CN1901802A - 用脂肪组织来源的细胞治疗心血管疾病的方法 - Google Patents

Abstract

用存在于经处理的吸脂组织中的细胞治疗患者，包括患有心血管病症、疾病或失调的患者。治疗患者的方法包括处理脂肪组织以将从脂肪组织得到的干细胞的浓缩量递送于患者。该方法可以在密闭系统中实施从而干细胞在暴露于患者前不暴露于外部环境。因此，在优选方法中，将经处理的吸脂物中存在的细胞与促进、产生或者支持治疗性心血管益处所需的添加剂一起置于接受者体内。

Description

用脂肪组织来源的细胞治疗心血管疾病的方法

相关申请

本申请要求标题为“用脂肪组织来源的细胞治疗心血管疾病的方法”的2003年2月20日申请的美国临时申请号60/449,279和标题为“用脂肪组织来源的细胞治疗心血管疾病的方法”的2003年4月15日申请的美国临时申请号60/462,911的优先权。将前述申请的内容明确并入本文作为参考。

发明背景

1.发明领域

本发明一般涉及来源于脂肪组织的细胞，更具体地，涉及脂肪来源的干细胞和祖细胞(progenitor cell)，涉及使用脂肪来源的干细胞和祖细胞的方法，涉及含有脂肪来源的干细胞和祖细胞的组合物，和用于制备和使用脂肪来源的干细胞和祖细胞的系统，所述脂肪来源的干细胞和祖细胞用于治疗心血管疾病和病症。

2.相关文献描述

心血管疾病和病症是所有工业化国家中死亡和劳动能力丧失的主要原因。仅在美国，心血管疾病就占死亡率的约40％，并侵袭5800万美国人(美国心脏协会，2002)。使得心血管疾病尤其具有破坏性的主要因素之一是心脏损失后不能自身修复。因为心肌细胞，即心肌细胞不能分裂和在受损部位重新增殖，由于损伤或者疾病导致的心脏细胞损失很大程度上是不可逆的(Abbate等人，2002；Remme，2000)。

在可以利用的治疗形式中，人到人的心脏移植在治疗严重心血管疾病和病症中最有效。实际上，普通心脏移植受体的一年和五年生存率在当前为70％。然而，当前，由于许多原因，移植是严重受限的形式，所述原因即适宜供体的缺乏、该方法的花费和很可能产生移植物排斥和相关问题，如感染、肾功能异常和免疫抑制剂相关的癌(美国心脏协会，2002)。

移植疗法的备选方案是使用再生药物修复和再生受损的心肌细胞。再生性药物以临床靶定的方式控制干细胞(即机体的未特化的主细胞(master cell))自身无限地更新和发育成成熟的特化细胞。在发育早期的胚胎、胎儿组织和某些成年器官和组织中发现干细胞(Pera等人，2000)。已知胚胎干细胞(下文中称作“ESCs”)变成身体的许多(如果不是所有)细胞和组织类型。ESCs不仅含有个体的所有遗传信息而且还含有变成身体的200+细胞和组织的任一种的新生能力。从而，这些细胞具有作为再生药物的巨大潜力。例如，ESCs可以生长成特定组织，如心脏、肺或者肾，然后它们可以用于修复受损和患病的器官(Assady等人，2001；Jacobson等人，2001；Odorico等人，2001)。然而，ESC来源的组织具有临床局限。因为ESCs必须来源于另一个个体，即，胚胎，所以存在受体的免疫系统排斥新的生物物质的危险。尽管可以利用防止这种排斥的免疫移植药物，但是公知这些药物阻断所希望的免疫应答，如针对细菌感染和病毒的免疫应答。此外，对ESCs来源，即胚胎的伦理上的争论由来已久并造成了额外的，可能是可预见的将来不可克服的障碍。

成年人干细胞(下文中可互换称作“ASCs”)代表使用ESCs的备选方案。ASCs静止地存在于许多非胚胎组织中，可能等待应答外伤或者其他破坏性疾病过程从而它们可以治疗受伤的组织(Arvidsson等人，2002；Bonner-Weir和Sharma，2002；Clarke和Frisen，2001；Crosby和Strain，2001；Jiang等人，2002a)。值得注意地，不断出现的科学证据表明每个个体携带ASCs库，其与ESCs都具有变成许多(如果不是所有)细胞和组织类型的能力(Young等人，2001；Jiang等人，2002a；Jiang等人，2002b；Schwartz等人，2002)。从而，ASCs，像ESCs具有再生药物的临床应用的巨大潜力。

已经表明ASC群体存在于骨髓、皮肤、肌肉、肝脏和脑的一种或多种中(Jiang等人，2002b；Alison，1998；Crosby和Strain，2001)。然而，这些组织中ASCs的频率很低。例如，估计骨髓中间充质干细胞频率为100,000个有核细胞中一个到1,000,000个有核细胞中一个(D＇Ippolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993)。类似地，从皮肤摘除ASCs包括数周内一系列复杂细胞培养步骤(Toma等人，2001)并且骨骼肌来源的ASCs的临床应用需要两到三周培养期(Hagege等人，2003)。从而，来自这些组织的ASCs的任何提出的临床应用需要通过细胞纯化和细胞培养方法增加细胞数、纯度和成熟。

尽管细胞培养步骤可以提供增加的细胞数、纯度和成熟，但是需要付出代价。该代价包括下面的技术困难之一或多个：由于细胞老化丧失细胞功能、可能有用的非干细胞群体的损失、细胞可能应用于患者的延迟、金钱花费增加，和培养期间细胞受到环境微生物污染的危险增加。最近检查骨髓来源的ASCs的治疗效果的研究使用基本上完整骨髓以克服与细胞培养有关的问题(Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002)。然而，临床益处是次最佳的，并且结果几乎无疑与有限的ASC剂量和骨髓中内在可利用的纯度有关。

最近，已经证明脂肪组织是ASCs的来源之一(Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。不像骨髓、皮肤、肌肉、肝脏和脑，脂肪组织相当容易以相对大量收获(Commons等人，2001；Katz等人，2001b)。此外，已经表明脂肪来源的ASCs具有在体外产生多种组织，包括骨髓、脂肪、软骨和肌肉的能力(Ashjian等人，2003；Mizuno等人，2002；Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。从而，脂肪组织给出了用于再生药物中的ASCs的最佳来源。然而，本领域中缺少收获脂肪来源的ASCs的适宜方法。现有方法具有许多缺点。例如，现有方法不能最适地容纳用于除去脂肪组织的吸出装置。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或完全自动化(Katz等人，2001a)。现有方法还缺少大于100ml脂肪组织的容量。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或全部密闭系统。最后，现有方法缺少组分处理能力以减小一个样品与另一个样品的物质的交叉污染的伴随危险。总之，从脂肪组织收获ASCs的现有技术方法没有克服与从上述皮肤、肌肉、肝脏和脑收获ASCs相关的技术困难。

因此，考虑到ASCs的巨大的治疗潜力，本领域中迫切需要从产生ASCs群体的脂肪组织以高产率、一致性和/或纯度收获ASCs并且快速而可靠地收获并且对摘除后操作的需要减小或者不存在的装置、细胞或者方法。理想地，这种装置、系统或者方法将以适于直接置于受体的方式产生ASCs。这种装置、系统或方法的获得以及使用脂肪来源的ASCs治疗心血管疾病和病症的方法和组合物将对这些疾病的治疗产生巨大变化。考虑到心血管疾病的普遍和当前治疗选择的不足，迫切需要这种治疗。

发明概述

本发明至少部分基于如下发现：脂肪来源的成年人干细胞可用于治疗心血管病症、疾病和失调。本发明还基于发现用于制备脂肪来源的成年干细胞和祖细胞的装置、系统和方法。本发明还基于发现脂肪来源的成年干细胞和祖细胞用于治疗心血管病症、疾病和失调的方法和组合物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及使用来源于脂肪组织的细胞的组合物、方法和系统，所述细胞与促进、产生或者支持治疗心血管益处所需的添加剂一起直接置于受体中。

在一个实施方案中，在保持密闭的、无菌流体/组织途径的系统中发生脂肪组织处理。这通过使用预先装配、连接的一组密闭无菌容器和允许组织和流体成分在密闭途径中转移的管道来实现。该处理设备可以与插入装置中的一系列处理试剂(例如，盐水、酶，等等)连通，所述装置可以控制试剂的加入、温度，和处理时间选择，从而减轻操作人员手动操作该过程的需要。在优选实施方案中，从组织切除到加工到置于接受者体内的整个方法将都在相同设施中进行，甚至在经历该方法的患者的相同室内进行。

根据本发明的一方面，处理粗制脂肪组织以基本上除去成熟的脂肪细胞和结缔组织从而得到适于放置于接受者体内的许多异质脂肪组织来源的细胞。所述细胞可以与其他细胞、组织、组织碎片，或者细胞生长和/或分化的其他刺激剂联合置于接受体体内。在优选实施方案中，所述细胞与任何上面提到的添加剂以单一操作方法置于这些细胞所来源的人体中，目的是使该接受者得到治疗益处。

在一个实施方案中，治疗患者的方法包括步骤：a)提供组织除去系统；b)使用所述组织除去系统从患者除去脂肪组织，脂肪组织具有浓缩干细胞；c)处理至少一部分所述脂肪组织以得到与处理前脂肪组织的干细胞浓度不同的干细胞浓度；和d)使用本领域普通技术人员公知的几种方法，包括但不限于，静脉内、冠状动脉内和心内膜心肌内方法对患者施用干细胞和祖细胞而在施用于该患者前不从组织除去系统除去干细胞和祖细胞。

按照本文中公开的方法的系统包括a)组织收集容器，其包括i)组织收集入口，其经构造以收集从患者除去的脂肪组织；和ii)滤器，其置于容器内并且经构造以保留从患者除去的脂肪组织并使从患者除去的非脂肪组织通过；b)混合容器，其与组织收集容器配合以接收从脂肪组织得到的干细胞而不除去来自组织除去系统的干细胞，并且包括添加剂口，其用于施用至少一种添加剂以与其中包含的干细胞混合；和c)出口，其经构造以允许混合容器中的细胞从组织收集系统除去以施用于患者。

文中描述的任何特征或者特征的组合都包括在本发明的范围内，条件是根据上下文、该说明书和本领域中普通技术人员的知识，任何此类组合中包括的特征不相互矛盾。本发明的其他方面和优点在如下详述中更明显。

附图简述

图1描绘了处理脂肪组织的组织除去系统。

图2描绘了图1的组织除去系统的组织收集容器。

图3是图2的组织收集容器的部分横断面视图。

图4描绘了用于自动化组织除去系统的操作的处理装置。

图5A和5B描绘了培养的脂肪来源的干细胞的VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白质的表达。

图6描绘了脂肪来源的干细胞群体内内皮祖细胞的检测。

图7A和7B描绘了正常(7A)和链脲佐菌素处理的(7B)小鼠脉管结构的体外发育。

图8描绘了与阴性对照比较脂肪来源的干细胞处理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢复的增加。

图9A和9B表明增加脂肪来源的干细胞剂量提高移植存活和血管发生(9A)并描绘了组织样品中脂肪组织构造的保持。

图10描绘了梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞移植的组织学时间线(timeline)。

图11描绘了β-半乳糖苷酶和肌球蛋白重链的双阳性染色。高亮细胞都显示出蓝色β半乳糖苷酶染色，表明它们来源于供体脂肪组织细胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重链的表达。显示出褐色和蓝色染色的细胞(如通过箭头指出)是呈现出心肌细胞表型的脂肪组织来源的细胞。

图12描绘了大鼠中阻塞/再灌注损伤后梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞群。

发明详述

本发明首次提供了使用脂肪来源的干细胞和祖细胞治疗心血管病症、疾病和失调的经证明的方法。具体地，本发明第一次阐明本发明的脂肪来源的干细胞和祖细胞(1)表达血管生成和动脉发生生长因子，包括胎盘生长因子(PIGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，(2)含有在血管形成中具有明确功能的内皮祖细胞(EPC)，(3)在体外发育成血管，(4)支持体内局部缺血组织生存，(5)诱导后肢的阻塞/再灌注损伤后的再灌注，(6)当心脏损伤后注射到动物时归巢到心脏，和(7)当心脏损伤后注射到动物时分化成细胞，所述细胞表达与它们分化成心肌细胞相一致的标记。因此，本公开确实阐明本发明的脂肪来源的干细胞和祖细胞可用于治疗心血管疾病和病症。

