CN105324136B - 用于组织工程的基质和植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于组织工程的多孔基质，其包含形成具有一级孔的三维一级结构的第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的选自由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组的第二生物降解性和生物相容性聚合物组分，其中所述第二聚合物组分形成具有二级孔的三维二级结构，所述二级结构包含在一级孔的至少一部分的内部空间内。

Description

用于组织工程的基质和植入物
本发明涉及如权利要求1所述的用于组织工程的基质、如权利要求9所述的该基质的制备方法以及如权利要求14所述的包含所述基质和至少一种胰岛(Islets ofLangerhans)细胞的植入物。
组织工程是将工程和材料科学与医学结合的交叉学科领域，其提供了治疗功能障碍或丧失的器官的替代性方法。在这种方法中，临时支架(也称基质)充当植入细胞的附着基底和引导新器官形成的物理支持体。因此，这种基质用来通过将细胞递送至体内所需位点、限定工程化组织的潜在空间和促进细胞生长来引导组织发育过程。为了使这些过程能够进行，组织工程用基质应该满足以下标准：
表面应允许细胞粘附、促进细胞生长并允许保留分化的细胞功能。此外，基质应具有生物相容性和生物降解性，从而使该基质能最终在体内被清除而不会导致炎症或毒性降解副产物。就其结构而言，基质的孔隙度应该足够高以便提供足够的细胞粘附用的空间、胞外基质再生和培养期间最小的扩散限制。其孔结构应允许在整个基质中产生均匀的空间细胞分布以有助于均一的组织形成，且所述材料应该能被可再现地加工为三维结构并且具有机械强度。
已经开发出许多由各种生物降解性材料制造的三维多孔基质。例如，EP-A-2256155公开了基于生物相容性聚合物或聚合物混合物的多孔基质。根据该文献，多孔基质通过所谓的浸出过程来制备，在该浸出过程中，将由具有限定粒径的聚合物颗粒和盐颗粒组成的混合物紧密化并随后使所述盐颗粒浸出。
现今通常使用合成的生物降解性聚合物，因其易于成形为所需形状并且比天然来源的聚合物具有更好的机械强度。合成的生物降解性聚合物具有额外优点：其降解周期还能通过控制结晶度、分子量和共聚比来操控。
虽然有这些优点，源自合成聚合物的基质也受到一些限制，例如，缺乏细胞识别信号、生物接受性和功能容量有限。另外的限制在于，如与水的较高接触角所示，合成聚合物通常是疏水性的，据发现这在基质上的细胞附着和细胞接种活性方面具有极负面的影响。
因此，本发明的目的在于提供一种生物相容性和生物降解性聚合物基质，其允许高效的细胞保留和增殖，同时维持已知基质、特别是合成基质的理想机械性质。根据更具体的方面，本发明旨在提供允许在植入物、特别是肝植入物的制备中使用的聚合物基质。
该目的通过如权利要求1所述的多孔基质、如权利要求9所述的制备基质的方法和如权利要求13所述的植入物来实现。进一步优选的实施方式是从属权利要求的主题。本发明的用于组织工程的多孔基质包含形成具有一级孔(primary pore)的三维一级结构的第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的第二生物降解性和生物相容性聚合物组分，所述第二生物降解性和生物相容性聚合物组分选自由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组。
本申请通篇所用术语“基质”是指三维支持体，即支架或海绵样结构，其适于被细胞拓殖。就此意义而言，基质充当能被细胞或组织拓殖的三维模板。这种拓殖可以在体外或体内发生。此外，在移植方面，基质起到使移植物定位的作用并且充当在体内逐渐形成的组织的占位物。
术语“生物相容性聚合物”是指在生物学上耐受且在被引入活的生物体时不会导致排斥的聚合物。对于本发明，生物相容性聚合物还涵盖：被宿主识别为外来物的聚合物，但可通过适当的免疫抑制来抑制对该聚合物的排斥。
“生物降解性”的表述是指在活的生物体内(或源自活生物体的体液或细胞培养物)能被转化为可代谢产物的材料。生物学降解性聚合物包括例如具有生物吸收性和/或生物侵蚀性的聚合物。“生物侵蚀性”是指在生物液体中可溶或可悬浮的能力。生物吸收性是指能够被活的生物体的细胞、组织或流体所摄取的能力。
因此，第一聚合物组分原则上可以是能够用在医学领域、特别是移植医学领域的任何生物降解性和生物相容性聚合物。如下文将更详细描述的，第一聚合物化合物通常是合成的聚合物化合物。与天然聚合物相比，合成聚合物通常提供更高的机械强度，并因此使得可以制备适于充当细胞附着和拓殖的物理支持体的基质。
现已出人意料地发现，如果存在形成具有二级孔的三维二级结构的第二聚合物组分，其中所述二级结构包含在一级结构的至少部分一级孔的内部空间内，则基质的亲水性得到显著增强，同时能够保持有益性质，即第一生物降解性和生物相容性聚合物组分的机械强度。由于亲水性的增强，基质上的细胞附着和细胞拓殖得到极大地促进。这进而增加了植入程序的成功机会，即植入的基质被接受者所接受而不发生排斥。
因此，本发明提供了允许将合成聚合物和天然聚合物两者的有益性质结合起来的方案。
具体而言，本发明允许使用合成聚合物作为为基质提供必要的机械强度的第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，而第二生物降解性和生物相容性聚合物组分是选自胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白的组的天然聚合物，其为基质提供极为有益的亲水性。用在组织工程中的聚合物基质的亲水性被认为对于在三维空间中均匀且充分的细胞接种而言极为重要。
此外，如下文将更详细说明的，就本发明基质的孔结构而言，第二聚合物组分的存在极大地增加了可能的设计选择方案的数目。根据第二聚合物组分在一级聚合物组分的孔内的特定排布，一级孔的尺寸和形式能够自由地相适应。这使得能够例如通过同时提供容纳细胞尺寸较大的细胞的较大孔和保留细胞尺寸较小的细胞的较小孔而在基质的孔内包埋和接种多于一种细胞类型。
词语“孔”用于指代存在于本发明的基质中的空腔或空隙区域。其可以在二维截面上具有圆形和/或有角形状、特别是八角形，和/或在以三维观察时具有倾斜形状。此外，所述形状优选地具有延伸部分特征，从而使空腔的形状能与神经细胞的形状相类比。由此，术语“孔”也指由包围空隙区域的纤丝形成的空腔。这些孔或空腔可以相互连通，意味着两个相邻孔之间的孔壁可以包含洞，从而在所述相邻孔之间形成连接。虽然“一级孔”和“二级孔”均被称作“孔”，但其在结构上可能彼此明显不同，例如在其形状、尺寸和/或互通性方面。
孔的尺寸可以借助其平均孔径来指定，即在二维截面所能分辨的孔的最长和最短尺寸的平均值。孔径和孔分布可以借助扫描电子显微镜(SEM)来确定，例如以本领域技术人员公知的方式确定。
本发明的基质具有另外的优点：其不仅允许适配其中的孔的尺寸，而且还可以通过适配具有给定尺寸和/或形状的孔的密度梯度来制备具有各种渗透性和/或孔隙度的基质。
