KR102459911B1 - 황백을 유효성분으로 포함하는 미분화 인간 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 - Google Patents

황백을 유효성분으로 포함하는 미분화 인간 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 제거용 조성물, 및 (a) 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 황백 추출물을 처리하여 미분화 유도만능 줄기세포를 선택적으로 세포사멸 시키는 단계;를 포함하는 미분화 유도만능 줄기세포의 제거방법에 관한 것이다.
본 발명의 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 유도만능 줄기세포가 분화하는 과정에서 미분화 상태로 남아있는 줄기세포만을 효과적으로 제거할 수 있으며, 미분화 줄기세포로 인해 생성될 수 있는 기형종의 형성 억제 효과를 가지므로, 안전한 줄기세포 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Description

황백을 유효성분으로 포함하는 미분화 인간 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 {Composition for inducing selective apoptosis undifferentiated human induced pluripotent stem cells comprising Phellodendri Cortex}
본 발명은 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 제거용 조성물, 및 (a) 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 황백 추출물을 처리하여 미분화 유도만능 줄기세포를 선택적으로 세포사멸 시키는 단계;를 포함하는 미분화 유도만능 줄기세포의 제거방법에 관한 것이다.
유도만능 줄기세포는 만능분화능(pluripotency)을 가지고 있지 않던 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 만능분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, ① 세포의 모양(둥근 모양, 큰 핵과 인, 적은 세포질)과 자라는 속도(배아줄기세포의 분열시간: 17 hr)가 배아줄기세포와 유사하며, ② 유전자 발현과 염색체 변형(chromatin modification) 패턴이 배아줄기세포와 유사하며, ③ 만능분화능을 가지고, ④ 면역 결핍 생쥐에서 테라토마를 형성할 수 있으며, ⑤ 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라(chimera) 생쥐를 형성하며, ⑥ 유전자의 생식선 전이(germ line transmission)가 가능한 특성을 가진다.
다분화능(Pluripotency)에 핵심적인 역할을 하는 리프로그래밍 유도 전사인자들(Oct4, Sox-2, Klf4, cMyc)의 복합적인 과발현을 통해 체세포로부터 유도만능 줄기세포를 생산할 수 있는 역분화 기술이 최초로 개발됨에 따라 (Cell, 126: 663-676, 2006), 상기 기술을 바탕으로 세포치료제 및 신약개발을 주도하기 위한 세계 각국의 기술 개발 경쟁이 치열하게 진행되고 있다.
이러한 역분화 기술은 환자에게 신체적 손상 및 불편함이 거의 없는 비교적 손쉬운 방법으로 자가-체세포를 확보하고, 이로부터 인간 배아줄기 세포와 같은 특성의 유도만능 줄기세포를 제조하는 것을 가능케 함으로써, 환자-체세포로부터 맞춤형 자가 전분화능 줄기세포주를 확립하는 전략을 획기적으로 진화시켰으며, 인간 배아줄기세포 이용 시 야기될 수 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있는 최적의 해법으로 인식되면서, 미래 재생의료 기술 개발 분야에 무한한 가능성을 제시하고 있다. 또한, 이러한 역분화 만능줄기세포는 환자 면역 적합형 세포치료제 개발을 가능케 하며, 세포를 얻기 어려운 기관인 뇌나 심장 등의 세포로 분화 등을 가져올 수 있어 뇌질환이나 심장질환의 원인 규명과 치료 방법을 규명할 수 있는 이점을 가진다. 하지만, 역분화 기술의 우수성에도 불구하고, 이를 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발 단계에 활용하기 위해서는 낮은 역분화 효율, 역분화 과정에 소요되는 긴 시간 프레임 등의 극복되어야 하는 문제점들이 아직 남아있는 실정이어서, 유도만능 줄기세포의 제조 효율을 증진시킬 수 있는 기술의 개발이 요구되어 왔다.
