KR102159333B1 - 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포사멸 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물, 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 제거용 조성물, (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법, 및 상기 방법으로 미분화 다능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물에 관한 것이다.
만능줄기세포가 분화하는 과정에서 잔존하는 미분화줄기세포는 세포치료제로 이식 시 테라토마(기형종)를 형성할 수 있는 문제점을 가지는 상황에서, 본 발명의 하고초 추출물을 포함하는 조성물은 만능줄기세포가 분화하는 과정에서 미분화 상태로 남아있는 줄기세포만을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 안전한 줄기세포 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Description

하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포사멸 방법{Composition for inducing selective apoptosis undifferentiated pluripotent stem cells comprising prunellae spica extracts and the Method for inducing selective apoptosis using the same}

본 발명은 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물, 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 제거용 조성물, (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 하고초 박 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법, 및 상기 방법으로 미분화 다능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물에 관한 것이다.

유도만능줄기세포는, 만능분화능(pluripotency)을 가지고 있지 않던 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 만능분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, ① 세포의 모양(둥근 모양, 큰 핵과 인, 적은 세포질)과 자라는 속도(배아줄기세포의 분열시간: 17 hr)가 배아줄기세포와 유사하며, ② 유전자 발현(gene expression) 과 염색체 변형(chromatin modification) 패턴이 배아줄기세포와 유사하며, ③ 만능분화능을 가지고, ④ 면역 결핍 생쥐에서 테라토마를 형성할수 있으며, ⑤ 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라(chimera) 생쥐 를 형성하며, ⑥ 유전자의 생식선 전이(germ line transmission)가 가능한 특성을 가진다.

2006년 세계 최초로 일본 교토대 야마나카 교수팀에 의해 다분화능(Pluripotency)에 핵심적인 역할을 하는 리프로그래밍 유도 전사인자들(Oct4, Sox-2, Klf4, cMyc)의 복합적인 과발현을 통해 체세포로부터 유도만능줄기세포를 생산할 수 있는 역분화 기술이 개발됨에 따라(Cell, 126: 663-676, 2006), 상기 기술을 바탕으로 세포치료제 및 신약개발을 주도하기 위한 세계 각국의 기술 개발 경쟁이 치열하게 진행되고 있다.

이러한 역분화 기술은 환자에게 신체적 손상 및 불편함이 거의 없는 비교적 손쉬운 방법으로 자가-체세포를 확보하고, 이로부터 인간배아줄기 세포와 같은 특성의 유도만능줄기세포를 제조하는 것을 가능케 함으로써, 환자-체세포로부터 맞춤형 자가 전분화능 줄기세포주를 확립하는 전략을 획기적으로 진화시켰으며, 인간 배아줄기세포 이용 시 야기될 수 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있는 최적의 해법으로 인식되면서 미래 재생의료 기술 개발 분야에 무한한 가능성을 제시하고 있다. 또한, 이러한 역분화 만능줄기세포는 환자 면역 적합형 세포 치료제 개발을 가능케 하며, 세포를 얻기 어려운 기관인 뇌나 심장 등의 세포로 분화 등을 가져올 수 있어 뇌질환이나 심장질환의 원인 규명과 치료 방법을 규명할 수 있는 이점을 가진다. 하지만, 역분화 기술의 우수성에도 불구하고, 이를 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발 단계에 활용하기 위해서는 낮은 역분화 효율, 역분화 과정에 소요되는 긴 시간 프레임 등의 극복되어야 하는 문제점들이 아직 남아 있는 실정이어서, 유도만능줄기세포의 제조 효율을 증진시킬 수 있는 기술의 개발이 요구되어 왔다.