例如，孔可以高度互通或高度不相交。高度互通的孔通常产生具有提高的渗透性(例如，水渗透性或对于给定类型的材料的渗透性)的组合物，而高度不相交的孔通常产生具有对于相同的孔隙度而言降低的渗透性的组合物，所述孔隙度通过将基质的代表性样品的空隙体积除以其总体积来计算。
因此，如果基质应当发挥具有提高的渗透性的渗透性或半渗透性基质的功能，则将该基质设计为具有更高的互通孔数目。另一方面，具有更高的不相交孔数目的结构对于需要具有特别高的机械稳定性的基质而言有利。
根据本发明，基质的一级结构允许液体和(大)分子扩散进入基质，或甚至穿过基质。对于在组织工程中的应用，这种遵守Fick方程的渗透性是本发明基质的一大优点，因为对于允许和促进这类基质中或其附近的细胞增殖而言，气体(例如氧气)、液体和化合物(例如，细胞养料和废物)的交换至关重要。
另外，据发现，基质的一级结构的表面能够通过在植入位点处与接受者的组织相互作用而活化例如血管生长因子(VGF)等生长因子。活化的生长因子对于刺激和吸引导致进入基质的小血管(毛细血管)形成和向内生长的细胞而言很重要。活化的生长因子可能已存在于植入位点处的周围组织中，或者也可与基质一同提供至植入位点，例如，作为一级和/或二级聚合物材料中的组分、处在一级和/或二级结构的孔内或者通过包覆有包含所述生长因子的材料的基质来提供。
因此，本发明的基质能被完美地调节至即将被基质修复或代替的器官的特定功能。另外，由于其亲水性增强，本发明的基质满足了高度改善的接受者的接受度，且因而非常适用于组织工程。
就基质的材料而言，进一步优选的是第一聚合物组分选自由聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸-乳酸)(PGLA)及其混合物组成的组。对于制造生物降解性基质而言，乳酸(PLA)聚合物组分(例如聚-L-乳酸(PLLA)、聚-D,L-乳酸(L-丙交酯和D-丙交酯的外消旋混合物；PDLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)或其混合物(PLGA；现也称作聚(丙交酯-co-乙交酯)或PLG))由于其柔性和明确定义的物理性质和相对的生物相容性而是具吸引力的候选物。另外，其降解产物是进入一般代谢途径的低分子量化合物(例如乳酸和乙醇酸)。此外，通过简单地改变乳酸与乙醇酸的共聚比，聚(乳酸-co-乙醇酸)提供了从数日至数年的广谱降解速率的优点。
在特别优选的实施方式中，第一聚合物是PGA和PLA的共聚物。通过在基本的PLA/PGA主题下改变聚合物组成，可以对这些聚合物的性质进行谐调。
更具体地，第一聚合物组分优选为乳酸含量为约85mol％且乙醇酸含量为约15mol％的聚(乙醇酸-乳酸)。聚乳酸(PLLA)和聚(丙交酯-co-乙交酯)(85/15)(PLGA 85/15)的这种混合物可以购自例如Evonik Industries AG(Essen，德国)。进一步优选的PGA/PLA混合物是：聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)50:50，例如RG 502；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)65:35，例如RG 653；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)75:25，例如RG 752；聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)85:15，例如RG 858。
如上所述，第二聚合物组分选自由作为胞外基质蛋白的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组，它们可以以本身已知的方式以纯化形式制备或者商购获得。
在这些胞外基质蛋白中，最优选的是胶原蛋白。由于其纳米纤维构造，胶原蛋白在促进组织培养物中的细胞附着、生长和分化功能方面特别有效。然而，还发现如果第二聚合物组分包含胶原蛋白，则本发明的基质的亲水性得到特别增强。就此而言，用在本发明的上下文中的术语“胶原蛋白”涵盖天然来源的胶原蛋白和合成方式制造的胶原蛋白以及胶原蛋白衍生的物质，例如作为胶原蛋白水解形式的明胶。
因此，本发明的基质提供了两种生物降解性聚合物组分的混合结构，该结构稳定，能以不同形状制备，并且还允许良好的细胞相互作用和亲水性。
基于基质的总重，一级结构与二级结构的重量比优选为约1％至100％。
此外特别优选的是，第二聚合物组分基本由胶原蛋白组成。就此而言，第二聚合物组分可以仅由一种类型的胶原蛋白(即，I型)组成，或者可以由多种胶原蛋白类型的混合物(即，I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白)组成。在后一种情形中，优选的是含有重量百分比大致相等的蛋白的混合物。I型胶原蛋白是天然血管的主要成分之一，并且为二级结构提供细胞附着位点以及拉伸强度。如上所述，第二聚合物组分包含在提供物理表面的一级孔结构的一级孔内，在所述第二聚合物组分上细胞可以以三维方式铺展其自身的胞外基质。优选地，一级孔形成包括通道网络的互通孔结构。
特别优选的是，第二聚合物组分是明胶。明胶是胶原蛋白的水解形式，也称水解胶原蛋白。水解胶原蛋白与胶原蛋白的氨基酸成分相同。其通常用作食品、药品和化妆品制造中的胶凝剂。
在一级结构中，一级孔的平均孔径优选为150μm至300μm，优选200μm至300μm。具有这种孔径的孔(优选相互连通)的多孔结构能够改善养料通过所述一级结构向基质中心的运送，并且还避免形成大细胞簇，该大细胞簇可能因缺乏养料而潜在地发展为坏死中心。如上所述，孔径和孔分布可以借助扫描电子显微镜(SEM)来确定，SEM是这方面的标准程序且为本领域技术人员所公知。
为了进一步改善本发明基质的生理学功能，第二聚合物组分形成具有二级孔的三维二级结构。由此，在三维多孔一级结构内形成了三维多孔二级结构，从而基本形成所谓的“支架中支架”结构。在这方面应该注意的是，第二聚合物组分可以形成原纤维、纤维或泡沫体作为三维二级结构。然而，第二聚合物组分也可以是涂覆一级孔的至少部分内壁的层形式，由此基于下方的第一聚合物组分三维一级结构而形成三维二级结构。
这两种三维结构能够用于不同的目的。例如，一级结构可以主要为基质提供物理稳定性并提供容纳细胞尺寸较大的细胞的充足空隙空间，而二级结构可以被设计为形成更小的孔以便保留细胞尺寸较小的细胞。因此，该优选实施方式的基质特别适于包埋和接种多于一种细胞类型的细胞。
因此，一级孔和二级孔优选在其平均孔径方面不同。特别是，二级孔的平均孔径优选小于一级孔的平均孔径，并且为50μm至290μm、优选50μm至150μm、更优选50μm至100μm。
具有高孔隙度、特别是具有高表面/体积比的基质由于其允许输送大量细胞并促进维管组织在植入后侵入基质内而极为优选。
此外极为优选的是，本发明的基质设置有不同的亚结构，即部分、区域、层、表面或其组合，其基于各亚结构中的不同平均孔径而具有不同的渗透性。特别地，基质优选包括至少两个层，其中第一层的孔的平均孔径不同于第二层的孔的平均孔径。