미분화 유도만능 줄기세포에서 유래된 분화세포가 종양을 형성하는지는 알려져 있지 않지만, 세포 치료제의 성분 내에 포함된 미분화 세포에 의한 오염이 이소성 이식에서 인 비보(in vivo) 테라토마를 야기할 수 있다는 큰 우려가 있으며 (Nat Med 19: 998-1004 (2013); Nat Biotechnol 27(8): 743-745 (2009)), 실험적으로 이 우려가 마우스 배아줄기세포에서는 증명된 바 있다. 테라토마나 종양 등의 비정상적인 세포 성장의 형태는 상당한 건강상의 위험성을 갖고 있으며, 이는 이식한 세포나 조직의 기능의 손실을 야기할 수 있다. 실제로, SCID 마우스에 이식한 인간 태아 조직 내에 주입된 인간배아 줄기세포(hESCs)가 악성 종양으로 발전된 최근 연구가 존재한다. 이러한 종양 형성의 가능성 때문에, 재생의학의 세포치료에 있어서 미분화 유도만능 줄기세포의 임상적 적용을 어렵게 한다. 즉, 미분화 유도만능 줄기세포-유래 분화세포의 임상적 적용을 위해서는 상기 세포가 종양 형성의 위험성으로부터 자유롭다는 것에 대한 확실한 보장을 요구하며, 이러한 문제를 해결하기 위하여 다양한 접근방식들이 제안되고 있으나, 그 효율성 및 안정성 측면에서 여전히 한계가 존재한다.
한편, 황백(Phellodendri Cortex)은 운향과(Rutaceae) 황백속(genus Phellodendron)에 속하는 황벽나무 또는 황피수(黃皮樹)의 줄기껍질로서 주피를 제거한 것을 의미한다. 한방에서는 주로 위장염, 복통, 황달, 설사 등의 증상에 사용한 것으로 알려져 있으며, 항염, 항당뇨, 항균 활성 등에 대해서 연구된 바 있다 (Journal of Natural Medicines (2007) 71: 745-756; BMB reports (2008) 41(10): 710-715). 그러나, 유도만능줄기세포의 선택적 세포사멸과 관련해서는 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 줄기세포의 분화 후에 잔재하는 미분화 유도만능 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과, 황백 추출물을 처리할 경우 미분화된 유도만능 줄기세포의 선택적인 세포사멸을 유도하여 미분화 유도만능 줄기세포를 매우 효과적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 황백 추출물을 처리하여 미분화 유도만능 줄기세포를 선택적으로 세포사멸 시키는 단계;를 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 제거방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 사멸 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 양태는 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 "황백(Phellodendri Cortex)"은 운향과(Rutaceae) 황백속(genus Phellodendron)에 속하는 황벽나무 또는 황피수(黃皮樹)의 줄기껍질로서 주피를 제거한 것을 의미한다. 구체적으로, 페로덴드리온 아뮤렌스(Phellodendron amurense), 또는 페로덴드리온 치넨시스(Phellodendron chinense)의 줄기껍질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 황백은 자연에서 채취하거나, 상업적으로 판매되는 것을 구입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는, 황백 추출물을 미분화 유도만능 줄기세포에 처리하는 경우, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 세포 사멸을 유도하는 것을 확인한 바, 황백 추출물을 미분화 줄기세포의 제거 용도로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였다.
본 발명의 "황백 추출물"은 하나 이상의 용매로 추출하여 수득한 추출물의 형태를 의미하는 것으로, 상기 추출물의 제조에 사용되는 용매로는 물, 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 4(C4) 알코올, 바람직하게는 에탄올, 메탄올 또는 부탄올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출 방법으로는 용매 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 또는 증기 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "유도만능 줄기세포 (iPSC: induced pluripotent stem cell)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화 줄기세포라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능 줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는, 비슷한 세포 모양을 보여준다. 또한, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하고, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능 줄기세포이다.
본 발명에서의 용어, "분화"는　세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상. 즉　생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미하며, "분화된 세포(differentiated cells)"는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된 세포, 구체적으로는 0% 이상 내지 100% 미만의 세포 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 이에, 역분화에 의해 전부 또는 일부가 미분화될 수 있는 범주 내의 세포는 모두 분화된 세포로 포함되며, 예를 들어 체세포 또는 전구세포가 포함된다. 상기 0%의 세포 분화능을 가지는 세포는 체세포에 해당될 것이다.