为了更易理解本发明，首先定义某些术语。其他定义在详细描述全文中给出。

文中所用术语“脂肪组织”指含有多种细胞类型，包括脂肪细胞和微血管细胞的组织。脂肪组织包括干细胞和内皮前体细胞。因此，脂肪组织指脂肪，其包括储存脂肪的结缔组织。

文中所用术语“脂肪组织单位”指脂肪组织的离散的或者可测量的量。脂肪组织单位可以通过测定该单位的重量和/或体积来测量。基于上面鉴定的数据，从患者除去的一单位处理的吸脂物(lipoaspirate)具有细胞组分，其中至少0.1％细胞组分是干细胞。关于本文公开，一单位脂肪组织可以指从患者除去的脂肪组织的全部量，或者小于从患者除去的脂肪组织的全部量的量。从而，一单位脂肪组织可以与另一单位脂肪组织联合形成一单位脂肪组织，其具有个体单位总和的重量或者体积。

文中所用术语“部分”指小于全部的物质量。小部分指小于50％的量，大部分指大于50％的量。从而，小于从患者除去的脂肪组织全部量的一单位脂肪组织为所除去的脂肪组织的一部分。

文中所用术语“干细胞”指具有分化成多种其他细胞类型的潜力的多能细胞，其执行一种或多种特定功能并能够自我更新。文中公开的一些干细胞可以是多能的。

文中所用术语“祖细胞”指能够分化成一种或多种细胞类型的单能、双能或者多能细胞，其执行一种或多种特定功能具有有限的自我更新能力或者无自我更新能力。文中公开的一些祖细胞可以是多能的。

文中所用“干细胞数”或者“干细胞频率”指产克隆测定中观察到的集落数，所述测定中将脂肪来源的细胞(ADC)以低细胞密度(＜10,000个细胞/孔)接种并在支持MSC生长的生长培养基(例如，DMEM/F12培养基，补加10％胎牛血清、5％马血清，和抗生素/抗真菌剂)中生长。细胞生长2周后将培养物用苏木精染色并将大于50个细胞的集落计数为CFU-F。干细胞频率计算为从所接种的每100个有核细胞所观察到的CFU-F数(例如，在以1,000个有核ADC细胞开始的平板中计数的15个集落得到干细胞频率为1.5％)。干细胞数计算为干细胞频率乘以所得有核ADC细胞的总数。从ADC细胞生长的高百分数(～100％)的CFU-F表达细胞表面分子CD105，骨髓来源的干细胞也表达CD105(Barry等人，1999)。脂肪组织来源的干细胞也表达CD105(Zuk等人，2002)。

文中所用术语“处理的吸脂物”指脂肪组织，其已经经处理以将活性细胞组分(例如，含有干细胞和祖细胞的组分)与成熟脂肪细胞和结缔组织分离。该级分在文中称作“脂肪来源的细胞”或者“ADC”。通常，ADC指通过洗涤和从脂肪组织分离细胞得到的细胞沉淀。该沉淀通常通过离心细胞得到，通过离心，细胞聚集在离心容器的底部。

文中所用短语“心血管病症、疾病或失调”旨在包括特征为不足的、不希望的或者异常的心脏功能的所有失调，包括局部缺血性心脏病、高血压心脏病和肺部高血压心脏病、瓣膜疾病、先天性心脏病和导致受试者中，尤其人类受试者中充血性心力衰竭的任何病症。不足的或异常的心脏功能可以由疾病、损伤和/或老化导致。作为背景，对心肌损伤的应答按照确定的途径，其中一些细胞死亡而其他细胞进入休眠状态，其中它们还没有死亡但是功能异常。接着是炎症细胞的渗入、胶原作为疤痕部分沉积，所有这些都与新血管的向内生长和一定程度的持续细胞死亡平行发生。文中所用术语“局部缺血”指由于血流减少而引起的任何局部化的组织局部缺血。术语“心肌局部缺血”指冠状动脉粥样硬化和/或心肌的供氧不足导致的循环紊乱。例如，急性心肌梗死代表对心肌组织的不可逆的局部损害。高损害来自于冠状循环中的阻塞(例如，血栓形成或栓塞)事件并产生这样的环境，其中心肌代谢需要量超过对心肌组织的供氧。

文中所用术语“血管发生”指从现有的脉管系统和组织产生新血管的过程(Folkman，1995)。短语“修复或者重建”指现有脉管系统的改造。组织局部缺血的减轻严重依赖于血管发生。新血管的自发生长提供了局部缺血区域内和周围的侧支循环，提高了血流，和减轻了局部缺血导致的症状。文中所用术语“血管发生因子”或者“血管发生蛋白”指能够从现有脉管系统生长新血管(“血管发生”)的任何公知的蛋白质。用于本发明的适宜的血管发生因子包括，但不限于，胎盘生长因子(Luttun等人，2002)、巨噬细胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Buschmann等人，2003)、血管内皮生长因子(VEGF)-A，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等人，2002)、神经毡蛋白(Wang等人，2003)、成纤维细胞生长因子(FGF)-1，FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等人，2000)，Angiopoietin 1、Angiopoietin 2(Sundberg等人，2002)、红细胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carano和Filvaroff，2003)、TGF-β(Xiong等人，2002)、IGF-1(Shigematsu等人，1999)、骨桥蛋白(Asou等人，2001)、多效营养因子(Beecken等人，2000)、激活蛋白(Lamouille等人，2002)、内皮素-1(Bagnato和Spinella，2003)和它们的联合。血管发生因子可以独立地或者相互联合作用。当联合时，血管发生因子可以协同作用，从而因子的联合效果大于单独采取的各自因子效果的总和。术语“血管发生因子”或者“血管发生蛋白”还包括这些因子的功能类似物。功能类似物包括，例如，因子的功能部分。功能类似物还包括抗独特型抗体，其结合所述因子的受体，从而模拟所述因子的活性以促进血管发生和/或组织重建。产生这些抗独特型抗体的方法是本领域中熟知的并且在例如WO 97/23510中描述，将WO 97/23510的内容完整并入本文作为参考。

用于本发明的血管发生因子可以从任何适宜的来源产生或者得到。例如，所述因子可以从它们的天然来源纯化，或者合成产生或者重组表达产生。所述因子可以作为蛋白质组合物施用于患者。备选地，所述因子可以以编码该因子的表达质粒的形式施用。适宜的表达质粒的构建是本领域中熟知的。用于构建表达质粒的适宜的载体包括，例如，腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、RNA载体、脂质体、阳离子脂质、慢病毒载体和转座子。

文中所用术语“动脉发生”指增强侧枝动脉和/或来自现有小动脉连接的其他动脉的生长的过程(Carmeliet，2000；Scholz等人，2001；Scholz等人，2002)。更具体地，动脉发生是通过来自现有小动脉连接的内皮和平滑肌细胞的增殖原位募集和扩增动脉，从而为局部缺血组织、肿瘤或者炎症部位提供血液。这些血管大部分生长在受影响的组织外部并且对于将营养物向局部缺血区域、肿瘤或者炎症部位的递送是重要的。动脉发生是对心肌局部缺血的正常应答的一部分(Mills等人，2000；Monteiro等人，2003)。此外，冠状动脉旁路移植(CABG)的常规手术技术实际上不过是产生动脉侧枝血管(Sergeant等人，1997)。从而，梗死后增强血管发生的方法将提高到达局部缺血组织的血流，导致细胞死亡减少和梗死尺寸减小。这些提高将导致改善的心脏功能和治疗益处。

文中所用术语“治疗”包括减少或者减轻心血管病症、疾病或者失调的至少一种不利影响和症状，所述心血管病症、疾病或者失调即特征是不足的或者不希望的心脏功能的任何失调。心脏失调的不利影响或者症状是本领域中熟知的并且包括，但不限于，呼吸困难、胸痛、心悸、眩晕、syncope、水肿、发绀、苍白、疲劳和死亡。

文中所用术语“施用”、“导入”和“移植”在本文中可以互换使用并且指通过方法和途径将本发明的ADC置入受试者中，所述置入导致ADC至少部分定位在所希望的部位。可以通过任何适宜的途径施用ADC，所述途径导致递送到受试者中所希望的位置，在此处至少部分细胞或者细胞组分保持存活。对受试者施用细胞后存活期可以短至几小时，例如，24小时，到几天，到长达数年。

文中所用术语“受试者”包括温血动物，优选哺乳动物，包括人。在优选实施方案中，受试者为灵长类。在更优选实施方案中，受试者为人。

现在将涉及本发明的当前优选的实施方案，它们的实例在附图中阐明。可能时，在附图中使用相同和类似的参考号，并且描述指相同和相似的部分。应该注意附图为简化形式并且不是精确比例。关于本文的公开，仅为了方便和清楚，关于附图使用方向术语，如顶部、底部、左、右、上、下、上方、上面、下方、下面、后面，和前面。不应将这些方向术语理解为以任何方式限制本发明范围。

尽管文中的公开涉及某些阐明的实施方案，但是应该理解这些实施方案作为实例给出并且不作为限制。下面详细描述的目的(尽管讨论代表性实施方案)将被理解为覆盖这些实施方案的所有修饰、备选方案，和等价方案，它们都在所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内。本发明可以与本领域中惯用的多种细胞和组织分离技术结合实施，并且文中包括的这些常用的方法步骤仅仅用于帮助对本发明的理解。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及存在于脂肪组织中的细胞群体，和对人或者动物患者施用细胞群体以治疗心血管疾病和病症的系统和方法。脂肪组织的细胞群体可以用作治疗应用的细胞来源。其中，所述细胞可用于再生性药物，如可以用再生性细胞治疗的疾病，包括心血管疾病和病症。可以将该群体的细胞施用于患有心血管疾病和病症的患者而不使用其他脂肪细胞和结缔组织。

具体地，本发明涉及脂肪组织来源的细胞和使用所述细胞的方法，所述细胞的若干性质可以有助于最小化损伤和促进心肌修复和该修复过程中的再生。这些性质包括：能够合成和分泌刺激新血管形成的生长因子；能够合成和分泌刺激细胞存活和增殖的生长因子；能够增殖和分化成直接参与新血管形成的细胞；能够植入受损的心肌和抑制疤痕形成(胶原沉积和交联)；能够增殖和分化成能够促进心肌收缩性的肌细胞；和能够增殖和分化成心肌细胞。

I.发明方法

1.得到经处理的吸脂物(ADC)的方法

已经发现脂肪组织是干细胞和祖细胞的尤其丰富的来源。该发现至少部分是由于容易除去脂肪组织的主要非干细胞组分——脂肪细胞。从而，在人和动物研究中，所处理的吸脂物(ADC)含有干细胞，其频率为至少0.1％，更通常大于0.5％。在本发明的某些实施方案中，已经得到了含有约2-12％干细胞的ADC。在其他实施方案中，处理ADC以得到细胞群体，其中干细胞构成该群体中高达100％的细胞。根据文中公开的本发明所得的干细胞的纯度/频率远大于公开的频率：骨髓中1/100,000(0.001％)(DTppolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993；Muschler等人，2001)。此外，与收集脂肪组织的相关的发病率比收集相同体积的骨髓的相关的发病率低(Nishimori等人，2002)。此外，脂肪组织含有内皮前体细胞，其能够为患者提供治疗(见(Asahara等人，1999；Causal等人，2001；Kawamoto等人，2003；Kawamoto等人，2001))。

在实施文中公开的方法中，施用于患者的细胞从脂肪组织得到。本领域普通技术人员可以通过任意方法得到脂肪组织。例如，通过抽吸辅助的脂肪整复(lipoplasty)、超声辅助的脂肪整复、和脂肪切除术可以从患者除去脂肪组织。此外，该方法可以包括这些方法的联合，如联合脂肪切除术和抽吸辅助的脂肪整复。由于所述组织或者其部分将重新植入患者体内，所以应该以某种方式收集脂肪组织使得保持细胞组分的生存力和最小化潜在感染性生物，如细菌和/或病毒污染该组织的可能性。从而，应该以无菌的方式实施组织切除以最小化污染。抽吸辅助的脂肪整复是从患者除去脂肪组织的所希望的方法，因为其提供了收集组织的最小侵入性方法，干细胞损害的可能性最小，其他技术，如超声辅助的脂肪整复可以伴随着所述损害。

关于抽吸辅助的脂肪整复方法，通过将插管插入到患者中存在的脂肪组织库中或附近然后将脂肪抽吸到抽吸装置中收集脂肪组织。在一个实施方案中，小插管可以连接到注射器，可以手工抽吸脂肪组织(Asken，1990)。对收获相对适量的脂肪组织(例如，0.1ml到数百毫升脂肪组织)，使用注射器或者其他类似装置是所希望的。使用这些相对小的装置的方法的优点是相对于全身麻醉，可以仅通过局部麻醉实施所述方法。高于该范围(例如，大于数百毫升)的更大体积脂肪组织可能需要由供体和实施收集方法的人斟酌使用全身麻醉。当希望除去更大体积的脂肪组织时，在该方法中可以使用相对更大的插管和自动化抽吸装置。

