WO2014058274A1

WO2014058274A1 - 미분화 인간 유도만능줄기세포의 선택적 세포사멸 유도를 통한 테라토마 형성 억제 방법

Info

Publication number: WO2014058274A1
Application number: PCT/KR2013/009111
Authority: WO
Inventors: 차혁진
Original assignee: 서강대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-04-17
Also published as: KR20140047545A; KR101590603B1; US9657273B2; US20160002604A1

Abstract

본 발명은 (a) 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포 (differentiated celIs)를 포함하는 세포시료를 준비 (preparation)하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 다음 화학식 1 의 '쿠어세틴 (Quercetin) 또는 다음 화학식 2 의 YM-155 을 처리하여 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계를 포함하며, 미분화 유도만능줄기세포 ( induced pluripotent stem cel l : iPS)가 제거된， 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면， 본 발명은 유도만능줄기세포로부터 특정 분화세포로 분화시킨 후, 쿠어세틴 또는 YM-155 을 포함하는 분화용 배지에서 배양함으로써， 미분화된 유도만능줄기세포만을 효과적으로 선택적 사멸시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 분화방법은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 유도만능줄기세포만을 선택적 사멸하여 분화된 분화세포에는 전혀 영향을 미치지 않는다. 즉, 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시키므로， 임상에 있어 세포 치료제로의 적용 시 종양 형성 가능성을 배제함으로써 안전성 확보가 기대된다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

미분화 인간 유도만능줄기세포의 선택적 세포사멸 유도를 통한 테라토마 형성 억제 방법

【기술 분야】

본 발명은 대한민국 교육과학기술부의 지원 하에서 과제번호 2011- 0030832에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단， 연구사업명은 "기초연구사업-선도연구센터육성사업 (이공학분야) -유전체 불안정성 제어연구센터" ， 연구과제명은 "줄기세포 유전체 안정성 유지 신호 연구" ， 주관기관은 서강대학교， 연구기간은 2011. 09. 07 ~ 2018. 08. 31 이다.

본 특허출원은 2012년 10월 12일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 톡허출원 제 10-2012-0113636 호에 대하여 우선권을 추장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조호서 삽입된다.

본 발명은 미분화 인간 유도만능줄기세포의 선택적 세포사멸 유도를 통한 테라토마 형성 억제법에 관한 것이다.

【배경 기술】

인간 유도만능줄기세포는， 인간 몸을 구성하는 삼배엽성 (내배엽， 중배엽, 외배엽)으로 분화될 수 있는 전분화능 (Pluripoteftcy)을 가지며 끊임없이 분열을 거듭하는 특성 (self renewal)을 가지는 세포로서， 재생의학 (regenerative medicine)에 필요한 세포될:, 예흩 를어， 신경세 i, 간세포， 혈액세포 등으로의 분화와 관련하여 다양한 연구가 진행되고 있다. 인간 유도만능 줄기세포로부터 분화된 세포를 얻기 위해서는, 인간 유도만능 줄기세포를 특정 세포로 분화를 유도하고， 분화된 세포의 특정 표지 인자 (surf ace makers)의 항체를 이용하여 인지된 세포를 유세포 분리기 (Fluorescent Activated Cells Sorter ： FACS)를 통해 분리하여 분화된 세포만을 얻거나 (Fukuda, H 등, "Fluorescence-Activated Cell Sort ing-Based Purification of Embryonic Stem Cel 1 -Derived Neural Precursors Averts Tumor Format ion After Transplantation Stem Cells(2006)(24.3: 763-771)), 또는 항체를 이용하여 표지시킨 후 자성을 이용한 분리법 (Magnetic Cell sorting: MACS)이 사용되고 있다 (David, R 등_: "Magnetic Cell Sorting Purification of Differentiated Embryonic Stem Cells Stably Expressing Truncated Human Cd4 as Surface Marker" Stem Cells(2005)(23.4: 77-82)). 자성을 이용한 분리법 (MACS)은 유세포 분리기를 이용할 경우 시행되는 레이져에 대한 세포의 노출의 위험을 제거할 수 있다는 장점을 가지고 있다ᅳ

그러나, FACS 및 MACS 방법 모두 미분화된 유도만능 줄기세포의 흔재 가능성을 배제할 수 없기 때문에， 100%의 순도로 분화된 세포만을 분리하는 것은 기술적인 한계가 있다. 특히, 유도만능 줄기세포에서 유래한 분화세포에서 미분화세포가 흔재되어 있을 가능성이 존재하여， 유도만능 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 있어서 테라토마라는 미분화 만능 줄기세포에서 유래한 종양형성 위험에 대한 문제점이 끊임없이 대두되고 있는 실정이다. 따라서, 분화된 세포에는 영향이 없이, 테라토마의 위험성이 내재된 미분화 세포를 선택적으로 제거하는 기술의 개발이 당 업계에 요구되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참초되 ϋ 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】