미분화 다능성 줄기세포에서 유래된 분화세포가 종양을 형성하는지는 알려져 있지 않지만, 세포치료제의 성분 내에 포함된 미분화 세포에 의한 오염이 이소성 이식에서 인 비보(in vivo) 테라토마를 야기할 수 있다는 큰 우려가 있으며 (Lee AS, Tang C, Rao MS et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies (2013). Nat Med 2013;19:998-1004; Miura K, et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines (2009). Nat Biotechnol 27(8):743-745), 실험적으로 이 우려가 마우스 배아줄기세포에서는 증명된 바 있다. 미미하지만, 테라토마나 다른 비정상적인 세포 성장 (종양)의 형태는 상당한 건강상의 위험성을 갖고 있으며, 이는 이식한 세포나 조직의 기능의 손실을 야기할 수 있다. 실제로, 최근 보고에서 SCID 마우스에 이식한 인간 태아 조직 내에 주입된 인간배아줄기세포(hESCs)가 악성종양으로 발전된 결과가 있다. 이러한 종양 형성 가능성 때문에, 재생의학의 세포치료에 미분화 다능성 줄기세포, 구체적으로는 미분화 유도만능줄기세포를 임상적으로 적용하는 것을 어렵게 한다.

이러한 불확실성 때문에, 미분화 다능성 줄기세포-유래 분화세포의 임상적 적용은, 이 세포가 종양형성의 위험성으로부터 자유롭다는 것에 대한 확실한 보장을 요구한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 다양한 접근방식들이 제안되고 있는 추세이기는 하나, 여전히 이러한 접근에 대한 문제점은 한계가 있다는 문제점도 존재한다.

한편, 하고초(Prunellae spica)는 꿀풀과(Labiatae) 꿀풀속에 속한 다년생 초본인 꿀풀의 지상부 전초를 의미하는 것으로서, 주로 림프선에 멍울이 생기거나 가슴에 멍울이 만져지는 증상에 응용되는 것으로 보고되는데, 갑상선 비대, 고혈압 여성의 유선 증가에서 증상을 치료하며, 그 외 간염 또는 임파선 통증에 사용된다고 알려져 있다. 그러나 유도만능줄기세포의 선택적 세포사멸과 관련하여서는 보고된 바가 없다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 줄기세포의 분화 후에 잔재하는 미분화 다능성 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과, 하고초 추출물을 처리할 경우 미분화된 유도만능줄기세포의 선택적인 세포사멸을 유도하여 미분화 다능성 줄기세포를 매우 효과적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 사멸 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 제거용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계;를 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 미분화 다능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 사멸 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 양태는 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 제거용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 용어, "하고초(夏枯草)"는 꿀풀과(Labiatae) 꿀풀속에 속한 다년생 초본인 꿀풀의 지상부 전초를 의미하는 것으로서, 구체적으로, 프루넬라 불 알루티카(Prunella vulgaris var. aleutica), 프루넬라 불가리스 아시아티카(Prunella vulgaris var. asiatica), 프루넬라 불가리스 피나티피다(Prunella vulgaris pinnatifida Pers.), 프루넬라 불가리스 리라시나(Prunella vulgaris var. for lilacina), 프루넬라 불가리스 알비플로라(Prunella vulgaris var. for. albiflora) 및 프루넬라 불가리스 린네(Prunella vulgaris Linne)의 지상부 전초 또는 꽃대 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 하고초는 자연에서 채취하거나, 상업적으로 판매되는 것을 구입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는, 이러한 하고초 추출물을 미분화 다능성 줄기세포에 처리하는 경우, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포 사멸을 유도하는 것을 규명하여, 이를 미분화 다능성 줄기세포의 제거 용도로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였다.

상기 "하고초 (Prunellae Spica) 추출물"은 하나 이상의 용매로 추출하여 수득한 추출물의 형태를 의미하는 것으로, 본 발명에서 상기 추출물은 "PS (prunellae spica)"와 혼용될 수 있다.

상기 추출물의 제조에 사용되는 용매로는 물, 탄소수 1(C₁) 내지 탄소수 4(C₄) 알코올, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출방법으로는 용매 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 또는 증기 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어, "다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 전능성 줄기세포와 혼용되어 사용될 수 있고, 구체적으로는 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어, "배아줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.

본 발명에서의 용어, "유도만능줄기세포"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포 (iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이 러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여준다. 또한, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하고, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기 세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.

본 발명에서의 용어, "분화"는　세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상. 즉　생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미하며, "분화된 세포"는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된 세포, 구체적으로는 0% 이상 내지 100% 미만의 세포 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 이에, 역분화에 의해 전부 또는 일부가 미분화될 수 있는 범주 내의 세포는 모두 분화된 세포로 포함되며, 예를 들어 체세포 또는 전구세포가 포함된다. 상기 0%의 세포 분화능을 가지는 세포는 체세포에 해당될 것이다.