脂肪切除术方法包括，但不限于，其中除去含有脂肪组织的组织(例如，皮肤)作为该方法的附带部分，即，手术的主要目的是除去组织(例如，肥胖治疗或者整容手术中皮肤)的方法，并且其中脂肪组织与主要感兴趣的组织一起除去。

将从患者除去的脂肪组织收集到装置中进行进一步处理。如文中讨论的，在一个实施方案中，该装置经设计并致力于收集用于生产处理的脂肪组织细胞群体的目的，所述细胞群体包括干细胞和/或内皮前体细胞。在其他实施方案中，该装置可以是医生实施抽提方法常用于组织收集的任何常规装置。

所收集的组织的量将取决于许多变量，包括，但不限于，供体的身体质量指数(body mass index)、可接近的脂肪组织收获部位的可用性、相伴或者预先存在的药物治疗和状况(如抗凝血疗法)、和所收集的组织的临床目的。造血干细胞(用于再生受体的血细胞形成能力的骨髓或者脐带血来源的干细胞)的移植经验表明植入是具有阈值效应的依赖细胞剂量的(Smith和Sweetenham，1995；Barker等人，2001)。从而，可能“越多越好”的一般原理将应用于其他变量设置的极限内并且可能时所述收获将收集尽可能多的组织。

已经发现从瘦的个体提取的100ml脂肪组织的干细胞百分数大于从肥胖供体提取的100ml脂肪组织的干细胞百分数(表1)。这反映肥胖个体中增加的脂肪含量的稀释效应。因此，根据本发明的一方面，从超重供体得到的脂肪量大于从较瘦患者提取的脂肪量。该观察还表明本发明的效用不限于具有大量脂肪组织的个体。

表1：身体质量指数对组织和细胞产率的影响

身体质量指数状态	所得组织的量(g)	总细胞产率(×107)
			正常	641±142	2.1±0.4
肥胖	1,225±173	2.4±0.5
			P值	0.03	0.6

浓缩的干细胞可以在组合物中使用，所述组合物含有脂肪来源的干细胞和/或内皮前体细胞，基本上无成熟脂肪细胞和结缔组织。在某些实施方案中，该组合物含有细胞组分，其中至少0.1％的细胞是干细胞。在其他实施方案中，该组合物含有细胞组分，其中干细胞占细胞组分的约2％到12％。不同组合物中还包括更高的干细胞浓度，如高达100％。该组合物可以包括额外的组分，如细胞分化因子、生长促进剂、免疫抑制剂，或者医学装置，如文中所讨论。为了得到某些组合物，其中该组合物主要含有一种类型的细胞(例如，脂肪来源的干细胞或者脂肪来源的内皮前体细胞)，可以使用用于制备不同细胞类型的任何适宜的方法，如使用细胞特异抗体，其识别和结合存在于干细胞或者内皮前体细胞上的抗原。

对于多数应用，活性细胞群体的制备将需要耗竭脂肪组织的成熟的负荷脂肪的脂肪细胞组分。这通常通过一系列洗涤和解聚步骤实现，其中首先洗涤组织以减少游离脂质(从破碎的脂肪细胞释放)和外周血成分(组织收获期间从切断的血管释放)的存在，然后解聚以从结缔组织基质释放完整的脂肪细胞和其他细胞群体。在某些实施方案中，完整脂肪细胞组分或者非干细胞组分与脂肪组织的干细胞组分分离。在其他实施方案中，仅一部分或几部分脂肪细胞组分与干细胞分离。从而，在某些实施方案中，干细胞可以与内皮前体细胞一起施用。

洗涤是任选的但是优选的步骤，其中组织与溶液混合以洗除游离脂质和单一细胞组分，如血液中的那些组分，留下完整的脂肪组织碎片。在一个实施方案中，将从患者除去的脂肪组织与等渗盐水或者其他生理溶液(例如，Baxter Inc.的Plasmalyte或者Abbott Labs的Normoso)混合。通过本领域中普通技术人员公知的任一方法，包括，但不限于，过滤、倒出、沉降或者离心，可以将完整脂肪组织碎片与游离脂类和细胞分离。在本发明的所阐明的实施方案中，通过使用如文中讨论的组织收集容器内放置的滤器将脂肪组织与非脂肪组织分离。在其他实施方案中，用组织收集容器分离脂肪组织与非脂肪组织，所述容器利用倒出、沉降和/或离心技术分离物质。

然后用任意常规的技术或者方法解聚完整组织碎片，所述技术或方法包括机械力(切碎或剪切力)、使用一种或者组合蛋白质水解酶，如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶H1或者如美国专利号5,952,215中公开的Blendzyme家族的成员，和胃蛋白酶的酶消化，或者机械和酶促方法的联合。例如，通过使用胶原酶介导的脂肪组织解离的方法可以解聚完整组织碎片的细胞组分，所述方法类似于如美国专利号5,372,945中公开的用于收集脂肪组织中微血管内皮细胞的方法。可用于实施本发明的使用胶原酶的其他方法在美国专利号5,830,714和5,952,215中，和由Williams等人，1995(Williams等人，1995)公开。类似地，如(Twentyman和Yuhas，1980)中公开的，可以使用中性蛋白酶代替胶原酶。此外，方法可以使用酶的联合，如胶原酶和胰蛋白酶的联合，如(Russell等人，1976)中公开；或者酶(如胰蛋白酶)和机械解离的联合，如(Engelholm等人，1985)中公开。

通过减少成熟脂肪细胞的存在可以从解聚的组织碎片得到活性细胞群体(经处理的吸脂物)。然后经处理的吸脂物与脂肪组织在其中解聚的液体的悬浮液穿过另一容器，如细胞收集容器。该悬浮液可以流过一个或多个管道到达细胞收集容器，这可以通过使用泵，如蠕动泵，从组织收集容器抽取悬浮液并将其泵入细胞收集容器中。其他实施方案可以使用重力或者真空，同时保持密闭系统。悬浮液中细胞的分离可以通过浮力密度沉降、离心、淘析、过滤、差别粘附并从固相部分洗脱、抗体介导的选择、电荷的差异、免疫磁珠、荧光激活细胞分类术(FACS)、或者其他方法实现。这多种技术和实施这些技术的装置的实例可以在(Hemstreet等人，1980；Schweitzer等人，1995；Gryn等人，2002；Prince等人，2002；Watts等人，2002；Mainwaring和Rowley，1985；Greenberg和Hammer，2001)和美国专利号6,277,060；6,221,315；6,043,066；6,451,207；5,641,622；和6,251,295中发现。

在所阐明的实施方案中，使用旋转膜滤器将悬浮液中的细胞与悬浮液的非细胞组分分离。在其他实施方案中，使用离心将悬浮液中的细胞与非细胞组分分离。在一个此类代表性实施方案中，细胞收集容器可以是弹性包，其经构造置于离心机(例如，手工或者通过机器人)中。在其他实施方案中，不使用弹性包。离心后，细胞组分形成沉淀，可以将其用缓冲液重悬浮从而细胞可以穿过一个或多个管道到达本文中讨论的混合容器。可以通过任何适宜的方法提供悬浮液。例如，可以将缓冲液注射到细胞收集容器上的孔，或者细胞收集容器可以包括缓冲液储备物，通过破裂该储备物可以将缓冲液与细胞沉淀混合。当使用旋转膜滤器时，重悬浮是任选的，因为分离步骤后细胞保持在液体体积中。

尽管本发明的某些实施方案涉及完全解离脂肪组织以分离活性细胞与成熟脂肪细胞和结缔组织的方法，但是本发明的其他实施方案涉及其中脂肪组织仅部分解离的方法。例如，可以用一种或多种酶实施部分解离，相对于保持在脂肪组织以完全解离该组织的酶，用于部分解离的所述酶从至少一部分脂肪组织较早除去。这种方法需要较少的处理时间。

在一个具体实施方案中，将组织用无菌缓冲的等渗盐水洗涤并与胶原酶在一定的胶原酶浓度、温度下孵育并孵育足够时间以提供足够解离。在优选实施方案中，所用的胶原酶将由相关当局(例如，美国食品和药物管理局)批准用于人。适宜的胶原酶制剂包括重组和非重组胶原酶。可以从F.Hoffmann-La Roche Ltd，Indianapolis，IN和/或Advance Biofactures Corp.，Lynbrook，NY得到非重组胶原酶。可以如美国专利号6,475,764公开的得到重组胶原酶。

在一个实施方案中，溶液含有浓度为约10μg/ml到约50μg/ml的胶原酶并在约30℃到约38℃孵育约20分钟到约60分钟。这些参数将随着胶原酶的来源而变，通过经验研究优化，以便证明该系统可以以适宜的时间时限有效提取所希望的细胞群体。尤其优选的浓度、时间和温度为20μg/ml胶原酶(与中性蛋白酶分散酶；Blendzyme 1，Roche)在37℃下孵育45分钟。备选的优选实施方案应用0.5单位/mL胶原酶(与中性蛋白酶嗜热菌蛋白酶；Blendzyme 3混合)。在尤其优选的实施方案中，所用胶原酶经过相关当局(例如，美国食品和药物管理局)批准用于人。所用胶原酶应该没有微生物和污染物，如内毒素。

解离后，可以洗涤/冲洗活性细胞群体以除去解离过程的添加剂和/或副产物(例如，胶原酶和新近释放的游离液体)。通过离心或者如上讨论的本领域普通技术人员公知的其他方法可以浓缩活性细胞群体。处理后洗涤/浓缩步骤可以分开或者同时应用。

在一个实施方案中，浓缩细胞并通过将细胞群体穿过连续流动旋转膜系统等，例如，美国专利号5,034,135；和5,234,608中公开的系统离心细胞并除去胶原酶。

除了前面的，还有许多洗涤后方法用于进一步纯化活性细胞群体。这些方法包括阳性选择(选择靶细胞)、阴性选择(选择性除去不想要的细胞)，或者它们的联合。

在一个实施方案中，选择具有粘附性质的固相材料以允许差别粘附和/或细胞洗涤步骤后插入系统的经处理的吸脂物内的细胞亚群被洗脱。该一般方法已经用于临床输血中，其中用差别捕获白细胞的滤器耗竭污染白细胞的红细胞(Soli等人，2001)。该类型的滤器由PallBedical(Leukogard RS和Purecell RCQ)和Asahi(RS2000)销售。差别粘附也应用于单核细胞(Berdel等人，1982)和表皮干细胞(Bickenbach和Dunnwald，2000)的阳性选择。在该实施方案中，经处理的吸脂物将在流动和预定的缓冲条件下穿过过滤材料，所述缓冲条件用以促进靶细胞和不希望的细胞群体的差别粘附。对于阳性选择，滤器材料和条件将允许靶细胞的优先粘附而不想要的材料将自由穿过滤器并用过量缓冲液洗除。通过改变条件，如流速、pH、离子强度、和/或粘附所需的阳离子的存在可以从滤器洗脱靶细胞。过滤材料可以是三维网孔、小颗粒的填充盒、中空纤维或者具有高表面积的其他机制的形式。在优选实施方案中，该过滤装置将是图1中所示的一次性装备的组成部分并且将插入图4中所示装置中。所述装备和装置将从所指定的图中所示的那些实例稍微改变；图1包括滤器和滤器座，图4允许插入保持密闭、无菌流体途径所需的滤器座和管(包括阀门)。备选地，混合室(图4的组件108；图1的组件30)可以分别用装置配件和滤器/滤器座替换。

该差别粘附方法的备选实施方案将包括使用识别在靶细胞和不希望的细胞上差别表达的表面分子的抗体和/或抗体组合。基于特定细胞表面标记(或者标记的组合)表达的选择是另一种常用的技术，其中抗体(直接或间接)附着到固相支持体结构(Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001)。该方法显然可用于阳性和阴性选择中，其中，例如，使用CD45抗体可以除去残留白细胞。类似地，Reyes等人已经将抗体的复杂混合应用于从人骨髓选择多能成年祖细胞(Reyes等人，2001)。例如，特异结合脂肪细胞的抗体如AP2(Joyner等人，1999)可用于优先耗竭残留的脂肪细胞(包括不成熟的脂肪细胞和adipoblast)。通过使用对靶细胞群体特异的抗体可以应用阳性选择。例如，Quirici等人用针对神经生长因子受体的抗体富集骨髓来源的间充质干细胞(Quirici等人，2002)。

