KR102193405B1 - 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법 - Google Patents

배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 계대배양의 후기로 갈수록 인간 배아줄기세포(hESCs)는 BCL-xL 단백질 발현에 의존적으로 미분화만능줄기세포만을 선택적으로 세포사멸 할 수 있는 화합물인 YM155에 대한 저항성이 높아지는데, BCL-xL 단백질 억제제는 YM155에 저항성이 있는 hESCs만을 선택적으로 세포사멸 시킬 수 있음을 확인함으로써 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법은 줄기세포 치료제의 개발 및 적용에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법{Method of selective elimination of culture-adapted pluripotent stem cells}
본 발명은 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법에 관한 것이다.
배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)는 착상 전 배반포의 내부세포괴(inner cell mass: ICM)로부터 확립된 세포로서, 특정배양조건에서 무한히 증식하고 미분화 상태를 유지할 수 있으며 체내에 모든 종류의 세포로 분화가 가능한 전분화능을 가진다. 배아줄기세포는 체외(in vitro)에서 적절한 외부환경의 조절에 의해 신경계 세포, 심근 세포, 혈관내피 세포, 조혈모세포, 간세포, 췌장 세포 및 생식세포 등의 인체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는데, 이런 특성으로 인해 배아줄기세포는 현재 다양한 난치성 질환 치료를 위한 목적으로 많은 연구가 이루어지고 있다(Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts,James A. Thomson et al. Science, 282, 1145 (1998);).
배아줄기세포를 난치성 질병 치료 목적으로 이용하기 위해서는 안전한 세포 유지기술과 원하는 세포로의 분화기술, 안전한 이식기술이 필요하다. 배아줄기세포의 증식 능력 및 전분화 능력은 질병 치료를 위해 반드시 필요하나, 배아줄기세포 유래 세포의 세포치료 과정의 부작용으로 테라토마(Teratoma)와 같은 종양이 형성될 위험성이 있다(SA Przyborski, Differentiation of human embryonic stem cells after transplantation in immune-deficient mice, Stem Cells, 23, 1242 (2005)). 이러한 종양이 형성되는 이유는 배아줄기세포의 분화를 유도하는 과정에서 분화되지 않고 전분화 능력을 유지하는 세포가 남아있기 때문이다. 뿐만 아니라 배아줄기세포와 유도만능줄기세포와 같은 만능줄기세포의 장기간의 배양, 유지 과정에서 특이한 돌연변이가 축적되고, 이 돌연변이에 의해 세포사멸에 저항성을 갖는 배양적응(culture-adapted) 특성을 획득하게 된다. 배양과정에서의 다양한 배양 스트레스에 의해 생존특성이 부여된 돌연변이 세포는 배양과정에서 지배적인 세포(dominant population)가 되며, 유전체의 불안정성으로 인해 지속적인 돌연변이가 축적되어 이러한 만능줄기세포에서 유래한 분화세포에서까지 종양화 가능성이 증가하게 된다. 따라서, 미분화만능줄기세포를 배양하는 과정에서 배양적응된 미분화만능줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있는 기술의 개발이 안전한 만능줄기세포 유래 세포치료의 광범위한 임상적용에 필요하다.
본 발명의 목적은 BCL-xL 단백질 억제제의 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법을 제공한다.
계대배양의 후기로 갈수록 인간 배아줄기세포(hESCs)는 BCL-xL 단백질 발현에 의존적으로 미분화만능줄기세포만을 선택적으로 세포사멸 할 수 있는 화합물인 YM155에 대한 저항성이 높아지는데, BCL-xL 단백질 억제제는 YM155에 저항성이 있는 hESCs만을 선택적으로 세포사멸 시킬 수 있음을 확인함으로써 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 배양적응된 미분화만능줄기세포의 선택적 세포사멸 방법은 줄기세포 치료제의 개발 및 적용에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 YM155 처리에 따른 계대배양 1세대(P1: 40번대 계대배양 세포) 내지 4세대(P4: 300번대 계대배양 세포)의 생존 세포 수를 나타낸 도이다.
도 2는 YM155 처리에 따른 P1 내지 P4의 생존 세포률을 나타낸 도이다.
도 3은 YM155 처리에 따른 P1 내지 P4의 알칼리포스파타제 활성(alkaline phosphatase activity)을 나타낸 도이다.
도 4는 YM155에 민감한 집단(YM155S) 또는 YM155에 저항성이 있는 집단(YM155R)의 클러스터 히트맵 분석(cluster heatmap)을 나타낸 도이다.
도 5는 YM155S 또는 YM155R의 주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 나타낸 도이다.
도 6은 YM155S 또는 YM155R의 유전자 분포 매트릭스 분석(gene distribution matrix)을 나타낸 도이다.
도 7은 P4 hESCs의 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 분석을 나타낸 도이다.
도 8은 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 유전자 세트의 발현 및 히트맵을 나타낸 도이다.
도 9는 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 유전자 네트워크 분석(gene network analysis)을 나타낸 도이다.
도 10은 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 항-세포사멸 유전자 발현량을 나타낸 도이다.
도 11은 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포사멸-유도 유전자의 발현량을 나타낸 도이다.
도 12는 P1 hESCs 내지 P4 hESCs에서 BCL2L1 유전자의 발현량을 나타낸 도이다.
