JP6382962B2 - 組織工学のためのマトリックス及び移植片 - Google Patents

Description

本発明は、請求項１に記載の組織工学のためのマトリックス、請求項９に記載のその準備ための方法、並びに、請求項１４に記載のマトリックス及び少なくとも一つのランゲルハンス島細胞を含む移植片に関する。

組織工学（Tissue engineering）は、工学及び材料科学と医学とを融合する学際的な領域であり、機能不全の、又は、失った臓器の治療における代替アプローチを提供する。このアプローチにおいて、一時的な足場（マトリックスとも呼ばれる）は、移植される細胞のための接着性の基材として、及び、新規臓器の形成を誘導するための物理的な支持体として機能する。このようなマトリックスは、従って、生体における所望の部位へ細胞を送達すること、設計された生体組織のための潜在的な空間を定義すること、及び、細胞の成長を促進することによって、組織成長の過程を誘導するために利用される。このような過程を可能とするために、組織工学のためのマトリックスは、以下の基準を満たすべきである。

表面は、細胞接着を許容し、細胞の成長を促進し、そして、分化した細胞の機能の維持を許容すべきである。さらに、マトリックスは、製品によって炎症又は毒性の分解を引き起こすことなく、in vivoにおいて、マトリックスが徐々に除去されることができるように、生体適合性及び生分解性であるべきである。それらの構造に関して、マトリックスの多孔度は、培養中、細胞接着、細胞外マトリックスの再生、及び、最小の拡散制約のために十分なスペースを提供するために十分に高くなければならない。それらの細孔構造は、均一な組織形成を促進するために、マトリックス全体にも空間的な細胞分布を許容すべきであり、そして、マトリックスは、三次元構造的に再現性よく加工可能であり、機械的に強くなければならない。

様々な種類の生物分解性材料で製造された多数の三次元多孔質材料が開発されている。欧州特許公開第２２５６１５５号公報は、例えば、生物学的に適用可能なポリマー、又はポリマー混合物に基づく多孔質マトリックスを開示する。この文献によれば、多孔質マトリックスは、いわゆる浸出手順により調製される。本手順は、所定の粒径を有するポリマー粒子および塩粒子からなる混合物を圧縮し、続いて塩粒子を浸出させることによる。

今日では、斯かる用途は一般に、合成生分解性ポリマーより得られる。容易に所望の形状に形成可能であり、天然由来のポリマーよりも機械的強度が優れているためである。合成生分解性ポリマーには、結晶化度、分子量及び共重合比を制御することにより、分解時間を操作することができるという、更なる利点もある。

その利点にも関わらず、合成ポリマー由来のマトリックスは、細胞認識シグナルの欠如や生物学的受容性及び機能的能力の制限など、いくつかの制限も有している。さらなる制限として、合成ポリマーは、水との高い接触角で示されるように、一般的には疎水性である。斯かる性質は、細胞の接着性やマトリックスへの播種操作に対して、強い負の影響を有することが見出されている。

従って、本発明の目的の一つは、公知のマトリックス、特に合成マトリックスの所望の機械的特性を維持しつつ、効率的な細胞保持及び増殖を許容する、生体適合性及び生分解性ポリマーマトリックスを提供することである。より具体的な態様によれば、本発明は、移植片の調製において、特に肝臓移植片の調製において使用されることを許容するポリマーマトリックスを提供することを目的とする。

この目的は、請求項１に記載の多孔質マトリックス、請求項９に記載のマトリックスを調製するための工程、及び、請求項１３に記載の移植片によって達成される。さらに好ましい形態は、従属項の対象である。

本発明の組織工学組織工学のための多孔質マトリックスは、一次細孔を有する三次元の一次構造を形成する第一の生分解性及び生体適合性ポリマー成分を含み、並びに、さらに、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びその混合物から成る群から選択される第一のポリマー成分以外の第二の生分解性及び生体適合性ポリマー成分を含む。

本出願を通して使用される用語「マトリックス」は、細胞が定着するのに適した、三次元支持体、つまり、スキャフォールド又はスポンジ様構造を指す。この意味では、マトリックスは、細胞又は組織によって定着されることができる三次元の鋳型として働く。この定着（colonization）は、in vitro又はin vivoで実施できる。さらに、マトリックスは、移植に関連して、移植物の配置のために、及び、in vivoでの段階的に形成される組織のための位置維持体（place holder）としても働く。

用語「生体適合性ポリマー」とは、生存する生物に持ち込まれたとき、生物学的に許容され、拒絶を引き起こさないポリマーを指す。本発明に対して、生体適合性ポリマーもまた、外来として宿主によって認識されるが、その拒絶反応は適切な免疫抑制によって抑制されることができるポリマーも包含する。

「生分解性」という表現は、生存する生物（又は、体液若しくは生存する生物由来の細胞培養物）において、代謝可能な産物へと変換されうる材料を指す。生物学的に分解可能なポリマーは、例えば、生体吸収性（bioresorbable）及び／又は生体侵食性（bioerodable）なポリマーを含む。「生体侵食性」とは、生物学的な液体中に可溶又は懸濁される能力を意味する。生体吸収性とは、生存する生物の細胞、組織又は体液に取り込まれることができる能力を意味する。

第一のポリマー成分は、このように原理的には、医学分野において、特に、移植医学において使用されうる、任意の生分解性及び生体適合性ポリマーでありうる。以下に詳細に説明するように、第一のポリマー化合物は、一般には、合成ポリマー化合物である。天然ポリマーと比較して、合成ポリマーは、一般的に、より高い機械的強度を提供し、従って、細胞接着及び定着のための物理的支持体として働くために適したマトリックスを調製することを許容する。

驚くべき事に、有益な特性、つまり、第一の生分解性及び生体適合性ポリマー成分の機械的強度は維持されうる一方で、第二のポリマー成分が、二次細孔を有した三次元の二次構造を形成し、該二次構造が一次構造の一次細孔の少なくとも一部の内部空間内に含まれている場合、マトリックスの親水性の特性は有意に増強されることが見出された。

増強された親水性特性のおかげで、マトリックス上の細胞の接着性及び細胞の定着が著しく促進される。これは、次々に、成功した移植手順の機会を増加し、つまり、移植されたマトリックスは、レシピエントに受け入れられ、拒絶が起こらない。

本発明は、従って、合成及び天然ポリマーの両方の有益な特性を融合することを許容する解決策を提供する。

特に、本発明は、必要な機械的強度を有するマトリックスを提供する第一の生分解性及び生体適合性ポリマー成分としての合成ポリマーの使用を許容する一方、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンの群から選択される天然ポリマーである第二の生分解性及び生体適合性ポリマー成分が、優れて有益な親水性特性を有するマトリックスを提供する。組織工学組織工学において使用するためのポリマーマトリックスの親水性は、三次元において均一で十分な細胞播種には非常に重要であると考えられている。

さらに、以下でより詳細に説明するように、第二のポリマー成分の存在は、本発明のマトリックスの細孔構造に関して可能な設計オプションの数を非常に増加する。一次ポリマー成分の細孔内の第二のポリマー成分の特異的な配置に依存して、一次細孔のサイズ及び形状は、自由に適合させることができる。これは、例えば、大きな細胞のサイズの細胞を収容するための大きな細孔、及び、より小さい細胞のサイズの細胞を保持するための小さな細孔の両方を提供するマトリックスの細孔内に、１以上の細胞のタイプの包埋、及び、播種を可能にする。

用語「細孔（pores）」は、本発明のマトリックス中に存在する空洞又は空隙領域を指定するために使用される。それらは、２次元的な断面において、丸形状及び／若しくは角形状、特に八角形形状、並びに／又は、三次元的に見たときに、傾いた形状であってもよい。形状は、さらに好ましくは、空洞の形状が神経細胞の形状と比較できるように伸長によって特徴づけられる。このように、用語「細孔」もまた、空隙領域を含むフィラメントによって形成される空洞を指す。これらの細孔又は空洞もまた相互に接続可能であってもよく、２つの隣接した細孔の間の細孔壁は、孔を含みえるものであり、該隣接する細孔の間に接続を形成することを意味している。「一次細孔」及び「二次細孔」の両者は、「細孔」として呼ばれるが、それらは、例えば、形状、サイズ及び／又は相互接続に関して、互いに構造的に異なっても良い。

細孔のサイズは、その平均細孔径−二次元断面で識別可能な細孔の最大及び最小の直径の平均値、によって特定されることができる。細孔の細部及び分布は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の手段によって、例えば、当業者に周知の方法で決定されうる。