또한, "미분화"는 상기 분화와 반대되는 의미를 가진 용어로서, 세포가 분열 증식하기 전의 상태를 의미하며, 미분화 다능성줄기세포는 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래와 세포와 동일한 성질을 가지는, 즉, 전분화능을 가지는 다능성 줄기세포로 유지되어 있는 세포를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "체세포"는 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가 생산능이 제한된 세포를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "전구세포"는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 특정 세포 계통의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직으로 형성될 수 있는 세포로서, 자가재생산능(self-renewal)은 가지나 극히 제한된 분화능을 갖는 세포를 의미하며, 내배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 및 외배엽 전구세포가 모두 포함된다.

본 발명에서 용어, "세포사멸"은 세포자살 또는 아폽토시스(Apoptosis)와 혼용되어 사용되며, 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체　프로그램으로 비정상 세포, 손상된 세포, 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전체적인 신체건강을 유지하게 해 주는 메커니즘을 말한다.

본 발명에서 말하는 "선택적 세포사멸"은 분화된 세포에는 영향, 구체적으로는 세포독성의 영향을 미치지 아니하고, 분화되지 않은 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 말한다.

구체적으로, 상기 하고초 추출물은 p53을 활성화시켜 세포사멸을 유도하여 미분화 다능성 줄기세포를 제거하게 된다.

본 발명에서 용어, "p53"은 p53 단백질로, SV40바이러스에서　형질전환한 세포 내에 고(高)발현하는 단백질의 하나로서 발견하여 393개의　아미노산으로 구성되어 있다고 알려져 있다. 그　유전자는 대표적인 암　억제유전자로서 알려져 있으며, 사람　p53유전자(p53　gene)는 제17염색체상의 단완(短腕) 13.1에 위치한다. 전 사람 암의 반수이상에서 이 유전자의 변이를 확인하고 또한 거의 대부분의 정상조직에서 발현하며, 중요한 기능을 갖는 단백질이고, 일반적으로는 암세포에서 고발현하고 있는 p53은 변이형 p53으로 알려져 있다.

본 명세서에서 미분화 다능성 줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 “제거(depletion or removal)”는 세포 시료 즉 비균질 세포 파퓰레이션으로부터 미분화 다능성 줄기세포를 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 세포 조성물을 의미한다. 예를 들어, 용어 제거는 본 발명의 방법이 적용된 세포 시료에서 미분화 다능성 줄기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만이 되도록 하는 것을 의미한다. 상기 용어 “%”는 세포개수(cell count)를 기준으로 한 백분율이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 하고초 추출물 처리 후 세포의 형태학적 변화에서 세포사멸이 유도되고 회전 스페로이드 크기(Spheroid size)가 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였으며(도 1), 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 세포 주기 어레스트 및 프로그램된 세포사멸이 유도되고(도 2), 특히, 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 ROS 생성 및 미토콘드리아 막전위가 감소하고(도 3), p53 의존적으로 세포를 사멸함을 확인하였다(도 4). 또한, 미분화 iPSC와 달리, 분화된 줄기세포에 대해서는 하고초 추출물이 전혀 세포독성을 가지지 않음을 확인하였다(도 5).

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 사멸시키는 단계;를 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법을 제공한다.

상기 각각의 단계를 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다.

구체적으로, (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화 세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료의 준비(preparation) 단계에서, 상기 세포 시료는 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 미분화 다능성 줄기세포(예컨대, 유도만능줄기세포, iPSCs)를 분화시킨(예컨대, 신경 세포로 분화) 결과물이 상기 세포 시료이다. 미분화 다능성 줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 미분화 다능성 줄기세포가 소량 잔존해 있다. 따라서, 분화시킨 결과물을 세포 치료제로 이용하기 위해서는 미분화 다능성 줄기세포의 완전한 제거가 필요하다.

여기에서, 본 발명의 용어 "미분화 다능성 줄기세포" 및 "분화 세포"는 상기에서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도전능줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSCs)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 유도만능줄기세포일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 이용되는 미분화 다능성 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기세포이다.