具体而言，基质优选包括多孔基层和多孔细胞包埋层，基层中孔的平均孔径小于细胞包埋层中孔的平均孔径。在具体实施方式中，细胞包埋层中孔的平均孔径为300μm至500μm，而基层中孔的平均孔径为10μm至200μm。由于基质的这种特别设计，直径较大的细胞(即，200μm至300μm)可以保留和拓殖在细胞包埋层中，而直径较小的细胞(即，50μm至200μm)可以保留和拓殖在基层中。换言之，基层大致充当保留直径较小细胞的安全网，否则这些直径较小的细胞可能“下落穿过”细胞包埋层中的较大孔。因此，基层提供了针对细胞接种期间的细胞泄露的有效保护。通过将更多细胞保留在多孔基质中，极大促进了高效的组织再生。
进一步优选的是，基层中孔的平均孔径为10μm至100μm。这使得如肝细胞等小细胞也能被有效地保留在本发明的基质中并进行培养。
当使用基质进行细胞培养时，重要的是其提供促进细胞附着、增殖和向基质内的细胞迁移的最佳环境。如上所述，二级结构的存在为基质提供了增强的亲水性，这有助于细胞附着于基质结构。然而，不同细胞类型之间的附着和迁移能力显著不同。
为了进一步促进细胞在基质表面的附着，优选在将细胞加载至基质上之前通过等离子体处理为基质提供亲水性等离子体涂层。最优选的是，通过等离子体沉积聚合的物质来为基质提供薄涂层，所述聚合的物质优选选自(甲基)丙烯酸酯(MA)、(甲基)丙烯酸酐(MAA)和聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(PHEMA)的组。
等离子体处理是本领域技术人员已知的。其涉及使单层或薄聚合物膜附着于表面，并用来在进一步加工之前改善表面的润湿性和粘附性。更具体地，其通常涉及表面清洁、表面活化和后续对表面进行等离子体涂覆的步骤。对于清洁和活化而言，通常用如氩气、氧气、氮气或氟气等非聚合性气体在真空体系中对表面进行处理。为了获得具有任一种上述设计的基质，可以利用3D打印和/或等离子体技术和/或电纺丝来制备所述基质。
特别优选的是使用3D打印来制备本发明的基质，因为这种技术能够以无可挑剔的精确度制备几乎任何形状的三维固体物品。就本发明的基质而言，3D打印不仅允许产生一级结构和/或二级结构，而且还允许制备其中包埋有细胞、特别是两种不同类型细胞(更具体而言，肝细胞和胰岛细胞)的基质。
电纺丝方法特别适合于形成沉积在目标物上从而在其上构成网结构的细纤维。“目标物”是指可具有不同形式(例如，圆盘样形式)的成形体。本发明的基质包括直径约1μm至100μm、优选约10μm至40μm的纤维。
根据另一方面，本发明还提供了一种允许直接和经济地制备上文所述的基质的新制造方法。所述方法具体包括以下步骤：
a)提供混合物(M)，该混合物包含溶解于聚合物溶剂中的第一聚合物组分的聚合物颗粒的聚合物溶液(PS-I)和成孔性可浸出材料的颗粒，所述成孔性颗粒不溶于所述聚合物溶剂且粒径为约100μm至400μm；
b)通过除去所述聚合物溶剂(S-I)使所述混合物紧密化；
c)除去成孔性可浸出材料，由此生成具有一级孔的三维一级结构；
d)将所述一级结构浸入包含溶解在溶剂(S-II)中的第二聚合物组分的溶液(PS-II)中；和
e)除去溶剂(S-II)。
上述方法的第一步a)涉及将一级聚合物组分(例如，PLLA或PLGA)溶解于聚合物溶剂(S-I)(例如，氯仿或二氯甲烷)中。然后将所产生的聚合物溶液(PS-I)与成孔性可浸出材料(例如，水溶性成孔性可浸出材料，例如盐、特别是NaCl)混合以获得混合物(M)。混合也可通过用成孔性可浸出材料填充容器并在其上浇铸聚合物溶液(PS-I)而实现。然后，去除聚合物溶剂(S-I)，例如通过简单蒸发来除去，这导致混合物(M)体积的减少并因此获得紧密的结构；或者通过对混合物(M)施加压力来进行。除去聚合物溶剂(S-I)后，将成孔性可浸出物浸出，例如，如果使用的是水溶性成孔性可浸出材料，则通过在水中浸取紧密的混合物(M)来将成孔性可浸出物浸出。
所得一级结构的孔隙度可以利用所添加的成孔性可浸出材料的量来控制，而一级孔的孔径取决于成孔性可浸出材料晶体的尺寸。用70重量百分比以上的成孔性可浸出材料，获得了具有高互通性的一级孔。
紧密化优选通过压力的作用来实现。为此，可以将聚合物/成孔性可浸出材料在常规液压机中于约780psi至1450psi(有利的是约840psi至1230psi，且特别是约900psi至1100psi)的冲压下进行挤压。已证实有益的是在温度为18℃至25℃时使压力作用约10s至360s，有利的是约40s至180s，且特别是约50s至70s。
通过使用水或水性溶液使成孔性可浸出材料溶出而将其移除。首先，可将紧密的混合物(基质空白)浸泡约1h至80h、有利地约12h至62h且特别是约36h至60h。作为选择，可以用去离子水洗涤紧密的混合物直到干燥的一级结构的重量保持不变。
此外有利的是，在除去成孔性可浸出材料之前，将紧密的混合物先储存在CO2氛围中。因此，例如，可以在约140psi至1650psi、有利的是约360psi至1120psi且特别是约800psi至900psi的CO2压力下对紧密的混合物通气，其时间为约1h至180h、有利的是约3h至60h且特别是约12h至36h，就此而言已据证实是有利的。其后，以对孔的形成产生影响的压力降低速率来减小压力。虽然优选使用CO2，但如空气、氮气、氦气、氖气、氪气、氩气、氙气或氧气等其它气体也可类似地适用。随后，出于干燥目的，以目前已知的方式除去水或水溶液。为将其实现，可以例如将基质铺在吸收性纸上。
优选地，步骤a)中的混合物(M)通过将聚合物溶液(PS-I)添加至颗粒混合物(MP)来提供，所述颗粒混合物(MP)由第一聚合物组分的聚合物颗粒和成孔性可浸出材料的颗粒组成。换言之，本发明方法的步骤a)中提供的混合物(M)优选包含：
i)包含溶解在聚合物溶剂(S-I)中的第一聚合物组分颗粒的聚合物溶液(PS-I)，和
ii)第一聚合物组分的聚合物颗粒(优选具有约100μm至300μm的粒径)和成孔性可浸出材料颗粒的颗粒混合物(MP)。
就此而言，应该注意的是，颗粒混合物(MP)和聚合物溶液(PS-I)中的聚合物颗粒均是/包含第一聚合物组分的聚合物颗粒——一个是处在聚合物溶液中的溶解状态，一个是处于固体形式。聚合物溶液(PS-I)中的聚合物溶剂(S-I)的量优选使得在将聚合物溶液(PS-I)与颗粒混合物(MP)混合以制备混合物(M)时颗粒混合物(MP)中的固体聚合物颗粒不会立即溶解。如此，聚合物溶液(PS-I)与颗粒混合物(MP)的共混起初会产生可搅动的糊体，其后随着溶剂被除去而快速成为固体(→步骤b))。
在优选实施方式中，用于通过将聚合物颗粒溶解在聚合物溶剂(S-I)中来制备聚合物溶液(PS-I)的第一聚合物组分的聚合物颗粒的粒径为约100μm至300μm。该尺寸的颗粒在最小限度的量的聚合物溶剂中快速溶解。
同样，将聚合物溶液(PS-I)中的第一聚合物组分的浓度有利地选择成使得一方面第一聚合物组分得到完全溶解，而另一方面可以在颗粒混合物(MP)中的聚合物颗粒没有开始以任何显著程度溶解的情况下快速去除溶剂。已证实有益的是，聚合物颗粒与溶解的聚合物的重量比为10:1至1:100，有利的是2:1至1:25，且特别是1:1至1:10。就颗粒混合物(MP)中的第一聚合物组分的聚合物颗粒与成孔性颗粒的重量比而言，在本实施方式的背景下，可以选择对于成孔性可浸出材料而言较高的重量比，即，最高1:200、1:500或1:1000，且所有第一聚合物组分与成孔性可浸出材料的重量比仍大于1:100。如此，可以获得大于98％的孔隙度。