本発明のマトリックスは、その細孔のサイズの適応をさせることができるだけでなく、与えられたサイズ及び／又は形状を有する細孔の濃度勾配を適用することによって、可変透過性及び／又は多孔度を有するマトリックスを調製することがさらに可能であるという、さらなる利点を有している。

例えば、細孔は、高度に相互に接続された、又は、高度に非接続されたものであってもよい。高度に相互接続された細孔は、一般的に、増加した透過率（材料の与えられるクラスに対する透水率（hydraulic permeability）又は透過率（permeability）等）を有する組成物が得られ、一方で、高度に非接続の細孔は、一般的に同一の多孔度に対して、減少した透過率を有する組成物が得られ、それは、空隙容量をマトリックスの代表的なサンプルの総容量で除することで計算される。

このように、マトリックスが、増加した透過率を有する透過性又は半透過性マトリックスの機能を実行する必要がある場合、マトリックスは、より高い数の相互接続された細孔をもって設計される。一方で、より高い数の非接続細孔を有する構造は、特に高い機械的安定性を有することが必要であるマトリックスにとって利点を有しうる。

本発明によれば、マトリックスの一次構造は、マトリックスに対し、又は、マトリックスを通過する液体及び（マクロ）分子の拡散又はマトリックスを通過することを可能にする。このようなマトリックスの内部及び近接において細胞の増殖を可能にし、促進するために細胞の栄養及び廃棄物等の気体、例えば酸素、液体及び化合物の交換は不可欠であるので、組織工学組織工学における使用のために、フィックの方程式に従うこの透過率は、本発明のマトリックスの優れた利点である。

加えて、マトリックスの一次構造の表面は、移植部位におけるレシピエントの組織との相互作用によって、例えば血管増殖因子（ＶＧＦ）などの成長因子を活性化することができることが見出された。活性化された成長因子は、マトリックス内へ小血管（毛細血管）の形成及び内部成長へと導く細胞を刺激し、引きつけるために重要である。活性化された成長因子は、移植部位における周囲の組織に既に存在していてもよく、又は、マトリックとともに、例えば、一次及び／又は二次構造の細孔内に、一次及び／又は二次ポリマー材料中の成分として、又は、成長因子を含む材料で被覆されているマトリックスによって、移植部位に提供されてもよい。

本発明のマトリックスは、従って、マトリックスによって修復される、又は、代替されるべき臓器の特定の機能に完全に適合されうる。加えて、その増強された親水性の性質のために、発明のマトリックスはレシピエントによって、非常に改善された受け入れに適合しており、また、そのため、組織工学組織工学における使用に極めて適している。

マトリックスの材料に関して、第一のポリマー成分は、ポリ（ポリグリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸−乳酸）（ＰＧＬＡ）及びその混合物から選択されることがさらに好ましい。乳酸（ＰＬＡ）のポリマー成分、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｌ−及びＤ−乳酸のラセミ混合物；ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）又はその混合物（ＰＬＧＡ；これより、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）又はＰＬＧと呼ばれる）は、それらの柔軟で十分に定義された物理的特性及び相対的生体適合性のために、生分解性マトリックスを構築するために魅力的な候補である。さらに、その分解産物は、乳酸及びグリコール酸などの低分子量化合物であって、それらは、通常の代謝経路へ入る。さらに、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）のコポリマーは、グリコール酸に対する乳酸のコポリマー比率を単に変える事によって、数日から数年まで分解速度の大きな範囲の利点を提供する。

特に好ましい実施形態において、第一のポリマーは、ＰＧＡ及びＰＬＡのコポリマーである。これらのポリマーの特性は、基本的なＰＬＡ／ＰＧＡのテーマ内のポリマーの組成を変えることで調製されうる。

より具体的には、第一のポリマー成分は、好ましくは、約８５モル％の乳酸含有及び約１５モル％のグリコール酸含有を有するポリ（グリコール酸−乳酸）である。このようなポリ（乳酸）（ＰＬＬＡ）及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の混合物（８５／１５）（ＰＬＧＡ ８５／１５）は、例えば、エボニックインダストリー社（エッセン、ドイツ）から購入することができる。さらに好ましいＰＧＡ／ＰＬＡ混合物は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド） ５０：５０、例えばＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ５０２； ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド） ６５：３５、例えば、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ６５３； ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド） ７５：２５、例えば、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ７５２； ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）８５：１５、例えば、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ８５８である。

上述のように、第二のポリマー成分は、それ自体公知の方法で精製された形態にて調製されうる、又は、商業的に入手可能である細胞外マトリックスタンパク質である、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びその混合物から成る群から選択される。

これらの細胞外マトリックスタンパク質からは、コラーゲンが最も好ましい。そのナノ線維構造のおかげで、コラーゲンは、組織培養において細胞接着、増殖及び分化機能を促進するのに特に有効である。しかしながら、第二のポリマー成分がコラーゲンを含む場合、本発明のマトリックスの親水性の特性は特に増強されることも見出された。この点において、本発明の文脈において使用される用語「コラーゲン」は、天然由来のコラーゲン及び合成的に製造されるコラーゲン、及び、コラーゲンの加水分解された形態であるゼラチン等のコラーゲン由来物質をも包含する。

本発明のマトリックスは、安定な２つの生分解性ポリマー成分のハイブリッドの構造を提供し、異なる形状にて調製可能であり、そして、良好な細胞の相互作用及び親水性を許容する。

マトリックス総重量に基づき、二次構造に対する一次構造の重量比は、好ましくは、約１〜１００％の範囲である。

さらに、第二ポリマー成分は本質的にはコラーゲンからなることが特に好ましい。この点において、第二ポリマー成分は、一つのタイプのコラーゲン、すなわち、タイプＩから構成されてもよく、又は、コラーゲンタイプの混合物、すなわち、タイプＩコラーゲン及びタイプＩＶコラーゲンの混合物から構成されてもよい。後者の場合、重量でほぼ等しい割合でタンパク質を含む混合物が好ましい。コラーゲンタイプＩは、天然の血管の主要成分の一つであり、細胞付着部位を有する二次構造、及び、抗張力を提供する。上述のように、第二ポリマー成分は、細胞が三次元的に自分自身の細胞外マトリックスをその上に置くことが可能な物理的な表面を提供する一次細孔構造の一次細孔内に含まれる。好ましくは、一次細孔は、水路網（ｃｈａｎｎｅｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を含む相互接続された細孔構造を形成する。

第二ポリマー成分がゼラチンであることが特に好ましい。ゼラチンは、コラーゲンの加水分された形態であり、コラーゲン加水分解物とも呼ばれる。加水分解されたコラーゲンアミノ酸含有量は、コラーゲンと同じである。一般的に、食品、医薬品、及び化粧品の製造において、ゲル化剤として使用される。

一次構造において、第一細孔は、好ましくは１５０μｍ〜３００μｍ、好ましくは２００μｍ〜３００μｍの平均細孔サイズを有する。好ましくは相互接続された、この細孔サイズの細孔を有する細孔構造は、第一構造を通してマトリックスの中心へ改善された栄養の輸送を可能にし、栄養の欠乏のために壊死中心へと潜在的に発展することができる巨大な細胞クラスターの形成も防止する。述べたように、細孔サイズと細孔分布は、この点において標準的な手順であり、当業者によく知られている、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて決定されうる。

本発明のマトリックスの生理学的な機能をさらに向上させるために、第二ポリマー成分は、二次細孔を有する三次元的な二次構造を形成する。これにより、三次元の多孔質二次構造は、三次元の多孔質一次構造内に形成され、基本的には、いわゆる「スキャフォールド内スキャフォールド」構造を形成している。これに関して、第二ポリマー成分は、三次元の二次構造としての小線維、繊維又は発泡体を形成してもよい。しかしながら、第二ポリマー成分もまた、少なくとも一次細孔の内壁の少なくとも一部を被う層の形状であってもよく、このように、第一ポリマー成分の基礎となる三次元の一次構造に基づいて、三次元の二次構造を形成する。

二つの三次元構造は、異なる目的を果たすことができる。例えば、一次構造は、主にマトリックスに対して物理的な安定性を提供しうるものであり、大きな細胞のサイズの細胞を収容するために十分な空所を与え、一方で、二次構造は、より小さい細胞のサイズの細胞を保持するためのより小さな細孔を形成するために設計されてもよい。この好ましい実施形態のマトリックスは、それゆえ、一つの細胞タイプよりも多くの細胞を包埋、播種するのに、特によく適している。

このように、一次及び二次細孔は、それらの平均孔径が、好ましくは異なっている。とりわけ、二次細孔は、好ましくは、一次細孔の平均孔径のよりも小さい平均孔径を有しており、５０μｍ〜２９０μｍ、好ましくは５０μｍ〜１５０μｍ、より好ましくは５０μｍ〜１００μｍの範囲である。