在基于抗体的方法的一个实施方案中，可以将抗体(例如AP2)或者抗体混合物(例如，AP2、CD3、CD19、CD11b)加入经处理的吸脂物中。本领域技术人员可以认识到许多其他抗体和抗体组合并且这些实例仅作为实例提供。孵育后，在允许这些抗体最佳结合它们的相关抗原的预定条件下，通过将细胞穿过旋转膜滤器或者细胞洗涤室的其他实施方案洗涤以除去未结合的过量抗体。然后细胞将穿过固相结构，其类似于上面实施方案中描述的固相结构但是其中固相附着二级抗体，该抗体能够高亲和性附着现在结合到细胞表面的一级抗体。靶细胞，例如，脂肪组织来源的干细胞，将由于没有表达所选抗体(抗体混合物)识别的细胞表面抗原而自由穿过该滤器，从而产生阴性选择系统。在该实施方案中，将一次性装备(图3)和装置(图4)进行非常类似于上面实施方案中所描述的微小改变。

通过包括第三种添加剂以非常相似的方式实现抗体介导的阳性选择实施方案，所述添加剂促进细胞从固相支持体脱离。在该实施方案中，可以加入木瓜蛋白酶或者木瓜凝乳蛋白酶以切割抗体分子和从固相支持体释放细胞(Civin等人，1990)。另一种备选方案是使用与细胞表面抗原竞争结合抗体的特定肽，如Tseng-Law等人，美国专利号6,017,719中所述。

在另一实施方案中，细胞沉淀可以经重悬浮、在形成连续或者不连续密度梯度的液体材料上(或下)分层，和置于离心机中以基于细胞密度分离细胞群体。适于形成这些梯度的介质的实例包括Percoll和Ficoll-Paque(Qian等人，1998)(Smits等人，2000)或Ficoll-Paque(Lehner和Holter，2002；Van，V等人，2001)。该实施方案将能够从细胞群体分离出某些残留的血细胞群体和不成熟的脂肪细胞(前脂肪细胞)。

在类似实施方案中，也可以使用连续流动方法，如脱落(apheresis)(Smith，1997)，和淘析(用或不用逆流)(Lasch等人，2000)，也可以使用(Ito和Shinomiya，2001)的方法。这些机理已经用于分级分离血细胞，包括基于年龄分离血红细胞(Lasch等人，2000)，用该一般方法从经处理的吸脂物进一步纯化目标细胞对本领域技术人员是显而易见的。该实施方案可能需要修饰图4中的装置和一次性装备(图3)从而该装置将与另一装置整合以提供脱落或者淘析能力。

通过短期细胞扩增后附着到塑料已经应用于骨髓来源的成年干细胞群体(Jaiswal等人，2000)。该方法使用培养条件优先扩增一种群体而其他群体得到保持(从而通过用生长选择的细胞稀释减少)或者由于缺少所需的生长条件而损失。Sekiya等人已经描述了在这点上用于骨髓来源的干细胞的条件(Sekiya等人，2002)。该方法(利用或不利用差别附着到组织培养塑料)可用于本发明的其他实施方案中。在该实施方案中，从图4中所示装置除去细胞并将细胞置于提供细胞培养组分的另一装置中。这可以是常规实验室组织培养的培养箱或者生物反应器型的装置，如Tsao等人，美国专利号6,001,642，或者Armstrong等人，美国专利号6,238,908所述。在备选实施方案中，混合组分(图4中所示装置的组件108；图3中的组件30)可以由允许经处理的吸脂物的短期粘附和/或细胞培养的生物反应器组分替换。该备选实施方案将允许将生物反应器组件整合到装置并且不需要从该装置除去细胞并置于另一装置中。

i.得到经处理的吸脂物的阐明方法

用以从患者除去脂肪组织的组织除去系统的一个实例在图1中阐明。在广义实施方案中，组织除去系统10包括组织收集容器12和连接到组织收集容器12的混合容器30。混合容器30和组织收集容器12之间的连接优选定义了密闭系统，其中从组织收集容器12导向混合容器30的组织不暴露于外部环境。系统10还包括出口32，其经构造以允许浓缩干细胞从组织收集系统10除去以施用于患者。组织收集容器12包括组织收集入口14和滤器16。滤器16布置在该容器内，并且经构造以例如在从患者除去组织时保持脂肪组织和穿过非脂肪组织。更具体地，滤器16允许穿过自由液体、血液和盐水，而在脂肪组织的最初收获期间或者在另一实施方案中，脂肪组织的最初收获后保持脂肪组织碎片。在那点上，滤器16包括许多孔，它们具有相同或不同的大小，但是大小为约20μm到5mm。在优选实施方案中，滤器为厚约200μm的医学级聚酯筛，其具有约265μm的孔大小和约47％的有效筛孔面积。该材料在洗涤期间保持组织但是在组织解离后允许细胞穿过网孔。从而，当从患者抽吸组织时，非脂肪组织可以与脂肪组织分离。混合容器30包括添加口30，其经构造以允许使用者向混合容器30施用添加剂以与混合容器30中所含干细胞混合。在优选实施方案中，组织收集容器12的尺寸应该允许在滤器中保持约1升组织碎片。在其他实施方案中，组织收集容器12的大小可以保持更大或更小体积的组织碎片；例如，组织收集容器的大小可以储存至少100mL脂肪组织碎片，和高达约2L脂肪组织碎片。

关于图1的系统10中存在的额外特征，组织入口14通过管22连接到插管24以限定组织除去线。在所阐明的实施方案中，插管24是集成的、单一用途吸脂术插管，并且该管为弹性管。该管的尺寸使得可以将其插入患者以从该患者除去脂肪组织。系统中所用的管22应该能够抵抗与吸脂辅助的脂肪整复相关的负压以减小压扁的可能性。组织收集容器12还包括置于滤器16上与组织入口14相反侧的抽吸孔18。抽吸孔18经构造以连接到抽吸装置20，其可以经手工操作或者自动操作。抽吸装置20可以是注射器或者可以是电真空等。抽吸装置20应该能够提供为容器12和插管24提供足够负压以从患者抽吸组织。如所阐明的，抽吸装置20通过管22连接到抽吸孔18。

组织除去系统10图解为还包括位于组织收集容器12和混合容器30之间的细胞收集容器26。细胞收集容器26位于系统10内从而细胞(如干细胞)穿过组织收集容器12到达细胞收集容器26再穿过混合容器30。在所阐明的实施方案中，细胞收集容器26通过细胞收集孔48与组织收集容器12连接。在系统10的实施方案中，细胞收集容器26包括细胞浓缩器(未显示)，其方便悬浮液中细胞的分离。细胞浓缩器的一个实例是离心装置，其可以基于例如，细胞的大小或密度将细胞与其他物质分开。另一实例是如上文讨论的旋转膜滤器。系统10还图解为包括滤器28，其构造使得细胞从细胞收集容器26穿过滤器28到达混合容器30，和防止例如大于细胞的物质穿过。细胞收集容器26还包括到达废物容器36的出口。细胞收集容器26中所含的物质的流动方向由一个或多个阀门的位置确定，这些阀门可以控制物质流向废物容器36或者混合容器30。

在所图解的实施方案中，细胞滤器28含有许多直径或者长度小于200μm的孔。在某些实施方案中，孔的直径小于200μm。在其他实施方案中，孔的直径为20到200μm。细胞滤器28可以远离细胞收集容器26或者可以包含在细胞收集容器26内。细胞滤器28还可以集成在细胞收集容器26中。系统10的额外的实施方案不包括细胞滤器28。细胞收集容器可以由任何适宜的材料制造。例如，细胞收集容器26可以是塑料袋，如常规用于血库中处理血液的那些塑料袋；或者在其他实施方案中，细胞收集容器26可以是结构上刚性的。在某些实施方案中，细胞收集容器26可以包括组分制备室和细胞洗涤/分离室。

在某些实施方案中，组分制备室包括一个或多个孔，其用于加入增强分离施用于患者的干细胞的试剂，如生长因子或者用于悬浮细胞的缓冲液，如上文讨论。在这些实施方案中，组分制备室优选包括混合装置以混合或者搅拌容器中的细胞和添加剂。组分制备室还包括用于除去其中收集的细胞的一个或多个孔。可以提供一个孔以容许细胞穿过而流向混合容器30。可以提供其他孔将细胞或者部分细胞导向其他靶标，如植入材料，包括骨碎片，或者导向细胞培养或者纯化装置。在一个实施方案中，细胞洗涤/分离室包括旋转膜滤器组分，其可以用作细胞浓缩器，还可以或者优选地作为离心装置的备选方案。

还图解系统10包括组织回收线路34，其用于提供从组织收集容器12到混合容器30的管道。从而，组织回收线路34穿过或者引导组织收集容器12中的组织到达混合容器30，在混合容器30中组织可以与从细胞收集容器26得到的细胞混合。在所图解的实施方案中，组织回收线路34延伸到组织容器12中以除去滤器16中所含的脂肪组织。使用一个或多个泵或者抽吸装置使组织穿过或者通过组织回收线路34以输送已经冲洗但是不一定解离的脂肪组织。

在一个实施方案中，系统10包括温度控制装置，其关于系统10放置以调节组织收集容器12中所含物质的温度。在某些实施方案中，温度控制装置为加热器，在其他实施方案中，温度控制装置为冷却器。在额外实施方案中，温度控制装置能够在加热器和冷却器之间转换。温度控制装置可以是调节组织收集容器12中所含脂肪组织的温度的装置或者可以是用于改变被输送到组织收集容器12的液体的温度的装置。已经发现加热脂肪组织促进该组织的解离以增强活性细胞组分的分离。此外，希望在某些实施方案中冷却一部分组织，优选活性细胞组分以提供对该细胞的保护。甚至细胞的稍稍冷却也可提供适宜的保护以增强处理期间细胞的存活。

组织除去系统10的出口32图解为混合容器20的元件。在额外实施方案中，出口32的位置与混合容器32分离。出口32优选含有封口，其保持组织除去系统10的密闭结构，在某些实施方案中，出口32含有流体不可透过的膜(例如，液体和空气不可透过的膜)。出口32的结构应该为在适宜条件下使混合容器30中的组合物穿过到达患者。例如，如果用注射器抽取组合物，出口32将能够容纳注射器针头而不危害该系统或者组合物的无菌性。在额外实施方案中，如果该出口连接到装置，该装置经设定施用组合物，但是不抽取组合物，如插管，其通过应用正压力使组合物通过插管移动而施用该组合物，出口32的构造应该允许混合容器30中所含组合物穿过该插管。在其他实施方案中，出口32可以含有，或者以密闭系统方式连接到用于施用组合物的装置，如注射器针头或者用于通过正压力施用组合物的插管。

组织除去系统10还图解为包括废物容器36，其用于从收集容器12收集废物。在所图解的实施方案中，废物容器36还经连接并在适当位置上以接受来自细胞收集容器26的废物。提供了与洗涤线路39流体连通的洗涤容器38，以通过洗涤孔46输送洗涤液体，如盐水或者其他适宜的缓冲液到组织收集容器12。组织收集容器12还包括空气入口40，其用于控制组织收集容器12中的压力量。提供组织收集容器12上的添加线路42以允许将添加剂加入组织收集容器12中。关于文中公开的方法，提供添加线路42以将一种或多种酶输送到组织收集容器12以方便活性细胞组分与滤器16中所含的剩余脂肪组织分离。如所图解的，添加线路42含有针头44，其可用于从适宜的容器接收酶。

组织除去系统10组件的一个具体实施方案在图2和图3中阐明，其中同样的数字代表同样的部分。在图2和3的具体实施方案中，组织收集容器12包括一个物体，当对该容器应用抽吸时该物体保持其形状。更具体地，组织收集容器12包括刚性物体，例如，由医学级聚酯制造的物体，其含有医学级聚酯的大体上为圆锥形的滤袋，该滤袋的网孔大小为275μm。该刚性组织收集容器可以具有约8英寸高和约5英寸直径的尺寸；壁厚度可以为约0.125英寸。该圆柱的内部由两个用于抽吸管的孔、两个具有管用于通过无菌停靠技术连接的孔，和两个用于通过用针头刺穿橡胶隔片的孔进入。可以用不同材料、网孔大小和数目和类型的孔实现相同的功能。例如，小于100μm或者大至几千微米的网孔大小将实现相同的目的，即允许盐水和血细胞穿过而保留脂肪组织聚集物和碎片。类似地，通过使用备选的刚性塑料材料，通过用非一次性的可多次使用的无菌插管代替一次性插管，或者通过本领域技术人员公知的许多其他修饰可以实现装置目的。然而，在组织除去系统10的其他实施方案中，组织收集容器12可以包括可压扁的物体，如组织收集袋。在此类系统中，优选为袋提供支持体，如内部或者外部框架，其帮助减小对袋应用抽吸时该袋将压扁的可能性。