上述方法的步骤b)涉及通过除去聚合物溶剂(S-I)来使聚合物(M)紧密化。如上所述，这种紧密化优选通过压力的作用来实现，例如在常规液压机中。通过压力的作用，聚合物溶剂(S-I)的溶剂分子被挤出固体颗粒间的间隙，这与吸附于海绵中的水被拧出类似。然而，聚合物溶剂(S-I)也可以例如在减压下至少部分地除去，这也导致混合物(M)的紧密化，因为溶剂分子从固体颗粒之间的间隙的去除能够使保留在混合物中的分子彼此更为靠近。结果，通过除去聚合物溶剂(S-I)减小了混合物的体积。
用来制备聚合物溶液(PS-)的聚合物溶剂(S-I)应该溶解第一聚合物组分但不会溶解成孔性可浸出材料。这确保可浸出材料的成孔性不受影响或仅受到轻微影响。出于该目的，例如丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、六氟异丙醇、氯化和氟化的脂肪族和芳香族烃、四氢呋喃、甲乙酮、二乙酮及其混合物适合溶解上述聚合物。氯仿特别适合溶解聚(乙醇酸)、聚(乳酸)或聚(乙醇酸-乳酸)，并且其出于医用目的也是合适的。
在上述方法中，成孔性可浸出材料充当根据定义被理解为是固体或至少半固体的材料，该材料起初与基质形成聚合物联合以得到混合物然后被从混合物中除去，导致形成空腔(孔)。
为了将成孔性可浸出材料从混合物中除去，有利的是所述材料可溶于至少一种溶剂中而在至少另外一种溶剂中基本不可溶。特别是当材料在处理条件(即通常在温度为18℃至25℃且在大气压力下)下少于30重量％、优选少于20重量％、特别是少于10重量％(例如少于5重量％、4重量％、3重量％、2重量％和1重量％)可溶时，该材料为基本不可溶。
所得一级结构的结构和性质基本由用来制备该结构的成孔性颗粒的尺寸、形状和重量比来确定。由于成孔性颗粒的尺寸会影响在成孔性可浸出材料浸出后所形成的孔的尺寸，其平均粒径通常为100μm至400μm，优选为300μm至400μm。该尺寸与通过浸出成孔性颗粒而形成的孔的尺寸大致对应。
就此而言，应该注意的是，不仅成孔性可浸出材料的性质重要，而且成孔性颗粒的粒径分布也尤为重要。因此，通常适用的是，不仅孔径而且连通性(即彼此连通的空腔的网络)随着粒径的增加而增加。该网络也称为大结构(macrostructure)或大孔结构，应该将其区别于能通过发泡获得且通常闭合并因此形成被称为微小结构(microstructure)或微孔结构的结构的孔。
在本发明的制备过程中，成孔性可浸出材料优选为盐，更优选地选自由氯化钠、柠檬酸钠、酒石酸钠和氯化钾组成的组，最优选为氯化钠。氯化钠是特别有益的，因为其可以低价广泛地获得，对人体无害且因此易于操作。另外，氯化钠可溶于包括水在内的多种溶剂。
为了制备基质，随后将一级结构浸入包含溶解于溶剂(S-II)的第二聚合物组分的溶液(PS-II)中(步骤d)。
根据本发明，第二聚合物组分选自由胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白及其混合物组成的组。其中，优选胶原蛋白。
因此，可溶解第二聚合物组分的任何类型的溶剂均适用于本发明的方法。已发现酸性水溶液对于该目的特别有利。
在优选的实施方式中，在步骤d)中，优选在减压下，将一级结构浸入包含第二聚合物组分的酸性水溶液中。减压浸渍使得一级结构的一级孔能被包含第二聚合物组分的溶液完全填充。
在特别优选的实施方式中，将一级结构浸入I型胶原蛋白酸性溶液(pH 3.2)，优选在真空下浸入，以使得一级结构的孔被胶原蛋白溶液填充。溶液中胶原蛋白的有效浓度为0.1(w/v)％至1.5(w/v)％。在步骤e)中除去溶剂(S-II)后，获得了本发明的基质。优选在减压下除去有机溶剂。优选地，在减压除去溶剂(S-II)之前执行离心步骤。
水性溶剂优选通过在-80℃冷冻并在真空下冻干来除去。在真空下约3h至60h且特别是约12h至36h的时间被证明为在此方面特别有利。
在特别优选的实施方式中，溶剂(S-II)是水性溶剂，且本发明方法的步骤e)中溶剂(S-II)的去除涉及以下步骤：
e1)离心；和
e2)冷冻-干燥和/或在真空下冻干。
离心步骤起着除去未附着在一级结构表面上的任何过量的含有第二聚合物组分的溶液(PS-II)的作用。通过冷冻-干燥和/或在真空下冻干，溶剂(S-II)基本被完全去除，并且在所得的基质结构中，第二聚合物组分形成包含于至少部分一级孔的内部空间内的三维二级结构。
包含在一级孔内的二级结构的量可以通过调节包含溶解的第二聚合物化合物的溶液(PS-II)的粘度和/或离心速率来调节。例如，溶液(PS-II)的粘度和/或离心速率越高，一级孔内将形成越少的二级结构。通常，为了避免在一级孔内形成过多的二级结构，离心速率(或离心加速度)优选设定为高于500g。更优选地，离心速率设定为600g至10000g。另外，优选的是溶液(PS-II)中所溶解的第二聚合物组分的浓度为0.1(w/v)％至1.5(w/v)％。在该范围内，溶液(PS-II)的粘度使得溶液(PS-II)完全浸润至一级孔内。
为了获得高度交联的三维二级聚合物结构，还可用如戊二醛等交联剂处理基质。
此外优选的是，对基质进行额外的步骤f)，其涉及表面修饰步骤、特别是等离子体处理步骤。
如上所述，本发明涉及用于治疗用途的本发明的基质，具体而言，该基质一般用于组织工程，且更具体而言用于制备植入物、特别是肝植入物。
在组织工程领域中，本发明的基质可以充当支架，细胞可迁移至该支架内和/或细胞可粘附于其上。在组织工程中，基质与粘附至其上的细胞的这种组合通常称作“植入物(implant)”。
本发明的基质已证实在用于组织工程用植入物中时展现出非常重要的优点。例如，内部尺度(意指内部自由空间)使得基质能高效地被细胞拓殖。一方面，基质是可自由成型的，而另一方面，其提供充分的稳定性和刚性以便承受手术植入程序并抵抗作用于植入位点处的机械力。在植入后开始的初始细胞破坏受到了限制，并且在短时间后植入的组织能承担期望的功能。在植入后不久，血管或富血管的肉芽组织以及神经组织开始增生进入植入物内。此外，本发明的基质可以在不必使用生理上有害的溶剂(例如甲醛)的情况下制备，这意味着无需特殊方法来除去该溶剂且这些溶剂存留的残量也无危险。
为此，可以例如在体外用所需细胞对基质进行接种，即，用含细胞溶液处理并温育直到细胞已附着至基质。然后可以对这种基质以及附着至其上的细胞(此处称作植入物)进行额外的操作步骤，例如适当时在活性化合物的影响下进一步培养(例如为了进一步扩增细胞或改变其性质)，和/或以合适的方式在植入前进行储存，例如储存于冰上或在标准条件下储存于生物流反应器中。在这种应用的背景下，有利的是能够在体外初步分离并在适当时扩增意图用于植入的细胞。特别是，这由此使得能够将不同的细胞类型(例如上述肝细胞以及胰岛细胞)应用于基质。
