CN114736862B - 一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法。本申请第一方面提供了一种造血干细胞培养基，包括：骆驼蓬碱、造血干细胞无血清培养基和添加剂。本申请第二方面提供了一种造血干细胞的体外扩增方法，包括：将取出组织或器官分离处理得到的细胞于造血干细胞培养基中进行培养，得到造血干细胞；其中，所述造血干细胞培养基为所述造血干细胞培养基。本申请提供的一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法，填补目前尚未有成熟的造血干细胞扩增体系的空缺。
Description
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。目前造血干细胞已被广泛应用于临床血液病的治疗，并且是基因治疗最有前景的靶细胞。然而，目前尚未有成熟的造血干细胞扩增体系，其原因在于体外扩增的造血干细胞数目有限，同时扩增的造血干细胞的功能下降。这两点是移植造血干细胞后的患者早期感染风险与移植相关死亡率居高不下的主要原因。因此，体外能够扩增足够数量的造血干细胞是治疗临床血液相关疾病的重要手段。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法，填补目前尚未有成熟的造血干细胞扩增体系的空缺。
本申请第一方面提供了一种造血干细胞培养基，包括：
骆驼蓬碱、造血干细胞无血清培养基和添加剂。
另一实施例中，所述添加剂选自肝素钠、双抗、人源造血干细胞生长因子和人源细胞表达的重组人血小板生成素中的一种或多种。
另一实施例中，所述骆驼蓬碱的浓度为0.5～2μmol/L。
另一实施例中，所述骆驼蓬碱的浓度为1μmol/L。
另一实施例中，所述肝素钠的浓度为5～15ug/mL。
另一实施例中，所述人源造血干细胞生长因子的浓度为5～15ng/mL。
另一实施例中，所述人源造血干细胞生长因子的浓度为10ng/mL。
另一实施例中，所述人源细胞表达的重组人血小板生成素的浓度为4～10ng/mL。
另一实施例中，所述人源细胞表达的重组人血小板生成素的浓度为6ng/mL。
本申请第二方面提供了一种造血干细胞的体外扩增方法，包括：
将取出组织或器官分离处理得到的细胞于造血干细胞培养基中进行培养，得到造血干细胞；
其中，所述造血干细胞培养基为所述造血干细胞培养基。
另一实施例中，所述细胞选自全骨髓细胞、脐带血干细胞中的一种。
另一实施例中，所述细胞的培养密度为0.1～10×105个/mL。
另一实施例中，所述培养条件为37℃恒温，5％O2培养，所述培养时间为7～14d。
本申请第三方面提供了所述造血干细胞培养基在扩增造血干细胞和增强造血干细胞克隆形成能力中的应用。
本申请发现，骆驼蓬碱在造血干细胞体外扩增中也发挥了重要的作用，骆驼蓬碱显著促进造血干细胞在体外有效地扩增，使造血干细胞数量增加、细胞周期更为静息，以及造血干细胞的克隆形成能力。本申请试验可知，骆驼蓬碱能在体外培养中诱导小鼠造血干细胞和人脐带血干细胞数目的增加，以及诱导体外培养中小鼠造血干细胞克隆和人脐带血干细胞形成能力增强。
可见，本申请发现骆驼蓬碱与造血干细胞无血清培养基和添加剂混合的造血干细胞培养基，可使HSC的数目显著增加，体外克隆形成能力更强，能有效地克服体外培养扩增造血干细胞所面临的困难，为临床解决造血干细胞短缺这一难题提供了新的解决方案。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请提供的骆驼蓬碱的化学结构式；
图2为本申请实施例1中小鼠造血干细胞流式计数结果；
图3为本申请实施例1中小鼠造血干细胞体外克隆形成实验结果；
图4为本申请实施例2中人脐带血干细胞流式计数结果；
图5为本申请实施例2中人脐带血干细胞体外克隆形成实验结果。
具体实施方式
本申请提供了一种造血干细胞培养基和造血干细胞的体外扩增方法，用于填补目前尚未有成熟的造血干细胞扩增体系的空缺。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
以下实施例的骆驼蓬碱(Harmine)，分离自骆驼蓬种子，是β-咔啉类家族的一种生物碱，目前采用提取方式为：将骆驼蓬种子压榨后的油饼，用体积分数为95％的乙醇提取获得含生物碱的浸膏，该浸膏先后用体积分数为10％的硫酸和25％的氨水处理得到骆驼蓬种子总生物碱，再用氧化铝柱层析和溶剂重结晶等方法进一步纯化，得到骆驼蓬碱单体。骆驼蓬碱化学式为C13H12N2O，Harmine的化学结构式如图1，其熔点为：262-264℃，在760mmHg下沸点为421.4℃，闪点139.7℃。
以下实施例的SFEM为造血干细胞无血清培养基(9650，Stem CellTechnologies)。
以下实施例的人源SCF为人源造血干细胞生长因子。