본 발명자들은 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 순수하게 얻을 수 있는 방법, 특히 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 유도만능 즐기세포의 종양 형성 가능성을 제거하여 분화된 세포만을 순수하게 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 항-세포사멸 인자인 서바이빈 (Survivin)의 발현을 억제하는 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 YM-155 를 처리하면, 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 미분화 유도만능줄기세포만이 효과적으로 선택적 사멸된다는 것을 확인함으로써， 본 발명을 완성하^,게 되었다. ᅳ

따라서, 본 발명의 목적은 미분화 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된， 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 미분화 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된 세포 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 미분화 유도만능줄기세포의 선택적 사멸용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【과제의 해결 수단】

본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하며， 미분화 유도만능즐기세포 (induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된， 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법을 제공한다:

(a) 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포 (differentiated cells)를 포함하는 세포시료를 준비 (preparation)하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 YM-155 을 처리하여 미분화 유도만능줄기세포♦ 선택적으로 사멸시키는 단계. 본 발명자들은 유도만능줄기세포로부터 분화된 세포를 순수하게 얻을 수 있는 방법， 특히 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화 유도만능 줄기세포의 종양 형성 가능성을 제거하여 분화된 세포만을 순수하게 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 항-세포사멸 인자인 서바이빈 (Sur vin)의 발현을 억제하는 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 YM-155 를 처리하면， 분화된 세포에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 미분화 유도만능줄기세포만이 효과적으로 선택적 사멸된다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 미분화^.유도만능줄기세포 (induced luri potent stem ceil: iPS)가 제거된, 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능즐기세포 및 분화세포 (differentiated eel is)를 포함하는 세포시료 준비 (preparat ion) 본 발명에 따르면, 우선 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화 세포를 포함하는 세포시료를 준비한다ᅳ

상기 세포시료는 다양하게 준비될 수 있다. 예흩 들어, 유도만능줄기세포를 분화시킨 (예컨대, 평활근 세포로 분화) 결과물이 상기 세포시료이다. 유도만능줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 미분화 유도만능줄기세포가 소량 잔존 해 있는 비균질 파풀레이션을 이룬다. 따라서， 분화시킨 결과물을 세포 치료제로 이용하기 위해서는 미분화 유도만능줄기세포의 완전한 제거가 필요하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유도만능즐기세포" 는 비-전분화능 세포 (예를 들면， 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하여 인위적으로 유래된 전분화능 줄기세포이다. 상기 유도만능줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현， 염색체 메틸화, 배가시간 (doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성， 교잡성 및 분화성올 가지는 면에서 전분화능 줄기세포 (예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분화세포" 는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된 세포이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유도만능줄기세포는 인간, 소, 말， 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고， 바람직하게는 인간 유도만능줄기세포이다. 상기 유도만능줄기세포는 분화된 세포를 3 종 또는 4 종의 유전자를 도입시켜 배아줄기세포의 전분화성을 유도한 전능 세포를 의미하며， 이러한 유도만능줄기세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 용이하게 구축될 수 있다 ( Takahashi , Yamanaka S (August 2006). "Induction of luri otent stem eel Is from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Ceil 126(4) :663-76) . 예를 들어， 마이토마이신 -C 를 처리하여 증식을 억제시킨 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF)가 지지세포로서 포함되고， 소태아혈청 (FBS), β-머갑토에탄을 및 비 -필수 아미노산이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)과 같은 적절한 배지에서 배양한 후, 혈청대체물, 머캅토에탄을, 비 필수 아미노산 및 bPGF2 로 보충된 KnockoutH EM 에서 계대 배양하여 유도만능 줄기세포를 얻을 수 있다. 알려진 유도만능줄기세포주로서 예컨대, SES-8 (Tae-Hee Lee 등, "Functional Recapitulation of Smooth Muscle Cells Via Induced Pluripotent Stem Cells From Human Aortic Smooth Muscle Cells"^' Circulation Research(2010) (106：120-128)) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 이용되는 유도만능줄기세포는 유래되는 대상에 대하여 자가 (autologous)이거나 또는 타가 (allogenic)일 수 있으나, 바람직하게는 자가이다. 자가 유도만능줄기세포는 객체 자신의 조직으로부터 유도만능즐기세포를 분리 및 배양하여 제조된다.

