KR20110042426A

KR20110042426A - 쿠어세틴을 이용한 미분화 배아줄기세포의 선택적 세포사멸 방법

Info

Publication number: KR20110042426A
Application number: KR1020090099094A
Authority: KR
Inventors: 차혁진; 이미옥
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2011-04-27

Abstract

본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 분화용 배지 중에서 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 분화가 유도된 배양액에 쿠어세틴(quercetin)을 가하여 배양을 수행함으로써 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킨 후, 분화된 세포(differentiated cells)를 분리하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 분화방법을 제공한다. 본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 분화방법은 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 특정 세포로 분화시킨 후, 쿠어세틴을 함유하는 분화용 배지 중에서 배양함으로써, 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 분화방법은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시켜 인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포만을 순수하게 얻을 수 있으므로, 세포 치료제로의 적용시 종양 형성 가능성을 배제할 수 있다.

인간 배아줄기세포, 분화, 쿠어세틴, 선택적 세포사멸, 테라토마 형성 방지

Description

쿠어세틴을 이용한 미분화 배아줄기세포의 선택적 세포사멸 방법{Process for selective cell death of undifferentiated human embryonic stem cells using quercetin}

본 발명은 쿠어세틴을 이용한 미분화 배아줄기세포의 선택적 세포사멸 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시켜 인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포만을 순수하게 얻을 수 있는 인간 배아줄기세포의 분화방법에 관한 것이다.

인간 배아줄기세포는 인간 몸을 구성하는 삼배엽성 (내배엽, 중배엽, 외배엽)으로 분화될 수 있는 전분화능(Pluripotency)을 가지며 끊임없이 분열을 거듭하는 특성(self-renewal)을 가지는 세포로서, 재생의학(regenerative medicine)에 필요한 세포들, 예를 들어, 신경세포, 간세포, 혈액세포 등으로의 분화와 관련하여 다양한 연구가 진행되고 있다.

인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포를 얻기 위하여는, 인간 배아줄기세포를 특정 세포로 분화를 유도하고, 분화된 세포의 특정 표지 인자(surface makers)의 항체를 이용하여 인지된 세포를 유세포 분리기(Fluorescent Activated Cells Sorter : FACS)를 통해 분리하여 분화된 세포만을 얻거나(Fukuda, H, et al., "Fluorescence-Activated Cell Sorting-Based Purification of Embryonic Stem Cell-Derived Neural Precursors Averts Tumor Formation After Transplantation" Stem Cells 24.3 (2006): 763-71), 혹은 항체를 이용하여 표지시킨 후 자성을 이용한 분리법(Magnetic Cell sorting : MACS)이 사용되고 있다(David, R, et al., "Magnetic Cell Sorting Purification of Differentiated Embryonic Stem Cells Stably Expressing Truncated Human Cd4 as Surface Marker" Stem Cells 23.4 (2005): 477-82). 자성을 이용한 분리법(MACS)은 유세포 분리기를 이용할 경우 시행되는 레이져에 대한 세포의 노출의 위험을 제거할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

그러나, FACS 및 MACS 방법 모두 미분화된 배아줄기세포의 혼재 가능성을 배제할 수 없기 때문에, 100%의 순도로 분화된 세포만을 분리하는 것은 기술적인 한계가 있다. 특히, 배아줄기세포에서 유래한 분화세포에서 미분화세포가 혼재되어 있을 가능성이 존재하여, 배아줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 있어서 종양형성 위험에 대한 문제점이 끊임없이 대두되고 있는 실정이다. 따라서, 분화된 세포에는 영향이 없이 테라토마의 위험성이 내재된 미분화 세포를 선택적으로 제거하는 기술의 개발이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명자들은 인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포를 순수하게 얻을 수 있는 방법, 특히 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 인간 배아줄기세포의 오염 가능성을 해결하여 분화된 세포만을 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도, 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 분화를 유도하고 쿠어세틴(quercetin)을 최종 배지에 처리하였을 때, 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 미분화된 인간 배아줄기세포만이 선택적으로 사멸된다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 쿠어세틴을 사용하여 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킴으로써 인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포만을 순수하게 얻는, 인간 배아줄기세포의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 분화용 배지 중에서 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 분화가 유도된 배양액에 쿠어세틴을 가하여 배양을 수행함으로써 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킨 후, 분화된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 분화방법이 제공된다.