또한, "미분화"는 상기 분화와 반대되는 의미를 가진 용어로서, 세포가 분열 증식하기 전의 상태를 의미하며, 미분화 유도만능 줄기세포(undifferentiated induced pluripotent stem cells)는 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래와 세포와 동일한 성질을 가지는, 즉, 전분화능을 가지는 다능성 줄기세포로 유지되어 있는 세포를 의미한다.
본 발명에서의 용어, "체세포"는 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미한다.
본 발명에서의 용어, "전구세포"는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전단계의 특정 세포 계통의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직으로 형성될 수 있는 세포로서, 자가재생산능(self-renewal)은 가지나 극히 제한된 분화능을 갖는 세포를 의미하며, 내배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 및 외배엽 전구세포가 모두 포함된다.
본 발명에서 용어, "세포사멸"은 세포자살 또는 아폽토시스(apoptosis)와 혼용되어 사용되며, 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체　프로그램으로 비정상 세포, 손상된 세포, 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전체적인 신체건강을 유지하게 해 주는 메커니즘을 말한다.
본 발명에서 말하는 "선택적 세포사멸"은 분화된 세포에는 영향, 구체적으로는 세포독성의 영향을 미치지 아니하고, 분화되지 않은 미분화 유도만능 줄기세포에 대하여 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 말한다.
본 발명에서 미분화 유도만능 줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 “제거(depletion or removal)”는 세포 시료, 즉 비균질 세포 파퓰레이션(population)으로부터 미분화 유도만능 줄기세포가 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 세포 조성물을 의미한다. 예를 들어, 상기 제거는 본 발명의 방법이 적용된 세포 시료에서 미분화 유도만능 줄기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만이 되도록 하는 것을 의미한다. 상기 용어 “%”는 세포개수(cell count)를 기준으로 한 백분율이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 황백 추출물이 미분화 인간 유도만능 줄기세포 단독 (실시예 2), 및 분화세포와의 공동배양 조건에서도 미분화 유도만능 줄기세포에 대한 선택적인 세포사멸을 유도하고 (실시예 3), 분화세포의 DNA에는 손상을 미치지 않음을 확인하였다 (실시예 5).
본 발명의 황백 추출물은 기형종 형성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 "기형종(teratoma)"은 다분화능을 가지는 세포에 의해서 발생하는 종양으로, 악성 기형종의 경우 자가면역질환 또는 암을 발생시킬 위험이 있으며, 양성이라 하더라도 발생한 위치에 따라 통증이 나타날 수 있어 대부분 수술을 통하여 제거가 필요하다. 또한, 만능 줄기세포를 분화시키는 단계에서 잔존하는 미분화 줄기세포를 이식하는 경우 기형종이 형성될 수 있으므로, 세포 치료제의 개발 과정에서 기형종의 형성 억제는 안전성 측면에서 매우 중요하다.
본 발명의 "기형종"은 "테라토마"와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 황백 추출물 처리에 의하여 미분화 유도만능 줄기세포에 의하여 형성된 기형종의 크기가 약 76% 감소된 것을 확인한 바 (실시예 4), 황백 추출물의 기형종 형성 억제 효과가 매우 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 황백 추출물을 처리하여 미분화 유도만능 줄기세포를 선택적으로 세포사멸시키는 단계;를 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 제거방법을 제공한다.
상기 용어 "미분화", "유도만능 줄기세포", "분화", "황백 추출물", "선택적 세포사멸" 및 "제거"는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 발명에서 이용되는 미분화 유도만능 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 유래의 유도만능 줄기세포이다.
본 발명의 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 유도만능 줄기세포가 분화하는 과정에서 미분화 상태로 남아있는 줄기세포만을 효과적으로 제거할 수 있으며, 미분화 줄기세포로 인해 생성될 수 있는 기형종의 형성 억제 효과를 가지므로, 안전한 줄기세포 치료제 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 황백 추출물이 미분화 유도만능 줄기세포에만 선택적으로 세포사멸을 유도함을 확인한 도이다.