본 발명의 방법에 있어서, ^'쿠어세틴 또는 YM-155 가 처리되는 세포시료는 유도만능줄기세포를 분화시켜 얻은 어떠한 결과물도 포함한다. 예를 들어， 유도만능줄기세포를 특정 세포로 분화시켜 얻은 세포 파풀레이션 및 유도만능줄기세포로부터 유래된 배상체 (embryoid body)를 분화시켜 얻은 세포 파플레이션 등을 본 발명에서 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배상체 (embryoid body)" 는 배아 줄기 세포가 자연 분화되어 형성되는 세포 덩어리로， 내배엽, 증배엽 및 외배엽의 3가지 배아 배엽층 (three germ layer)으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포 집합체를 의미하며, 얻어진 배상체는 적당한 배지 상태에서 유지될 수 있다. 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성하는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어， Kim J 등， "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryo id Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007 )(16 :269— 280)에 개시된 방법에 따라 유도만능줄기세포를 혈청 (또는 혈청 대체물), L-글루타민, 비필수 아미노산, 및 β- 머캅토에탄을을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양함으로써, 배상체를 형성할 수 있다. 또한， 유도만능줄기세포의 콜로니를 공배양된 추변 지지세포 (MEF)로부터 분리하여， bFGF2 가 첨가되지 않은 배양액, 즉， 혈청대체물， 머캅토에탄을, 비 -필수 아미노산 및 bFGF2 로 보층된 Knockout -DME 중에서 부유 배양함으로써 배상체를 형성할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 얻고자 하는 세포의 종류에 따라 다양한 조성의 기질 세포를 배지에 함유할 수 있으며, 상기 배상체의 분화방법은 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어， Cho SW 등

"Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothel ial-1 ike cell transplant at ion in a mouse model of hindlimb ischemia" Circulation (2007)(20; 116(21) :2409- 19)에 개시된 바와 같이， 유도만능줄기세포 유래의 배상체를 내피 세포 (Endothe a! cells)로 분화시키는 경우, 배상체를 적절한 배양용 배지 (예를 들어, 10% 소태아혈청 (FBS) 및 페니실린—스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12 배지)에서 약 9 일간 부유 배양시킴으로써 얻을 수 있다. 이와 같이 얻은 배상체는 예컨대, 파이펫을 이용하여 물리적인 힘을 가해, 배상체의 중심부를 분리하여 얻을 수 있으며, 이렇게 분리한 인간 배상체의 중심부는 상기 줄기세포 분화용 배지 (예컨대 , EGM-2)에서 배양될 수 있다. 상기와 같은 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단계 (b): 상기 단계 (a)의 결과물에 쿠어세틴 - (Quercetin 또는 M-

155을 처리하여 미분화된 유도만능즐기세포를 선택적으로 사멸사키는 단계 이어， 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 제거하기 위하여, 상기 단계 )의 결과물에 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 YM-155 을 처리한다. 그 결과, 분화세포에는 전혀 영향을 미치지 않아 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지되고, 미분화된 유도만능줄기세포만이 선택적으로 사멸된다. 본 명세서에서 미분화 유도만능줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 "제거 (depletion or removal)" 는 비균질 세포 파 "레이션으로부터 미분화 유도만능줄기세포가 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어， 용어 "제거" 는 본 발명의 방법이 적용된 시료에서 미분화 유도만능즐기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만， 보다 바람직하게는 0.1% 미만, 가장 바람직하게는 실질적으로 없는 것을 의미한다. 상기 용어 "%" 는 세포개수 (ceil count)를 기준으로 한 백분율이다.

본 명세서에서 세포 사멸은 특별하게 다르게 언급되지 않는 한, 아픕토시스를 의미한다. 아픕토시스 (apoptosis)는 다세포에서 일어나는 프로그램화된 세포사멸 (programmed cell death: PCD)이다 (Mbeits, Bruce et al . , (2008). "Chapter 18 Apoptosis: Progra画 ed Cell Death

Eliminates Unwanted Cells". Molecular Biolog of the Cell (5^th ed.). Garland Science, p. 1115). 아폽토시스의 생화학적 현상은 세포의 형태를 변화시키고 사멸을 이끈다. 이러한 변화는 세포막의 기포형성, 세포 수축， 핵 파쇄， 염색체 웅축 및 염색체 DNA 파쇄를 포함한다. 세포괴사와 다르게, 아픕토시스에 의해 생산된 아픕토틱 바디는 세포 밖으로 유출되어 세포를 손상시키기 전에 탐식형 세포 (phagocytic ceils)가 에워싸서 제거하게 된다.