도 13은 P1 hESCs 내지 P4 hESCs에서 BCL-xL 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 14는 YM155의 농도에 따라 그 농도에서 생존한 hESCs에서 BCL-xL 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 15는 YM155S hESCs 및 YM155R hESCs의 시그니처 유전자(signature gene)의 발현과 CTRP 데이터세트(dataset)의 패턴 매칭(pattern matching)을 나타낸 도이다.
도 16은 YM155R hESCs를 특이적으로 타겟하는 화합물 예측(prediction)을 나타낸 도이다.
도 17은 ABT-263 처리 농도에 따른 P2 hESCs 내지 P4 hESCs의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 18은 ABT-263 처리 농도에 따른 P2 hESCs 내지 P4 hESCs에서 세포사멸 마커 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 19는 ABT-737 처리 농도에 따른 P2 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 20은 ABT-737 처리 농도에 따른 P2 hESCs 또는 P4 hESCs에서 세포사멸 마커 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 21은 ABT-263 처리 시간에 따른 GFP를 발현하는 P1의 hESCs(EGFP-P1 hESCs) 또는 P4 hESCs의 세포모양을 나타낸 도이다.
도 22는 ABT-263 처리 농도에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 FACS 분석을 나타낸 도이다.
도 23은 ABT-263 처리 농도에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 24는 ABT-263, ABT-737, 또는 항암제인 에토포시드(etoposide) 처리에 따른 P1 hESCs 또는 P3 hESCs의 MMT(mitochondrial membrane potential) 분석을 나타낸 도이다.
도 25는 ABT-263, ABT-737, 또는 에토포시드 처리에 따른 P1 hESCs 또는 P3 hESCs의 MMT 분석을 나타낸 도이다.
도 26은 WEHI-539 처리 농도에 따른 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 FACS 분석을 나타낸 도이다.
도 27은 WEHI-539 처리 농도에 따른 P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 28은 ABT-263 처리에 따른 P2 hESCs 또는 CDy 1으로 염색한 P4 hESCs에서 세포사멸 마커 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 29은 ABT-263 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포모양을 나타낸 도이다.
도 30은 ABT-263 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 분포를 나타낸 도이다.
도 31은 WEHI-539 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 FACS 분석을 나타낸 도이다.
도 32는 WEHI-539 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 33은 WEHI-539 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포모양을 나타낸 도이다.
도 34는 WEHI-539 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 분포를 나타낸 도이다.
도 35는 ABT-263 처리 이후, Y-27632 처리에 따른 EGFP-P1 hESCs 또는 P4 hESCs의 세포 분포를 나타낸 도이다.
도 36은 ABT-263을 처리한 P1 hESCs(ABT-P1 hESCs) 또는 처리하지 않은 P1 hESCs에서 전분화성 마커 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 37은 ABT-P1 hESCs 또는 P1 hESCs에서 전분화성 마커 유전자의 발현을 나타낸 도이다.
도 38은 ABT-P1 hESCs 또는 P1 hESCs에서 알칼리포스파타제 활성을 나타낸 도이다.
도 39는 ABT-P1 hESCs 또는 P1 hESCs에서 외배엽 마커, 중배엽 마커, 또는 내배엽 마커 유전자의 발현을 나타낸 도이다.
도 40은 ABT-P1 hESCs 또는 P1 hESCs에서 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽에서 기형종 형성을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은,
다음 단계를 포함하며, 미분화 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된, 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법을 제공한다.
(a) 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포시료를 준비하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에, 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하여 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계:
[화학식 1]
Figure 112019065668566-pat00001
[화학식 2]
Figure 112019065668566-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019065668566-pat00003
.
본 발명자들은 계대배양의 후기로 갈수록 인간 배아줄기세포(hESCs)는 BCL-xL 단백질 발현에 의존적으로 미분화만능줄기세포만을 선택적으로 세포사멸 할 수 있는 화합물인 YM155에 대한 저항성이 높아지는데, BCL-xL 단백질 억제제는 YM155에 저항성이 있는 hESCs만을 선택적으로 세포사멸 시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 미분화 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된, 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포시료 준비(preparation)
본 발명에 따르면, 우선 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화 세포를 포함하는 세포시료를 준비한다.
상기 세포시료는 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 유도만능줄기세포를 분화시킨(예컨대, 평활근 세포로 분화) 결과물이 상기 세포시료이다. 유도만능줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 미분화 유도만능줄기세포가 소량 잔존 해 있는 비균질 파퓰레이션을 이룬다.따라서, 분화시킨 결과물을 세포 치료제로 이용하기 위해서는 미분화 유도만능줄기세포의 완전한 제거가 필요하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유도만능줄기세포”는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하여 인위적으로 유래된 전분화능 줄기세포이다. 상기 유도만능줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “분화세포”는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유도만능줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 바람직하게는 인간 유도만능줄기세포이다.