도 2는 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포의 공동배양(co-culture) 조건에서 황백 추출물이 미분화 유도만능 줄기세포에만 선택적으로 세포사멸을 유도함을 확인한 도이다.
도 3은 황백 추출물의 기형종 형성 억제 효과를 평가한 도이다.
도 4는 분화세포에 황백 추출물을 처리하여 DNA의 손상 여부를 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 황백 추출물의 제조
중국산 황백을 무게의 약 10배의 70% 에탄올에 3시간 환류 추출한 후 거름망으로 여과하고 동결건조하여 분말 형태로 제조하였다. 이를 실험에 사용하기 위하여 10% DMSO에 50 mg/ml 농도로 녹인 후 0.22μm syringe filter로 여과한 후 -20℃ 냉동보관하여 사용하였다.
실시예 2. 미분화 인간 유도만능 줄기세포에 대한 황백 추출물의 선택적 세포독성 확인
Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 24-웰 배양접시에 미분화 인간 유도만능 줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)를 접종한 후, mTeSR1 배양배지(STEMCELL technologies, USA)에서 24시간 배양하였다. hiPSCs-유래 분화세포(hiPSC-Diffs) 는 24-웰 배양접시에 접종 후 DMEM 배지 (10% FBS, NEAA, PS, 2-ME 첨가)에서 24시간 배양하였다. 약 50% 정도 세포 컨플루언시(confluency)가 확인되면, 황백 추출물을 2.5, 5, 10μg/ml의 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, crystal violet solution으로 염색하여 흡광도 측정을 통해 세포 생존율을 확인하였으며 (도 1B), 각 세포의 형태학상 변화를 확인하기 위하여, 배양 플레이트에서의 세포사멸 형태를 현미경으로 확인하였다 (도 1A).
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 미분화 hiPSC는 황백 추출물의 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소한 것을 확인하였다. 이에 반해, 분화세포 (hiPSC-Diffs)에 대해서는 황백 추출물의 10μg/ml 농도까지 세포독성이 없으며, 세포 생존율이 95% 이상 유지되는 것을 확인하였다. 즉, 황백 추출물이 미분화 유도만능 줄기세포에만 선택적으로 세포독성이 있음을 확인한 바, 황백 추출물은 미분화 유도만능 줄기세포에 대하여 선택적 세포사멸 효능이 있음을 시사한다.
실시예 3. 분화세포와의 공동배양(co-culture) 조건에서 미분화 인간 유도만능 줄기세포에 대한 황백 추출물의 선택적 세포독성 확인
미분화 유도만능 줄기세포(hiPSC) 및 분화세포(hiPSC-Diffs)를 함께 공동 배양하는 조건에서 황백 추출물을 처리하는 경우, 미분화 유도만능 줄기세포만이 선택적으로 제거되는지 여부를 확인하였다. 먼저, hiPSC를 green 형광 염색 시약인 CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)로 라벨링하고, 분화세포를 green 라벨링된 미분화 유도만능 줄기세포에 넣어준 후, overnight 동안 공동배양 하였다. 그 후, 황백 추출물을 2.5, 5, 10μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후, 세포 형태 및 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 미분화 유도만능 줄기세포를 표시하는 green fluorescence는 농도 의존적으로 감소된 반면, 공동배양 된 분화세포는 세포독성을 나타내지 않고 잘 자라는 것을 확인하였다. 즉, 황백 추출물은 분화세포와의 공동배양 조건에서도 미분화 유도만능 줄기세포에만 선택적으로 세포독성이 있음을 확인한 바, 미분화 유도만능 줄기세포에 대하여 선택적 세포사멸 효능이 있다는 실시예 2의 결과와 상응한다.
실시예 4. 황백 추출물의 기형종 생성 억제 효과 확인
실시예 3의 방법과 동일하게 공동배양 된 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포에, 황백 추출물 10μg/ml를 처리하고 24시간 후 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 matrigel과 잘 혼합한 후, ED (embryonic development) day 10 유정란의 CAM에 로딩하였다. 약 10일 동안 인큐베이션 한 후, 기형종(teratoma) 형성 여부 및 크기를 확인하였으며 (도 3A), 기형종을 절제하여 그 무게를 측정하였다 (도 3B).