본 발명에서 이용되는 쿠어세틴 (Quercetin)은 항―세포사멸 인자인 서바이빈 (Survivin)의 화학적 억제제이며， 화학명은 2-(3,4ᅳ d i hydr oxypheny 1 ) -3 , 5 , 7- 1 r i hydroxy- H-chr omen^~4-one 으로 하기 화학식 1의 구조를 갖는다:

화학식 1

본 발명에서 이용되는 YM-155 은 항-세포사멸 인자인 서바이빈 (Survivin)의 화학적 억제제이며, 화학명은 4,9— Dihydro-1— (2ᅳ methoxye thyl )—2一 me thyl-4,9-di οχο^~3- (2-pyrazinylmethyl ) -IH-napht ho [2, 3- d]imidazoiiuffl bromide으로， 하기 화학식 2의 구조를 갖는다 :

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 처리되는 쿠어세틴의 농도는 2으100 μΜ 이며， 보다 바람직하게는 3으90 μΜ, 보다 더 바람직하게는 40-80 μΜ, 가장 바람직하게는 50 μΜ이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면ᅳ 상기 YM-155 의 농도는 2-80 nM 이며 , 보다 바람직하게는 5-70 nM, 보다 더 바람직하게는 10-60 nM, 가장 바람직하게는 1으 50 nM이다.

본 발명의 단계 (b)의 배양 기간은 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 5-100 시간， 보다 바람직하게는 약 10-50 시간, 보다 더 바람직하게는 약 15-30 시간, 가장 바람직하게는 약 24 시간이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 미분화 유도만능출기세포가 제거된 세포 조성을을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 상술된 본 발명의 방법에 의해 제조된 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.

상기 본 발명의 방법에 의해 미분화 유도만능줄기세포가 제거된 세포 조성물은 다양한 웅용성을 가지며， 특히 세포 치료제로서 이용될 수 있다. 예를 들어， 미분화 유도만능줄기세포가 제거된, 근세포로 분화된 결과물인 경우에는 근이양증 (muscular dystrophy), 근위축증 (muscular atrophy), 근육염 (Myositis), 다발성 근육염 (polymyositis) , 말초혈관 질환 (peripheral vascular disease) 및 섬유증 (f ibrosis)과 같은 근육 손상 질환, 신경근육계 질환, 근육계 관절염, 퇴행성 근육 질환 및 허혈성 근육 질환 등을 포함하나， 이에 한정되지 않으며， 근육계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다. 또한， 예를 들어， 미분화 유도만능줄기세포가 제거된, 신경세포로 분화된 결과물인 경우에는 뇌졸중 (stroke), 외상성 뇌손상， 뇌성마비, 간질, 알츠하이머병, 다발성경화증， 파킨슨병， 척추 손상 질환 (spinalcord injury disease), 치매, 간성 뇌증 및 저산소증， 탈수초질환， 헌팅톤병, 근위축성 척수측색경화증, 퇴행성 질환 및 허혈성 질환 등을 포함하나， 이에 한정되지 않으며， 신경계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 YM-155 를 포함하는 미분화 유도만능줄기세포의 선택적 사멸용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 본 발명의 방법에 이용하는 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 상기 YM-155 를 포함하기 때분에, 이 둘 사아에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하예 그 기재를 생략한다.

【발명의 효과; 1

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 유도만능줄기세포로부터 특정 분화세포로 분화시킨 후， 쿠어세틴 또는 YM-155을 포함하는 분화용 배지에서 배양함으로써， 미분화된 유도만능줄기세포만을 효과적으로 선택적 사멸시킬 수 있다.

(b) 본 발명에 따른 유도만능줄기세포 분화방법은 테라토마 형성의 원인이 되는 미분화된 유도만능즐기세포만을 선택적 사멸하여 분화된. 분화세포에는 전혀 영향올 미치지 않는다. 즉, 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지시키므로, 임상에 있어 세포 치료제로의 적용 시 종양 형성 가능성을 배제함으로써 안전성 확보가 기대된다.

【도면의 간단한 설명】

도 la 는 인간 대동맥 평활근세포 (human aortic smooth muscle cells: HASMC)에서 유래한 인간 유도만능줄기세포 ( iPS)， HASMC, IPS 에서 분화ᅳ유래된 평활근 세포 1 번 (iPS— SMC-1) 및 iPS 에서 분화ᅳ유래된 평활근 세포 3번 GPS-SMC-3)에 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간 처리한 후, 세포사멸 정도를 세포사멸 특이 세포형으로 확인한 현미경 사진이다. 그 결과, 쿠어세틴 처리 시 인간 유도만능출기세포에서, 뚜렷한 세포사멸 특이 세포 표현형이 관찰되었다ᅳ 도 lb는 면역 블랏팅법을 이용하여, 도 la 와 같은 방법으로 처리한 세포 용해액의 세포사멸 표지 단백질을 확인한 결과이다. 그 결과, 쿠어세틴 처리시 인간 유도만능줄기세포에서, 세포사멸 시 발생하는 Parp-1 의 절단 (T 형)， 카스파아제 3 번 및 9 번의 절단형 (cleaved 카스파아제)이 발현되었다.