본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 쿠어세틴의 농도는 25μM 내지 200μM, 바람직하게는 약 50μM인 것이 바람직하며, 단계(b)의 상기 배양은 8시간 내지 24 시간, 바람직하게는 약 16 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해, 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 특정 세포로 분화시킨 후, 쿠어세틴을 함유하는 분화용 배지 중에서 배양함으로써, 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 즉 분화된 세포의 생존능은 그대로 유지시키면서 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 분화방법은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시켜 인간 배아줄기세포로부터 분화된 세포만을 순수하게 얻을 수 있으므로, 세포 치료제로의 적용시 종양 형성 가능성을 배제할 수 있다.

본 발명은 (a) 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 분화용 배지 중에서 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 분화가 유도된 배양액에 쿠어세틴(quercetin)을 가하여 배양을 수행함으로써 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킨 후, 분화된 세포(differentiated cells)를 분리하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 분화방법을 제공한다.

본 발명의 분화방법은 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 분화용 배지 중에서 배양하여 분화를 유도하는 단계[즉, 단계(a)]를 포함하며, 상기 단계는 공지의 분화 유도 방법에 따라 수행할 수 있다.

상기 "인간 배아 줄기세포"는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전 능 세포를 말한다. 상기 인간 배아 줄기세포는 예를 들면, H-9 hESC (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7) 등을 사용할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 인간 배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있으며, 적절한 배지, 예를 들어 마이토마이신-C를 처리하여 증식을 억제시킨 생쥐 배아 섬유아세포(MEF)를 지지세포로서 포함하고, 소태아혈청(FBS), β-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 중에서 배양한 다음, 다시 혈청대체물, β-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산 및 bFGF2로 보충된 Knockout-DMEM 중에서 계대 배양할 수 있다.

또한, 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체(embryoid body)는 배아 줄기 세포가 자연 분화되어 형성되는 세포 덩어리로, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배아 배엽층(three germ layer)으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포 집합체를 의미하며, 얻어진 배상체는 적당한 배지 상태에서 유지될 수 있다. 인간 배아줄기세포로부터 배상체를 형성하는 방법은 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280 에 개시된 방법에 따라 인간 배아 줄기세포를 혈청(또는 혈청 대체물), L-글루타민, 비필수 아미노산, 및 β-머캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지 중에서 배양 함으로써, 배상체를 형성할 수 있다. 또한, 인간 배아줄기세포의 콜로니를 공배양된 주변 지지세포(MEF)로부터 분리하여, bFGF2가 첨가되지 않은 배양액, 예를 들어 혈청대체물, β-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산 및 bFGF2로 보충된 Knockout-DMEM 중에서 부유 배양함으로써 배상체를 형성할 수 있다.

상기 분화용 배지는 얻고자 하는 세포의 종류에 따라 다양한 조성의 기질 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, Cho SW, Moon SH, Lee SH, Kang SW, Kim J, Lim JM, Kim HS, Kim BS, Chung HM. "Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia". Circulation (2007) 20;116(21):2409-19에 개시된 바와 같이 인간 배아줄기세포 유래의 배상체를 내피 세포(Endothelial cells)로 분화시키는 경우, 인간 배상체를 적절한 배양용 배지(예를 들어, 10% 소태아혈청 (FBS), 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12로 이루어진 배지)를 가하고, 약 9일간의 부유 배양을 통해 얻을 수 있다. 이와 같이 얻은 배상체는 예를 들어 파이펫을 이용하여 물리적인 힘을 가해 인간 배상체의 중심부를 분리하여 얻을 수 있으며, 이렇게 분리한 인간 배상체의 중심부는 상기 줄기세포 분화용 배지(예를 들어 EGM-2) 중에서 배양될 수 있다.

