된 2차원 및 3차원 시스템에서 hESCs-CM의 수가 약 1-2배 증가하였다. 대조군인 2차원 배양 시스템의 저농도로 배양된 세포와 비교하면 약 1.5배 증가하였으며(도 4B), 이것은 3차원 시스템이 hESCs-CM 증식에 더 효과가 있음을 나타내는 결과이다. CB 형태(CB formation)를 사용하는 CM의 증식능력은 시간에 따라 점진적으로 감소하였고, 새로운 CM 분열은 재 플레이팅후에는 관찰되지 않았다(도 4F). 그러나, 관찰된 hESCs-CM 수축은 유지되었다. 중요하게도, 재 플에이트된 CM의 동기화된 수축을 관찰하였으며, 이는 CM가 시스템상에서 gap junction으로 연결되어 있음을 암시한다. 동기화된 CM는 cTnT 과 sMHC 발현의 육종 구조(sarcoma structure)를 보였으며, 이는 성숙한 CM를 나타낸다(도 4G-4I). 이러한 결과에 근거하여, 미분화된 hESCs로부터 고 정제된 분화된 CM의 산출양을 수량화하였다. 또한, hEBs형성 전에 미분화된 hESCs의 수를 측정하고, 도 4F와 같이 성숙한 CM의 수량을 세어보았다. 본 발명의 시스템에서는 미분화된 hESCs의 85% 이상이 성숙한 CM가 되었다(도 4J).

이러한 결과는, 본 발명의 방법은 대량의 고 정제된 CM를 얻을 수 있는 방법임을 시사하는 것이다.

Claims

(a) 인간 배아줄기세포의 배아체(embryoid body)를 무혈청 배지에서 배양하는 단계 및,
(b) 상기 (a) 단계에서 생존한 세포를 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 밀도 배양하는 단계를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화된 심근세포를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 심근세포는 cTnT, 및 sMHC를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배아체는 수축성의 배아체인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 DMEM, N2 및 항생제를 포함하는 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 세포는 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 밀도로 배양 후 응집되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 2X10⁴ 세포/㎠ 내지 7X10⁴ 세포/㎠의 세포 밀도로 3차원 부유배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되며, 하기의 특징을 가지는 심근세포:
(ⅰ) 심근세포 특이적인 cTnT, 및 sMHC 분화마커를 발현함;
(ⅱ) 낭포-유사 (cyst-like), 혼합된 모양 (mixed shape), 부유체 (floating) 또는 근육-유사 (muscle-like) 형태를 가짐; 및
(ⅲ) 박동하는 세포임.
DMEM, N2 및 항생제를 포함하는 인간 배아줄기세포의 배아체로부터 심근세포 분리용 무혈청 배지 조성물.