상기 세포 시료는 미분화 다능성 줄기세포를 특정 세포로 분화시킨 세포를 포함하는 시료이며, 구체적으로 상기 세포 시료는 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포를 모두 포함하는 시료를 말하고, 보다 구체적으로는 미분화 유도만능줄기세포 및 분화세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

다음으로, (b) 상기 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 세포사멸시키는 단계는, 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 제거하기 위해 상기 (a)의 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하는 것을 의미한다.

여기에서, "하고초 추출물", "미분화 다능성 줄기세포", "선택적 세포사멸", 및"제거"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법은 하고초 추출물을 (a)의 세포 시료에 처리하여 미분화된 다능성 줄기세포가 선택적으로 세포 사멸될 수 있도록 유도함으로써 제거되는 것을 말하며, 구체적으로는 분화 및 미분화 줄기세포가 함께 있는 시료에서 미분화 줄기세포가 선택적으로 사멸된 것을 확인하기 위해 NOD/SAD 마우스에 접종 후 in vivo 테라토마 생성 여부를 확인하거나, 또는 미분화 마커인 Oct4, nanog, 또는 sox-2등의 발현을 확인해 볼 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 명세서에서 미분화 다능성 줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 제거(depletion or removal)”는 세포 시료 즉 비균질 세포 파퓰레이션으로부터 미분화 다능성 줄기세포를 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 세포 조성물을 의미한다. 예를 들어, 용어 제거는 본 발명의 방법이 적용된 세포 시료에서 미분화 다능성 줄기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만이 되도록 하는 것을 의미한다. 상기 용어 “%”는 세포개수(cell count)를 기준으로 한 백분율이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상술한 본 발명의 제조방법에 의해 미분화 다능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "상술한 본 발명의 제조방법"은 상기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 제조방법을 말하며, "미분화 다능성 줄기세포"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 세포 조성물은 미분화 다능성 줄기세포가 제거된 조성물이다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 세포 조성물은 동물에 이식 시 테라토마(teratoma)를 형성하지 않는 안전한 조성물이다.

만능줄기세포가 분화하는 과정에서 잔존하는 미분화줄기세포는 세포치료제로 이식 시 테라토마(기형종)를 형성할 수 있는 문제점을 가지는 상황에서, 본 발명의 하고초 추출물을 포함하는 조성물은 만능줄기세포가 분화하는 과정에서 미분화 상태로 남아있는 줄기세포만을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 안전한 줄기세포 치료제 개발에 활용될 수 있다.

도 1은 미분화 유도만능줄기세포에 대한 하고초 추출물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 미분화 유도만능줄기세포에 하고초 추출물 처리 시 세포주기 어레스트 및 프로그램된 세포사멸 유도 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 미분화 유도만능줄기세포에 하고초 추출물 처리 시 ROS 생성 및 미토콘드리아 막전위 감소 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 미분화 유도만능줄기세포에 하고초 추출물 처리 시 p53 의존적인 세포 사멸 기전을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 분화된 줄기세포에 대한 하고초 추출물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 하고초 추출물의 제조

중국산 하고초를 무게의 약 10배의 70% 에탄올에 3시간 환류 추출한 후 거름망으로 여과하고 동결건조하여 분말 형태로 제조하였다 (수율 6.28%). 이를 실험에 사용하기 위하여 10% DMSO에 50 mg/ml 농도로 녹인 후 0.22 μm syringe filter로 여과한 후 -20℃ 냉동보관하여 사용하였다.

실시예 2: 미분화 iPSC에 대한 하고초 추출물(PS)의 세포독성 확인

먼저, 하고초 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 후 세포생존률을 CCK 어세이로 분석하였다. 이를 위해, Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 24-웰 배양 플레이트(24-well culture plate)에 미분화 iPSC를 씨딩(seeding)한 후 mTeSR1 배양배지 (STEMCELL technologies, USA)에서 24시간 배양하였다. 약 50% 정도 세포 컨플루언시(confluency)가 확인되면, 상기 실시예에서 제조한 하고초 추출물 (PS)을 5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 및 100 μg/ml 의 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 CCK 용액 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)을 첨가하고 1-4시간 경과한 후, SpectraMaxi3 Multi-mode reader (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

또한, 하고초 추출물을 처리하고 24시간 후 세포의 형태학상 변화를 확인하기 위해, 배양 플레이트에 부착되어 있는 세포 모양 및 부착성이 떨어져 세포모양이 둥글게 변화는 등의 세포사멸 형태를 현미경으로 확인하였다.