본 발명이 분화방법은 상기 분화가 유도된 배양액에 쿠어세틴을 가하여 배양을 수행함으로써 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킨 후, 분화된 세포를 분리하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.

상기 쿠어세틴(quercetin)은 플라본(flavon) 유도체로서, 화학명이 2-(3,4- 디히드록시페닐)-3,5,7-트리히드록시-4H-1-벤조피란-4-온이며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

상기 배양액 중 쿠어세틴의 농도는 25μM 내지 200μM, 바람직하게는 약 50μM인 것이 바람직하며, 상기 배양 즉 쿠어세틴을 함유하는 배양액 중에서의 배양은 8시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 16 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 쿠어세틴을 함유하는 분화용 배지 중에서 배양함으로써, 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 즉 분화된 세포의 생존능은 그대로 유지시키면서 미분화된 인간 배아줄기세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 상기와 같이 배양을 통하여 얻어진 분화된 세포는 통상의 방법으로 세포를 분리함으로써 분리할 수 있으며, 예를 들어, 쿠어세틴에 의해 세포사멸이 유도된 미분화 배아줄기세포는 배양접시에서 떨어지기 때문에, 배양액만을 분리하고, 배양접시를 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2회에서 3회 세척하여, 세포사멸 유도된 미분화 배아줄기세포를 배양접시에서 분리해낼 수 있다. 배양접시에 남아 있는 분화된 줄기세포는 트립신 EDTA (0.05%) 등의 효소를 처리하여 분리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예.

1. 재료 및 시험방법

(1) 세포 배양 및 재료

인간 배아줄기세포 H-9 (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7)는 WiCell에서 공여되었고, 공지의 방법(Kim, J, et al., "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated From Human Embryonic Stem Cells" Stem Cells Dev 16.2 (2007): 269-80)에 따라 배양하였다. 즉, 젤라틴이 코팅된 배양접시에 마이토마이신-C를 2시간 선처리하여 증식을 억제시킨 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF)를 배양용 배지(10% 소태아혈청 (FBS), 0.1mM β-머캅토에탄올(BME), 1% 비-필수 아미노산(non-essential amino acids:NEA)이 첨가된 90% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지로 24시간 배양하였다. 인산완충 식염수액 (phosphate buffered saline: PBS) 으로 배양접시를 2회 세척하고, 배양접시에 20% 혈청대체물 (Serum replacement:SR), 0.1mM BME, 1% NEA 및 4ng/ml의 bFGF2로 보충된 80% Knockout-DMEM으로 이루어진 배양액으로 교체하여 인간 배아줄기세포를 약 7일간 배양하였다. 배양액중에 형성된 인간배아줄기세포의 콜로니를 미세 유리봉을 사용하여 공배양된 주변 지지세포(MEF)로부터 분리하여, bFGF2첨가되지 않은 상기의 배양액으로 이루어진 배양액에 약 10일동안 부유 배양하여 배상체를 형성하였다.

Oct-4 항체(sc-9081), actin 항체 (sc-8432), Parp (sc-25780), 및 mcm7 (sc-46687)는 Santa-cruz biotechnology 에서 구입하였고, caspase 9 (#9502), Active caspase-3(#9661) 항체는 cell signaling에서 구입하였다. Annexin V 표지를 위해 Annexin V apoptosis kit (559763)는 BD phamigen^TM에서 구입하였다. 쿠어세틴(quercetin)(Q4951)은 Sigma Aldrich에서 구입하였다.

(2) 인간 배아줄기세포의 쿠어세틴 처리

인간 배아줄기세포(H9)를 자발적 분화 유도 배양액 (bFGF2 를 제거한 10% 소태아혈청 (FBS), 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12로 이루어진 배지)에 7일간 부유 배양하여 인간 배상체를 얻고, 얻어진 배상체를 다시 동 배양액에 배양접시에 부착시켜 7일간 분화시켜 자발적인 분화를 유도하였다. 분화가 종료된 후에 50μM의 쿠어세틴을 16시간 또는 24시간 동안 처리하여 미분화된 인간배아 줄기세포의 선택적 세포사멸을 유도하였다. 세포사멸이 유도된 미분화 인간배아줄기세포는 배양액을 모아 분리하고, 배양접시를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 3회 세척하여 세포사멸이 진행중인 미분화 인간배아줄기세포를 배양접시에서 분리하여 제거하였다. 배양접시에 남아 있는 분화된 줄기세포는 트립신 EDTA (0.05%)를 처리하여 분리하였다.