如上文所指出，本发明的基质据显示不仅很适合于一般意义的细胞培育，而且特别适于培养已知极难培养的肝细胞。虽然肝脏具有惊人的体内再生能力，但培养物中的肝细胞却具有有限的增殖能力，并且通常不能在悬浮液中存活超过数小时。问题在于，新鲜分离的肝细胞展现出其体内对应物的典型结构和大部分功能，但其已丧失特化的膜结构域(例如，细胞间连接和胆小管)，因此其在不附着于基底时无法存活。然而，即使在将这些肝细胞在常规培养条件下平板接种以使其可以再集合并重构胆小管样结构，其仍表现出早期表型改变并仅存活数日。
更大的困难在肝细胞被加载至多孔基底时(例如，用作植入物时)出现，由于肝细胞尺寸小(10μm至15μm，与例如约50μm的成纤维细胞相比)，肝细胞的加载具有细胞会落下穿过多孔基底而不是被保留在其中的风险。这一问题因以下事实而更为严重：通常用于制造所述基质的材料(例如PLA、PLG、PLGA等)高度疏水并因而阻碍任何的细胞附着。
现已出人意料地发现，本发明的基质特别适于肝细胞培养。不希望受理论束缚的情况下，认为这至少部分地由于以下事实：即本发明的基质包含被二级多孔结构至少部分地填充的一级孔。由此，所述基质还允许保留小尺寸细胞，例如肝细胞。通过增加或减少第二聚合物组分的含量和/或孔隙度，可以根据细胞增殖的需要来调节一级孔内可利用的空间。就此而言，特别优选的是第二聚合物组分形成孔隙度至少为90％的二级结构。
可以对第二聚合物组分的含量进行调节，例如通过调节在溶液(PS-II)中(在制备如上所述的基质的过程中该溶液浸渍了一级结构)溶解的第二聚合物组分的浓度来进行调节。最优选的是，溶液(PS-II)中的第二聚合物组分的浓度为0.1(w/v)％至1.5(w/v)％。
另外，选自胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物的组的第二聚合物组分为基质提供了优异的亲水性(即，改善的水润湿性)。本发明基质的提高的亲水性极大地促进了多孔基质结构中的细胞接种，因为细胞能更容易地浸润至基质内并粘附于二级结构，由此避免接种的细胞渗漏。
在用作第二聚合物组分的上述材料中，特别最优选的是明胶。由于其纳米纤维构造，明胶在促进在组织培养物中的细胞粘附、生长和分化功能方面特别有效。
除了第一聚合物组分和第二聚合物组分给出的特殊材料组成以外，认为本发明基质的特定三维结构也为基质内的细胞粘附和培养提供了理想的结构环境。例如，孔(特别是一级孔)的尺寸优选使得基质不仅能装载单个细胞，而且能够装载多细胞细胞簇(也称球状体)。
在涉及到肝细胞时，基质装载多细胞细胞簇的可行性是特别的优点，因为已发现如果将肝细胞以预组装状态加载至基底上，会使其死亡率显著降低。
因此，考虑到肝细胞的平均细胞尺寸(10μm至15μm)并鉴于基质在制备肝植入物中的应用，一级孔优选具有150μm至300μm、优选200μm至300μm的平均孔径。
几年前，开发出了一种新型培养技术，其允许提供处于可转移且可保存状态的这种预组装细胞簇。该培养技术已知名为“悬滴(hanging drop)技术”，其涉及在悬挂在表面上的培养基液滴中进行细胞培养。这些培养基液滴接种有活细胞，并且在重力牵引下，培养基小液滴中的细胞下降以组装为微型组织，这产生了在形态和功能上与天然组织非常相似的多细胞微组织球状体。这些预先准备的微组织可以以即用形式购买，或可以例如根据瑞士联邦理工学院(ETH)(苏黎世)和瑞士苏黎世大学的分拆公司InSphero所开发的GravityPLUSTM技术来制备。此处参考关于InSphero的悬滴技术的欧洲专利EP-B1-2342317的公开内容。
特别考虑到使用上述多细胞微组织球状体，本发明的基质极为适合，因为该基质(优选具有平均孔径为150μm至300μm的一级孔)的孔提供了充分的空间，使得预组装的细胞簇易于适配至一级孔内。
虽然通常优选植入已预先加载(体外接种)有活细胞的植入物，但另一种可能是以诱导能够进行组织再生的前体细胞迁移进入损伤组织并在此使已损失的组织再生为目的来植入基质(没有任何在先的细胞附着)。为此，必须将基质配置成使得所需细胞能迁移至基质内，而不希望的细胞则不能。这种应用通常被描述为引导型组织再生(GTR)。
因此，本发明的基质或本发明的植入物能用来治疗人或动物体。为此，通过手术或介入程序将一种以上的基质或一种以上的植入物引入待治疗的体内。如果植入物含有具备器官功能的细胞，或者如果具有器官功能的细胞将迁移至基质内，例如肝细胞或胰岛细胞的情形，则可以将基质或植入物例如植入待治疗个体的肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜前空间或肌内空间。
原则上，需要适当的组织替换的任何个体均可用本发明的基质或植入物来治疗。这些个体通常是罹患其病程涉及到功能性组织丧失的特定障碍症或疾病。这可能潜在地影响整个器官，例如肝脏或胰腺。
因此，本发明的另一个目的在于提供用于组织工程的包含基质和包埋在其中的细胞的植入物。
该目的通过权利要求13所述的主题来实现，其属于包含至少一种本发明的基质和至少一种胰岛细胞的组织工程用植入物。
胰岛细胞是来自胰腺的细胞，其在胰腺中形成细胞集合——所谓的朗格罕氏细胞的“岛”。在健康成年人的整个胰腺中分布着约100万个岛，每一个经测量直径为小于40μm至400μm，并且含有从仅几个细胞/岛到约5000个细胞/岛的多个细胞(Bonner-Weir 1994)。人胰岛中的细胞的65％至80％是胰岛素生成β细胞，其遍布在所述岛上。
所述基质的结构使其成为优异的细胞用基底，并且可以在该基质上培养单一细胞类型或几种不同细胞类型。就此而言，除了胰岛细胞外，植入物可以包含其它细胞，具体而言，肝细胞、胰腺细胞、脂肪细胞、肠细胞、皮肤细胞、血管细胞、神经细胞、肌肉细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、泌尿道上皮细胞、来自输卵管的细胞、泌尿生殖组织、成纤维细胞或纤维细胞以及牙根细胞的细胞。
基质中存在的孔为细胞内向生长和胞外基质的沉积提供了空间。由于基质提供了必要的机械稳定性和弹性，在经过初始的静止期之后，细胞培养可以动态地完成。这意味着细胞在例如细胞培养瓶等静态环境中培养。随后，在支架上生长的细胞被转移至模拟动态环境的灌流室中。这一过程影响进一步的细胞生长。例如，胞外基质的组成取决于细胞所暴露至的机械应力。
特别优选的是，植入物除胰岛细胞外还包含肝细胞。因此，在该实施方式中，植入物包含至少两种细胞类型，其优选为自体同源细胞(来自接受稍后的植入物的个体的细胞)，但作为另一选择也可以是异源细胞。
已出人意料地发现，包含肝细胞和胰岛细胞的本发明植入物提供了肝组织的优异生物替代品，其允许在慢性或急性肝病的情况下恢复、维持并改善肝脏的器官功能。特别是，已发现肝细胞与胰岛细胞的特定比例对于允许植入物实现其特定功能而言特别有利。
在特别优选的实施方式中，植入物已加载有包含预组装的肝细胞细胞簇和至少一种(优选多种)胰岛细胞的多细胞微组织球状体。优选根据例如EP-B1-2342317中所公开的悬滴技术来制备此种预组装的细胞簇，更具体为多细胞微组织球状体形式的预组装细胞簇。作为另一选择，含有预组装细胞簇的制备好的悬滴可以作为保存在冷冻状态(优选在-78℃)的预制球状体而购得。
预组装细胞簇或微组织球状体在宽度和高度上的尺寸优选为100μm至300μm。因此，当用所述细胞加载基质时，预组装细胞簇易于适配至一级孔内。