为了减小组织除去系统10内的污染，可以在多种线路或管道上提供一个或多个夹子23以控制物质通过线路流到该系统的多种组件。夹子23允许使用者有效封闭组织除去系统10的多个区域。在优选实施方案中，系统10的一个或多个组件是一次性的。在该实施方案中避免重复使用组件有助于减小与反复使用多种组件有关的污染。此外，在一次性装备中提供组件提供了能够一次消毒所有组件的优点，这可以极大地减少实施文中公开的方法所需的时间。在完全或部分自动化的实施方案中，可以实现计算机控制的阀门作为夹子23的补充或者替代。

此外，组织除去系统10可以包括额外的装置或者组件，其允许确定滤器16中保留的物质的体积，以允许记录关于提取或者处理步骤的文字信息，或者执行其他补充功能，如在操作期间将所述装置连接到架子或者衬垫。

组织除去系统10的组件应该由不与生物流体或者组织反应并且不与用于处理生物流体和组织的试剂反应的材料制成。此外，用于制造多种组件的材料应该能够抵抗消毒，例如，通过高压灭菌和放射，包括但不限于β-或γ-放射进行的消毒。管道和插管把柄可以由任何适宜的材料，如聚乙烯制成。插管可以由任何适宜的材料(包括不锈钢)制成。

根据文中公开的本发明，组织除去系统10提供了密闭系统，其方便除去、处理和施用脂肪组织中发现的成年干细胞。该系统置于患者附近以除去脂肪组织，可以处理组织而不需要从该系统除去该组织。从而，提供了系统，其为患者提供新鲜的干细胞增强的组合物，并减小了与培养和保存干细胞相关的潜在危险。

因此，基于本公开，本发明提供了使用下面的步骤从患者提取组织的方法：(i)关于常规脂肪整复准备患者；(ii)从包装材料将插管和组织除去系统转移到无菌区域；(iii)将抽脂泵(带有常规捕集器和内嵌的微生物滤器)连接到从组织收集容器引出的软管接头；(iv)确保管螺旋夹没有夹住组织收集容器的抽吸孔；(v)使用插管作为常规抽脂插管以除去不想要的脂肪组织；(vi)用组织收集容器收集所希望量的脂肪组织后，在手工操作实施方案中用两个管螺旋夹封闭组织收集容器；(vii)确保组织收集容器被正确标记患者识别标签，按照惯例记录标签上的其他信息(步骤的日期和时间，等等)，和(viii)从患者提取脂肪组织。

关于所图解的组织除去系统10，通过用嵌入式流体捕集器将管22连接到抽吸源20并将插管24插入收获部位将组织直接收集到处理组件中。然后将脂肪组织抽吸入组织收集容器12，在12中脂肪组织被组织收集容器12内的滤器16保留。组织收集后，可以将收集的脂肪组织用洗涤容器38中的洗涤液，如无菌等渗盐水洗涤，所述洗涤液通过洗涤线路39加到组织收集容器12中。当所图解的实施方案中组织收集容器12由刚性材料制成以维持抽吸下的收集时，盐水加入期间从机架(housing)转移的空气可以通过空气入口40放出。备选地，空气可以转移到废物容器36或者类似的支撑位置。一旦冲洗组织，可以允许废物材料流入废物容器36。

收集组织后，可以将针头44插入含有胶原酶溶液的无菌小瓶中，然后该溶液进入组织收集容器12，在12中该溶液与脂肪组织在或者约37℃混合15-60分钟。如需要可以重复洗涤步骤并且洗脱活性细胞群体后可以洗涤解离的组织以便产率最大化。在组织解离结束时，组织收集容器12直立以允许脂肪细胞的浮悬。然后让活性细胞群体流入细胞收集容器26中，在26中细胞与胶原酶和残留的游离脂质分离。可以通过本领域中普通技术人员公知的任意方法洗涤和/或浓缩细胞，所述方法包括但不限于顺序离心/重悬浮洗涤或者连续流动机制。然后允许浓缩的、经洗涤的细胞流入混合容器30中，在30中这些细胞与来自组织回收线路34和/或任何计划的添加剂混合后从出口32除去以施用于患者。细胞收集容器26中所含物质可以在用细胞滤器28过滤后洗涤以加强除去不想要的残留细胞和组织聚集物，它们在应用时可以导致栓塞。

在处理期间，如果需要可以向多种容器加入一种或多种添加剂以提高结果。添加剂的某些实例包括优化洗涤和解离的试剂、增强处理期间活细胞群体的生存力的添加剂、抗微生物剂(例如，抗生素)、裂解脂肪细胞和/或血红细胞的添加剂，或者富集目的细胞群体(通过差别附着到固相部分或者促进细胞群体的大量减少或者富集)的添加剂。

在上面的实施方案中，组织收集容器12为组织除去系统10的处理组件内在的。备选地，可以使用单独的组织收集容器，如2002年9月12日申请的标题为“保护非胚胎细胞不受造血组织损害”的专利申请号10/242,094中描述的组织收集容器可完整或者部分使用并随后将解离的材料转移到处理组件中，所述专利申请要求普通转让的2001年9月14日申请的美国临时专利申请60/322,070的益处，将这些专利申请的内容特意并入本文作为参考。其他可能的组织收集容器在美国专利号6,316,247和5,372,945中公开。

如上面指出的，在本发明的某些实施方案中，通过提供可以自动执行该方法的步骤的一个或多个额外的装置可以自动化所述方法。在这些实施方案中，处理装置(例如，微处理器或者个人计算机)是部分或完全自动化上述步骤的装置。可以进行此类自动化的步骤的实例包括，但不限于，通过控制系统或者处理装置的泵或阀门控制流体和组织沿着特定管道途径的进出；用压力传感器检测堵塞；混合机制，使用容积机制测量将沿着特定途径移动的组织和/或流体的量；用热控制装置保持多种组分的温度；用时间选择和软件机制洗涤和浓缩细胞，和集成该过程。在一个实施方案中，软件可以控制该过程的参数以允许产生根据特定操作人员限定的参数制备的细胞群体。从而，一种或多种自动化装置提高了所述方法的性能，并提供了脂肪组织的自动收获和脂肪组织的处理以施用于患者。

一种具体的自动化装置在图4中图解。将组织除去容器(未显示)置于装置100中，使用不同颜色标记的引导标记112-118将管正确排列和插入到适宜的途径中。装置100包括许多阀门105和110，许多泵104和109。将管置于一系列阀门105、110和泵104、109，它们受到集成微处理系统的控制以按照用户限定的程序协调流体和组织流动。通过用户界面板106介导程序选择。将盐水容器置于支持结构101上并连接到组织收集容器。将胶原酶或者其他组织解离介质或混合物的小瓶或管(未显示)在点103处插入组织收集容器中。将废物袋(未显示)插入支持结构111中，细胞分离室/细胞收集容器置于支持结构107中，组织/细胞混合容器置于支持结构108中。组织收集容器置于搅拌/孵育室102中。

可以将脂肪组织收集到组织收集容器中而该容器位于该装置中或者该装置位置之前。该装置可以含有任选的透明插入物119或者其他装置以允许确定组织收集容器内的组织的体积。备选地，通过测量搅拌/孵育室102(相应于组织收集容器12)所含物质的重量可以确定体积。该体积可以显示在用户界面屏106上。

然后微处理器打开线路114和115上的阀门105并开动线114上的泵104以将盐水导入收集室102并除去废物物质115进入废物袋111。在该过程期间，收集室通过摇动搅动并通过集成到室102的加热装置保持在程序设定的温度。在某些实施方案中，组织处理可以使用预热的盐水，在该情况下搅拌/孵育室的加热装置的作用是保持温度在确定的程序设定点而不是升高温度。

一旦洗涤组织，从0％到100％的某一分数的完整的、经洗涤的脂肪组织可以通过开动线路116上的泵109和阀门110从孵育室102除去。此时抽取的物质保持在混合室108中。通过打开线路113上的阀门105，关闭113上的其他阀门和开动泵104可以将解离介质103加入室102中剩余的物质。加入解离介质后，室102经搅动并保持在如上描述的温度下。在程序化孵育期结束时，停止搅动以允许脂肪细胞浮选。可以加入额外的盐水以促进该过程。脂肪细胞浮选后，打开线112和115上的阀门以允许从室102除去靶细胞群体进入细胞洗涤室107中。经洗涤的细胞通过线路117除去进入混合室108，将上清液和洗涤溶液通过线路118除去进入废物室111。额外的盐水通过线路114穿过该系统以完成洗涤过程。细胞在室108中与早先处理的通过线路116除去的任何完整组织混合。可通过本领域中技术人员公知的任何方法实现混合，所述方法包括但不限于室的搅拌摇动/翻转，或者通过压缩脉冲或者通过移动滚筒。然后通过一次性装备的混合室中的孔除去混合的物质。

该装置包括根据预先程序设定的参数106的自动化该过程的微处理器控制的机制。该系统还可以包括使用压力传感器检测堵塞和类似安全和质量控制机制。在优选实施方案中，该系统的软件组件将包括“运行数据”的自动化收集，所述数据包括，例如，一次性组件的批号、温度和体积测量、组织体积和细胞数参数、所应用的酶的剂量、孵育时间、操作人员身份、日期和时间、患者身份，等等。在该装置的优选实施方案中，将集成条形码阅读系统以允许这些变量(例如，一次性装备批号和失效期、胶原酶的批号和失效期、患者/样品标识符，等等)的数据作为处理文件的一部分进入装置控制器。这将减少数据输入错误的机会。使用USB或者本领域中公知的其他接口或者系统可以将该装置整合到控制系统。这样，该装置将提供数据输入和过程记录的集成控制。这些参数的打印报告将是该装置的程序化操作的用户定义的参数的一部分。自然，这将需要在软件中集成打印机组件(硬件和驱动程序)或者打印机驱动程序以及该装置的硬件中打印机的接口输出连接器(例如，USB端口)。

在另一实施方案中，整合到控制器的软件将提示用户进行将管和其他元件正确插入装置的步骤。软件将还开始自动化检测以证实管的正确插入、不存在堵塞，等等。

该装置中处理的一般方法将使用与该公开中别处关于手工细胞处理所描述的参数相同的参数。

用于细胞处理的分阶段机制的许多其他构造将对本领域技术人员是显而易见的，并且仅包括本描述作为一个实例。例如，洗涤和解离期间组织和盐水的混合可以通过本实例中的搅拌或者通过流体再循环发生。细胞洗涤可以通过连续流动机制如旋转膜方法、差别粘附、差别离心(包括，但不限于差别沉降、速度、或者梯度分离)，或者通过方法的联合来介导。类似的，允许细胞的进一步操作的其他组分包括加入生长因子或者其他生物应答修饰剂(Lind，1998)(Hanada等人，1997)(Lieberman等人，1998)，将细胞与天然或者合成的组分混合，所述组分将与细胞一起植入接受者(Fukuda，2001；Sodian等人，2002；Ye等人，2000)。

处理后操作可以还包括细胞培养(Caplan和Bruder，2001；DeUgarte等人，2003；Zuk等人，2001)、基因转移(Luskey等人，1990；Morizono等人，2003)，或者进一步细胞纯化(Greenberg和Hammer，2001；Mainwaring和Rowley，1985；Schweitzer等人，1995)。执行这些功能的机制可以集成到图4中所示装置或者可以整合到单独的装置中。

在本发明的额外实施方案中，可以将收集到常规脂肪组织捕集器的组织转移到经设计用于处理其他组织的处理装备。例如，Baxter Inc.生产和销售用于骨髓移植收获背景中的一系列塑料袋和滤器(″BoneMarrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and Inline Filters″，产品号，4R2107，美国专利号4,346,703和5,724,988)。该袋装置含有具有集成的800μm滤器的大的锥形袋，所述滤器可用于洗涤收集的脂肪组织。在该实例中，大于800μm的脂肪组织碎片将保持在该袋中。通过反复加入盐水(或者其他洗涤溶液)然后通过滤器下面的孔除去废物可以洗涤这些碎片。可以通过手工或者使用桌面摇动装置实现混合，通过使用加热垫可以升温。可以在该袋的腔内发生解离。解离后，细胞将穿过集成的800μm滤器(和任选地通过与试剂盒提供的一个或多个更小网孔大小的滤器)并收集到收集袋(也提供)中。该袋将置于离心机(例如，Sorval RC-3C)中，细胞可以在该离心机中顺序洗涤和浓缩。也可以用现有的细胞洗涤装置(主要为洗涤人血液产品开发)如Baxter Inc(Cytomate或Baxter CS3000)或Cobe Inc.(Cobe Spectra)销售的装置洗涤细胞。可以用生产商提供的配件将一次性元件集成或者可以通过使用无菌连接装置，如Terumo Inc生产的那些装置连接这些一次性元件。类似地，该较少集成的方法中描述的机制可以连接到中央控制器并作为更集成的装置的组件装配。可以用蠕动泵或者泵组自动化流体流动，使用手工或者自动化夹具打开和关闭流体路径。