도 2a 는 다양한 농도의 쿠어세틴 (QC)를 처리하여， 농도 의존적인 유도만능줄기세포의 세포사멸 정도를 세포사멸 특이 세포 표현형으로 확인한 현미경 사진이다. 도 2b 는 Annexin V 법을 이용하여， 도 2a 의 다양한 농도의 쿠어세틴에 의한 iPS 및 HASMC 의 세포사멸 정도를 확인한 결과이다. 도 2c 는 도 2b 에서 얻은 세포사멸 정도를 그래프로 나타낸 결과로서, iPS 및 HASMC의 각 생존세포 (live eel Is)의 비율을 보여준다. 도 3a는 HASMC 및 iPS-SMC3에 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간 처리한 후, 면역형광법을 이용하여 평활근세포에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 a -Smooth muscle act in (α-SMA)의 발현을 확인한 결과이다. 도 3b는 RT-PCR을 이용하여， 도 3a와 같은 방법으 S 처리한 iPS-SMCl 및 iPS- SMC3 의 세포 내 α-SMA 의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 3c 는 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 에 50 yM 의 쿠어세틴 또는 DMS0 를 24 시간 처리한 후， ATP또는 75mM 의 칼쁌 용액 (75K⁺)을 처리하여 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 의 세포내 칼슘 농도를 측정함으로써 인간 유도만능즐기세포에서 분화-유래된 평활근세포의 기능을 확인한 결과이다. 도 3d 는 도 3c 에서 측정된 내부 칼슘 농도를 그래프로 나타낸 결과이다.

도 4a 는 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간 처리한 미분화 유도만능줄기세포를 마우스의 고환에 주입하여， 10 주 후 테라토마 형성능을 대조군과 비교한 결과이다. 도 4b 는 도 4a 의 테라토마 형성여부를 확인하기 위해， Secretory eipthelium 및 Neural rosette structure를 각각 PAS 염색 H&E 염색한 결과이다.

도 5 는 iPS, HASMC 및 iPS-SMC-3 에 다양한 농도의 YM-155 를 24 시간 처리한 후, 세포사멸 정도를 세포사멸 특이 세포형으로 확인한 현미경 사진이다. 그 결과， YMᅳ 155 처리 시 인간 유보만능줄기세포에서， 농도 의존적으로 뚜렷한 세포사멸 특이 세포 표현형이 관찰되었다.

도 6a 는 Annexin V 법을 이용하여， 다양한 농도의 YM-155 에 농도 의존적인 iPS, HASMC 및 iPS-SMC3 의 세포사멸 정도를 확인하고 유세포 분리법을 통해 측정한 결과이다. 도 6b 는 도 6a 에서 얻은 세포사멸 정도를 그래프로 나타낸 결과로서 , ifS, HASMC 및 iPS-SMC3 의 각 생존세포 (live ceil)의 비율을 보여준다. ^■

도 7a는 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 에 50 nM 의 YM 155 또는 DMS0를 24 시간 처리한 후， ATP또는 75inM 의 칼륨 용액 (75K⁺)을 처리하여 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 의 세포내 칼슘 농도를 측정함으로써， 인간 유도만능즐기세포에서 분화ᅳ유래된 평활근세포의 기능을 확인한 결과이다. 도 7b 는 도 7a 에서 측정된 내부 ¾슘 농도를 그래프로 나타낸 결과이다.

도 8a 는 인간 유도만능줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래의 평활근세포 (SMC3)을 1:1 로 흔합하고, 쿠어세틴 50 μΜ 을 24 시간 봉안 처리한 후 SSEA-4(녹색) 및 절단형 카스파아제 -3(빨강색) (위쪽 패널), 또는 SM 녹색) 및 절단형 카스파아제 -3(빨강색) (아래쪽 패널)로 면역염색 분석한 결과를 보여준다. 스케일 바는 lOO. iirti 를 나타낸다. 도 8b 는 SMA-양성 파풀레이션 또는 SSEA-4-양성 파풀레이션에서의 절단형 카스파아제 -3 양성 파풀레이션의 백분을을 나타낸다. 는 'PO.01' 의 유의성을 나타낸다.

도 9a는 인간 유도만능줄기세포 및 평활근의 1:1 흔합물을 마우스에 주입한 결과를 나타낸다. 미처리 또는 10 mM YM155 # 전처리한 인간 유도만능줄기세포를 마우스에 주입하여 형성된 테라&마의 이미지를 보여준다. NC 는 세포를 주입하지 않은 마우스의 고환이다. 도 9b 는 인간 유도만능줄기세포를 주입한 마우스에서 형성된 테라토마의 H&E, asson's tri chrome 및 Acian Blue 염색 결과를 보여준다. 테라토마는 내장 상피, 연골， 분비 상피 및 신경 로제트 구조를 나타내는 세포를 생산하였다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

재료 및 방법

시약

쿠어세틴 (Quercetin, Cat # Q0125)은 Sigma-Aldr ich(St . Louis, MO,

USA)에서, YM-155(Cat # S1130)은 Selleck chemicals 에서 구매하였다. 인간 유도만능줄기세포 PS)의 배양 및 분화