因此，本发明最优选地还涉及在植入后执行肝脏的代谢功能的植入物。出于该目的，肝细胞与胰岛细胞之比优选为约1×106个肝细胞比20000～500000个胰岛细胞，更优选为约1×106个肝细胞比20000～100000个胰岛细胞。最优选地，植入物包含约1×106个肝细胞与20000～70000个胰岛细胞。
在这方面应该注意的是，上述数字明确地涉及细胞的数目，而不是预组装细胞簇的数目。
另外，本发明优选涉及在植入后表现出等同的胰腺器官的内分泌性质的植入物。为了执行胰腺的功能，植入物优选包含比肝细胞更多的胰岛细胞。就此而言，肝细胞与胰岛细胞的优选比例为1:1至1:200。出于该目的，最优选的是肝细胞与胰岛细胞之比为约1:100。
用于在本发明的基质中拓殖的细胞或细胞混合物可以以目前已知的方式获得。为了制备自体同源植入物，所述细胞优选源自将要插入所述植入物的个体。因此，通常从该个体取出合适的组织，例如一部分肝脏或胰腺，并以合适的方式制备以用于在体外接种和培养所述基质。就此而言，重要的是所述细胞展现出尽可能高的活力率。
如果从肝组织获得肝细胞，则必须要考虑到如下事实：肝细胞被厚厚的结缔组织层所包围，特别是在肝硬化的情形中。根据本发明，使用具有限定组成的溶液以便能将包含尽可能高的活细胞比例的肝细胞分离。
优选地，用含有NaCl、KCl、Na3PO4·12H2O、葡萄糖和乙二醇四乙酸(EGTA)且pH约为7.4的水性组合物A来对一部分肝脏或胰腺进行输注。特别地，1000ml的这种溶液含有约8gNaCl、0.2g KCl、0.27g Na3PO4·12H2O、1.8g葡萄糖和1.9g EGTA。输注优选在约37℃的温度和约15ml/分钟的流速下进行。数分钟、特别是约3分钟～5分钟(例如约4分钟)足够以上述流速对所述组织部分进行输注。
作为另一选择，也可以使用含有EGTA的水性组合物A'对一部分肝脏或胰腺进行输注。
为了对一部分肝脏或胰腺进行输注，优选利用pH为约7.3至7.4、优选为约7.35的水性组合物B。组合物B优选是含有HEPES、CaCl2和50U/ml IV型胶原蛋白酶的低葡萄糖DMEM(Dulbecco氏改良伊戈尔培养基)
在此情形中，同样地，在约37℃和约10ml/分钟的流速下进行输注经证实是有利的。数分钟、特别是约5分钟～10分钟(例如约6分钟～7分钟)足够对所述组织部分进行适当输注。
作为另一选择，也可以使用含有胶原蛋白酶和透明质酸酶的水性组合物B'来对一部分肝脏或胰腺进行输注。1000ml的该溶液优选含有50U透明质酸酶/ml。
如果先用组合物A处理组织部分然后用组合物B处理，则对于所要分离的细胞的活力而言是有利的。作为另一选择，可以先使用组合物A’然后使用组合物B’。
在输注后，可以将组织部分切碎并小心地悬浮于合适的培养基(例如Williams培养基E)中。如果所得细胞悬浮液仍含有相对粗的细胞碎片，则可以以目前已知的方式将后者除去，例如将细胞悬浮液过滤通过尼龙网(100μm)。然后可以小心地将滤液的细胞沉淀，与此结合的是，在60g～130g和4℃～22℃下进行3分钟离心，这经证明是有利的。
以目前已知的方式将已分离的细胞加载至基质上。通常，细胞作为含细胞的溶液被加载至基质上，然后使细胞和基质接种(通常在细胞培养条件下)直到细胞附着于基质。如果胰岛细胞与至少一种其他细胞类型(例如肝细胞)一同提供于基质上，则原则上可以将所述不同细胞类型共同加载或者依次加载至基质上。
因此，本发明还提供了制备植入物的方法，其包括以下步骤：
a.提供本发明的多孔基质，和
b.将肝细胞和至少一种胰岛细胞加载于所述基质的至少一侧上。
更具体地，优选先加载胰岛细胞，然后是肝细胞，每种情况中的温育在加载之后进行，直至至少一部分细胞附着于基质。
最优选地，胰岛细胞和肝细胞以预组装细胞簇共同加载至基质上。这种预组装细胞簇可以购得，或例如通过使用上文所述的悬滴技术来培养。
在特别优选的实施方式中，所提供的预组装细胞簇或微组织在宽度和高度上的尺寸为100μm至300μm，从而当用细胞加载基质时其易于适配至一级孔内。
然而，本发明的基质不仅促进其上的细胞沉积，而且还提供了如下的结构环境，该结构环境不仅允许细胞存活，而且使其在基质内增殖和迁移。更具体地，本发明的基质允许液体和(大)分子运送至基质内，甚至穿过该基质。开始时，养料(例如，氧气)和废物的交换借助于扩散来进行。然而，扩散作为存活过程的被动运送方式仅在短距离内有效。特别是，已发现扩散使得氧气和养料被供给至基质内的细胞，但最大供给距离仅为从表面至基质内部约400μm。这意味着，由于缺乏必需的养料特别是氧气，已沉积在基质上的细胞通常不能迁移至基质内的比该扩散距离更深的地方。考虑到该有限的扩散范围，基质的厚度优选为0.1mm至1.0mm，更优选0.5mm至1.0mm。
另一方面，本发明的植入物(即其上沉积有细胞的基质)不必受基质的尺寸限制。如果需要厚度大于1.0mm的植入物，例如出于稳定性原因或为了为细胞提供更大的附着位点，则可以用彼此上下铺叠且可选地胶接或缝合在一起的至少两个基质来制备该植入物。优选地，这种“双层或多层植入物”由在组装前已加载有细胞的至少两个基质来制备。
根据特别优选的实施方式，将本发明的植入物制备成形成整体稳定主体的双层或多层结构，其制备通过以下程序进行：
a)提供本发明的基质，该基质基本为片形且厚度为约0.1mm至1.0mm；
b)将细胞——特别是肝细胞和至少一种胰岛细胞加载于所述基质的至少一侧上；
c)将其上具有细胞的基质折叠为多层结构。
在步骤c)中折叠基质之前，优选将基质置于提供最佳细胞增殖条件的温育器中。上文限定的基质的优选厚度确保了能通过扩散为细胞提供充分的氧气和养料，从而使其能增殖并形成功能性组织(例如转运通道)，还能够激活整个基质结构体中的物质转运。当随后将基质折叠为多层结构(步骤c)时，物质运送也能通过遍及基质新形成的功能组织而活跃地发生。另外，由于基质优选被折叠而不是由几个个体基质组装，因而所得到的植入物特别稳定，并且允许便利的运送和植入，而没有解体风险。
最优选地，在步骤b)中，细胞被加载于基质的两侧上，即上侧和下侧上。这使得能够从上部和下部迁移至基质内。细胞在基质两侧上的加载可以通过以下方式实现：将细胞加载至基质的第一侧，然后翻转基质以便将细胞加载至基质的另一侧。该程序可以反复数次，期间将基质短时间温育，以使细胞迁移进入基质，而后将更多细胞加载至基质表面上。
特别优选的是提供总厚度为1mm至10mm的多层植入物。例如，优选将厚度为0.6mm的基质折叠两次来得到总厚度(或高度)为1.8mm的三层植入物。
此外还可以用多于一种基质制备多层植入物。例如，可以将较小基质置于第二种更大基质的中心，随后将第二基质的边缘折叠以包围内部的较小基质。换言之，可以用“包裹”第一基质的第二基质来将较小的第一基质包封。如此，可以用第一细胞类型接种第一基质，用第二细胞类型接种第二基质，然后折叠第二基质包围第一基质。