상기 유도만능줄기세포는 분화된 세포를 3 종 또는 4 종의 유전자를 도입시켜 배아줄기세포의 전분화성을 유도한 전능 세포를 의미하며, 이러한 유도만능줄기세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 용이하게 구축될 수 있다( Takahashi K, Yamanaka S (August 2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell 126(4):66376). 예를 들어, hESCs(WA09; WiCell Research institute)을 구입하여 매트리겔(matrigel, BD Biosciences)이 코팅된 배양접시에 분주하고 50 gm/mL의 겐타마이신(gentamicin, Life Technologies)을 첨가한 TeSRTM-E8TM배지에서 배양에서 계대배양하여 유도만능 줄기세포를 얻을 수 있다. 알려진 유도만능줄기세포주로서 예컨대, SES-8 (Tae-Hee Lee 등, “Functional Recapitulation of Smooth Muscle Cells Via Induced Pluripotent Stem Cells From Human Aortic Smooth Muscle Cells” Circulation Research(2010) (106:120-128)) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 이용되는 유도만능줄기세포는 유래되는 대상에 대하여 자가(autologous)이거나 또는 타가(allogenic)일 수 있으나, 바람직하게는 자가이다. 자가 유도만능줄기세포는 객체 자신의 조직으로부터 유도만능줄기세포를 분리 및 배양하여 제조된다.
본 발명의 방법에 있어서, ABT-263, ABT-737 또는 WEHI-539가 처리되는 세포시료는 유도만능줄기세포를 분화시켜 얻은 어떠한 결과물도 포함한다.
예를 들어, 유도만능줄기세포를 특정 세포로 분화시켜 얻은 세포 파퓰레이션 및 유도만능줄기세포로부터 유래된 배상체(embryoid body)를 분화시켜 얻은 세포 파퓰레이션 등을 본 발명에서 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “배상체(embryoid body)”는 배아 줄기 세포가 자연 분화되어 형성되는 세포 덩어리로, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배아 배엽층(three germ layer)으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포 집합체를 의미하며, 얻어진 배상체는 적당한 배지 상태에서 유지될 수 있다. 유도만능줄기세포로부터 배상체를 형성하는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어,hESCs(WA09; WiCell Research institute)을 구입하여 매트리겔(matrigel, BD Biosciences)이 코팅된 배양접시에 분주하고 50 gm/mL의 겐타마이신(gentamicin, Life Technologies)을 첨가한 TeSRTM-E8TM배지에서 배양함으로써, 배상체를 형성할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 얻고자 하는 세포의 종류에 따라 다양한 조성의 기질 세포를 배지에 함유할 수 있으며, 상기 배상체의 분화방법은 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다.
단계 (b): 상기 단계 (a)의 결과물에 ABT-263, ABT-737 또는 WEHI-539를 처리하여 미분화된 유도만능줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계
이어, 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 제거하기 위하여, 상기 단계 (a)의 결과물에 화학식 1(ABT-263), 2(ABT-737), 3(WEHI-539)으로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 처리한다. 그 결과, 분화세포에는 전혀 영향을 미치지 않아 분화세포의 생존능 및 기능은 그대로 유지되고, 미분화된 유도만능줄기세포만이 선택적으로 사멸된다.
본 명세서에서 미분화 유도만능줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 “제거(depletion or removal)”는 비균질 세포 파퓰레이션으로부터 미분화 유도만능줄기세포가 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 “제거”는 본 발명의 방법이 적용된 시료에서 미분화 유도만능줄기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만, 가장 바람직하게는 실질적으로 없는 것을 의미한다. 상기 용어 “%”는 세포개수(cell count)를 기준으로 한 백분율이다.
본 명세서에서 세포 사멸은 특별하게 다르게 언급되지 않는 한, 아폽토시스를 의미한다. 아폽토시스(apoptosis)는 다세포에서 일어나는 프로그램화된 세포사멸(programmed cell death: PCD)이다(Alberts, Bruce et al., (2008). "Chapter 18 Apoptosis: Programmed Cell Death Eliminates Unwanted Cells". Molecular Biology of the Cell(5th ed.). Garland Science. p. 1115). 아폽토시스의 생화학적 현상은 세포의 형태를 변화시키고 사멸을 이끈다. 이러한 변화는 세포막의 기포형성, 세포 수축, 핵 파쇄, 염색체 응축 및 염색체 DNA 파쇄를 포함한다. 세포괴사와 다르게, 아폽토시스에 의해 생산된 아폽토틱 바디는 세포 밖으로 유출되어 세포를 손상시키기 전에 탐식형 세포(phagocytic cells)가 에워싸서 제거하게 된다.
본 발명에서 이용되는 ABT-263는 항-세포사멸 인자인 Bcl-xL의 화학적 억제제이며, 화학명은 R)-4-(4-((4'-chloro-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1'-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)-N-((4-((4-morpholino-1-(phenylthio)butan-2-yl)amino)-3-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)sulfonyl)benzamide; Navitoclax으로 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
[화학식 1]
Figure 112019065668566-pat00004
본 발명에서 이용되는 ABT-737은 항-세포사멸 인자인 Bcl-xL의 화학적 억제제이며, 화학명은 4-[4-[(4'-Chloro[1,1'-biphenyl]-2-yl)methyl]-1-piperazinyl]-N-[[4-[[(1R)-3-(dimethylamino)-1-[(phenylthio)methyl]propyl]amino]-3-nitrophenyl]sulfonyl]benzamide으로 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.
[화학식 2]
Figure 112019065668566-pat00005
본 발명에서 이용되는 WEHI-539는 항-세포사멸 인자인 Bcl-xL의 화학적 억제제이며, 화학명은 (E)-5-(3-(4-(aminomethyl)phenoxy)propyl)-2-(8-(2-(benzo[d]thiazol-2-yl)hydrazono)-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl)thiazole-4-carboxylic acid으로 하기 화학식 3의 구조를 갖는다.