마이토마이신 -C 를 처리한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF)가 지지세포로서 포함된 ESC 배지 (20% nockOut™ 혈청 대체물, 0.1¾ 젠타마이신 (gentamycin), 1% 비 -필수 아미노산， 0.1% 머갑토에탄을 및 4 ng/ml bFGF가 보충된 DMEM/P/12)에서 인간 대동맥 평활근세포 (human aortic smooth muscle cells: HASMC)에서 유래한 인간 유도만능줄기세포 (iPS)(Lee, T.H. , et al . , (2010) . Functional recapitulation of smooth muscle eel Is via induced luri otent stem eel Is from human aortic smooth muscle cells. Circ Res 106， 120-128)를 계대 배양하였다.

본 발명의 쿠어세틴 및 YM-155 에 대한 전처리흩 위하여 , iPS 는 매트리겔이 코팅된 60 麵 디쉬에서 mTeSR™l 배지 (29106， Stem Cell Technology)로 배양하여 평활근세포 (smooth muscle cells: SMC)로의 분화를 유도하였다. 인간 대동맥 평활근 세포 O man aortic smooth muscle cells: HASMC) 및 인간 유도만능 줄기세포 -유래 분화세포 (iPSᅳ SMC)의 배양

인간 대동맥 평활근 세포 (human aortic smooth muscle cells: HASMC) 및 인간 유도만능 줄기세포 -유래 분화세포， 측 인간 유도만능 줄기세포- 유래 평활근 세포 (iPS-SMC)는 상술한 참조문헌 (Lee et al .， 2010)에 기재된 바와 같이, SMCM 배지 (ScienCeH research laboratories, cat # 1101)에서 배양하였다ᅳ 면역블롯팅법 (Imimmob t ting) 및 면역형광세포화학염색법 ( imi mo fluorescence cytochemistry, IFC)

면역블홋팅 분석에 이용한 항체는 항 -PARP sc-7150) 및 항 ᅳ 액틴 (SC-47778)는 Santa Cruz Biotech Inc.(CA, 미국)에서 구매하였다. 또한, 항 -카스파아제 -9(Cat# 9502) 및 항 -cleaved 카스파아제 -3(Cat# 9661)는 Cell Signaling Techno logy (Danvers, MA, USA)에서 구매하였다.

IFC 에 사용된 제 1 차 항체 (1:200)는 항 -a-s(tiooth muscle actin

( α-SMA) (Dako Inc, Carpinteria, Calif)을 사용하였다. Axioscope Al 현미경 (Carl Zeiss)을 이용하여 이미지들을 얻고 분석하였다. 실시간 PCR (Real -time PCR)

RNA 추출 및 cDM 합성은 일반적인 프로토촐 (VanGuilder HD, et al

(2008) . "Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis'^*. Bio techniques 44 (5)： 619-626)을 이용하였다ᅳ

본 실시예에서 이용되는 유전자ᅳ특이적 프라이머 서열은 다음과 같다:

β -액틴: 5¹ -GTCCTCTCCCAAGTCCACAC-3 '， 5 ' -GGGAGACCAAAAGCCITCAT -3 '

Q-SMA: 5^*- AGAACATGGCATCATCACCA-3' , 5 '— TACATGGCTGGGACATTGM-3 '

FACS분석

모든 FACS 분석에는 FACS cali bur™ (BD Biosciences) 및 CellQuest 소프트웨어를 이용하였다. 세포는 PE Annex in V Apoptosis Detection Kit 1 (BD Pharmingen™)를 이용하여 제품에 동봉된 프로토콜에 기재된 바와 같이 염색하였다. 테라토마 형성 및 면역조직화학법

이미 분화된 세포의 경우 테라토마 형성능력이 없기 때분에， 쿠어세틴 또는 YM-155 의 테라토마 형성 억제 효과를 확인하기 위하여 , 미분화된 상태의 세포가 포함된 조건을 만돌어 테라토마 형성 실험을 실시하였다. 즉, iPS로부터 형성된 배상체 (EB)에 쿠어세틴 (100 μΜ) 또는 YM-155(10 riM)을 24 시간 동안 처리한 세포 (약 5 x 10⁶ cells) 또는 미처리한 세포 (약 5 X 10⁶ cells)* 수득하고, N0D/SCID 마우스 (Charles River Laboratories, Yokohama, Japan)의 고환에 주입하여 테라토마를 형성시켰다. 주입 10 주 후， 상기 이종 이식된 세포 (xenograft mass)을 수득하여 4% PFA 에 2 주 동안 고정시키고， Tissue-Tek VIP embedding machine (Miles Scientific, Napervi lie, ID 및 Thermo Shandon Histocenter2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 파라핀에 포매하였다. 상기 제조된 파라핀 블록은 Leica RN2065 microtome (Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 절편 (2 μπι 두께)으로 만들었다ᅳ 테라토마의 형성올 확인하기 위하여 헤마토자일린-에오신 (Η&Ε), PAS(Periodic-Acid-Schiff) 염색한 후, 숙련된 병리학자가 분석하였다.