以下实施例的人源TPO为人源细胞表达的重组人血小板生成素。
以下实施例的HSC抗体为造血干细胞抗体。
实施例1
本申请实施例提供了采用不同培养基体外培养小鼠造血干细胞试验，各步骤试验方法具体如下：
1、小鼠造血干细胞体外培养试验，包括：
本实施例的体外培养的原代全骨髓细胞是由C57小鼠股骨分离获得的C57小鼠骨髓的原代全骨髓细胞，按照2×104/孔的细胞量接种于96孔板中，本实施例分别设计了四个组(分别为A组、B组、C组和D组)，A组为SFEM、B组为SFEM、6ng/mL TPO和10ng/mL SCF、C组为SFEM、20ng/mL TPO和10ng/ml SCF、D组为SFEM、6ng/ml TPO、10ng/ml SCF和1μmol/Lharmine。小鼠全骨髓细胞体外培养14d后，进行流式检测造血干细胞的数目，小鼠全骨髓细胞体外培养14d，计算造血干细胞各系克隆形成数目，本实施例分别对比试验了在不同培养基下小鼠全骨髓细胞体外培养的效果。
具体的，上述SFEM培养基均还添加了10μg/ml肝素钠(MCE，HY-17567A)以及1％双抗(hyclone，SV30010)，人源SCF(PEPROTECH，300-18-10)，人源TPO(PEPROTECH，300-07-10)，上述小鼠全骨髓细胞的培养条件为37℃恒温，低氧5％O2培养箱培养。
1.1、小鼠造血干细胞流式检测术试验，包括：
收集体外的培养的原代小鼠全骨髓细胞，600g离心5分钟，弃上清并用300μl的PBS重悬，每个样品各加入1μl的HSC抗体(Lin,其中包括CD3单抗(145-2C11)、CD4单抗(RM4-5)、CD8单抗(53-6.7)、Mac-1单抗(M1/70)、Gr1单抗(RB6-8C5)、B220单抗(RA3-6B2)、IgM单抗(II/41)和TER119单抗(TER-119)。SCA1单抗(D7)，c-KIT单抗(2B8)，FLK2单抗(A2F10)，CD34单抗(RAM34))4℃孵育1h后流式细胞计数，测得四组体外扩增后造血干细胞的数目，结果如图2所示。各图由左至右的四个柱依序表示SFEM条件下的空白组(A组)、SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组(B组)、SFEM+20ng/ml TPO+10ng/ml SCF处理组(C组)与SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1μmol/L harmine处理组(D组)。图2结果显示，SFEM+20ng/ml TPO+10ng/ml SCF处理组，SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1μmol/Lharmine处理组可以显著地诱导体外培养中HSC数目的增加，而SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组的诱导效果较弱，说明Harmine可替代TPO功能，诱导体外培养HSC数目的增加。
1.2、小鼠造血干细胞体外克隆形成试验，包括：
将体外扩增的原代小鼠全骨髓细胞，按照5×103/孔的细胞量接种于6孔板中，培养14d后，在高倍镜下每孔随机挑选30个视野，计算造血干细胞各系克隆形成数目(BFU-E、CFU-GEMM和CFU-GM)。
其中，本实施例体外克隆形成实验采用的培养基为(Stem cell technologym3434)，培养条件为37℃恒温，低氧5％O2培养箱培养。本实施例采用了SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF(B组为对照组)、SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1μmol/Lharmine(D组为实验组)小鼠全骨髓细胞体外培养24小时，通过克隆形成实验，试验结果如图3所示。各图由左至右的二柱依序表示SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组与SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1μmol/Lharmine处理组。图3的结果显示，Harmine处理后，三系集落数目显著升高。Harmine能诱导体外培养中小鼠造血干细胞克隆形成能力增强。
实施例2
本申请实施例提供了采用不同培养基体外培养脐带血干细胞试验，各步骤试验方法具体如下：
1、人脐带血干细胞体外培养试验，包括：