[화학식 3]
Figure 112019065668566-pat00006
.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 처리되는 ABT-263의 농도는 20-100 μM이며, 보다 바람직하게는 30-90 μM, 보다 더 바람직하게는 40-80 μM, 가장 바람직하게는 50 μM이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 처리되는 ABT-737의 농도는 20-100 μM이며, 보다 바람직하게는 30-90 μM, 보다 더 바람직하게는 40-80 μM, 가장 바람직하게는 50 μM이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 처리되는 WEHI-539의 농도는 1-10μM, 보다 바람직하게는 2-8μM, 보다 더 바람직하게는 2-5μM, 가장 바람직하게는 2μM이다.
본 발명의 단계 (b)의 배양 기간은 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 5-100 시간, 보다 바람직하게는 약 10-60 시간, 보다 더 바람직하게는 약 15-50 시간, 가장 바람직하게는 약 48 시간이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 미분화 유도만능줄기세포가 제거된 세포 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 상술된 본 발명의 방법에 의해 제조된 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 본 발명의 방법에 의해 미분화 유도만능줄기세포가 제거된 세포 조성물은 다양한 응용성을 가지며, 특히 세포 치료제로서 이용될 수 있다.
예를 들어, 미분화 유도만능줄기세포가 제거된, 근세포로 분화된 결과물인 경우에는 근이양증(muscular dystrophy), 근위축증(muscular atrophy), 근육염(Myositis), 다발성 근육염(polymyositis), 말초혈관 질환(peripheral vascular disease) 및 섬유증(fibrosis)과 같은 근육 손상 질환, 신경근육계 질환, 근육계 관절염, 퇴행성 근육 질환 및 허혈성 근육 질환 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 근육계 질환의 세포치료요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다.
또한, 예를 들어, 미분화 유도만능줄기세포가 제거된, 신경세포로 분화된 결과물인 경우에는 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 알츠하이머병, 다발성경화증, 파킨슨병, 척추 손상 질환(spinalcord injury disease), 치매, 간성 뇌증 및 저산소증, 탈수초질환, 헌팅톤병, 근위축성 척수측색경화증, 퇴행성 질환 및 허혈성 질환 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 신경계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다.
상기 미분화 유도만능줄기세포는 하기 화학식 4로 표시되는 YM155에 대해 저항성이 있는 미분화 유도만능줄기세포인 것이 바람직하다.
[화학식 4]
Figure 112019065668566-pat00007
상기 화학식 4에서,
X-는 -1가의 음이온이며, 바람직하게는 할로겐 이온이다.
이때, 상기 화학식 4로 표시되는 YM155는 항-세포사멸 인자인 서바이빈(Survivin)의 화학적 억제제이며, 화학명은 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one이다.
본 발명의 또 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BCL-xL 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 미분화 유도만능줄기세포의 선택적 사멸용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 본 발명의 방법에 이용하는ABT-263, ABT-737 또는 WEHI-539를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)의 계대배양
hESCs(WA09; WiCell Research institute)을 구입하여 매트리겔(matrigel, BD Biosciences)이 코팅된 배양접시에 분주하고 50 gm/mL의 겐타마이신(gentamicin, Life Technologies)을 첨가한 TeSRTM-E8TM배지에서 배양하였다. 매일 새 배지로 갈아주었고, 5 내지 6일마다 계대배양하여 1세대(P1: 40번대 계대배양 세포), 2세대(P: 100번대 계대배양 세포), 3세대(P3: 200번대 계대배양세포) 내지 4세대(P4: 300번대 계대배양 세포)의 hESCs을 얻었다.
실험예 1. hESCs의 계대배양 초기 또는 후기에서 YM155에 대한 저항성 비교
hESCs의 선택적 사멸을 유도하는 YM155에 대한 저항성이 계대배양의 후기로 갈수록 높아지는지를 확인하였다.
1-1. 계대배양 초기 또는 후기에서 YM155 처리에 의한 세포 생존 정도
계대배양 초기 또는 후기의 hESCs에 YM155를 처리했을 때 세포의 생존 정도가 달라지는지 확인하였다.
구체적으로, P1 내지 P4의 hESCs에 5 nM의 YM155를 24시간 동안 처리한 후, Annexin-V apoptosis detection assay(BD PharmingenTM, Cat# 556547)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 항-7-AAD(7-Aminoactinomycin D) 항체 및 항-FITC-Annexin-V 항체를 처리하여 FACS 분석으로 생존 세포 및 사멸 세포의 수를 측정하였다. 또한, P1 내지 P4의 hESCs에 10 nM 또는 40 nM의 YM155를 24시간 동안 처리한 후, 알칼리포스파타제 염색 분석 키트(alkaline phosphatase staining assay kit, Sigma-Aldrich, Cat# 86R-1KT)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 알칼리포스파타제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, P1 및 P2에 비해 P3 및 P4에서 생존하는 세포 수가 많았고, 도 3에 나타낸 바와 같이, P1 및 P2에 비해 P3 및 P4의 세포가 알칼리포스파타제 활성이 높게 나타났다.