본 발명의 모든 실험들은 차의과대학교 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of CHA University)의 승인을 받았으며, 본 발명의 모든 과정은 미국 국립보건원 (NIH publication no. 85-23, revised 1996)에서 발행한 'Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals' 에 따라 수행하였다. 세포내 칼슘 측정

평활근세포로의 분화가 완료된 분화세포의 기능을 확인하기 위하여 세포내 칼슘 반웅을 이용하였다. 상술한 참조문헌 (Lee et al., 2006)에 기재된 바와 같이, 세포 내외의 칼슘 이동 (calcium transients)은 약리적 시약, ATP 또는 75 mM K⁺ 용액을 이용하여 유도하였으며 _> 칼슴 인디케이터 Fura-2 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 형광으로 값을 수치화하여 측정하고 이미지화하였다. 실험 결과

쿠어세틴에 의한 미분화 인간 유도만능줄기세포의 세포사멸 및 인간 유도만능줄기세포 -유래 평활근 세포 (iPS-SMC)의 확인

쿠어세틴의 세포사멸 쿠어세틴의 미분화 인간 유도만능줄기세포에 대한 선택적 세포사멸을 확인하기 위하여, 인간 대동맥 평활근세포 (human aortic smooth muscle cells: HASMC)에서 유래한 인간 유도만능줄기세포 ( iPS) , HASMC, iPS 에서 분화-유래된 평활근 세포 1 번 (iPS-SMC-l) 및 iPS 에서 분화 유래된 평활근 세포 3 번에 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간 처리하고 세포사열 시 나타나는 세포사멸 특이 세포 표현형을 확인한 결과, 쿠어세틴 처리 시 인간 유도만능줄기세포에서, 뚜렷한 세포사멸 특이 세포 표현형이 발견되었다 (도 la). 또한， 면역 블랏팅법을 이용하여, 세포사멸 관련 표지 단백질을 확인한 결과， 쿠어세틴 처리시 인간 유도만능줄기세포에서， 세포사멸 시 발생하는 Parp-1 의 절단 (T 형), 카스파아제 3 번 및 9 번의 절단형 (cleaved 카스파아제)이 발현되었다 (도 lb).

다양한 농도의 쿠어세틴 (QC)를 처리 시， 농도 의존적인 유도만능줄기세포의 세포사멸 정도를 세포사멸 특이 세포 표현형으로 확인하였다 (도 2a). 또한, Annexin V 법을 이용하여, 다양한 농도의 쿠어세틴에 의한 iPS 및 HASMC 의 세포사멸 정도를 확인하였고, 이를 그래프로 나타내어 iPS 및 HASMC 의 각 생존세포 (live eel Is)의 비율을 확인하였다 (도 2b 및 c). 인간유도만능줄기세포 -유래 평활근 세포 (iPS-SMC)의기능확인

인간 유도만능즐기세포에서 분화-유래된 평활근세포의 기능을 확인하기 위하여, HASMC 및 iPS-SMC3 에 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간. 처리한 후， 면역형광법을 이용하여 평활근세포에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 α Smooth muscle actin( a-SMA)의 발현을 확인한 결과 aᅳ SMA 의 발현을 확인하였고, 또한 RT-PCR 을 이용하여 , iPS-SMCl 및 iPS- SMC3의 세포 내 a-SMA의 mRNA 발현도 확인하였다 (도 3a 및 b) .

또한, 인간 유도만능출기세포에서 분화-유래된 평활근세포의 기능을 확인하기 위하여 ,· iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 에 50 μΜ 의 쿠어세틴 또는 DMS0 를 24 시간 처리한 후, ΑΤΡ 또는 75mM 의 칼름 용액 (75K+)을 처리하여 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 의 세포내 칼슘 농도를 측정한 결과, 평활근세포로서의 기능을 확인하였다 (도 3c 및 d). 테라토마 형성능

쿠어세틴의 처리시 테라토마 형성여부를 확인하기 위해, 50 μΜ 의 쿠어세틴을 24 시간 처리한 미분화 유도만능출기세포를 마우스의 고환에 주입하여, 10 주 후 테라토마 형성능을 대조군 (쿠어세틴 미처리 유도만능줄기세포)과 비교한 결과한 결과, 대조군에서 Secretory eipthelium 및 Neural rosette structure 이 확인되었고, 이를 각각 PAS 염색 및 H&E 염색하여 테라토마의 형성을 확인하였다.