多数の細胞の運搬を可能にし、移植後のマトリックス中に血管結合組織の侵入を促進するため、とりわけ大きい表面／容量比率で、高い多孔度を有するマトリックスは、非常に好ましい。

本発明のマトリックスは、それぞれのサブ構造において異なる平均細孔サイズに基づき異なる透過性を有する異なるサブ構造、すなわち、部分、領域、層、表面又はその組み合わせ、が提供されることがさらに好ましい。特に、マトリックスは、好ましくは、少なくとも２つの層を含み、第一の層の細孔の平均孔径は、第二の層の細孔の平均孔径とは異なる。

特に、マトリックスは、好ましくは、多孔質基層及び多孔質細胞包埋層を含み、該基層中の細孔の平均孔径は、該細胞包埋層における細孔の一つより小さい。具体的な実施形態において、該細胞包埋層における細孔の平均孔径は、３００μｍ〜５００μｍの範囲であり、一方、該基層における細孔の平均孔径は、１０μｍ〜２００μｍの範囲である。マトリックスのこの特別な設計により、より大きな直径、すなわち、２００μｍ〜３００μｍの細胞は、細胞包埋層中に保持及び定着化されることが可能であり、一方、より小さな直径、すなわち、５０μｍ〜２００μｍの細胞は、基層中に保持され、定着化されることが可能である。換言すれば、基層は、より小さい直径の細胞を保持するためのセキュリティーネットの一種として働き、さもなければ、細胞包埋層のより大きな細孔を「通過して落ちる（ｆａｌｌ ｔｈｒｏｕｇｈ）」かもしれない。基層は、このように、細胞播種の間、細胞の漏れに対して効果的な保護を提供する。多孔質マトリックス中のさらなる細胞の保持によって、効果的な組織再生が、大幅に促進される。

基層中の細孔は、１０μｍ〜１００μｍの範囲の平均孔径を有することがさらに好ましい。これは、平均細胞直径が２０〜３０μｍである、例えば肝細胞のような小さい細胞が、効果的に保持可能であり、本発明のマトリックス中で培養可能であることを許容する。

マトリックスが、細胞培養に使用される場合、マトリックスに対して細胞が接着し、増殖し、そして細胞遊走することを促進する最適な環境を提供することが重要である。述べたように、二次構造の存在が、増強した親水性の性質を有するマトリックスを提供し、それがマトリックスル構造に対して細胞の接着を促進する。しかしながら、接着及び遊走する能力は、一つの細胞のタイプから他のタイプで非常に異なる。

細胞のマトリックスの表面への接着のさらなる促進のために、マトリックスは、好ましくは、細胞がマトリックス上に載置される前に、プラズマ処理によって親水性プラズマコーティングが提供される。最も好ましくは、マトリックスは、（メチル）−アクリレート（ＭＡ）、（メチル）−アクリレート無水物（ＭＡＡ）及びポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）からなる群から好ましくは選択される、重合化物質のプラズマ蒸着による薄膜コーティングが提供される。

プラズマ処理は当業者に知られている。それは、表面への単層又は薄いポリマーフィルムの付着を含み、さらに処理する前に表面の濡れ性及び接着性を向上するために使用される。より具体的には、一般的には、表面洗浄、表面活性化、及びそれに続く表面のプラズマコーティングの工程を含む。洗浄及び活性化のために、表面は、通常、真空システムにおいて、アルゴン、酸素、窒素又はフッ素等の非重合性ガスで処理される。上述の設計の任意のマトリックスを得るために、マトリックスは３Ｄ印刷及び／又はプラズマ技術及び／又はエレクトロスピニングを使用することによって調製することが可能である。

この技術は、完璧な精度を有する実質的に任意の形状の三次元固形体を製造することを可能にするので、本発明のマトリックスを調製するための３Ｄ印刷の使用は特に好ましい。本発明のマトリックスに関して、３Ｄ印刷は、一次構造及び／又は二次構造を調製することを可能にするだけでなく、細胞、特に、２つの異なるタイプの細胞、より好ましくは、肝細胞及びランゲルハンス島細胞、が包埋されたマトリックスを調製することをさらに可能する。

エレクトロスピニング法は、メッシュ構造をその上に構成するターゲット上に付着する薄い繊維を形成することに特に適している。「ターゲット」とは、異なる形態を有する事ができる形成体、例えば、円形板状用形態、を意味する。本発明のマトリックスは、約１〜１００μｍ直径、特に約１０〜４０μｍの繊維を含む。

さらなる態様によれば、本発明もまた、上述のマトリックスの直接及び経済的な調製を可能にする新規製造方法を提供する。該方法は、特に、以下の工程を含む：

ａ）ポリマー溶媒中に溶解した第一ポリマー成分のポリマー粒子のポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）
及び
細孔形成（ｐｏｒｏｇｅｎｉｃ）浸出（ｌｅａｃｈａｂｌｅ）材料の粒子であって、該細孔形成粒子は、ポリマー溶媒中で不溶であって、約１００μｍ〜４００μｍの範囲の粒径を有する粒子、
を含む、混合物（Ｍ）を調製すること；

ｂ）ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の除去による混合物（Ｍ）を圧縮すること（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）；

ｃ）細孔形成浸出材料を除去し、これによって、一次細孔を有する三次元の一次構造を得ること；

ｄ）溶媒（Ｓ−ＩＩ）中に溶解した第二のポリマー成分を含む溶液（ＰＳ−ＩＩ）中に、一次構造を浸漬すること、及び

ｅ）該溶媒（Ｓ−ＩＩ）を除去すること。

上記の方法の第一工程ａ）は、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）、例えば、クロロホルム又は塩化メチレンに、一次ポリマー成分、例えばＰＬＬＡ又はＰＬＧＡを溶解することを含む。得られるポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）は、その後、混合物（Ｍ）を得るために、細孔形成浸出材料（ｐｏｒｏｇｅｎｉｃ ｌｅａｃｈａｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）、例えば、塩、特にＮａＣｌなどの、水溶性の細孔形成浸出材料、と混合される。混合はまた、細孔形成浸出材料で容器を充填し、その上にポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）を流し込むこと（ｃａｓｔｉｎｇ）により、実施することができる。その後、例えば、混合物（Ｍ）の容量を減少し、そして、圧縮された構造へと導くように簡単に蒸発することによって、又は、混合物（Ｍ）に圧力を適用することによってポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）は除去される。ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の除去後、水溶性の細孔形成浸出材料が使用されていた場合、例えば、水中の圧縮された混合物（Ｍ）を浸出することによって、細孔形成浸出は浸出される。

一次構造の結果として得られる多孔度は、添加された細孔形成浸出材料の量によって制御可能で、一方で、一次細孔の孔径は、細孔形成浸出材料の結晶のサイズに依存する。７０重量％の細孔形成浸出材料及び上記をもって、高い相互接続性を有する一次細孔が達成された。

圧縮は、好ましくは、圧力の作用によって行われる。このために、ポリマー／細孔形成浸出材料は、約７８０ｐｓｉ〜１４５０ｐｓｉの範囲、有利には、約８４０ｐｓｉ〜１２３０ｐｓｉの範囲、特に、約９００ｐｓｉ〜１１００ｐｓｉの範囲のラム圧力において、従来の水圧プレスにて、圧縮されうる。１８℃〜２５℃の範囲の温度にて、約１０ｓ〜３６０ｓ、有利には約４０ｓ〜１８０ｓ、特に、５０ｓ〜７０ｓの間、作用する圧力を許容することが好都合であることが証明された。

細孔形成浸出材料は、例えば、水又は水溶液を使用して溶解することによって、除去される。第一に、圧縮された混合物（マトリックスブランク）は、約１時間〜８０時間、有利には、約１２時間〜６２時間、特に、約３６時間〜６０時間、浸漬されることができる。あるいは、圧縮された混合物は、乾燥した一次構造の重量が変化しなくなるまで、脱イオン水で洗浄されうる。

細孔形成浸出材料が除去される前に、圧縮された混合物が、最初にＣＯ₂雰囲気中に保存されることがさらに有利である。このように、例えば、圧縮された混合物は、約１時間〜１８０時間の範囲、有利には約３時間〜６０時間の範囲、特に、約１２時間〜３６時間の範囲の時間、約１４０ｐｓｉ〜１６５０ｐｓｉの範囲、有利には約３６０ｐｓｉ〜１１２０ｐｓｉの範囲、特に約８００ｐｓｉ〜９００ｐｓｉの範囲のＣＯ₂圧力において、ガス処理されることができ、これに関連して好都合であることが証明されている。この後、細孔形成に影響を与える圧力が減少される速度にて、圧力が減少される。ＣＯ₂の使用は好ましいが、他のガス、例えば、空気、窒素、ヘリウム、ネオン、クリプトン、アルゴン、キセノン又は酸素は、同様に適切でありうる。その後、水又は水溶液は、乾燥の観点から、それ自体公知の方法で除去される。これを達成するために、マトリックスは、例えば、吸収性紙上に置くことができる。