1-2. 계대배양 초기 또는 후기에서 hESCs의 유전자 프로파일
P1 및 P2의 hESCs를 YM155에 민감한 집단으로(YM155-sensitive, YM155S), P3 및 P4의 hESCs를 YM155에 저항성이 있는 집단으로(YM155-resistant, YM155R) 분류하여 YM155S 또는 YM155R에서 발현되는 유전자 프로필을 비교하였다.
구체적으로, P1 내지 P4의 hESCs에 대해 클러스터 히트맵 분석(cluster heatmap), 주성분 분석(principal component analysis, PCA), 및 유전자 분포 매트릭스 분석(gene distribution matrix)을 수행하였다.
그 결과, 도 4 내지 6에 나타낸 바와 같이, YM155S 또는 YM155R에서 발현되는 유전자 프로필이 상이하게 나타났다.
1-3. P4의 hESCs에서 특징적으로 발현되는 유전자 세트
계대배양 후기의 hESCs에서 YM155에 대한 저항성과 관련되는 유전자를 확인하기 위해 hESCs에서 특징적으로 발현되는 유전자 세트를 분석하였다.
P4의 hESCs의 다양한 유전자 세트를 Molecular Signature 데이터베이스(MSigDB, https://software.broadinsitute.org/gsea/ msigdb/) 및 Pathway Commons (http://www.pathwaycommons.org/)로부터 수집하여 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 분석을 수행하였다. 이를 기반으로 P1 또는 P4의 hESCs에서 세포사멸의 특징(hallmark of apoptosis) 또는 세포사멸 신호전달 경로(apoptotic signaling pathway)와 관련된 유전자 세트의 발현을 분석하고, 세포사멸과 관련된 유전자 세트의 히트맵을 확인하였으며, 이를 유전자 네트워크 분석(gene network analysis)으로 분석하였다. 유전자 네트워크 분석을 위해 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)로부터 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI) 결과를 수집하여 SIF(simple interaction format) 파일을 생성하였다.
그 결과, 도 7 내지 9에 나타낸 바와 같이, P4의 hESCs에서 세포사멸과 관련된 유전자 세트의 발현이 증가하였고, 이중 BCL2L1, ANAXA1, 및 PLAT 유전자의 발현이 상향 조절되었다.
상기 결과는 계대배양 후기로 갈수록 hESCs의 YM155에 대한 저항성이 높아지고, 이는 세포사멸 관련 유전자의 발현 증가와 연관될 수 있음을 제시한다.
실험예 2. BCL2L1 유전자에 의한 계대배양 후기 hESCs의 YM155 저항성 획득
BCL2L1 유전자의 발현이 계대배양 후기의 hESCs가 YM155에 대한 저항성이 높은 것과 관련이 있는지를 확인하였다.
2-1. P1 또는 P4의 hESCs에서 항-세포사멸(anti-apoptotic) 유전자 또는 세포사멸-유도(pro-apoptotic) 유전자의 발현량
P1 또는 P4의 hESCs에서 항-세포사멸 유전자 또는 세포사멸-유도 유전자의 발현량을 PCR 어레이(array)로 비교하였다.
구체적으로, P1 또는 P4의 hESCs로부터 RT2 profiler PCR array system-Human Apoptosis PCR array(Qiazen)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다.
그 결과, 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, P1의 hESCs에 비해 P4의 hESCs에서 항-세포사멸 유전자의 발현량은 증가하였고, 세포사멸-유도 유전자의 발현량은 감소하였다.
2-2. P1 내지 P4의 hESCs에서 BCL2L1 유전자의 발현량
P1 내지 P4의 hESCs에서 BCL2L1 유전자의 발현량을 비교하였다.
P1 내지 P4의 hESCs로부터 easy-BLUETM RNA 분리 키트(iNtRON Biotechnology)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출한 후, 1 mg의 total RNA로부터 PrimeScriptTM RT regent 키트(TaKaRa)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA에 SYBR® Green PCR 시약(Life Technologies)을 처리하고 Loche Light Cycler-480®II로 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative real-time PCR, RT-qPCR)을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, P1 및 P2의 hESCs에 비해 P3 및 P4의 hESCs에서 BCL2L1 유전자의 발현량이 증가하였다.
2-3. P1 내지 P4의 hESCs에서 BCL-xL 단백질의 발현량
P1 내지 P4의 hESCs에서 BCL2L1 유전자가 암호화하는 BCL-xL 단백질의 발현량을 비교하였다.
구체적으로, P1 내지 P4의 hESCs를 TLB 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% triton X-100, 10% glycerol)로 용해하고, 10 mM의 바나듐산나트륨(sodium vanadate) 및 1 mM의 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche)을 첨가하여 단백질을 추출한 후, 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 1차 항체로는 항-Bcl-xL 항체(Abcamm, Cat# ab32370)를, 2차 항체로는 HRP(horseradish peroxidase)-conjugated 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, P1 및 P2의 hESCs에 비해 P3 및 P4의 hESCs에서 BCL-xL 단백질의 발현량이 증가하였다.
2-4. YM155 처리 농도에 따른 P3의 hESCs에서 BCL-xL 단백질의 발현량
YM155를 고농도로 처리할수록 해당 농도에서 생존한 hESCs에서 BCL-xL 단백질이 높게 발현되는지를 확인하였다.