YM-155 에 의한 미분화 인간 유도만능줄기세포의 세포사멸 유도 및 인간 유도만능줄기세포 -유래 평활근 세 i(iPS-SMC)의 확인

YMᅳ 155의 세포사멸

YM-155 의 미분화 인간 유도만능즐기세포에 대한 선택적 세포사멸을 확인하기 위하여, 인간 대동맥 평활근세포 (human aortic smooth muscle cells: HASMC)에서 유래한 인간 유도만능줄기세포 (iPS)， HASMC 및 iPS 에서 분화ᅳ유래된 평활근 세포 3 번에 다양한 농도의 YM-155 올 24 시간 처리하고 세포사멸 시 나타나는 세포사멸 특이 세포 표현형을 확인한 결과, 농도 의존적인 YM-155 처리 시 인간 유도만능줄기세포에서, 뚜렷한 세포사멸 특이 세포 표현형이 발견되었다 (도 5).

또한, Annexin V 법을 이용하여, 다양한 농도의 YM-155 에 의한 iPS, HASMC 및 iPS-SMC3의 세포사멸 정도를 확인하였고， 이를 그래프로 나타내어 iPS, HASMC 및 iPS-SMC3 의 각 생존세포 (live eel Is)의 비율을 확인하였다 (도 6a 및 b). 인간 유도만능줄기세포ᅳ유래평활근 세포 (iPS-SMC)의 기능확인

인간 유도만능줄기세포에서 분화-유래된 평활근세포의 기능을 확인하기 위하여 , iPS-SMCl 및 iPS-SMC3에 50 nM의 YM-155 또는 DMS0를 24 시간 처리한 후, ATP 또는 75 mM 의 칼륨 용액 (75K+)을 처리하여 iPS-SMCl 및 iPS-SMC3 의 세포내 칼슴 농도를 측정한 결과, 평활근세포로서의 기능을 확인하였다 (도 7a 및 b). 쿠어세틴 처리에 의한 분화된 세포의 기능에 대한 영향 확인 인간 유도만능줄기세포에서 분화-유래된 평활근세포의 기능을 확인하기 위하여, 인간 유도만능줄기세포 및 인간유도만능줄기세포에서 분화ᅳ유래된 평활근세포를 1:1 로 혼합하여 배양한 파풀레이션에 50 uM 쿠어세틴을 24 시간 동안 처리하고, SMA-양성 파블레이션 또는 SSEA-4-양성 파풀레이션에서의 절단형 카스파아제 -3 양성 파풀레이션을 확인한 결과， 인간 유도만능줄기세포-평할근세포의 흔합 세포 파풀레이션에서 쿠어세틴 처리 후 SSEA-4 양성 파풀레이션 내 절단형 카스파아제 3 양성 파풀레이션이 우세한 것을 확인하였다 (도 8a 및 b). 서바이빈 억제제인 YM-155의 인간 유도만능줄기세포의 사멸 유도

서바이빈 억제제인 YM-155 의 인간 유도만능줄기세포의 선별적 사멸을 확인하기 위해, 인간 유도만능줄기세포 및 평활근의 1:1 흔합물을 마우스에 주입한 결과를 나타낸다ᅳ 미처리 또는 10 mM YM155 를 전처리한 인간 유도만능줄기세포를 마우스에 주입하여 테라토마를 유도한다 (도 9a). 인간 유도만능줄기세포를 주입한 마우스에서 형성된 테라토마의 H&E, Masson's trichrome 및 Acian Blue 염색한 결과, YM 155 의 24 시간 단회 처리에 의해 테라토마의 형성이 억제됨을 보여준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【흑허청구범위】

【청구항 1】

다음 단계를 포함하며， 미분화 유도만능줄기세포 (induced pluri potent stem cell: iPS)가 제거된, 유도만능즐기세포 유래 분화세포의 제조방법:

(a) 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포 (differentiated eel Is)를 포함하는 세포시료를 준비 (preparation)하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 다음 화학식 1 의 쿠어세틴 (Quercetin) 또는 화학식 2 의 YM-155 을 처리하여 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계.

화학식 1

【청구항 2】

제 1 항에 있어서， 상기 유도만능출기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양 개, 고양이, 마우스， 래트 또는 조류로부터 유래된 것을 특징으로 하는

【청구항 3】

제 1 항에 있어서, 상기 쿠어세틴 및 YM-155 의 농도는 각각 20-100 tiM 및 2.5-80 nM 인 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 4】

상기 제 1 항 내지 제 3 항 증 어느 한 항의 방법에 의해 미분화 유도만능줄기세포가 제거된 세포 조성물.

【청구항 5】

다음 화학식 1 의 쿠어세틴 (Quercetin) 는 화학식 2 의 YM-155 를 포함하는 미분화 유도만능줄기세포의 선택적 사뎔용 조성불.

화학식 2