2. 실험결과

(1) 쿠어세틴에 의한 미분화 인간 배아줄기세포의 선택적인 세포사멸

인간 배아줄기세포 (H9) 또는 인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast: hDF)를 다양한 농도의 쿠어세틴이 포함된 배지에 16시간 동안 처리하였다. 배양접시에 붙어있는 인간배아줄기세포와 죽어서 떨어진 세포를 모두 함께 수확하여 면역 블랏팅을 수행하였다. 쿠어세틴을 처리한 미분화 인간배아줄기세포(hES)에서 세포사멸이 이루어지는 반면, 인간 피부 섬유아세포에서는 세포사멸이 발견되지 않았다(도 1 참조).

동일한 방법으로 다양한 농도의 쿠어세틴을 처리한 미분화 인간배아줄기세포와 인간 피부 섬유아세포에서, 세포사멸을 야기하는 효소인 케스페아제-3(caspase 3)의 활성을 측정하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이 인간배아줄기세포에서 농도 의존적으로 케스페아제-3의 활성이 증가하였다.

또한, Annexin V를 통해 세포사멸을 겪지 않은 생존된 세포의 비율을 측정한 결과, 미분화 인간배아줄기세포의 경우 쿠어세틴에 의해 농도 의존적으로 50μM까지 90%이상의 세포사멸이 유도되는 반면. 인간 피부 섬유아세포의 경우 최고 200μM에서까지 생존세포의 비율이 90% 이상 유지되었다(도 3 참조).

또한, 동일한 방법으로 처리한 두 가지 세포를 세포사멸 표지 단백질 항체를 사용하여 면역 블랏팅을 통해 관찰한 결과, 세포사멸 표지 단백질인 Parp-1 (상위 패널)과 caspase-9의 절단된 형태 (T:truncated)의 분율이 미분화 인간배아줄기세 포에 쿠어세틴 처리시 농도 의존적으로 증가되었다(도 4 참조). 또한, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, Oct4의 발현은 인간배아줄기세포가 미분화상태를 유지하고 있음을 나타낸다. β-액틴은 사용된 전체 단백질의 양을 나타낸다.

(2) 쿠어세틴 처리로 인간배아줄기세포에서 분화된 세포와 미분화 인간배아줄기세포와의 세포사멸 반응

상기의 방법으로 인간배아줄기세포를 자발적 분화를 유도하고 분화 종료 후, 50uM의 쿠어세틴을 배양액에 가하고, 16 시간 동안 배양하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 배상체를 통해 7일간 자발적 분화를 유도하였을 경우 미분화 세포와 분화세포가 혼재되어 있으나(Cont가하고쿠어세틴(QC)를 16시간 처리하였을 경우에는 분화된 세포의 특이적인 형태를 갖는 세포만이 얻어졌다.

동일한 방법으로 분화한 인간배아줄기세포에 쿠어세틴을 처리하고 배양접시에 붙어있는(A: 생존하고 있는) 세포와 배양접시에서 떨어진 (F: 세포사멸을 겪은) 세포를 따로 분리하여 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과, 세포사멸의 표지 단백질인 Parp-1의 절단 (T)이 쿠어세틴을 처리한 조건중 배양접시에서 떨어진 (F) 조건에서 분명하게 관찰되었다(도 6 참조). 또한, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 배양접시에서 떨어진 조건에서, 즉 세포사멸 표지 단백질인 Parp-1의 절단이 일어난 조건에서 (상위패널) 미분화 인간배아줄기세포의 표지 단백질인 Oct-4가 관찰되었으며, 이는 쿠어세틴을 처리하여 Oct-4로 표지된 즉 미분화 인간배아줄기세포만에서 세포사멸이 일어난 것을 의미한다(중간 패널). 뿐만아니라, 쿠어세틴을 처리하고 생존 한 조건 (A)에서 Parp-1의 절단이 관찰되지 않는 것은 인간배아줄기세포에서 분화된 세포 즉 Oct-4 음성인 세포는 쿠어세틴에 의해 세포사멸이 유도되지 않음을 나타낸다. Mcm7은 사용된 전체 단백질의 양을 나타낸다 (아랫 패널).