구체적으로, P3의 hESCs에 0, 25, 또는 50 nM의 YM155를 24시간 동안 처리하고, 각 농도에서 생존한 세포를 항-BCL-xL 항체로 염색한 후, BCL-xL 단백질의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 높은 농도의 YM155에서 생존한 세포일수록 BCL-xL의 단백질 발현량이 증가하였다.
상기 결과는 hESCs의 YM155에 대한 저항성은 BCL2L1 유전자가 암호화하는 BCL-xL 단백질의 발현에 의존적일 수 있음을 제시한다.
실험예3. YM155R hESCs를 선택적으로 타겟하는 화합물 예측(prediction)
YM155에 저항성이 있는 hESCs를 선택적으로 타겟하는 화합물을 예측하였다.
구체적으로, YM155S hESCs 및 YM155R hESCs의 시그니처 유전자(signature gene)를 CTRP 데이터베이스(Cancer Therapeutics Response Portal, https://portals.broadinstitute.org/ctrp/)에 적용하고, 피어슨 상관 계수(pearson correlation coefficient)를 이용해 시그니처 유전자의 발현과 CTRP 데이터세트(dataset)의 패턴 매칭(pattern matching)을 수행하였다.
그 결과, 도 15 및 16에 나타낸 바와 같이, BCL2 패밀리 단백질을 표적으로 하는 ABT-263, ABT-737과 같은 BH3 미메틱스(mimetics)가 YM155R hESCs를 특이적으로 타겟하였다.
실험예 4. BCL-xL 단백질의 억제제를 이용한 YM155R hESCs의 세포사멸 유도
BCL-xL 단백질의 억제제가 BCL-xL의 항-세포사멸 기능을 억제하여 YM155R hESCs의 세포사멸을 유도할수 있는지 확인하였다.
4-1. ABT-263 또는 ABT-737에 의한 P2 내지 P4 hESCs의 세포사멸
실험예 3에서 예측된 BH3 미메틱스인 ABT-263 또는 ABT-737이 YM155R hESCs의 세포사멸을 유도하는지 확인하였다.
먼저, P2 내지 P4의 hESCs에 0, 10, 20, 50 또는 100 nM의 ABT-263을 48시간 동안 처리하였다. 처리한 세포를 Annexin-V 및 7-AAD로 염색하여 염색되지 않은 세포 수를 측정하였고, 처리한 세포에 실험예 2-3과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 세포사멸의 마커인 Ccasp-3(cleaved caspase-3) 단백질의 발현을 확인하였다. 1차 항체는 항-Ccasp-3 항체(Cell signaling technologies, Cat# 9664S)를 사용하였다.
한편, P2 또는 P4의 hESCs에 ABT-737을 24시간 동안 처리하고, PARP 단백질 및 Ccasp-3 단백질의 발현을 확인한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 세포 수를 측정하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체는 항-Ccasp-3 항체(Cell signaling technologies, Cat# 9664S) 및 항-PARP 항체(Cell signaling technologies, Cat# sc-7150)를 사용하였다.
그 결과, 도 17 내지 20에 나타낸 바와 같이, ABT-263 또는 ABT-737의 처리 농도에 의존적으로 P3 또는 P4의 hESCs 세포사멸이 증가하였다.
4-2. ABT-263에 의한 P1 또는 P4 hESCs의 세포사멸
ABT-263에 의한 YM155R hESCs의 세포사멸을 농도, 또는 시간에 따라 확인하였다.
구체적으로, GFP를 발현하는 P1의 hESCs(EGFP-P1), 또는 P4의 hESCs에 ABT-263을 처리하고 10분마다 세포모양을 관찰하였고, 0, 20, 37.5, 60, 또는 80 nM의 ABT-263을 48시간 동안 처리하고, 처리한 세포를 Annexin-V 로 염색하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 세포 생존률을 분석하였다.
그 결과, 도 21 내지 23에 나타낸 바와 같이, ABT-263의 처리 시간 또는 농도에 의존적으로 P4의 hESCs 세포사멸이 증가하였다.
4-3. ABT-263에 의한 P1 또는 P3 hESCs의 미토콘드리아 프라이밍(mitochondrial priming)
즉각적인 세포사멸을 의미하는 미토콘드리아 프라이밍이 ABT-263에 의해YM155R hESCs에서 회복되는지 확인하였다.
구체적으로, P1 또는 P3의 hESCs에 50 nM의 ABT-263, ABT-737, 또는 에토포시드(etoposide)를 처리하고, JC-1으로 염색한 후 FACS 분석을 통해 MMT(mitochondrial membrane potential) 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 24 및 25에 나타낸 바와 같이, P1 hESCs의 MMT는 에토포시드에 의해 불안정해 졌으나 ABT-263 또는 ABT-737에 의해서는 영향이 없었고, P3 hESCs의 MMT는 ABT-263 또는 ABT-737에 의해 불안정해졌다. 이는 ABT-263 또는 ABT-737이 YM155R hESCs 특이적인 미토콘드리아 의존적인 세포사멸 능력을 회복시킴을 의미한다.
4-4. WEHI-539에 의한 P1 또는 P4 hESCs의 세포사멸
ABT-263 및 ABT-737은 BCL-xL 단백질을 특이적으로 타겟하지 않기 때문에, BCL-xL 단백질 억제제의 YM155R hESCs의 세포사멸 유도를 검증하기 위해 BCL-xL 단백질을 선택적으로 억제하는 WEHI-539에 의한 YM155R hESCs의 세포사멸을 확인하였다.