또한, 3D-spheroid culture 조건에서 PS 처리에 의한 변화를 확인하기 위해, 미분화 iPSC를 mTeSR1 배양배지에 부유시킨 후 96-well U-bottomed Ultra Low Attachment (ULA) culture plate에 씨딩한 후 (200 μl/well), 200 g에서 5분간 원심분리하였다. 약 3일동안 스페로이드(spheroid) 형태로 배양시킨 후, 하고초 추출물을 10 μg/ml, 25 μg/ml 및 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 5일간 추가 배양하면서 스페로이드 형태를 관찰하고 스페로이드 지역을 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 하고초 추출물 10 μg/ml 농도 이상에서 세포생존율이 농도의존적으로 감소됨을 확인하였고(도 1의 A), PS 처리 24시간 후 세포 형태학적 변화에서는 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였으며(도 1의 B), 3D-spheroid culture 조건에서 PS 처리에 의하여 스페로이드 크기가 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 1의 C).

이러한 결과는 하고초 추출물이 미분화 iPSC에 대하여 세포독성이 있어 세포 사멸을 유도하는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3: 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 세포주기 어레스트 및 프로그램된 세포사멸 유도 여부 확인

하고초 추출물 (PS)에 의한 세포 사멸 유도 효과가 세포 주기 진행 조절과 어떠한 관련성이 있는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 6-웰 배양 플레이트에 씨딩한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 실시예 1에서 제조한 하고초 추출물 (PS)을 50 μg/ml의 농도로 처리하여, 3시간, 6시간, 12시간 및 18시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배양 플레이트에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모두 모은 다음 PBS로 2회 세척하고, 70% 에탄올을 천천히 가하여 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 24시간 동안 -20℃에서 보관하였다. 에탄올을 제거하기 위하여, 원심분리 후, 세포는 PBS로 2회 세척하고 RNase A(0.05 ㎎/㎖), 0.1% Triton X-100 및 0.1 mM EDTA가 포함되어 있는 50 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI) 용액을 가하여 30분 동안, 4℃에서 차광 염색하였다. 염색 후 PI 용액을 제거하고 염색된 세포를 PBS로 현탁한 뒤, 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(polystyrene round-bottom tube)로 옮겨서, CellQuest 소프트웨어를 이용한 유세포분석기 (FACS Fortessa flow cytometer)(BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 세포 주기를 분석하였다. 세포 내 DNA 변화 양상은 WinMDI 2.8 소프트웨어(J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA)를 이용하여 각 세포 주기 당 분포 비율을 계산하였다.

그 결과, PS 50 μg/ml 농도로 처리한 후 시간 별 cell cycle distribution을 분석하였을 때, G2/M 어레스트를 거쳐 cell death가 일어남을 확인하였다(도 2의 A).

또한, 하고초 추출물 (PS)이 세포주기 조절 단백질인 p21, p27 및 사이클린 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다.

구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 60 mm 배양접시에 씨딩한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여, 24시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배양접시에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모두 모은 다음 PBS로 2회 세척하고, 세포의 전체 cell lysate는 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 준비하였다. cell lysate은 BCA 단백질 분석 (BCA(Bicinchoninic Acid) protein assay)으로 단백질 농도를 정량하였고, 동량의 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한 후 Immunobilon PVDF membrane(Millipore, Bedford, MA)에 옮긴 후 Immunoblotting을 수행하였다. 단백질 발현 정도는 ECL 용액과 반응시킨 후 ImageQuant LAS 4000 mini(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과, PS 처리 후 세포주기 어레스트 관련 단백질에서는 p21과 p27이 증가하고, 사이클린은 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 B).

또한, 하고초 추출물 처리에 의해 세포사멸 과정에 중요한 caspase-3, -8, -9 활성이 증가하는지 확인하기 위해, BioVision caspase activity colorimetric assay kit를 사용하였다.