在本发明的优选实施方案中，组织除去系统和加工装备将存在于接受治疗的患者的附近，如手术室或者门诊病人处理室(有效地在患者的床边)。这允许快速、有效组织收获和加工，除去了样品处理/标记错误的机会从而允许整个过程的执行在一个手术步骤中进行。

提供下面的实施例以阐明该技术可以应用的特定条件和背景，这些实施例不打算限制本公开中包括的本发明和权利要求的范围。

2.用经处理的吸脂物(ADC)治疗心血管疾病和病症的方法

如在本公开中阐明的，在尤其优选的实施方案中，本发明的ADC可用于治疗心血管疾病和病症。通过实施本发明的方法得到的脂肪组织来源的干细胞和祖细胞具有一些性质，这些性质有助于减小和/或最小化损伤和促进损伤后心肌或者心血管修复和再生。这些性质包括能够合成和分泌刺激新血管形成的生长因子；能够合成和分泌刺激细胞存活和增殖的生长因子；能够增殖和分化成直接参与新血管形成的细胞；能够植入受损的心肌和抑制疤痕形成(胶原沉积和交联)；能够增殖和分化成能够促进心肌收缩性的肌细胞；和能够增殖和分化成心肌细胞。

使用本发明的脂肪来源的成年干细胞的前面减小和/或最小化损伤和促进损伤后心肌或者心血管修复和再生的方法在本公开下面的实施例部分详细描述。具体地，本发明第一次阐明本发明的脂肪来源的干细胞(或者ADC)表达多种血管生成生长因子，包括胎盘生长因子(PIGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，含有内皮祖细胞(EPC)，其在血管形成中具有确定的功能，体外发育成血管，支持体内局部缺血性组织存活，诱导后肢的阻塞/再灌注损伤后的再灌注，当动物心脏损伤后注射到动物时归巢到心脏，和分化成表达标记的细胞，所述标记与当动物心脏损伤后注射到动物时它们分化成心肌细胞的标记一致。

因此，在本发明的一方面，从供体的脂肪组织提取脂肪组织来源的细胞并将其用于通过文中阐明的一种或多种机制引起对损害或者再生的心肌或者其他心肌组织的治疗益处。在优选实施方案中，从人的脂肪组织提取细胞并将该细胞植入所述人中，从而减小与针对移植物的抗原和/或免疫原应答有关的潜在并发症。通常评价患者以评估心肌损伤或者疾病，这可以通过医生或者其他临床供应者实施一个或多个下面的步骤来完成：患者的健康史、体检、和客观数据，包括但不限于EKG、血清心脏酶图谱，和超声波心动描记法。

在一个实施方案中，在患者接受经设计用以减少血液凝固和治疗心肌梗死的任意产品之前进行收获步骤。然而，在某些实施方案中，可以在收获步骤之前让患者接受阿司匹林。此外，一种优选的方法包括在任何试图的血管再形成步骤之前收集脂肪组织。然而，如本领域中技术人员理解的，将预期收集的时间选择不同并且取决于多种因素，包括患者稳定性、患者凝固图谱、供给者的可用性，和质量照顾标准。最后，收集的时间选择将由负责对受侵袭的患者进行护理的开业医生决定。

从患者收集的脂肪组织的体积可以为约0cc到约2000cc，在一些实施方案中，高达约3000cc。所除去的脂肪的体积将在患者之间不同并且将取决于许多因素，包括但不限于：年龄、体质、凝血图、血液动力学稳定性、梗死的严重性、共-发病、和医生的偏爱。

细胞可以施用于其中心肌功能受损的任何背景下的患者。这些背景的实例包括，但不限于，急性心肌梗死(心脏病发作)、充血性心力衰竭(作为治疗或者作为移植的桥接)，和冠状动脉旁路移植术手术的补充，等等。可以预先提取细胞并将其以冷冻保存的方式保存或者可以在明确需要时或者接近该时间时提取细胞。如文中讨论的，可以将细胞施用于患者，或者直接应用于受损的组织，或者受损组织附近，而不进一步处理或者按照其他的方法进一步纯化、修饰、刺激或者改变细胞。例如，从患者所得细胞可以施用于需要该细胞的患者而不在将它们施用于该患者前培养所述细胞。在一个实施方案中，将在患者的床边实施脂肪组织的收集。可以用血液动力学监视患者的临床状态。

根据文中公开的本发明，可以在从患者收获脂肪组织后不久将脂肪来源的细胞递送给该患者。例如，可以在处理脂肪组织后将细胞立即施用以得到脂肪来源的干细胞的组合物。在一个实施方案中，递送的优选计时应该在梗死后数小时到数天后发生以利用心脏损伤后存在的神经激素环境。最后，递送的计时将取决于患者可用性和处理脂肪组织所需的处理时间。在另一实施方案中，如果将再次输注于患者的细胞受到如文中讨论的额外的修饰、纯化、刺激或者其他操作，那么递送计时将相对更长。此外，梗死后可以多次施用脂肪来源的细胞。例如，细胞可以在更长的时间内(例如数小时)连续施用，或者可以在更长的时间内多次快速浓注施用。在某些实施方案中，细胞的最初施用将在梗死后约12小时内施用，如在6小时，或者一次和多次细胞剂量将以12小时间隔施用。

施用于患者的细胞数可以例如与脂肪组织处理后的细胞产率有关。细胞总数的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，所递送的剂量将取决于细胞向患者的递送途径。当使用心外和心内递送系统时，需要较少的细胞，因为这些系统和方法可以提供治疗心血管疾病的最直接的途径。在本发明的一个实施方案中，将要递送到患者的细胞，例如，未纯化的细胞数预计为约5.5×10⁴个细胞。然而，可以以数量级调节该数目以实现所希望的疗效。

细胞可以与添加剂一起应用以增强、控制或者指导预定的疗效。例如，在一个实施方案中，如文中描绘，可以通过抗体介导的阳性和/或阴性细胞选择进一步纯化细胞以富集细胞群体以增加功效、减少发病率，或者促进所述方法的容易性。类似地，细胞可以与生物相容的基质一起应用，所述基质通过支持和/或指导植入细胞的命运而促进体内组织工程化。同样地，可以将细胞基因操作后施用从而它们表达基因产物，认为或预定所述基因产物促进所述细胞提供的治疗应答。操作的实例包括控制(增加或减少)促进血管发生或者脉管发生的因子(例如VEGF)的表达、促进分化成特定细胞谱系的发育基因(例如，MyoD)或者刺激细胞生长和分化的发育基因(例如，bFGF-1)的表达的操作。

还可以将细胞在支架材料上进行细胞培养后植入。从而，使用ADC可以在天然或者合成的基质或支架上合成组织工程化瓣膜、心室补片、心包膜、血管，和其他结构后插入或者植入接受者(Eschenhagen等人，2002；Zimmermann等人，2004；Zimmermann等人，2002；Nerem和Ensley，2004)。实际上，已经阐明了脂肪组织来源的干细胞和祖细胞体外分化成心肌细胞的细胞表达标记(Gaustad等人，2004；Rangappa等人，2003)。

3.用于治疗心血管疾病和病症的ADC的施用途径

在一个实施方案中，优选将细胞直接施用于目的计划益处的部位。这可以通过直接注射到心脏的外部表面(心外膜)、通过插入适宜的插管通过内表面(心内的)直接注射到心肌、通过动脉或者静脉输液(包括逆行流动机制)或者通本文中公开的或者本领域中公知的其他方法实现。本领域中普通技术人员公知的施用途径包括但不限于，静脉内、冠状动脉内、心肌内、心肌外膜、心室内、后窦或者静脉内。

如上文提到的，通过一些途径可以施用细胞，这些途径包括通过静脉或者动脉输液(包括逆行流动输液)全身性施用或者直接注射到心脏。全身性施用，尤其通过外围静脉通路全身性施用依赖于心脏的天然灌注从而具有最小侵入性和脂肪组织来源的细胞能够靶定损伤部位的优点。细胞可以以单次快速浓注注射，这可通过缓慢输液或者通过相隔数小时的交错系列应用或者如果细胞经适宜保存，可以相隔数天或者数周交错系列应用。可以通过导管插入术应用细胞从而通过使用气囊控制心肌血流增强细胞通过心脏的首次穿过。关于外周静脉通路，可以通过导管以单次快速浓注或者以多次更小的等分试样注射细胞。还可以通过心外膜注射将细胞直接应用于心肌。这可以在打开心脏方法(如冠状动脉旁路移植手术)或者放置心室辅助装置的背景下在直接观察下应用。装备针头的导管可以用于将细胞以心内方式直接递送到心肌，这可以允许直接应用的较小的侵入性方法。

在一个实施方案中，递送途径包括通过标准外周静脉导管、中央静脉导管、或者肺动脉导管的静脉内递送。在其他实施方案中，可以通过当前可接受的方法得到的冠状动脉内途径递送细胞。通过位于患者脉管系统内远端和近端气囊的连续充气/放气可以控制细胞的流动，从而产生暂时的无流动区，其促进细胞植入或者细胞治疗作用。在另一实施方案中，可以通过心内(心室的内表面)方法递送细胞，该方法需要使用相容的导管以及能够成像或者检测所计划的靶组织。备选地，可以通过心外膜(心脏的外表面)方法递送细胞。该递送可以通过打开心脏方法时的直接观察或者通过需要专门的细胞递送仪器的胸腔镜方法实现。此外，应该按照单独或者与上面鉴别的一种或多种方法联合的下述途径递送细胞：皮下、肌内、舌下、逆行冠状输液、冠状旁路机制、离体膜充氧(ECMO)设备和通过心包窗。

在一个实施方案中，将细胞作为血管内快速浓注或者定时输液施用于患者。在另一实施方案中，可以将细胞重悬在人工或者天然培养基或者组织支架中后施用于患者。

施用于患者的细胞剂量将取决于收获的脂肪组织量和供体的身体质量指数(作为可利用的脂肪组织的量度)。也可通过心肌损伤或者退化的程度确定所获的组织的量。本发明的范围包括使用多次组织收获的多次治疗或者使用应用间细胞的适宜保存的单次收获的多次治疗。

所处理的吸脂物的部分在施用于患者前可以保存起来。对于短期保存(少于6小时)，可以将细胞在室温或者室温下保存在密闭容器中，容器中补加或者不补加营养溶液。中期保存(小于48小时)优选在2-8℃下等渗的缓冲液(例如，Plasmalyte)的容器中进行，所述容器含有防止细胞贴壁的材料或者由防止细胞贴壁的材料组成。长期保存优选通过适宜的冷藏进行并且将细胞保存在促进细胞功能保持的条件下，如2002年9月13日申请的普通拥有和转让的PCT申请号PCT/US02/29207和2001年9月14日申请的美国临时申请号60/322,070中公开的条件，这里引用所述专利申请作为参考。

按照本发明的一个方面，施用于患者的脂肪组织来源的细胞可以作为生长因子递送载体。例如，通过工程化细胞以表达适于减轻与心血管病症或疾病有关的症状的一种或多种生长因子，可以将细胞施用于患者，并且工程化以释放一种或多种生长因子。所述释放可以以受控的方式长期释放。因为可以控制释放，所以生长因子以脉冲的或者定期的方式释放从而在组织的损伤区域附近生长因子局部升高和/或生长因子的量局部下降。

施用于患者的细胞不仅帮助恢复受损或者不健康组织的功能，而且促进受损组织的重建。

可以进行细胞递送但是其不限于下面的场所：诊所、门诊部、急诊室、医院病房、重病监护室、手术室、导管插入室，和放射室。

在一个实施方案中，将通过但不限于下面的临床量度之一阐明细胞递送疗法的效果：心脏射血分数增加、心力衰竭率降低、梗死尺寸减小、患病率(肺水肿、肾衰竭、心率不齐)的减小、运动耐受性的改善或者其他生命质量量度，和死亡率降低。该方法后数天到数周时间里细胞疗法的效果将变得明显。然而，有益效果可以在早至该方法后数小时后观察到，并且可以持续数年。

通常在细胞递送之前和期间监视患者。监视方法包括，但不限于：凝血研究、氧饱和、血流动力学监视，和心律监视。细胞递送后，患者需要约24小时对副反应的监视。用于评估所述方法的功能改进的跟踪研究可以包括但不限于：患者功能性能力(例如，用力时呼吸困难、爆发性夜间呼吸困难、咽峡炎)、超声波心动描记法、核灌注研究、磁共振成像、正电子成像术，和冠状血管造影术。