好ましくは、工程ａ）の混合物（Ｍ）は、第一のポリマー成分のポリマー粒子、及び、細孔形成浸出材料の粒子からなる、粒子混合物（Ｍｐ）に対する、ポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）を加えることによって提供される。換言すると、発明の方法の工程ａ）で提供される混合物（Ｍ）は、好ましくは、

ｉ）ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）中に溶解された第一のポリマー成分の粒子を含むポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）、及び、

ｉｉ）好ましくは、約１００μｍ〜３００μｍの範囲の粒径を有する第一ポリマー成分のポリマー粒子、及び、細孔形成浸出材料の粒子のポリマー混合物（Ｍｐ）
を含む。

この点について、粒子混合物（Ｍｐ）中のポリマー粒子及びポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）の両方は、第一のポリマー成分−かつて、ポリマー溶液中に溶解した状態であり、かつて固体形状であったもの、のポリマー粒子であること／含むことに留意すべきである。ポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）中のポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の量は、混合物（Ｍ）の調製のためにポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）が粒子混合物（Ｍｐ）と混合される場合、粒子混合物（Ｍｐ）中の固体ポリマー粒子が即座に溶解されないようなことが好ましい。このように、ポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）及び粒子混合物（Ｍｐ）の混合は、溶媒が除去されるにつれて、急速に固体になる攪拌可能なペーストが得られる（→ 工程 ｂ））。

好ましい実施形態において、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）中のポリマー粒子を溶解するためのポリマー溶液（ＰＳ−Ｉ）を調製するために使用される第一ポリマー成分のポリマー粒子は、約１００μｍ〜３００μｍの範囲の粒径を有する。このサイズの粒子は、ポリマー溶媒の最小量に迅速に溶解される。

また、ポリマー溶媒（ＰＳ−Ｉ）中の第一ポリマー成分の濃度は、第一のポリマー成分が完全に溶解されるように選択されることが好都合であり、そして一方で、任意の有意な程度に溶解することを開始する粒子混合物（Ｍｐ）中のポリマー粒子を用いることなる、溶媒は除去されることが可能である。１０：１〜１：１００までのポリマー粒子対溶解されたポリマーの重量比、有利には、２：１〜１：２５、特に、１：１〜１：１０が、有益であることが証明されている。第一ポリマー成分のポリマー粒子対粒子混合物（Ｍｐ）中の細孔形成粒子（ｐｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の重量比に関する限り、本実施形態の範囲内において、総第一ポリマー成分対細孔形成浸出材料の重量比が１：１００よりも高いものであって、細孔形成浸出材料に関してより高い、すなわち、１：２００、１：５００又は１：１０００までの重量比を選択することが可能である。このようにして、９８％より高い多孔度を得ることが可能である。

上記方法の工程ｂ）は、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の除去による、混合物（Ｍ）の圧縮に関する。上述のように、圧縮は、好ましくは、圧力の作用によって、例えば、従来の水圧プレスで行われる。圧力の作用によって、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の溶媒分子は、絞り出されるスポンジ中に吸収された水に類似して、固体粒子間の間隙から絞り出される。しかしながら、固体粒子間の間隙からの溶媒分子を除去して、分子を混合物中に残存させ、相互により近接するようになるので、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）は、混合物（Ｍ）の圧縮につながる、例えば減圧下にて、少なくとも一部が除去されてもよい。結果として、混合物の量は、ポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）の除去によって減少する。

ポリマー溶液（ＰＳ−）を調製するために使用されるポリマー溶媒（Ｓ−Ｉ）は、第一ポリマー成分を溶解すべきであるが、細孔形成浸出材料は溶解すべきでない。これは、浸出材料の細孔形成特性は、影響されない、又は、わずかしか影響されないことを保証する。この目的のために、アセトン、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩素化及びフルオロ化脂肪族並びに芳香族炭化水素類、テトラヒドロフラン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、及び、それらの混合物は、例えば、上記ポリマーを溶解するために適している。クロロホルムは、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸−乳酸）を溶解するために、特に適しており、また、医療用途の観点でも適している。

上述の方法において、細孔形成浸出材料は、定義により、最初に、混合物を与えるマトリックス形成ポリマーと結合し、混合物からその後除去された結果、空洞（細孔）を形成する、固体又は少なくとも半固体材料として理解される材料として機能する。

混合物から細孔形成浸出材料を除去するために、少なくとも一つの溶媒に可溶であり、少なくともさらに一つの溶媒に実質的に不溶である前記材料は好都合である。処理条件の下、すなわち、１８℃〜２５℃の範囲の温度及び大気圧下で、特に、重量あたり３０％未満、好ましくは重量あたり２０％未満、特に重量あたり１０％未満、例えば、重量あたり５、４、３、２、１％未満の可溶であるとき、材料は実質的には不溶である。

得られる一次構造の構造及び特性は、それらを調製するために使用された細孔形成粒子のサイズ、形状、及び重量比によって、実質的に決定される。細孔形成粒子のサイズは、細孔形成浸出材料が浸出する際に形成される細孔のサイズに影響を与えるので、一般的に、１００〜４００μｍ、好ましくは、３００〜４００μｍの平均粒径を有する。このサイズは、細孔形成粒子の浸出によって形成された細孔のサイズとほぼ一致する。

これに関連して、細孔形成材料の性質のみならず、特に、細孔形成粒子の粒径分布もまた重要であることに留意すべきである。このように、粒径だけでなく、接続性すなわち、相互に繋がる間隙のネットワークもまた、粒径が増加するときに増加することが一般的には適用される。マクロ構造又はマクロ多孔質構造とも呼ばれるこのネットワークは、発泡によって得られ、一般的に、閉鎖され、それゆえマイクロ構造又はマイクロ多孔質構造と呼ばれる構造を形成する細孔とは区別されることになる。

発明の調製工程のために、細孔形成浸出材料は、好ましくは、塩、より好ましくは、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及び塩化カリウムからなる群から選択され、最も好ましくは、塩化ナトリウムである。塩化ナトリウムは安価であり広く入手可能であり、人体に害がなく、また、それゆえ、扱いやすいためにとりわけ有益である。加えて、塩化ナトリウムは水を含む様々な溶媒に可溶である。

マトリックスの調製のために、第一構造は、その後、溶媒（Ｓ−ＩＩ）に溶解された第二ポリマー成分を含む溶液（ＰＳ−ＩＩ）中に浸漬される（工程 ｄ）。

本発明によれば、第二ポリマー成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びその混合物から成る群から選択される。これより、コラーゲンが好ましい。

このように、第二ポリマー成分溶解することができる任意のタイプの溶媒は、本発明の方法で使用に適している。酸性水溶液は、この目的のために特に好都合であることが見出されている。

好ましい実施形態では、工程ｄ）において、一次構造は、第二ポリマー成分を含む酸性水溶液に浸漬され、好ましくは、減圧下である。減圧下での浸漬は、第二ポリマー成分を含む溶液で一次構造の一次細孔が完全に充填されることを可能にする。

特に好ましい実施形態では、一次構造は、タイプＩコラーゲン酸性溶液（ｐＨ３．２）中に浸漬され、好ましくは、一次構造の多孔質がコラーゲン溶液で充填されるように、真空下である。溶液中のコラーゲンの効果的な濃度は、好ましくは、０．１〜１．５（ｗ／ｖ）％の範囲が好ましい。工程ｅ）における溶媒（Ｓ−ＩＩ）の除去の際、本発明のマトリックスが得られる。有機溶媒は、好ましくは、減圧下において除去される。好ましくは、遠心分離工程は、減圧下において、溶媒（Ｓ−ＩＩ）除去前に実施される。

水性溶媒は、好ましくは、真空下で−８０℃にて凍結し、凍結乾燥することで除去される。約３時間〜６０時間、特に、約１２時間〜３６時間の範囲の時間、真空下で、これに関連して好都合であることが立証されている。

特に好ましい実施形態において、溶媒（Ｓ−ＩＩ）は水性溶媒であって、本発明の方法の工程ｅ）の溶媒（Ｓ−ＩＩ）の除去は、以下の工程、
ｅ１）遠心分離；及び
ｅ２）真空下での凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）及び／又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）」
を含む。