구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 100 mm 배양접시에 씨딩한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여, 24시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배양접시에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모두 모은 다음 PBS로 2회 세척하고 cell lysis buffer로 용해시킨 후 단백질 정량을 실시하였다. 100 μg 단백질과 caspase-3, -8, -9의 고유 기질 (각 DEVD-pNA, IETD-pNA, LEHD-pNA)을 잘 섞은 후 37℃에서 1-2시간 반응시켰다. SpectraMaxi3 Multi-mode reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하고초 추출물을 처리하지 않은 대조 세포군과 비교하여caspase 활성의 증가를 계산하였다.

또한, 하고초 추출물이 세포사멸과 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 100 mm 배양접시에 씨딩한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여, 24시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배양접시에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모두 모은 다음 PBS로 2회 세척하고, 세포의 전체 cell lysate는 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 준비하였다. cell lysate 내 단백질 농도를 정량한 후, 동량의 단백질을 사용하여 pro-apoptotic 단백질인 Bax, anti-apoptotic 단백질인 Bcl-xL, 활성화된 caspase-3, -8, -9, 그리고 PARP의 cleavage 정도를 Immunoblotting을 통해 확인하였다. 단백질 발현 정도는 ECL 용액과 반응시킨 후 ImageQuant LAS 4000 mini(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과, PS에 의해 caspase 활성이 증가되며(도 2의 C), pro-apoptotic 단백질들은 증가하고 anti-apoptotic 단백질은 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 D).

이러한 결과들을 통하여 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 세포주기 어레스트와 프로그램된 세포사멸을 유도되는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 ROS 생성 및 미토콘드리아 막전위 감소 여부를 확인

하고초 추출물 (PS)이 세포 내 산화 스트레스 (oxidative stress)를 통해 세포 사멸을 유도하는지 확인하기 위해 활성산소종 (reactive oxidative species: ROS) 생성정도를 유세포 분석기를 통해 확인하였다. 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 레벨은 과산화물-민감 형광 프로브(peroxide-sensitive fluorescent probe)인, DCF-DA를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 60 mm culture dish에 seeding한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인 큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 세포에 처리하여 3-6시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양한 세포에 5 μM의 DCF-DA를 가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 2번 세척하고, 떼어낸 후 PBS에 현탁하여 FACS Fortessa 유세포분석기를 이용하여 세포 내 활성산소종의 생성 정도를 측정하였다. 히스토그램의 MFI (mean fluorescence intensity: 평균형광강도)가 증가한 것으로 활성산소종의 증가를 확인하였다. 한편 ROS를 제거하는 NAC (1 mM)를 전처리한 후 하고초 추출물을 처리하여 세포사멸 과정에 ROS 생성이 관여하는지 확인하였다.

또한, 하고초 추출물에 의한 미토콘드리아의 막손상이 세포 사멸에 기여하였는지 확인하기 위해 미토콘리아 특이 염색 시약인 JC-1을 사용하여 집합체(aggregate, red)와 모노머(monomer, green)를 확인하였다. 구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 35 mm glass dish (SPL Lifesciences, 한국)에 seeding 한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 세포에 처리하여 12-24간 배양하였다. 배양 후 세포를 2번 세척하고, JC-1 (5 ㎍/㎖ in mTeSR1)을 넣고 15분 염색하였다. mTeSR1 배지로 2번 세척한 후 손상되지 않은 집합체와 손상된 모노머를 형광현미경으로 확인하였다.

그 결과, PS 50 μg/ml 농도로 처리한 후 ROS 생성 정도를 DCF-DA 염색 후 FACS 분석을 통해 확인하였을 때 PS 처리에 의해 ROS 생성이 증가됨을 확인하였으며(도 3의 A), ROS scavenger인 NAC를 전처리한 경우, PS 처리에 의한 세포생존율 감소가 완화되는 것을 확인하였다(도 3의 B).

또한, PS 처리에 의해 집합체(aggregate, red)는 감소하고, 반면 모노머(monomer, green)는 증가되는 것을 확인함으로써, MMP가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 3의 C).