如前面提出的，在优选实施方案中，将ADC，即活性脂肪来源的干细胞群体直接施用于患者。换句话说，将活性细胞群体(即干细胞和/或内皮前体细胞)施用于患者而不从系统除去或者在施用于患者前暴露于系统的外部环境。提供密闭的系统减小了施用于患者的材料污染的可能性。从而，在密闭系统中处理脂肪组织提供了相对于现有方法的益处，因为活性细胞群体更可能是无菌的。在这种实施方案中，干细胞和/或内皮前体细胞暴露于外部环境或者从系统除去的唯一时间是细胞被吸入应用装置或者施用于患者时。在一个实施方案中，应用装置可以是密闭系统的部分。从而，用于这些实施方案中的细胞不经处理以用于培养或者冷藏并且可以不经处理而施用于患者，或者可以与其他组织或者细胞混合后施用于患者。

在其他实施方案中，保存至少一部分活性细胞群体以用于以后的植入/灌注。可以将该群体分成一份以上的等分试样或者单位从而干细胞或者内皮前体细胞群体的部分保留用于以后应用而部分立即应用于患者。细胞库中所有或部分细胞的中到长期保存也在本发明的范围内，如2002年9月12日申请的标题为“保存非胚胎细胞防止非造血组织的危害”的美国专利申请号10/242,094中公开的，该申请要求普通转让的2001年9月14日申请的美国临时专利申请60/322,070的益处，将这些文献特别并入本文作为参考。处理结束时，可以将浓缩的细胞装入递送装置，如注射器，以通过本领域中普通技术人员公知的任意方法置于接受者中。

II.药物组合物

活性细胞群体可以单独应用或者与其他细胞、组织、组织碎片、生长因子，如VEGF和其他公知的血管生成和动脉生成性生长因子、生物活性或惰性化合物、可以再吸收的塑料支架，或者旨在增强群体的递送、功效、耐受性或者功能的其他添加剂联合应用。通过插入DNA或者通过将DNA以这样的方式置于细胞培养物中使得改变、增强或者补充细胞的功能以得到结构或者治疗目的来修饰细胞群体。例如，干细胞的基因转移技术是本领域中技术人员公知的，如(Morizono等人，2003；Mosca等人，2000)中公开，并且可以包括病毒转染技术，更具体地，如(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中公开的腺相关病毒基因转移技术。还可以如(Muramatsu等人，1998)中公开的实施基于非病毒的技术。

另一方面，细胞可以与编码原-血管生成和/或心肌生成的生长因子的基因结合，所述基因允许细胞在心脏修复或再生期间作为它们的生长因子的自身来源。还可以应用编码抗凋亡因子的基因或者试剂。可以通过本领域中公知的任意技术加入基因(或者基因的联合)，所述技术包括，但不限于腺病毒转导、“基因枪”、脂质体介导的转导，和逆转录病毒或者慢病毒介导的转导、质粒、腺相关病毒。细胞可以与携带基因递送载体的载体材料一起植入，所述基因递送载体能够随时间释放和/或递送基因到细胞从而转导可以持续或者在原位启动。尤其当细胞和/或含有该细胞的组织施用于该细胞和/或含有该细胞的组织从中得到的患者之外的患者时，可以对接受该细胞和/或含有该细胞的组织的患者施用一种或多种免疫抑制剂以减小，优选防止移植物的排斥。文中所用术语“免疫抑制药物或试剂”旨在包括一种或者干扰正常免疫功能的药物试剂。适宜用于文中公开的方法的免疫抑制剂的实例包括抑制T-细胞/B细胞共刺激途径的试剂，如美国专利公开号20020182211中描述的干扰T细胞和B细胞通过CTLA4和B7途径偶联的试剂。优选的免疫抑制剂为环孢菌素A。其他实例包括myophenylate mofetil、rapamicin、和抗-胸腺细胞球蛋白。在一个实施方案中，免疫抑制药物与至少一种其他治疗剂一起施用。免疫抑制药物与以与施用途径相容的制剂施用并且以足够实现所希望的治疗效果的剂量施用。在另一实施方案中，免疫抑制药物施用足够短的时间而不诱导对本发明ADC的耐受性。

在本发明的某些实施方案中，细胞与一种或多种细胞分化试剂，如细胞因子和生长因子施用于患者。多种不同的细胞分化试剂的实例在(Gimble等人，1995；Lennon等人，1995；Majumdar等人，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等人，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等人，2001；Zuk等人，2001)中公开。

通过下面的实施例进一步阐明本发明，决不应将这些实施例理解为进一步限制。所有引用的参考文献，包括本申请中引用的参考文献、出版的专利、公开的专利申请，和共同待决的专利申请特别并入本文作为参考。

实施例

下面实施例中所用的脂肪来源的干细胞的ADC或者活性群体通过本公开中描述的方法和/或2002年12月9日申请的题为“用经处理的吸脂细胞治疗患者的系统和方法”的美国申请序列号10/316,127中描述的方法得到，美国申请序列号10/316,127要求普通转让的2001年12月7日申请的美国临时申请序列号60/338,856的优先权，将所述申请的内容特别并入本文作为参考。

实施例1：通过ADC表达血管生成生长因子VEGF

血管内皮生长因子(VEGF)是血管发生的关键调节剂之一(Nagy等人，2003；Folkman，1995)。胎盘生长因子——VEGF家族的另一成员在血管发生以及动脉发生(侧支血管应答增加的灌注和剪切力募集和扩增的过程)中起相似作用(Nagy等人，2003；Pipp等人，2003；Scholz等人，2003)。特别地，野生型(P1GF+/+)细胞向P1GF敲除小鼠的移植恢复了从后肢局部缺血快速恢复的能力(Scholz等人，2003)。

考虑到血管发生和动脉发生对再血管化过程的重要性，使用来自三名供体的ADC用ELISA测定法(R&D Systems，Minneapolis，MN)检查ADC细胞的P1GF和VEGF表达。一名供体具有高血糖和2型糖尿病(与微血管和微血管疾病高度相关的疾病，包括患有冠状动脉病的患者)史。将来自每名供体的ADC细胞以1,000个细胞/cm²铺于补加10％FCS和5％HS的DMEMIF-12培养基中并生长到汇合。采集上清液样品并分析PIGF和VEGF蛋白质的表达。如图5A和5B中所示，结果表明本发明的脂肪来源的干细胞高水平表达VEGF(图5A)和PIGF(图5B)。

这些数据表明来自正常和糖尿病患者的脂肪组织来源的干细胞和祖细胞表达血管生成和动脉生成性生长因子。这是重要的，因为患有糖尿病的患者的心血管疾病的危险增加并且这些数据表明ADC细胞在糖尿病背景中保持它们的血管生成能力。从而，糖尿病患者可以从他们自身的ADC细胞得到血管生成益处。

实施例2：ADC含有参与血管发生的细胞群体

公知内皮祖细胞(EPCs)参与血管发生。已经在外周血、脐血、骨髓、和胎儿肝脏中检测到循环内皮前体细胞(Takahashi，1999；Asahara，1999；Asahara，1997；Loomans，2004；Shintani，2001；Vasa，2001)。为了确定脂肪来源的干细胞中EPC的频率，实施EPC测定。将ADC细胞铺在包被纤连蛋白的平板上并在内皮细胞培养基中培养3天以除去成熟的内皮细胞。除去未贴壁的细胞并再次铺板。14天后，通过用缀合FITC的荆豆(Ulex europaeus)凝集素-1(VectorLabs，Burlingame，CA)和DiI-标记的乙酰化LDL(MolecularProbes，Eugene，OR)染色鉴定菌落。如图6中所示，结果表明EPC频率为约500EPC/10⁶ADC细胞。

脂肪组织来源的干细胞和祖细胞群体内EPCs的存在表明该群体可以直接参与新血管的发育和增强血管发生和再灌注，从而减少心肌梗死或者充血性心力衰竭后局部缺血的持续时间。

实施例3：ADC中血管结构的体外发育

本领域公知的血管发生测定法是这样的测定法，其中成纤维细胞的喂饲层上生长的内皮细胞发育成CD31-阳性管的复杂网络，让人想起初生毛细血管网(Donovan等人，2001)。在缺少喂饲层时ADC形成相似网络(图7A)。值得注意地，从具有链脲霉素(STZ)诱导的1型糖尿病的高血糖小鼠得到的ADC细胞与未处理的小鼠以相似频率形成相似结构(图7B)。

这是重要的，因为糖尿病患者的心血管疾病危险增加，这些数据表明ADC细胞在糖尿病背景中保持它们的血管生成能力。从而，糖尿病患者可以从他们的自身ADC细胞得到血管生成益处。

总之，上面实施例1到3的结果表明脂肪来源的干细胞含有可以促进血管发生和动脉发生的细胞群体。这些结果还表明来自糖尿病人供体或者表现出持续高血糖的STZ-处理的小鼠的脂肪来源的干细胞可能不缺乏促进血管发生的细胞。从而，脂肪可以代表再生细胞库，所述再生细胞不受到其中心血管疾病的危险显著增加的糖尿病背景的损害。

实施例4：ADC中血管结构的体内发育

如果细胞不发挥体内血管活性，那么体外血管发生潜力尽管有希望，但是几乎没有价值。啮齿动物中关键肢局部缺血的手术诱导是其中可以观察到动脉发生(主要应答增加的剪切力的侧枝血管的募集和扩大)和血管发生(应答局部缺血的心血管发生)的同时发生过程的公认模型(Schatteman，2000；Scholz，2002；Takahashi，1999)。该模型在免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠中开发，所述小鼠中可以观察到人细胞驱动再灌注。具体地，将动物用氯胺酮和甲苄噻嗪(80mg/kg；7.5mg/kg)麻醉并以仰卧位置姿势置于手术台面上。如下为两个后肢确定手术前血流值。将动物用聚维酮碘预处理，以常规消毒方式覆盖并置于循环水浴上。切开单侧1.5cm切口，该切口从后肢的起端到接近膝盖以暴露髂动脉，接近其分叉点到深层和表面股动脉。用3-0丝结扎线对脉管系统在下面的部位打结：1)髂动脉接近其分叉点；2)深层股动脉起始的远端，3)接近表面股动脉的分枝处。结扎后，一起除去脉管系统。然后鉴定任何明显侧枝，将其结扎并随后除去。伤口和肌肉层用4-0vicryl封闭并用5-0vicryl封闭皮肤。动物手术后用布诺啡(0.5mg/kg)处理并在循环水浴上恢复直到自发斜卧。手术后24小时，将动物通过尾静脉注射5×10⁶个ADC细胞。NOD-SCID小鼠用人供体细胞注射，包括在一个研究中，用来自糖尿病患者的细胞注射。处理后14天对流动成像。

在这些研究中，ADC处理的动物表现出肢结构保持的改善(肢挽救；与0/5ADC处理的动物相比2/3未处理的小鼠丧失所有较低的后肢结构)和流动恢复的改善(图8)。最显著地，在接受来自糖尿病人供体细胞的NOD-SCID小鼠中，与未治疗动物中10±10％相比，经治疗的动物中第14天流动恢复到50±11％(p＜0.05)。到第19天已经发生反弹从而实验肢中灌注大于对照中的灌注(136±37％)。该反应在用从两名正常(非糖尿病)供体得到的细胞观察的范围内(50-90％)。

在类似实验中，在其中可以确定自体细胞转移的效果的免疫活性小鼠(129S小鼠)中，ADC细胞处理的小鼠在第14天表现出80±12％流动恢复，相比未处理的小鼠中为56±4％。

在该模型中，血流的恢复来自侧枝血管的募集和扩大和下肢中的血管发生。这些过程是梗死后心脏中血流恢复的关键。从而，ADC体内刺激这些过程的能力强烈支持ADC细胞应用于心肌梗死的背景中。还重要的是注意到从糖尿病供体(处于心血管疾病的较高危险下的患者群体的一员)所得ADC细胞也表现出该活性。

实施例5：增加ADC剂量与提高的移植存活和血管发生有关

自体脂肪组织的移植是整形和重构手术中相对常见的方法{Fulton，1998；Shiffman，2001}。然而，该方法受到如下事实的限制，即转移的脂肪组织碎片没有血管供应，结果，移植物存活取决于新血管形成(Coleman，1995；Eppley等人，1990)。从而，移植的组织以受限的方式代表局部缺血组织。