遠心分離工程は、一次構造の表面に対して接着していない溶媒（ＰＳ−ＩＩ）を含むいずれかの過剰な第二ポリマー成分を除去することに役立つ。真空下でのフリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）及び／又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）によって、溶媒（Ｓ−ＩＩ）は実質的に完全に除去され、得られるマトリックス構造において、第二ポリマー成分は、少なくとも一次細孔の一部の内部空間内に含まれる、三次元の二次構造を形成する。

一次細孔内に含まれる二次構造の量は、溶解された第二ポリマー化合物を含む溶液（ＰＳ−ＩＩ）の粘度及び／又は遠心分離速度を調節することによって制御可能である。例えば、溶液（ＰＳ−ＩＩ）の粘度及び／又は遠心分離速度が高ければ高いほど、一次細孔内に、より小さい二次構造が形成される。一般に、一次細孔内に過剰な二次構造の形成を回避するために、遠心分離速度（又は、遠心加速度）は、好ましくは、５００ｇ以上に設定される。より好ましくは、遠心分離速度は、６００ｇと１０，０００ｇの範囲内に設定される。加えて、溶液（ＰＳ−ＩＩ）に溶解された第二ポリマー成分の濃縮は、０．１〜１．５（ｗ／ｖ）％の範囲内である。この範囲内において、溶液（ＰＳ−ＩＩ）の粘度は、実質的に、一次細孔に対して溶液（ＰＳ−ＩＩ）の完全な浸透を可能にする。

高度に架橋された三次元二次ポリマー構造を得るために、マトリックスは、グルタルアルデヒド等の架橋剤でさらに処理することができる。

それはさらに、マトリックスは、表面修飾工程、特に、プラズマ処理工程を含む、追加の工程ｆ）にさらされることが好ましい。

述べたように、本発明は、治療用途、特に、一般的に組織工学組織工学にて使用するための、さらにより具体的には、移植片、特に、肝臓移植の調製に使用するための発明のマトリックスに関する。

組織工学組織工学の分野において、本発明のマトリックスは、細胞が遊走する及び／又は細胞が接着するスキャフォールドとして働くことができる。組織工学組織工学において、マトリックス及び後者に対して接着する細胞のこの組み合わせは、一般的に、「移植片」と呼ばれる。

本発明のマトリックスは、組織工学のための移植片で使用したとき、重要な利点を示すことが証明されている。例えば、内部の空き領域を意味する、内部寸法は、マトリックスへ効率的に細胞が定着することを可能にする。マトリックスは、一方で、自由に成形可能であり、一方で、外科的移植手順に抵抗性があり、移植部位において作用する機械的な力に耐えるための安定性及び強剛性を提供する。移植後に設定する初期細胞破壊は、限られており、短期間の後、移植組織は意図した機能が想定しうる。間もなく、移植後、血管又は血管が豊富な肉芽組織、そして神経組織も、組織片へと増殖し始める。さらに、本発明のマトリックスは、生理学的に有害な溶媒、例えば、ホルムアルデヒド等の使用をすることなく調製されることができ、それは、溶媒を除去するための特別な方法が必要とされず、また、これらの残存溶媒の残存量の危険が無いことを意味する。

このために、マトリックスは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、所望の細胞と播種されることができ、すなわち、細胞を含む溶液で処理され、細胞がマトリックスへ接着するまでインキュベートされる。接着している細胞と一緒になったこのようなマトリックス（本明細書では、移植片という）は、その後、例えば、細胞のさらなる増幅又はそれらの性質の変更を目的とするために、適当な場合に活性化化合物の影響の下、さらに処理工程、例えば、さらに培養工程にさらされうる、及び／又は、適切な方法、例えば、氷上若しくは標準的な条件下でのバイオフローリアクター中において、移植するまで保存されうる。この使用の文脈において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、移植のために意図された細胞を、最初に単離できる、及び、適当な場合、増幅もできることは利点である。特に、これは、それによって、ランゲルハンス島細胞とともに上述の肝細胞のような異なる細胞のタイプをマトリックスに適用することを可能にする。

上に示すように、本発明のマトリックスは、一般的に細胞培養に非常に適しているだけでなく、特に、培養が非常に困難であることが知られる、肝細胞の培養に適していることが示されている： 肝臓は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて驚くべき再生能力を有しているが、培養中の肝細胞は、増殖能力が限られており、懸濁液中では数時間以上は、通常、生存できない。問題は、新たに単離された肝細胞は、典型的な構造及びそれらのｉｎ ｖｉｖｏのカウンターパートの機能のほとんどを示すが、それらは、基材へと付着なしでは生存できないような、特異的な膜ドメイン、例えば、細胞間結合及び毛細胆管を失っている。しかし、毛細胆管様構造を再集合及び再構築できるように、従来の培養条件にてこれらの肝細胞が播種された時でも、それらは、早期に表現型の変化を示し、ほんの数日のみ生存する。

肝細胞が、例えば、移植片として使用するために、多孔質基材上に載置され場合、より多くの困難が生じる： その小さいサイズ（例えば、約５０μｍの線維芽細胞と比較して、１０〜１５μｍ）のために、肝細胞の播種は、内部へ保持される代わりに、細胞が多孔質基材を通過して落ちるリスクを生じる。この問題は、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ等のような、このようなマトリックスの製造のために使用される一般的な材料は、非常に疎水性であり、これにより、任意の細胞接着を妨害するという事実によって悪化される。

驚くべきことに、本発明のマトリックスは、特に、肝細胞培養に非常に適していることが見いだされた。理論に縛られることを望まないが、本発明のマトリックスは、二次細孔構造で少なくとも一部が充填された一次細孔を含むという少なくも部分的事実によるものと推察される。このように、マトリックスは、肝細胞のような、小さなサイズの細胞をも保持することを可能にする。第二ポリマー成分の含有量及び／若しくは多孔度の増加又は減少によって、一次細孔内の利用可能なスペースは、細胞増殖にとって必要に応じて調製可能である。これに関連して、第二ポリマー成分は、少なくとも９０％の多孔度を有する二次構造を形成することが特に好ましい。

第二ポリマー成分の含有量は、例えば、一次構造が、上述のマトリックスを調製中に浸漬される、溶液（ＰＳ−ＩＩ）中に溶解された第二ポリマー成分の濃度を調製することによって、調節されることができる。最も好ましくは、溶液（ＰＳ−ＩＩ）中の第二ポリマー成分の濃度は、０．１〜１．５（ｗ／ｖ）％の範囲内である。

加えて、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びその混合物の群から選択される第二ポリマー成分は、マトリックスへ優れた親水性（すなわち、改善された水の濡れ性）を提供する。細胞が、マトリックスへより容易に浸潤することができ、二次構造へと接着し、これによって、播種された細胞の漏れを防ぐので、本発明のマトリックスの増加した親水性は、多孔質マトリックス構造中の細胞播種をより促進する。

第二ポリマー成分として使用される上述の材料から、コラーゲン、特に、ゼラチンは、最も好ましい。そのナノ繊維構造のために、生体組織培養中において、細胞接着、増殖及び分化機能を促進するのに特に有効である。

第一及び第二ポリマー成分によって与えられる特別な材料組成を除いて、本発明マトリックスの特別な三次元構造は、マトリックス内の細胞の接着及び培養に理想的な構造環境を提供する。例えば、細孔のサイズ及び一次細孔は、特に、マトリックスが、単一細胞が載置されることができるだけでなく、「スフェロイド」とも呼ばれる多細胞性の細胞クラスターも載置することが出来ることが好ましい。

肝細胞が、予め集合させた状態で基材上に載置された場合、それらの死亡率は有意に減少されることができることが見出されたので、それが肝細胞になると、マトリックスに多細胞性の細胞クラスターを載置する可能性は特に有利である。

それゆえ、肝細胞の平均細胞サイズ（１０〜１５μｍ）を考慮に入れ、肝臓移植片を調製するための、マトリックスの使用の観点より、一次細孔は、好ましくは、１５０μｍ〜３００μｍ、好ましくは２００μｍ〜３００μｍの平均細孔サイズ直径を有する。