本实施例获得原代的人脐带血干细胞，按照2×104/孔的细胞量接种于96孔板中，本实施例分别设计了四个组(分别为A组、B组、C组和D组)，A组为SFEM、B组为SFEM、6ng/mlTPO和10ng/ml SCF、C组为SFEM、20ng/ml TPO和10ng/ml SCF、D组为SFEM、6ng/ml TPO、10ng/ml SCF和1μmol/L harmine。脐带血干细胞体外培养14d后进行流式检测脐带血干细胞的数目；脐带血干细胞体外培养14d，计算脐带血干细胞各系克隆形成数目，本例分别对比试验了在不同培养基下脐带血干细胞体外培养的效果。
其中，上述SFEM培养基均还添加了10μg/ml肝素钠(MCE，HY-17567A)以及1％双抗(hyclone，SV30010)，人源SCF(PEPROTECH，300-18-10)，人源TPO(PEPROTECH，300-07-10)，上述脐带血干细胞的培养条件为37℃恒温，低氧5％O2培养箱培养。
1.1、人脐带血干细胞流式计数试验，包括：
收集体外的培养14d后的人脐带血干细胞，600g离心5分钟，弃上清并用300μl的PBS重悬，每个样品各加入1μl的HSC抗体(Lin，其中包括CD3单抗(145-2C11)、CD4单抗(RM4-5)、CD8单抗(53-6.7)、Mac-1单抗(M1/70)、Gr1单抗(RB6-8C5)、B220单抗(RA3-6B2)、IgM单抗(II/41)和TER119单抗(TER-119)。SCA1单抗(D7)，c-KIT单抗(2B8)，FLK2单抗(A2F10)，CD34单抗(RAM34))，4℃孵育1h后上流式细胞计数，测得四组体外培养后造血干细胞的数目。试验结果如图4。各图由左至右的四个柱依序表示SFEM条件下的空白组(A组)、SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组(B组)、SFEM+20ng/ml TPO+10ng/ml SCF处理组(C组)与SFEM+6ug/ml TPO+10ug/ml SCF+1umol/L harmine处理组(D组)。图4结果显示，SFEM+20ng/ml TPO+10ng/ml SCF处理组，SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1umol/Lharmine处理组可以显著地诱导体外培养中HSC数目的增加，而SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组的诱导效果较弱，说明Harmine可替代TPO功能，诱导体外培养HSC数目的增加。
1.2、脐带血干细胞克隆形成试验，包括：
将体外扩增的人脐带血干细胞，按照5×103/孔的细胞量接种于6孔板中，培养14d后，在高倍镜下每孔随机挑选30个视野，计算造血干细胞各系克隆形成数目(BFU-E、CFU-GEMM和CFU-GM)。
其中，本实施例体外克隆形成实验采用的培养基为Stem cell technologyh3434，培养条件为37℃恒温，低氧5％O2培养箱培养。本实施例分别采用了SFEM+6ng/mlTPO+10ng/ml SCF(B组为对照组)、SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF+1umol/Lharmine(D组为实验组)，人脐带血干细胞体外培养14d，通过克隆形成实验，试验结果如图5。各图由左至右的二柱依序表示SFEM+6ng/ml TPO+10ng/ml SCF对照试验组与SFEM+6ug/ml TPO+10ug/mlSCF+10ug/ml harmine处理组。图5的结果显示，Harmine处理后，三系集落数目显著升高。Harmine能诱导体外培养中人脐带血干细胞克隆形成能力增强。
通过所述试验可知，本申请实施例采用Harmine体外培养造血干细胞，通过检测体外培养后造血干细胞的数目，体外培养后造血干细胞克隆形成能力数据可知，Harmine能促进小鼠造血干细胞以及人脐带血干细胞体外扩增、增强造血干细胞功能，提高造血干细胞的重建能力。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (2)
1.一种造血干细胞的体外扩增方法，其特征在于，
包括：
将取出组织或器官分离处理得到的细胞于造血干细胞培养基中进行培养，得到造血干细胞；
其中，所述造血干细胞培养基包括：
骆驼蓬碱、造血干细胞无血清培养基和添加剂；
所述细胞选自全骨髓细胞或脐带血干细胞中的一种；
所述添加剂为自肝素钠、青霉素-链霉素溶液、人源造血干细胞生长因子和人源细胞表达的重组人血小板生成素；
所述骆驼蓬碱的浓度为0.5~2μmol/L；
所述肝素钠的浓度为5~15ug/ml；
所述人源造血干细胞生长因子的浓度为5~15ng/mL；
所述人源细胞表达的重组人血小板生成素的浓度为4~10 ng/mL。
2.根据权利要求1所述的体外扩增方法，其特征在于，所述培养条件为37℃恒温，5% O2培养，所述培养时间为7~14d。
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