인간배아줄기세포의 미분화성을 표지하는 알칼라인 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase)의 활성을 Alkaline 탈인산화효소 활성 염색법을 통해 측정하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 미분화 배아줄기세포에서 분명한 붉은 색의 알칼라인 탈인산화효소 활성 염색이 나타났다 (상위 패널). 자발적 분화를 유도 후 분화가 효과적으로 이루어지지 않은 배상체의 중심부분에 미분화 배아줄기세포가 위치하며 붉은 색의 알칼라인 탈인산화효소 활성 염색으로 확인할 수 있다 (중간 패널). 쿠어세틴을 처리하였을 경우에는 중간부분의 미분화 배아줄기세포가 세포사멸을 통해 상실되었는 것이 관찰되었다(도7, 하위 패널).

또한, 퀴어세틴 처리시 세포사멸시에 활성화된 활성화형태의 caspase-3 (active caspase-3)이 Oct-4가 발현되는 세포와 공염색되는 반면에 Oct-4에 음성인 세포는 활성화형태의 caspase-3과 공염색되지 않았으며(도 8), 이는 퀴어세틴에 의한 세포사멸은 Oct-4가 발현되는 미분화세포에서만 이루어지는 것을 나타낸다. 따라서, 퀴어세틴에 의해 미분화된 인간 배아줄기세포에서 선택적인 세포 사멸로 선택적인 제거가 이루어졌음을 확인할 수 있다.

도 1은 인간 배아줄기세포와 인간 피부 섬유아세포에 다양한 농도의 쿠어세틴 함유한 배지로 16시간 처리한 이후의 세포의 변화를 관찰한 결과이다.

도 2는 도 1에서와 같은 방법으로 처리한 세포의 단백질 추출물의 케스페아제-3의 활성을 측정한 그래프이다.

도 3은 Annexin V를 통해 세포사멸을 측정하고, 세포사멸을 이루지 않은 세포의 분율을 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 다양한 농도의 쿠어세틴을 처리하고 얻은 세포의 단백질 추출물을 상기의 항체를 이용하여 면역 블랏팅을 수행한 결과이다.

도 5는 인간 배아줄기세포를 배상체를 통한 분화조건으로 분화를 유도하고 50uM의 쿠어세틴를 16시간 처리하고 처리하지 않은 세포와의 세포의 형태를 비교한 결과를 나타낸다.

도 6은 도 5에서와 동일한 방법으로 배상체를 통해 분화시키고 50uM의 쿠어세틴을 처리한 단백질 추출물과 처리하지 않은 세포에서 얻은 단백질 추출물에서의 상기 항체로 면역 블랏팅을 한 결과이다.

도 7은 인간 배아줄기세포의 분화 전, 분화 후 그리고, 분화 후 쿠어세틴을 처리한 후 알칼라인 탈인산화 효소 활성을 염색을 통해 나타낸 결과이다.

도 8은 인간 배아줄기세포의 자발적 분화후 쿠어세틴을 처리하고, 남은 세포에서 상기의 면역항체를 통해 형광 면역 염색법을 수행한 결과이다.

Claims

(a) 인간 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 분화용 배지 중에서 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 분화가 유도된 배양액에 쿠어세틴(quercetin)을 가하여 배양을 수행함으로써 미분화된 인간 배아줄기세포를 선택적으로 사멸시킨 후, 분화된 세포(differentiated cells)를 분리하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 분화방법.
제1항에 있어서, 상기 쿠어세틴의 농도가 25μM 내지 200μM인 것을 특징으로 하는 분화방법.
제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 배양이 8시간 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.