실시예 5: 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 p53 의존적인 세포 사멸　기전을 확인

하고초 추출물에 의해 p53 의존적인 세포사멸이 유도되는지 확인하기 위해, 먼저 p53 타겟 유전자인 PUMA, NOXA, MDM2의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

구체적으로, 미분화 iPSC 세포를 Matrigel Matrix (hESC-qualified)가 코팅된 100 mm culture dish에 seeding한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 하고초 추출물을 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여, 24시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배양접시에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모두 모은 다음 PBS로 2회 세척하고, 세포의 전체 cell lysate는 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 준비하였다. cell lysate 내 단백질 농도를 정량한 후, 동량의 단백질을 사용하여 p53, p-p53, PUMA, NOXA, MDM2의 발현정도를 Immunoblotting을 통해 확인하였다. 단백질 발현 정도는 ECL 용액과 반응시킨 후 ImageQuant LAS 4000 mini(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 가시화하였다. 또한 미분화 iPSC 세포 (p53 WT)로부터 p53 유전자를 제거한 p53 KO(넉아웃, Knockout) 미분화 iPSC에 하고초 추출물을 처리한 후 세포 생존율, 세포의 형태학적 변화, ROS 생성 여부, 미토콘드리아 막전위 손상을 확인하였다.

그 결과, PS를 미분화 iPSC에 처리하였을 때 p53, p-p53, PUMA, NOXA, MDM2가 증가됨을 확인하였으며(도 4의 A), p53 KO iPSC에 PS를 처리하였을 때 p53 wild iPSC와 비교하여 세포생존율이 높음을 확인하였고(도 4의 B), p53 KO iPSC에 PS를 처리한 결과, 세포사멸 형태학적 변화가 관찰되지 않고, ROS가 생성되지 않으며, MMP는 감소되지 않음을 확인할 수 있었다(도 4의 C 내지 E).

이러한 결과는 미분화 iPSC에 하고초 추출물 처리 시 p53 의존적으로 세포 사멸이 유발됨을 나타내는 것이다.

실시예 6: 분화된 줄기세포에 대한 하고초 추출물의 세포독성을 확인

분화 유도된 줄기세포에 대한 하고초 추출물의 효과를 확인하기 위해 미분화 iPSC로부터 EB (embryonic body)로 분화를 유도하였다. 구체적으로, EB를 만들기 위해 AggreWell 800 microwell plate (STEMCELL technologies, USA)를 사용하였다. anti-adherence rinsing solution로 AggreWell plate의 각 well을 전처리한 후, AggreWell EB formation media에 부유시킨 미분화 iPSC를 씨딩하였다. AggreWell plate를 100 g에서 3분간 원심분리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2일 간격으로 새로운 AggreWell EB formation media로 배지를 교환해가면서 7일간 배양하였다. 이렇게 만들어진 EB의 분화도를 확인하기 위해 미분화 마커인 Oct4 유전자 발현 정도를 Real-time PCR을 통해 분석하고, 미분화 iPSC와 비교하였다. 미분화 iPSC에 대해 세포사멸 유도 효능이 있었던 하고초 추출물이 분화 EB에 대해 세포독성을 가지는지 확인하기 위해, 분화된 EB에 하고초 추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 48시간 추가 배양하면서 EB의 모양을 확인하였다. 독성이 있는 경우, EB의 크기가 감소하고 작은 조각 혹은 단일세포로 흩어지는 양상이 확인된다.

그 결과, 7일간 분화시킨 EB의 Oct4 발현은 미분화 줄기세포 (iPSC)에 비해 80% 정도 감소된 것을 확인하였으며, 분화된 EB에 PS를 48시간 처리한 후 세포독성을 확인하였을 때 독성이 확인되지 않음을 확인할 수 있었다(도 5).

상기 내용을 종합하면, 하고초 추출물은 미분화된 다능성 줄기세포만 선택적으로 사멸을 유도할 수 있음을 나타내는 것인 바, 이러한 결과들은 통하여 미분화 줄기세포와 분화 세포가 모두 있는 세포 시료에서 미분화 줄기세포만 선택적으로 제거함으로써 안전한 줄기세포 치료제 개발에 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 세포사멸 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)인 것인, 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 유도만능줄기세포인 것인, 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 인간으로부터 유래된 것인, 조성물.
   
5. 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 선택적 제거용 조성물.
   
6. (a) 미분화 다능성 줄기세포 및 분화세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비하는 단계; 및
   (b) 상기 세포 시료에 하고초 추출물을 처리하여 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 세포사멸시키는 단계;를 포함하는, 미분화 다능성 줄기세포의 제거방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)인 것인, 제거방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기세포는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells)인 것인, 제거방법.
   
   
9. 삭제

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