数年前に譲渡可能であり、保存可能な状態において、このような予め集合させた細胞クラスターを提供することができる新しい培養技術が開発された。この培養技術は、「ハンギングドロップ技術」の名前で知られるようになり、それは、表面で吊している培養液の水滴中に細胞を培養することを含んでいる。培養液のこの水滴は、生きている細胞とともに播種され、そして、重力の引力の下、培養液滴中の細胞はマイクロ組織のように下降して集合し、その結果、天然の組織に形態学的及び機能的に非常に類似した多細胞性のマイクロ組織スフェロイドになる。これらの予め集合させたマイクロ組織は、使用準備済みの製品を購入可能、又は、例えば、スイス連邦工科大学（ＥＴＨ）チューリッヒ及び、チューリッヒ大学、スイスのスピンオフ会社、Ｉｎｓｐｈｅｒｏ社によって開発されたＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ^TM技術に基づいて、製造可能である。それは、このように、Ｉｎｓｐｈｅｒｏ社のハンギングドロップ技術に関する欧州特許第ＥＰ−Ｂ１−２３４２３１７の開示が適用される。

特に、上の多細胞性マイクロ組織スフェロイドを使用する観点において、本発明のマトリックスは、好ましくは１５０μｍ〜３００μｍの平均孔径の一次細孔を有する、マトリックスの細孔として特に非常に適しており、一次細孔に対して予め集合させた細胞クラスターが容易に適合する十分なスペースを提供する。

事前に生細胞が載置されている（ｉｎ ｖｉｔｒｏ播種）移植片の移植はしばしば好ましいが、他の可能性としては組織再生が可能である、損傷を受けた組織に遊走するための前駆細胞を含む目的で、マトリックスを移植すること（任意の前の細胞接着無し）であり、そこに失った組織を再生する。このために、マトリックスは、非所望の細胞ではなく、所望の細胞が、マトリックスへ遊走できるように形成されなければならない。このような使用は、一般的には、導かれた組織再生（ＧＴＲ）として説明される。

本発明のマトリックス又は本発明の移植片は、従って、ヒト又は動物の身体を治療するために使用することができる。このために、１以上のマトリックス、又は、１以上の移植片が、外科的又は介入処置の方法によって治療されるべき身体へと導入される。移植片が臓器機能を有する細胞を含む場合、又は、臓器機能を有する細胞がマトリックスへと遊走する事になる場合、例えば、肝細胞又はランゲルハンス島細胞を有する時、マトリックス又は移植片は、例えば、治療されるべき個体の腸間膜、皮下組織、後腹膜、腹膜前空間、又は筋肉内空間へと移植することができる。

原理的には、適切な組織置換を必要とする個体は、本発明のマトリックス又は移植片で治療することができる。これらの個体は、一般的に、その過程で機能的な組織の欠損を含む特異的な障害又は疾患を患っている個体である。これは、潜在的に、全体的な臓器、例えば、肝臓又は膵臓に影響を与えてもよい。

従って、組織工学にて使用するために、マトリックス及びそれに包埋された細胞を含む移植片を提供することが本発明の他の目的である。

本目的は、少なくとも一つの本発明のマトリックス及び少なくとも一つのランゲルハンス島細胞を含む、組織工学のための移植片に関する、請求項１３に記載の主題によって達成される。

ランゲルハンス島細胞は、細胞集合体−いわゆる、ランゲルハンス細胞の「膵島」を形成する、膵臓由来の細胞である。健常な成人の膵臓全体に分布する約１００万の膵島があり、それぞれは、直径にして、４０μｍ未満から４００μｍを測定し、膵島１つあたり、わずか数個の細胞から約５０００個の細胞の範囲の細胞数を含む（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ １９９４）。ランゲルハンスのヒト膵島中の細胞の６５〜８０％は、インシュリンを産生するベータ細胞であって、それは、膵島全体にわたり分布している。

マトリックスの構造は、細胞に対して優れた基材を与え、マトリックス上で単一の細胞タイプ又は複数の異なる細胞タイプを培養することを可能にする。これに関連して、ランゲルハンス島細胞とは別に、移植片は、特に、肝臓細胞、膵臓細胞、脂肪細胞、腸管細胞、皮膚細胞、血管細胞、神経細胞、筋細胞、平滑筋細胞、甲状腺細胞、尿管上皮細胞、輸卵管由来細胞、泌尿生殖組織、線維芽細胞又は線維細胞、及び、歯根細胞由来の他の細胞を含んでもよい。

マトリックス中に存在する細孔は、細胞の内職及び細胞外マトリックスの堆積のための空間を提供する。マトリックスは、必要な機械的な安定性及び弾力性を提供するので、初期の静的段階の後の細胞培養は動的に行われてもよい。これは、細胞は、例えば、細胞培養フラスコ等の中の静的な環境中で培養されることを意味する。その後、スキャフォールド上で成長する細胞は、動的な環境を模擬した灌流チャンバー中に移される。この方法はさらに細胞の成長に影響を与える。例えば、細胞外マトリックスの組成は、細胞が暴露されている機械的な系統（ｓｔｒａｉｎ）に依存する。

移植片は、ランゲルハンス島細胞に加えて、肝細胞をさらに含むことが特に好ましい。この実施形態において、移植片は、それゆえ、少なくとも２つの細胞タイプを含み、それは好ましくは自家細胞（後の移植を受ける個体由来の細胞）であるが、代替的に、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってもよい。

驚くべき事に、肝細胞及びランゲルハンス島細胞を含む本発明の移植片は、慢性又は急性肝臓病の場合の、肝臓の臓器機能を回復し、維持し、改善することを可能にする肝臓組織の優れた細胞学的な代替物を提供することを見出した。特に、ランゲルハンス島細胞に対する肝細胞の特定の比率は、移植片にその特定の機能を果たさせるための、特に、利点になることが見出されている。

特に好ましい実施形態では、移植片は、肝細胞、及び、少なくとも１つのランゲルハンス島細胞、好ましくは、多細胞の、予め集合させた細胞クラスターを含む多細胞性の微細組織スフェロイドが載置されている。このような予め集合された細胞クラスター、より好ましくは、多細胞性の微細組織スフェロイドの形態における予め集合させた細胞クラスターは、好ましくは、例えば、ＥＰ−Ｂ１−２３４２３１７にて開示されたハンギングドロップ技術に沿って調製される。あるいは、予め集合させた細胞クラスターを含んだ簡単に準備されたハンギングドロップは、凍結状態、好ましくは−７８℃で保存される事前調製されたスフェロイドとして購入することができる。

予め集合させた細胞クラスター又はマイクロ組織スフェロイドは、好ましくは、幅及び高さにおいて、１００μｍ〜３００μｍのサイズを有する。このように、マトリックスは細胞が載置された時、予め集合させた細胞クラスターは一次細孔に対して容易に適合する。

発明は、それゆえ、最も好ましくは、移植後、肝臓の代謝機能を実行する移植片にも関する。この目的のために、肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比は、好ましくは肝細胞約１×１０⁶対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜５００，０００であり、より好ましくは肝細胞約１×１０⁶対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜１００，０００である。最も好ましくは、移植片は、肝細胞約１×１０⁶対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜７０，０００細胞を含む。

これに関して、上記の数値は、明確に細胞の数に関するものであり、予め集合させた細胞クラスターの数では無いことに留意されたい。

また、本発明は、好ましくは、移植後、同等の膵臓臓器の内分泌特性を示す移植片に関する。膵臓の機能を実施するために、移植片は、好ましくは、肝細胞よりランゲルハンス島細胞を含む。これに関して、肝細胞対ランゲルハンス島細胞の好ましい比率は、１：１〜１：２００の範囲にある。最も好ましくは、この目的のために、肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比率は、約１：１００である。

本発明のマトリックスに定着するために使用されることになっている細胞又は細胞混合物は、それ自体が公知の方法で得ることができる。自家の移植片を製造する目的のために、細胞は、好ましくは、移植片が挿入されることになっている個体由来が好ましい。このように、適した組織、例えば、肝臓又は膵臓の一部は、一般的に、個体から取り除かれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマトリックスに播種し、培養するために適した方法で調製される。これに関して、細胞は、出来るだけ高い生命力を示す細胞が重要である。

もし、肝臓細胞が、肝臓組織から得られているとき、特に肝硬変である場合に、肝細胞が厚い結合組織層によって囲まれているという事実が考慮されなければならない。本発明によれば、定義された組成物の溶液は、出来るだけ高い活力のある細胞の比率を含む肝臓細胞を単離することを可能とするために使用される。

好ましくは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ₃ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、グルコース及びエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を含み、約７．４のｐＨを有する、溶液組成物Ａは、肝臓又は膵臓の一部を灌流するために使用される。特に、この溶液の１０００ｍＬは、約８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、０．２７ｇのＮａ₃ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、１．８ｇのグルコース及び１．９ｇのＥＧＴＡを含む。灌流は、好ましくは、約３７℃の温度、及び約１５ｍＬ／分の流速で実施される。数分、特に、約３〜５分、例えば、４分は、上述の流速にて、適切に組織の一部を灌流することに十分である。