在Fisher大鼠中进行了研究，其中将脂肪组织碎片移植到外部大腿肌肉上的皮下空间中。将右腿仅用0.2g脂肪组织碎片移植，左腿用0.2g脂肪组织碎片移植，补加三种不同剂量(1.7×10⁵-1.3×10⁶个细胞/移植物；每种剂量三只动物)的脂肪来源的干细胞；这样，对侧腿作为对照。将动物保持1个月，之后对动物实施安乐死并回收移植物，将其称重，福尔马林固定并包埋在石蜡中进行组织学分析。

如图9A中所示，结果表明对照腿中移植组织的最小保持，和经处理腿中移植物重量保持的依赖剂量的增加。此外，移植物的免疫组织化学分析表明脂肪来源的干细胞处理的移植物中大量新血管发生和灌注(图9B，箭头)。这也与脂肪组织形态的保持相关(图9B)。

如上文，ADC细胞促进灌注不足的缺血组织的存活的论证是心血管疾病中临床潜力的重要标志。

实施例6：通过ADC的心肌植入

心肌的冷损伤是研究细胞治疗在心肌再生中的作用的成熟的手术模型(Marchlinski等人，1987)。为了阐明ADC细胞能够植入受损的心肌并从而移植疤痕形成(胶原沉积和交联)，进行B6129SF1/J小鼠中心肌冷损伤。损伤即刻后，通过心室内途径注射从lacZ基因为转基因的ROSA26小鼠中收获的1百万(1.0×10⁶)个ADC细胞。用β-半乳糖苷酶染色的受体心脏组织将通过染成蓝色检测供体脂肪来源的干细胞的存在。在注射后5个时间点处理并收获小鼠心脏：第1天、第7天、第14天、第28天、第84天。如图10中所示，结果阐明上面参考的所有时间点梗死的心肌区域中供体来源的脂肪衍生的干细胞的植入。图10阐明植入的组织学时间线。

重要的是，在第14天的供体来源的(β-半乳糖苷酶阳性)细胞的免疫组织化学分析表明许多供体来源的细胞表达心肌细胞标记肌球蛋白重链(图11)。这表明ADC细胞能够归巢到受损心脏的损伤部位并且能够分化成心肌细胞。从而，ADC细胞能够补充心脏病发作(心肌梗死)后损失的心肌细胞。

为了在物种间扩展这些发现，研究了大鼠阻塞/再灌注模型中供体来源的经处理的吸脂物的植入。在该实验设置中，用7-0聚丙烯纺织纤维暂时阻塞免疫活性Wistar大鼠的主要冠状动脉(左前降支)并且用小部分硅胶管作为动脉上的圈套。1小时后，释放阻塞并允许血液再灌注局部缺血的心肌。该模型更接近代表人临床范例中的损伤和修复机理。再灌注后，立即通过心室内途径注射从Rosa26小鼠得到的1百万(1×10⁶)个ADC细胞。注射后1周收获心脏。如图12中所示，结果阐明了供体来源的ADC细胞的植入。

实施例7：急性心脏损伤的治疗

急性心肌梗死(心脏病发作)导致心肌的局部缺血损伤。通过损伤组织的再灌注和心肌组织的再生可以使组织损伤最小化(Murry等人，1996；Orlic等人，2001；Orlic等人，2003；Rajnoch等人，2001；Strauer等人，2002；Assmus等人，2002)。由于例如非脂肪来源疗法，如骨髓收获使用更多数目的非培养的细胞和更纯的细胞至少一种，如文中公开的，脂肪来源的细胞疗法设法提供相对于非脂肪来源的细胞疗法的再生细胞的更好来源。

患者被怀疑患有心急梗死。患者经历1小时的梗死后被接受。为患者开具脂肪来源的细胞疗法的处方。查看患者的体型寻找适于进行脂肪组织采集的部位。通过下面的至少一种表征收获部位：受到正常解剖结构限制的潜在空间、处于损害危险的非主要血管或者内脏结构，和接近的容易性。优选第一次收获部位，但是以前的收获部位不妨碍额外的脂肪组织收获。潜在的收获部位包括，但不限于下面的：双侧下肢的侧面和中间大腿区、前腹壁血管翳、和双侧肋腹区。

患者接受肿胀流体溶液的皮下注射，该溶液含有例如不同标准给药方案中的利多卡因、盐水和肾上腺素的联合。使用解剖刀(例如，11-刀片解剖刀)，在患者的右和/或左腿的股内前廉区中产生小的穿刺伤口以便横切真皮。将刀片转360度以完成伤口。将钝头插管(例如，14-号插管)插入切口下的皮下脂肪组织平面。该插管连接动力辅助的抽吸装置。通过脂肪组织平面移动插管以破坏结缔组织结构。得到约500cc吸出物。除去脂肪组织后，用标准手术技术实现止血并将伤口缝合。

根据上文中公开的方法处理吸脂物以得到一单位浓缩的脂肪来源的干细胞。备选地，梗死约6小时后，对患者施用干细胞。基于吸脂物的处理，估计患者接受的最初干细胞剂量为约5.5×10⁴个干细胞到约5.5×10⁵个干细胞。最初施用后患者以12小时间隔接受两次补充剂量。将干细胞通过中央静脉导管施用于患者。为了促进靶区域中的细胞植入，通过位于靶标部位下游的气囊和靶标部位上游的气囊控制干细胞流动以产生低血流或最小血流区。

细胞施用程序后约6小时注意到患者的改善。细胞施用程序后数天观察到患者的进一步改善，这可通过增加的血液体积射血分数、心力衰竭的速度下降、梗死大小的减小、改善的锻炼耐受性和其他生命质量量度来证明。

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文中描述的任何特征或者特征的组合都包括在本发明的范围内，条件是任一这类组合中包括的特征不相互矛盾，这将从本说明书的上下文，和本领域中普通技术人员的知识是显而易见的。为了概述本发明，在文中描述本发明的某些方面、优点和新的特征。当然，将理解不必所有这些方面、优点或者特征都在本发明的任意具体实施方案中体现。在下面的详细描述和说明书中本发明的其他优点和方面是显而易见的。

通过实施例提供了上述实施方案，并且本发明不局限于这些实施例。本领域技术人员考虑前面的描述后可以对所公开的实施方案作出多种改变和修改。此外，本领域技术人员考虑文中的公开将发现其他组合、省略、替换和修饰将是显而易见的。因此，本发明不打算受到所公开的实施方案的限制，而是受到所附权利要求书的限定。

上文中已经引用了许多出版物和专利，将每个所引用的出版物和专利完整并入本文作为参考。

等价方案

本领域技术人员将认识到或者仅仅使用常规实验就能够确定文中公开的本发明的特定实施方案的许多等价方案。下面的权利要求书包括这些等价方案。

Claims (82)

1.治疗受试者中特征为心脏功能不全的疾病的方法，该方法包括对受试者施用含有脂肪来源的细胞的组合物，从而该疾病得到治疗。

2.权利要求1的方法，其中受试者是人。

3.权利要求1的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

4.权利要求1的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

5.权利要求1的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的组合。

6.权利要求1的方法，其中疾病为充血性心力衰竭。

7.权利要求1的方法，其中疾病为心肌梗死。

8.权利要求1的方法，其中所述方法包括施用脂肪来源的细胞的快速浓注。

9.权利要求1的方法，其中所述方法包括施用脂肪来源的细胞的多次剂量。

10.权利要求1的方法，其中组合物还包含一种或多种血管生成因子。

11.权利要求1的方法，其中组合物还包含一种或多种动脉生成因子。

12.权利要求1的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

13.权利要求1的方法，其中通过心肌内、心肌外膜、心室内、冠状动脉内、后窦、动脉内、心包内，或者静脉内施用途径施用组合物。

14.权利要求1的方法，其还包括对受试者的脉管系统施用组合物。

15.权利要求1的方法，其中脂肪来源的细胞在施用于患者前生长在细胞培养基中。

16.权利要求1的方法，其中脂肪来源的细胞在促进向肌细胞表型的分化的培养条件下生长。

17.权利要求16的方法，其中肌细胞表型为心肌细胞表型。

18.权利要求16的方法，其中肌细胞表型为骨骼肌细胞表型。

19.权利要求16的方法，其中肌细胞表型为血管平滑肌细胞表型。

20.权利要求15的方法，其中细胞培养条件促进向内皮表型的分化。

21.权利要求15的方法，其中在支架材料上进行细胞培养以产生可以置于心脏上或心脏内的二维或三维构造。

22.权利要求21的方法，其中支架材料是在体内可再吸收的。

23.权利要求1的方法，其中通过基因转移修饰脂肪来源的细胞从而经修饰的脂肪来源的细胞中一种或多种基因的表达被改变。

24.权利要求23的方法，其中修饰导致受试者中血管生成水平的改变。

25.权利要求23的方法，其中修饰导致受试者中动脉生成水平改变。

26.权利要求23的方法，其中修饰导致受试者中凋亡水平改变。

27.权利要求26的方法，其中心肌细胞的凋亡受到改变。

28.权利要求23的方法，其中修饰导致脂肪来源的细胞的归巢性质改变。

30.治疗受试者中特征为心脏功能不全的疾病的方法，该方法包括对受试者施用含有脂肪来源的细胞的组合物，其中该组合物施用于所述脂肪组织最初从中收获的相同受试者。

31.权利要求30的方法，其中受试者是人。

32.权利要求30的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

33.权利要求30的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

34.权利要求30的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

35.权利要求30的方法，其中疾病为充血性心力衰竭。

36.权利要求30的方法，其中疾病为心肌梗死。

37.权利要求30的方法，其中所述方法包括施用脂肪来源的细胞的快速浓注。

38.权利要求30的方法，其中所述方法包括施用脂肪来源的细胞的多次剂量。

39.权利要求30的方法，其中组合物还包含一种或多种血管生成因子。

40.权利要求30的方法，其中通过心肌内、心肌外膜、心室内、冠状动脉内、后窦、动脉内、心包内，或者静脉内施用途径施用组合物。

41.权利要求30的方法，其还包括对受试者的脉管系统施用组合物。

42.权利要求30的方法，其中组合物施用于不同的受试者。

43.权利要求30的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

44.治疗受试者中组织局部缺血的方法，该方法包括对组织部位递送有效量的含有脂肪来源的细胞的组合物以通过形成所递送的组合物不存在后仍保持稳定的血管治疗组织局部缺血。

45.权利要求44的方法，其中组织局部缺血为心肌局部缺血。

46.权利要求44的方法，其中受试者是人。

48.权利要求44的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

49.权利要求44的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

50.权利要求44的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

51.权利要求44的方法，其中组合物还包含一种或多种血管生成因子。

52.权利要求44的方法，其中组合物还包含一种或多种动脉生成因子。

53.权利要求44的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

54.治疗受试者中组织局部缺血的方法，该方法包括对组织部位递送有效量的含有脂肪来源的细胞的组合物以通过扩大现有血管的血液携带能力治疗组织局部缺血，所述血液携带能力在所递送的组合物不存在后仍然保持稳定。

55.权利要求54的方法，其中组织局部缺血是心肌局部缺血。

56.权利要求54的方法，其中受试者是人。

57.权利要求54的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

58.权利要求54的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

59.权利要求54的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

60.权利要求54的方法，其中组合物还包含一种或多种血管生成因子。

61.权利要求54的方法，其中组合物还包含一种或多种动脉生成因子。

62.权利要求54的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

63.促进血管生成的方法，该方法包括将组织的局部部位与含有脂肪来源的细胞的组合物接触从而诱导组织部位内的血管生成。

64.权利要求63的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

65.权利要求63的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

66.权利要求63的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

67.权利要求63的方法，其中组合物还包含一种或多种血管生成因子。

68.权利要求63的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

69.权利要求63的方法，其中血管生成的诱导用于治疗局部缺血。

70.促进动脉生成的方法，该方法包括将组织的局部部位与含有脂肪来源的细胞的组合物接触从而诱导组织部位内的动脉生成。

71.权利要求70的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

72.权利要求70的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

73.权利要求70的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

74.权利要求70的方法，其中组合物还包含一种或多种动脉生成因子。

75.权利要求70的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

76.权利要求70的方法，其中动脉生成的诱导用于治疗局部缺血。

77.促进肌细胞生长的方法，该方法包括将组织的局部部位与含有脂肪来源的细胞的组合物接触从而诱导组织部位内的肌细胞生长。

78.权利要求77的方法，其中肌细胞具有心肌细胞的收缩性质。

79.权利要求77的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞。

80.权利要求77的方法，其中脂肪来源的细胞含有祖细胞。

81.权利要求77的方法，其中脂肪来源的细胞含有干细胞和祖细胞的联合。

82.权利要求77的方法，其中组合物还包含一种或多种生长因子。

83.权利要求77的方法，其中组合物还包含一种或多种免疫抑制药物。

84.权利要求77的方法，其中肌细胞生长的促进用于治疗局部缺血。

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