本发明特别涉及治疗会导致慢性肝病或胰腺病和/或慢性肝衰竭和胰腺衰竭的疾病。这些疾病包括例如成年人的慢性肝炎和胆汁性肝硬化以及儿童的胆道闭锁和先天性代谢缺陷。事实上，本发明的基质可以在所有表示需要肝脏移植的情形和所有肝损伤或功能不全的情形中用来缓解疾病。另一方面，特别是在所有形式的糖尿病、特别是I型或II型糖尿病的情形中，需要胰腺移植。对于治疗胰腺疾病或胰腺衰竭，优选对植入物提供肝细胞和胰岛细胞，最优选其比例为约1个肝细胞比约100个胰岛细胞。
因此，本发明还涉及本发明的基质或本发明的植入物在制备用于对个体进行移植的治疗剂中的应用，而且在此方面所述治疗剂特别用于治疗罹患将被移植物所替代的功能性组织的至少部分丧失的个体。
鉴于所述基质在肝移植学领域的优选应用，本发明还提供了用于制备肝植入物的试剂盒。所述试剂盒包含：
i)至少一种本发明的基质，和
ii)多细胞微组织球状体，其包含培养基中的预组装细胞簇。
根据特别优选的实施方式，所述试剂盒包含至少一种本发明的基质和在培养基中的至少一种胰岛细胞和肝细胞的预组装细胞簇。
所述多细胞微组织球状体优选根据上文所述的“悬滴技术”制备，例如根据由InSphero AG Switzerland的专利GravityPLUSTM悬滴技术来制备。
在不以下文的应用限制本发明的条件下，本发明的基质可以用于例如成纤维细胞、肌肉细胞或粘膜细胞的移植。粘膜细胞移植在涉及小肠的手术程序中特别受关注。
将在实施例中更详细地对本发明的基质的制备方法进行描述。以下实施例是说明性的，并不限制本发明的范围。在不脱离本发明的范围的前提下可以进行合理变化，例如本领域技术人员所合理想到的。
材料和方法
基质制备
通过以下程序制备直径20mm且厚2mm的基质：
实施例1
利用过筛的氯化钠微粒通过微粒浸出技术从PGLA制备三维一级结构。
分子量为90kD至126kD的聚(DL-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA 75:25)购自EvonikIndustries AG(Essen,德国)。将PGLA颗粒冷冻在液氮(N2)中并以10000rpm粉碎2分钟(冲击系统)。粉碎过程在球磨机中进行并在研磨后过筛。如此获得的颗粒的平均直径为108μm至250μm。
将2g聚合物团粒于22.5℃在50ml氯仿中溶解80分钟，产生聚合物溶液(A)。
在下一步中，将纯NaCl以10000rpm粉碎2分钟。如此获得的颗粒的平均直径为108μm至390μm。
将0.5g经粉碎的聚合物团粒与48g经粉碎的NaCl颗粒以90rpm混合4分钟，以聚合物溶液(A)填装并安置在圆形陶瓷小盘中。将溶剂在35℃蒸发28小时。在控温烘箱中进行溶剂蒸发，烘箱被安置在通风橱中以抽取氯仿有毒气体。将剩余盐/聚合物复合体在高压成型压缩机中于1000psi加压1分钟，然后通过用去离子水洗涤所述复合体来将NaCl浸出，直到干燥的一级结构的重量保持不变。将如此形成的具有一级孔的三维一级结构产品在40℃干燥12小时。SEM分析表明一级结构具有均匀分布且互通的孔结构。孔径和形态与所用NaCl微粒相同。然后在真空下将一级结构浸入I型胶原蛋白酸性溶液(1.0(w/v)％，pH 3.2，购自ICN Biomedicals,Costa Mesa,California)中，使得一级孔填充有胶原蛋白溶液。随后将含胶原蛋白溶液的一级结构在-80℃冷冻12小时并在0.2托的真空下再冻干24小时，以便在一级孔中形成二级胶原蛋白结构。通过在37℃用以25％戊二醛水溶液饱和的戊二醛蒸气进行4小时的处理来使胶原蛋白结构进一步交联。在交联后，用0.1M甘氨酸水溶液处理基质以封闭未反应的醛基。在用去离子水洗涤并冻干后，获得了包含具有一级孔的一级结构和包含在一级孔内的具有二级孔的三维二级胶原蛋白结构的基质作为最终产物。
实施例2
将直径为355μm至425μm的经筛分的NaCl微粒(36.0g)置于铝盘中并以浓度为27(w/v)％的PLGA的氯仿溶液(17.8ml)填装。因此，PLGA溶解在氯仿中，然后浇铸在盛有作为成孔剂(porogen)的NaCl微粒的铝盘上。
将混合物在空气流中风干48h，然后真空干燥48h。然后将干燥的PLGA/NaCl块体从铝盘取出并浸泡在去离子水中以浸出NaCl微粒。继续进行20次洗涤，每次用500mL去离子水洗涤1h，以将NaCl微粒完全去除。最后，在风干后形成PLGA一级结构。通过汞注入孔率计(AutoPore IV,Shimadzu,Kyoto,日本)来测定PLGA海绵的孔隙度。将PLGA一级结构切割为6.0mm×6.0mm×5.0mm的小块以进行表面处理。
用盐酸水溶液(0.001M)将1.0(w/v)％的胶原蛋白水溶液稀释至胶原蛋白浓度为0.5(w/v)％，由此制备0.5(w/v)％胶原蛋白水溶液(猪I型胶原蛋白，通过酶处理分离)。将该0.5(w/v)％胶原蛋白水溶液的pH设为2.5至3.5。
在减压下将经切割的PLGA一级结构浸入0.5(w/v)％胶原蛋白水溶液，以使一级结构的一级孔填充有胶原蛋白溶液。将含有胶原蛋白溶液的PLGA一级结构置于细胞滤网膜(其安置在50mL离心管中)上，并利用在4℃工作的多用低温型离心机LX-120(Tomy SeikoCo.,Tokyo,日本)或高速低温型离心机(Himac CR 21G,Hitachi,Tokyo,日本)以不同的离心加速度(96g、600g、1200g、2400g、5000g和10,000g)离心10分钟，以便除去任何过量的胶原蛋白溶液。离心后，将经胶原蛋白处理的PLGA结构体在-80℃的冷冻器中冷冻4h。冷冻的多孔支架在低于25Pa的真空下冷冻干燥24h。冷冻干燥后，将涂布有胶原蛋白的PLGA结构体在干燥器中储存待用。
基质性质分析
孔隙度计算
基质的孔隙度由下式确定：
三批生产工艺基质的孔隙度在表1中给出。
表1
胶原蛋白含量分析
使用分析天平(AG 135,Mettler-Toledo,OH)，在将PLGA一级结构浸入胶原蛋白水溶液之前对其称重，并在离心后称量经胶原蛋白处理的PLGA结构体的湿重。两个重量之差指示了在离心分离后保留在PLGA海绵中的胶原蛋白水溶液的量。
亲水性分析
亲水性如下测试：将300μl磷酸盐缓冲盐水(PBS；Sigma)以逐滴方式移取至基质顶部，以便确定该液体是被基质吸收还是排斥。
细胞粘附测试
通过用1型胶原蛋白涂布基质并以逐滴方式将300μl细胞悬浮液移取至基质顶部来测试基质上的细胞粘附性。其后，将加载有细胞悬浮液的基质在37℃、5％CO2和95％的相对湿度下温育。在更换培养基的同时，于1至3天后对保留在悬浮液中且因此未附着至基质的细胞进行计数。
细胞数计算
在用0.2％台盼蓝溶液将细胞悬浮液染色2分钟后，用血细胞计数器(NeubauerImproved Chamber)测定细胞数。
附着的细胞的数目根据下式来确定：
[接种至基质上的细胞数]–[保留在板孔中的细胞数]＝粘附至基质上的细胞数
细胞分离
缩写和物质：
-EGTA:乙二醇四乙酸(Sigma E4378)
-I型胶原蛋白酶:(Worthington 4196；246U/mg)
-FCS:胎牛血清(Sigma F2442)
-HEPES:4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(Sigma)
-Williams培养基E:包含William E培养基(Sigma W4128)和10体积％供体