あるいは、肝臓又は膵臓の一部を灌流するために、ＥＧＴＡを含む溶液組成物Ａ’を使用することも可能である。

肝臓又は膵臓の一部を灌流するために、使用は、好ましくは、ｐＨが約７．３〜７．４、好ましくは、約７．３５を有する溶液組成物Ｂから形成される。組成物Ｂは、好ましくは、ＨＥＰＥＳ、ＣａＣｌ₂及びコラゲナーゼ タイプＩＶ ５０Ｕ／ｍＬを含む、低グルコースＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）である。

この場合も、約３７℃、及び、約１０ｍＬ／分の流速の灌流が、好都合であることが証明されている。数分、特に、約５〜１０分、例えば、約６〜７分は、適切に組織の一部を灌流するためには十分である。

あるいは、肝臓又は膵臓の一部を灌流するために、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む溶液組成物Ｂ’を使用することも可能である。溶液の１０００ｍＬは、好ましくは５０Ｕヒアルロニダーゼ／ｍＬを含む。

組織の一部が、最初に組成物Ａで処理され、その後、組成物Ｂで処理された場合、単離されるべき細胞の生命力（ｖｉｔａｌｉｔｙ）は有利である。あるいは、組成物Ａ’を最初に使用し、その後、組成物Ｂ’を使用することが可能である。

灌流に続いて、組織部分は、その後、小さく刻まれ、慎重に適切な培地、例えば、ウィリアムズ培地Ｅに懸濁することができる。得られた細胞懸濁液は、比較的荒い細胞の残骸をまだ含んでおり、後者は、それ自体公知の方法、例えば、ナイロンネット（１００μｍ）を通して細胞懸濁液をフィルターすることによって除去することができる。６０〜１３０ｇ及び４〜２２℃における３分間の遠心分離は利点があることが証明されていることに関連して、濾液の細胞は、その後、慎重に沈殿されることができる。

単離された細胞は、それ自体が公知の方法でマトリックスに載置される。一般的に、細胞は、細胞を含んだ溶液としてマトリックス上に載置され、通常の細胞培養条件にて、細胞がマトリックスへ接着するまで、細胞とマトリックスは、その後インキュベートされる。ランゲルハンス島細胞が、少なくとも一つの他の細胞タイプ、例えば、肝細胞と一緒にマトリックス上に提供された場合、異なる細胞タイプは、原理的には、一緒に、又は、他に連続してマトリックス上に載置されることができる。

本発明は、したがって、移植片を調製するための方法も提供し、工程

ａ． 本発明の多孔質マトリックスを提供し、及び

ｂ．少なくともマトリックスの片側に、肝細胞及び少なくとも一つのランゲルハンス島細胞を載置すること、
を含む。

より具体的には、ランゲルハンス島細胞は、好ましくは、最初に載置され、続いて、肝細胞が載置され、載置された後に少なくとも細胞の一部がマトリックスへ接着するまでそれぞれの場合においてインキュベーションが実施される。

より好ましくは、ランゲルハンス島細胞及び肝細胞は、一緒に、予め集合させた細胞クラスターでマトリックス上に載置される。このような予め集合させた細胞クラスターは購入可能、又は、例えば、上述のハンギングドロップ技術を使用することによって培養できる。

特に好ましい実施形態において、予め集合させた細胞クラスター、又は、マイクロ組織は、マトリックスに細胞が載置されたときに、一次細孔へ容易に適合するように、幅及び高さ１００μｍ〜３００μｍのサイズで提供される。

本発明のマトリックスは、しかしながら、それ上の細胞の堆積を促進するだけでなく、細胞が生存し、マトリックス内で増殖し、遊走することを可能にする構造的な環境も提供する。より具体的には、本発明のマトリックスは、マトリックスへ液体及び（マクロ−）分子の移動を可能にし、又はマトリックスを通過することさえも可能にする。始めに、栄養（例えば、酸素）及び廃棄物の交換が、拡散によって行われる。しかしながら、生存工程のために意味する、受動的な輸送としての拡散は、短い距離のみ効果的である。具体的には、拡散は、マトリックス内の細胞に対して、酸素と栄養を供給することができるが、マトリックスの表面から内部まで、約４００μｍの最大距離までのみである。これは、マトリックス上に堆積している細胞は、通常、必須の栄養、特に酸素の欠乏のため、マトリックスへのこの拡散距離より深く遊走することができない。限定された拡散範囲を考慮にいれると、マトリックスは、０．１ｍｍ〜１．０ｍｍ、より好ましくは、０．５ｍｍ〜１．０ｍｍの厚さを有する。

本発明の移植片、すなわち、その上に堆積された細胞を有するマトリックスは、一方で、マトリックスの寸法は必ずしも限定されるものではない。１．０ｍｍを超える厚さを有する移植片が所望される場合、例えば、安定性の理由のため、又は、細胞に対してより大きな接着領域を提供するため、移植片は、互いの上に置き、追加的に、共に接着又は縫合された少なくとも二つのマトリックスから調製されうる。このような、「二重−又は多層移植片」は、好ましくは、組み立てる前に細胞が載置された少なくとも二つのマトリックスから調製される。

特に好ましい実施形態によれば、本発明の移植片は、以下の手順により、一体的に安定した本体を形成する二又は多層構造として調製される：

ａ）本発明によるマトリックスは、該マトリックスが、実質的に、約０．１〜１．０ｍｍの範囲の厚さを有するシート形状で提供され、

ｂ）細胞−特に、肝細胞及び少なくとも一つのランゲルハンス島細胞−は、少なくともマトリックスの片面に載置され、

ｃ）その上に細胞を有するマトリックスは、多層構造へと折りたたまれる。

マトリックスが工程ｃ）で折り畳まれる前に、マトリックスは、好ましくは、細胞が増殖する最適な条件が提供されるインキュベータ内に配置される。上記で定義されたマトリックスの好ましい厚さは、細胞が増幅でき、マトリックス構造全体に物質の能動輸送も可能なように、輸送流路のような機能的な組織を形成することができるように、拡散によって酸素及び栄養が十分に提供されることができることを保証する。マトリックスが、その後、多層構造へと折りたたまれる時（工程ｃ））、物質の輸送は、マトリックス全体に新規に形成された機能的組織を通って、能動的に実施されることもできる。加えて、マトリックスは、いくつかの個々のマトリックスから組み立てられるよりも、好ましくは折り畳まれるので、得られる移植片は、特に安定しており、分解のリスク無しで、促進された輸送及び移植を可能にする。

最も好ましくは、工程ｂ）において、細胞がマトリックスの両側上、すなわち、上部側及び下部側上に載置されることである。これはマトリックスへ上部から及び下部から遊走することを可能にする。両側の上に細胞をマトリックスへ載置することは、マトリックスの第一の側に細胞を載せ、その後、マトリックスの他の側に細胞を載置するためにマトリックスをひっくり返すことによって、達成することができる。この手順は、さらに細胞をマトリックスの表面上に載置される前に、細胞がマトリックスへと遊走することを可能とするために、間に短い時間、マトリックスをインキュベートして、数回繰り返すことができる。

多層の移植片は、１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲の合計の厚さが提供されることが特に好ましい。例えば、厚さ０．６ｍｍのマトリックスは、１．８ｍｍの合計の厚さ（又は高さ）を有する三層の移植片を得るために、好ましくは２回折り畳まれる。

１以上のマトリックスから多層の移植片を製造することはさらに可能である。例えば、より小さいマトリックスは、第二の、より大きいマトリックスの中心に配置されてもよく、第二のマトリックスの端は、続いて、内部のより小さいマトリックスの周囲に折り畳まれる。換言すると、より小さなマトリックスは、第一のマトリックスの「周囲が包まれた」第二のマトリックスによって封入することができる。このように、第一のマトリックスは、第二のマトリックスが第一のマトリックスの周囲で折り畳まれる前に、第一の細胞タイプ及び、第二の細胞タイプを有する第二のマトリックスで播種されることができる。

本発明は、慢性肝臓若しくは膵臓病、並びに／又は、慢性肝臓及び膵臓障害に繋がる疾患の治療に特に向けられている。これらの疾患は、例えば、成人の慢性肝炎及び胆汁性肝硬変並びに小児の胆道閉鎖症及び先天性代謝疾患を含む。実際には、本発明のマトリックスは、肝臓移植が示されている全ての場合、及び、肝臓機能障害又は機能低下の全ての場合において、疾患を緩和するために使用することができる。一方で、膵臓移植は、特に、糖尿病の場合において、特に、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病において示される。膵臓疾患又は膵臓の障害を治療するために、移植片は、好ましくは、肝細胞及びランゲルハンス島細胞が提供され、最も好ましくは、肝細胞約１対ランゲルハンス島細胞約１００個の比である。