구체적으로, P1 또는 P4의 hESCs에 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 μM의 WEHI-539를 처리하고, 처리한 세포를 PI(Propidium iodide) 로 염색하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 세포 생존률을 분석하였다.
그 결과, 도 26 및 27에 나타낸 바와 같이, WEHI-539에 의해 P4의 hESCs 세포사멸이 증가하였다.
상기 결과는 BCL-xL 단백질 억제제가 YM155R hESCs의 세포사멸을 유도할수 있음을 제시한다.
실험예 5. BCL-xL 단백질 억제제에 의한 YM155R hESCs의 선택적 제거
BCL-xL 단백질 억제제가 공동배양(co-culture)되는 YM155S hESCs 및 YM155R hESCs에 대해 YM155S hESCs는 손상시키지 않고 YM155R hESCs만을 선택적으로 제거할 수 있는지 확인하였다.
5-1. ABT-263에 의한 P4 hESCs의 선택적 세포사멸
ABT-263이 P4 hESCs만을 선택적으로 세포사멸시키는지 확인하였다.
hESCs에 대한 선택적 형광염색 프로브(probe)인 CDy 1으로 P4 hESCs를 염색하고, 이를 P2 hESCs와 공동배양하였다. 여기에 37.5 nM의 ABT-263을 48시간 동안 처리하고, 면역 형광 염색 세포 화학 분석(immunofluorescence cytochemistry)을 수행하였다. 구체적으로, 4%의 PFA(paraformaldehyde)에서 20분 동안 세포를 고정한 뒤 0.1%의 Triton X-100을 포함하는 PBS에서 10분 동안 투과처리하고, 5%의 정상 혈청 알부민으로 30분 동안 블로킹(blocking)하였다. 항-Ccasp-3 항체를 4℃에서 밤새 처리한 후, CyTM2(Jackson Immuno. Research Laboratories) 및 Alexa Fluor® 594가 결합된 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리, 형광 현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 마커인 Ccas-3 단백질은 CDy 1으로 염색한 P4 hESCs에서는 검출되었으나, CDy 1으로 염색하지 않은 P2 hESCs에서는 검출되지 않았다. 이는 ABT-263에 의해 YM155R hESCs만이 선택적으로 세포사멸되었음을 의미한다.
5-2. CDyl1의 오프 타겟 효과(off-target effect) 배제
실험예 5-1의 결과에서 CDy 1의 오프 타겟 효과(off-target effect)를 배제하기 위해, CDy 1으로 염색하지 않은 P4 hESCs와 EGFP-P1 hESCs를 공동배양하였다. 여기에 37.5 nM의 ABT-263을 48시간 동안 처리한 뒤 10분마다 세포모양을 관찰하였고, 5일 동안 세포를 회복시킨 후 세포 수를 FACS 분석으로 측정하였다.
그 결과, 도 29 및 30에 나타낸 바와 같이, ABT-263을 처리한 이후 대다수의 EGFP-P1 hESCs는 생존하였으나, P4 hESCs는 급격히 사멸하였고, 공동배양 세포 집단에서 P4 보다 P1의 hESCs가 다수를 이루었다.
5-3. WEHI-539에 의한 P4 hESCs의 선택적 세포사멸
WEHI-539이 P4 hESCs만을 선택적으로 세포사멸시키는지 확인하였다.
먼저, P4 hESCs와 EGFP-P1 hESCs를 공동배양한 뒤 0, 0.5, 0.75, 1.0, 또는 2.0 μM의 WEHI-539를 40시간 동안 처리하고, 처리한 세포를 Annexin-V로 염색하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 세포 생존률을 분석하였다. 한편, P4 hESCs와 EGFP-P1 hESCs를 공동배양한 뒤 1.0 μM의 WEHI-539를 48시간 동안 처리하고 10분마다 세포모양을 관찰하였고, 5일 동안 세포를 회복시킨 후 세포 수를 FACS 분석으로 측정하였다.
그 결과, 도 31 및 32에 나타낸 바와 같이, WEHI-539에 의해 P4의 hESCs 세포사멸이 증가하였다. 또한, 도 33 및 34 에 나타낸 바와 같이, WEHI-539를 처리한 이후 대다수의 EGFP-P1 hESCs는 생존하였으나, P4 hESCs는 급격히 사멸하였고, 공동배양 세포 집단에서 P4 보다 P1의 hESCs가 다수를 이루었다.
5-4. Y-27632에 의한 P4 hESCs의 증식 억제
장시간 BCL-xL 억제제를 처리하면 YM155S hESCs까지 손상되기 때문에 YM155R hESCs를 완전히 제거하는 것은 어렵다. 아울러 남아있는 YM155R hESCs는 분리에 의해 유도되는 세포사멸(dissociation-induced apoptosis)에 저항성이 강해 결국 증식하여 YM155S hESCs보다 그 수가 많아질 수 있는데, 이때 세포 부착을 유도하는 Y-27632를 처리하면 이를 지연시킬 수 있는지 확인하였다.
P4 hESCs와 EGFP-P1 hESCs를 공동배양한 뒤 37.5 nM의 ABT-263을 처리하고, 5일 동안 세포를 회복시켰다. 회복시킨 세포에 10 mM의 Y-27632(Gibco)를 처리한 뒤 세포 수를 FACS 분석으로 측정하였다.