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 황백 추출물을 처리한 군의 기형종 무게는 평균 14.56mg인 것에 비해, 황백 추출물을 처리하지 않은 군의 기형종 무게는 평균 60.7mg으로, 황백 추출물 처리에 의해 기형종의 크기가 약 76% 감소된 것을 확인하였다. 이를 통해, 황백 추출물은 기형종 형성 억제 효과가 있음을 확인한 바, 줄기세포의 이식 시 기형종 형성 위험성을 낮춰, 세포 치료제의 개발에 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 황백 추출물에 의한 분화세포의 DNA 손상 여부 확인
황백 추출물이 분화된 줄기세포(hiPSC-Diff)의 DNA를 손상시키는 지 여부를 확인하기 위하여, DNA 손상 시 그 발현이 증가되는 것으로 알려진 γ-H2AX foci 및 phospho-ATM 단백질의 발현 정도를 면역형광염색 (도 4A)및 웨스턴 블롯 (도 4B)을 통해 확인하였다.
구체적으로, 분화 인간 유도만능 줄기세포를 35mm 유리접시에 접종한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후황백 추출물을 5μg/ml, 10μg/ml의 농도로 처리하여, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 DNA 손상을 유도하는 양성 약물로 독소루비신(doxorubicin)을 0.25μM, 0.5μM 농도로 처리하였다. 추가 배양 후, 생리 식염수로 2회 세척하고 10% 포르말린(formalin)을 넣어 30분간 실온에서 고정하였다. 세척한 후 0.1% Triton X-100를 넣고 실온에서 30분간 침투 (permeabilization) 시킨 후 다시 생리 식염수로 2회 세척하였다. 3% BSA가 포함된 생리 식염수를 넣은 후 실온에서 60분간 blocking 시킨 후, 항-γ-H2AX 항체 (1:250 희석)를 넣어 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 생리식염수로 3회 세척한 후, Alexa-594가 라벨 된 2차 항체(1:500 희석)를 넣어 실온에서 3시간 반응시켰다. 다시 생리식염수로 3회 세척한 후, DAPI로 대조 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, 황백 추출물 처리군에서는 γ-H2AX foci가 나타나지 않은 반면, 독소루비신 처리 군에서는 γ-H2AX foci가 현저히 증가한 것을 확인하였다.
또한, 상기 실험 과정 중, 24시간 추가 배양 후, 세포를 모두 회수한 다음 생리 식염수로 2회 세척하고, 세포의 전체 cell lysate는 MPER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 준비하였다. cell lysate은 BCA (Bicinchoninic Acid) 단백질 분석으로 단백질 농도를 정량하였고, 동량의 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한 후, Immunobilon PVDF membrane(Millipore, Bedford, MA)에 옮긴 후 Immunoblotting을 수행하였다. 단백질 발현 정도는 ECL 용액과 반응시킨 후, ImageQuant LAS 4000 mini(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 가시화하였다.
그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 분화세포에 처리하자 DNA 수리에 관여하는 인산화된 ATM 단백질(p-ATM) 및 p-H2AX 단백질의 발현이 증가한 반면, 황백 추출물 처리군에서는 p-ATM 및 p-H2AX의 발현이 크게 증가하지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 황백 추출물은 분화된 유도만능 줄기세포의 DNA에 손상을 미치지 않음을 확인한 바, 안전한 줄기세포 치료제 개발에 황백 추출물이 활용될 수 있음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미분화 유도만능 줄기세포는 인간으로부터 유래된 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 황백 추출물은 기형종 형성을 억제하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조되는 것인, 조성물.
  5. 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 선택적 제거용 조성물.
  6. (a) 미분화 유도만능 줄기세포 및 분화세포를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 시료에 황백 추출물을 처리하여 미분화 유도만능 줄기세포를 선택적으로 세포사멸 시키는 단계;를 포함하는, 미분화 유도만능 줄기세포의 제거방법.
KR1020200173735A 2020-12-11 2020-12-11 황백을 유효성분으로 포함하는 미분화 인간 유도만능 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 KR102459911B1 (ko)

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