血清或10体积％FCS的用于培养肝细胞的标准培养基
以目前已知方式从待移植个体取出一部分肝。首先将已取出的肝部分用溶液(8gNaCl；0.2g KCl；0.266g Na3PO4·12H2O；1.8g葡萄糖和0.19g EGTA；用去离子水制成1000ml；pH 7.4)以30ml/分钟的流速在37℃灌注7分钟。然后将所述肝部分用胶原蛋白酶/透明质酸酶溶液(8g NaCl；0.2g KCl；0.266g Na3PO4·12H2O；1.8g葡萄糖；0.735g CaCl2和5ml～10ml HEPES；10U/ml胶原蛋白酶；用去离子水制成1000ml；pH 7.2)以30ml/分钟的流速在37℃下再灌注10分钟。在灌注结束后，将肝部分切碎并小心地悬浮在Williams培养基E中。将细胞悬浮液过滤(尼龙网；100μm)，然后用Williams培养基E洗涤。其后，将细胞在室温下以100g离心5分钟～10分钟。利用台盼蓝(0.2％)测定的细胞活力为70％。
细胞悬浮液的活力利用台盼蓝染料排除测试并使用下式进行确定：
以％计的活力＝(计数的活细胞×100)/总细胞数
以相同方式从一部分胰腺中分离出胰岛细胞。
细胞拓殖
在第一步中，将基质与如上文“细胞分离”中所述分离出的肝细胞以及胰岛细胞一同温育。
为此，通过将肝细胞和胰岛细胞分别悬浮在温热的补充有血清的Williams E培养基中来制备肝细胞溶液和胰岛细胞溶液，且各溶液的细胞浓度被调节至约1×106细胞/ml～3×106细胞/ml。细胞数通过在反转的Olympus显微镜下在0.25mm计数管中进行计数来测定。
将18ml肝细胞溶液和2ml胰腺胰岛细胞溶液合并，并小心地再悬浮以获得20ml自体同源移植用细胞溶液。因此，混合细胞溶液中的肝细胞与胰岛细胞之比为9:1。
在多孔板中制备20个基质，然后用移液枪将1ml的上文制备的混合细胞溶液(包含共1×106细胞～3×106细胞)施加至每个基质。然后将经如此方式处理的基质安置在细胞培养温育器中1小时以使细胞粘附。然后，小心地在多孔板的各孔中以移液枪加入额外1ml温热Williams E培养基(补充有人血清)作为对细胞的额外补给。将基质在37℃以5％CO2和95％相对湿度温育24小时～36小时。
在温育后测定每个基质的细胞数，以确定基质上的植入的细胞的粘附率。粘附率为30％至66％。
在植入前，可以将基质在冰上保持约1.5小时。如果计划在稍晚的时间进行植入，则可将基质在生物流反应器中于标准条件下保存最多5天。
肝细胞的分泌活性和增殖速率
以原位或异位植入程序，将根据实施例3制备的被细胞拓殖的基质移植至Lewis大鼠。在不同的时间将移植物从动物中再次取出并进行形态测定检查。移植后1个月、6个月和12个月时，显示出直径15mm且厚2mm的圆盘形的植入物中的细胞数分别为94×103、140×103和146×103。
组织化学分析证实了来自植入物上的细胞的白蛋白分泌。据发现，分泌在2周后开始。移植一个月后取出的移植物中的肝细胞展示出正常的白蛋白表达。在所有制备物中均发现了增殖中的肝细胞，而增殖速率方面没有任何病理性增加。根据本发明移植的肝细胞展示出BrdU的引入与标准肝制备物相比增加到了3倍。植入后，对肝脏的代谢活性进行了研究。
血管化
对根据实施例3制备的基质的进一步研究显示，这些基质在植入后仅一个月就得到极为良好的血管化。血管肉眼可见地延伸至基质，并且移植的肝细胞和胰岛细胞由于适当的毛细血管化而获得了与移植物接受体的心血管系统的接触。
此外，可以观察到，共同移植的胰岛细胞没有在接受体内造成任何低血糖症。这些细胞以及接受体自身的胰岛细胞的内分泌性能据推测受到反馈机制的调节。
肝功能的接纳
Gunn大鼠被视为人Crigler-Najar综合征的动物模型，原因在于，因特定的先天性代谢酶缺陷，其肝脏无法适当地结合(conjugate)胆红素。因此，未经结合的胆红素的毒性血浆水平由于显著的结果性损害而导致死亡。
用根据实施例3制备的被细胞拓殖的基质来对3只Gunn大鼠进行移植。所述基质的外部面积合计10cm2。
移植后仅4周，实验动物中的胆红素水平就下降了。自此，胆红素得到结合。在所有三个情形中，可以使用胆管探针在仍存在的肝的胆管中检测结合的胆红素。因此，结合在基质中的胆红素以生血方式到达肝脏并且能借助胆管系统从肝脏被清除。

Claims (16)

1.一种用于组织工程的植入物，其包含多孔基质和胰岛细胞和肝细胞，所述基质包含形成具有一级孔的三维一级结构的第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的第二生物降解性和生物相容性聚合物组分，所述第二生物降解性和生物相容性聚合物组分选自由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组，其中，第二聚合物组分形成具有二级孔的三维二级结构，所述二级结构包含在至少一部分所述一级孔的内部空间内，
其中，肝细胞与胰岛细胞之比为1×106个肝细胞比20000～500000个胰岛细胞。
2.如权利要求1所述的植入物，其中，所述第一聚合物组分选自由聚乙醇酸、聚乳酸、聚(乙醇酸-乳酸)及其混合物组成的组。
3.如权利要求1或2所述的植入物，其中，所述第二聚合物组分是胶原蛋白。
4.如权利要求1或2所述的植入物，其中，所述第二聚合物组分是明胶。
5.如权利要求1或2所述的植入物，其中，所述一级孔的平均孔径为150μm至300μm。
6.如权利要求5所述的植入物，其中，所述二级孔的平均孔径小于所述一级孔的平均孔径，并且是50μm至290μm。
7.如权利要求1或2所述的植入物，其包含多孔基层和多孔细胞包埋层，所述基层中的孔的平均孔径小于所述细胞包埋层中的孔的平均孔径。
8.如权利要求7所述的植入物，其中，所述基层中的孔的平均孔径为10μm至50μm。
9.如权利要求1或2所述的植入物，其中，所述基质的孔隙度为至少90％。
10.如权利要求1或2所述的植入物，其中，肝细胞与胰岛细胞之比为1×106个肝细胞比20000～100000个胰岛细胞。
11.如权利要求1或2所述的植入物，其中，肝细胞与胰岛细胞之比为1×106个肝细胞比20000～70000个胰岛细胞。
12.用于治疗慢性肝病或胰腺疾病的权利要求1或2所述的植入物。
13.用于治疗慢性肝衰竭和胰腺衰竭的权利要求1或2所述的植入物。
14.一种制备权利要求1至13中任一项所述的植入物的方法，其包括如下步骤：
a.提供权利要求1至9中任一项中定义的多孔基质，和
b.将肝细胞和胰岛细胞以1×106个肝细胞比20000～500000个胰岛细胞的干细胞与胰岛细胞之比加载于所述基质的至少一侧上。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述基质为0.1mm至1.0mm厚的片形，且所述方法包括如下的另一步：
c.将其上具有细胞的所述基质折叠以获得双层结构或多层结构。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，步骤b涉及将细胞加载于所述基质的两侧上。
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