그 결과, 도 35에 나타낸 바와 같이, Y-27632 처리에 의해 P4 hESCs의 증식이 억제되었다.
상기 결과는 BCL-xL 단백질 억제제가 YM155R hESCs만을 선택적으로 제거할 수 있음을 제시한다.
실험예 6.YM155S hESCs의 전분화성(pluripotent) 유지
YM155R hESCs의 선택적 제거를 위해 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하더라도 YM155S hESCs의 전분화성은 유지되는지 확인하였다.
6-1. ABT-263을 처리한 P1 hESCs에서 Oct4 및 Lin-28A 단백질의 발현
ABT-263을 처리한 P1 hESCs(ABT-P1) 또는 처리하지 않은 P1 hESCs에서 전분화성 마커인 Oct4 및 Lin-28A 단백질의 발현을 비교하였다.
구체적으로, 항-Oct4 항체(Abcam, Cat# ab19857) 및 항-Lin-28A 항체(Cell signaling technologies, Cat# 3695P)를 처리한 것을 제외하고는 실험예 5-1과 동일한 방법으로 면역 형광 염색 세포 화학 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 36에 나타낸 바와 같이, ABT-263을 처리한 P1 hESCs(ABT-P1)에서 Oct4 및 Lin-28A 단백질의 발현량은 감소하지 않았다.
6-2. ABT-263을 처리한 P1 hESCs에서 POU5F1 및 NANOG 유전자의 발현
ABT-P1 또는 P1 hESCs에서 전분화성 마커인 POU5F1 및 NANOG 유전자의 발현을비교하였다.
구체적으로, 실험예 2-2와 동일한 방법으로 RT-qPCR을 수행하였고, 대조군은 hDF(human dermal fibroblast)를 이용하였다.
그 결과, 도 37에 나타낸 바와 같이, ABT-P1에서 POU5F1 및 NANOG 유전자의 발현량은 감소하지 않았다.
6-3. ABT-263을 처리한 P1 hESCs에서 알칼리포스파타제 활성
ABT-P1 또는 P1 hESCs에서 알칼리포스파타제 활성을 비교하였다.
구체적으로, 실험예 1-1과 동일한 방법으로 알칼리포스파타제 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 38에 나타낸 바와 같이, ABT-P1에서 알칼리포스파타제 활성은 감소하지 않았다.
6-4. ABT-263을 처리한 P1 hESCs의 외배엽(ectoderm), 중배엽(mesodern), 또는 내배엽(endoderm)으로의 분화
분화된 ABT-P1 또는 P1 hESCs에서 외배엽 분화 마커인 MSX1 유전자, 중배엽분화 마커인 NESTIN 유전자, 또는 내배엽 분화 마커인 SOX17 또는 AFP 유전자의 발현을 비교하였다.
구체적으로, 실험예 2-2와 동일한 방법으로 RT-qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 39에 나타낸 바와 같이, ABT-P1에서 MSX1, NESTIN, SOX17, 및 AFP 유전자의 발현량은 감소하지 않았다.
6-5. ABT-263을 처리한 P1 hESCs의 기형종(teratoma) 형성
ABT-263에 노출된 P1 hESCs가 전분화성을 그대로 유지하는지 확인하기 위해 기형종 형성능을 확인하였다.
구체적으로, 7주령의 Balb/C 누드 마우스에 5X106개의 ABT-P1 세포를 피하(subcutaneously) 및 피내(intracutaneously)로 주입한 뒤, 3 내지 3.5개월 후 마우스를 안락사시키고, 외배엽인 신경능선(neural crest), 중배엽인 연골(cartilage), 및 내배엽인 호흡상피(respiratory epithelium) 조직을 관찰하였다.
그 결과, 도 40에 나타낸 바와 같이, 모든 조직에서 기형종이 관찰되었다.
상기 결과는 BCL-xL 단백질 억제제가 YM155S hESCs의 전분화성 유지에 영향을 미치지 않음을 제시한다.

Claims (5)

  1. 다음 단계를 포함하며, 미분화 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPS)가 제거된, 유도만능줄기세포 유래 분화세포의 제조방법:
    (a) 유도만능줄기세포를 분화시켜 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포시료를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물에, 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BCL-xL 단백질 억제제를 처리하여 미분화 유도만능줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계:
    [화학식 1]
    Figure 112019065668566-pat00008

    [화학식 2]
    Figure 112019065668566-pat00009

    [화학식 3]
    Figure 112019065668566-pat00010
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 처리농도는 20μm-100μm이고,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 처리농도는 20μm-100μm이고,
    상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 처리농도는 1μm-10μm인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미분화 유도만능줄기세포는 하기 화학식 4로 표시되는 YM155에 대해 저항성이 있는 미분화 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 4]
    Figure 112019065668566-pat00011

    (상기 화학식 4에서, X-는 -1가의 음이온이다).
  5. 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 1종 이상의 BCL-xL 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 미분화 유도만능줄기세포의 선택적 사멸용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019065668566-pat00012

    [화학식 2]
    Figure 112019065668566-pat00013

    [화학식 3]
    Figure 112019065668566-pat00014
    .
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Chang, J. et al., Nature Medicine (2016) 22(1):78-83
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