本発明は、従って、個体の移植を実施するための、並びに、これに関連して、特に移植によって置換されるべき機能的な組織の少なくとも一部の欠損を患っている個人の治療のための、使用可能な治療剤を製造する際の、本発明のマトリックスの使用、又は、本発明の移植片の使用にも関する。

肝臓の移植学の分野におけるマトリックスの好ましい使用の観点において、本発明は、さらに、肝臓移植の調製のためのキットをさらに提供する。該キットは、
ｉ）本発明の少なくとも一つのマトリックス、及び
ｉｉ）培養液中で予め集合させた細胞クラスターを含む、多細胞性の微細組織スフェロイド、
を含む。

特に好ましい実施形態によれば、キットは、本発明の少なくとも一つのマトリックスと、培養液中の、少なくとも１つのランゲルハンス島細胞及び肝細胞の予め集合させた細胞クラスターとを含む。

多細胞性の微細組織スフェロイドは、上述の「ハンギングドロップ技術」に基づいて、例えば、ＩｎＳｐｈｅｒｏ ＡＧ、スイスによる特許かされたＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ^TMハンギングドロップ技術に基づいて、好ましくは調製される。

以下の適用に本発明を限定することなく、本発明のマトリックスは、例えば、線維芽細胞、筋肉細胞又は粘膜細胞の移植のために使用されることができる。粘膜細胞の移植は、小腸を含む外科的処置において、特に意義深い。

本発明のマトリックスを製造する方法は、さらに実施例に詳細に記載される。以下の実施例は、例示であり、本発明の範囲を限定しない。合理的な当業者に生じるような、合理的な改変は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中にて行うことができる。

材料及び方法
マトリックス調製
直径２０ｍｍ及び厚さ２ｍｍのマトリックスは、以下の手順によって調製された：

＜実施例１＞
三次元の一次構造は、篩にかけられた（ｓｉｅｖｅｄ）塩化ナトリウム粒子を使用した、粒子浸出技術（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ−ｌｅａｃｈｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によってＰＧＬＡから調製された。

分子量９０〜１２６ｋＤを有する、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ ７５：２５）は、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧ社（エッセン、ドイツ）から購入された。ＰＧＬＡペレットは、液体窒素（Ｎ₂）で凍結され、１０，０００ｒｐｍにて２分間断片化された（ダシュラーインパクトシステム）。断片化する工程は、ボールミル中で実施され、粉砕後、篩にかけられた。このようにして得られた粒子は、平均１０８〜２５０μｍの直径を有していた。

ポリマーペレット２ｇは、温度２２．５℃で８０分間、５０ｍＬクロロホルム中に溶解され、ポリマー溶液（Ａ）を得た。

次の工程において、純粋なＮａＣｌは、２分間、１０，０００ｒｐｍにて細断された。このようにして得られた粒子は、平均１０８〜３９０μｍの直径を有していた。

細断されたポリマーペレット０．５ｇ及び細断されたＮａＣｌ粒子４８ｇは、４分間９０ｒｐｍにて混合され、ポリマー溶液（Ａ）と収容され、円形セラミック小板に載置された。溶媒は、３５℃、２８時間蒸発された。溶媒蒸発は、クロロホルム有毒ガスを抽出するためのドラフト内に配置された、制御された温度オーブン中で実施された。このように形成された一次細孔を有する三次元一次構造の生成物は、４０℃にて１２時間乾燥された。ＳＥＭ解析は、一次構造が一様に分布し、相互に接続された細孔構造を有することを証明した。細孔サイズ及び形態は、使用されたＮｃＣｌ粒子のそれと同様であった。一次構造は、その後、コラーゲン溶液で一次細孔が満たされるように真空下にて、タイプＩコラーゲン酸性溶液（１．０（ｗ／ｖ）％、ｐＨ３．２、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、コスタメサ、カリフォルニア、から購入）に浸漬された。コラーゲン溶液含有一次構造は、続いて、−８０℃にて１２時間凍結され、一次細孔中に二次コラーゲン構造の形成するために、０．２トルの真空下にて追加の２４時間凍結乾燥された。コラーゲン構造は、３７℃４時間、２５％グルタルアルデヒド水溶液で飽和グルタルアルデヒド蒸気での処理によってさらに架橋された。架橋された後、マトリックスは、未反応のアルデヒド基を阻害するために０．１Ｍのグリシン水溶液で処理された。脱イオン水で洗浄して凍結乾燥された後、一次細孔を有する一次構造、及び、一次細孔内に含まれた二次細孔を有する三次元の二次コラーゲン構造を含むマトリックスが、最終的な生成物として得られた。

＜実施例２＞
３５５〜４２５μｍの直径の範囲にある、篩にかけられたＮａＣｌ粒子（３６．０ｇ）は、アルミニウム皿に置かれ、２７（ｗ／ｖ）％濃度にてクロロホルム（１７．８ｍＬ）中のＰＬＧＡ溶液と収容した。このように、ＰＬＧＡは、クロロホルム中で溶解され、その後、ポロゲンとしてのＮａＣｌ粒子で充填されたアルミニウム皿上にキャスト（ｃａｓｔ）された。

混合物は、送風にて４８時間空気乾燥され、続いて、４８時間真空乾燥された。乾燥したＰＬＧＡ／ＮａＣｌブロックは、その後、アルミニウム皿から剥がされ、ＮａＣｌ粒子を浸出するために脱イオン水に浸漬された。洗浄は、ＮａＣｌ粒子を完全に除去するために、５００ｍＬ脱イオン水で１時間それぞれ、２０回続けられた。最終的に、ＰＬＧＡ一次構造は、空気乾燥後に形成された。ＰＬＧＡスポンジの多孔度は、水銀圧入ポロシメーター（オートポアＩＶ、島津製作所、京都、日本）で決定された。ＰＬＧＡ一次構造は、表面処理のために、６．０ｍｍ×６．０ｍｍ×５．０ｍｍの小片に切断された。

水溶性の０．５（ｗ／ｖ）％コラーゲン溶液（ブタ タイプＩコラーゲン、酵素処理によって単離された）は、水溶性の１．０（ｗ／ｖ）％コラーゲン溶液を塩酸（０．００１Ｍ）の水溶液で、０．５（ｗ／ｖ）％のコラーゲン濃度まで、希釈することによって調製された。水溶性の０．５（ｗ／ｖ）％コラーゲン溶液のｐＨは、２．５〜３．５へ設定された。

カットされたＰＬＧＡ一次構造は、一次構造の一次細孔がコラーゲン溶液で充填されるように、減圧下にて、水溶性の０．５（ｗ／ｖ）％コラーゲン溶液中に浸漬された。コラーゲン溶液を含むＰＬＧＡ一次構造は、５０ｍＬ遠心分離管に置かれたセルストレーナー膜上に載置され、余剰のコラーゲン溶液を除去するために、９６、６００、１２００、５０００、及び１０，０００ｇの様々な遠心加速にて、４℃で操作される多目的冷却遠心分離機ＬＸ−１２０（トミー精工社、東京、日本）又は、高速冷却遠心分離機（Ｈｉｍａｃ ＣＲ ２１Ｇ、日立社、東京、日本）を使用して、１０分間遠心分離された。遠心分離後、コラーゲン処理ＰＬＧＡ構造は、冷凍庫にて−８０℃、４時間凍結された。凍結された多孔質スキャフォールドは、２５Ｐａ未満の真空下で、２４時間、凍結乾燥された。凍結乾燥後、コラーゲン被覆ＰＬＧＡ構造は、使用するまでデシケーター中で保存された。

マトリックス特性解析

多孔度の計算
マトリックスの多孔度は、以下の公式によって決定された：

３バッチ製造工程マトリックスの多孔度は、表１に示される。

コラーゲン含有量解析

ＰＬＧＡ一次構造は、コラーゲン水溶液に浸漬する前に秤量され、コラーゲン処理ＰＬＧＡ構造の湿重量は、化学天秤（ＡＧ １３５、メトラー−トレド、オハイオ）を使用して遠心分離後に秤量された。２つの重さの間の違いが遠心分離後にＰＬＧＡスポンジに残存したコラーゲン水溶液の量を示した。

親水性解析
親水性は、以下のように試験された：液体がマトリックスによって吸収されるか、又は、はじかれるかを決定するために、３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；シグマ社）は、液滴方法によってマトリックスの上部にピペットで移された。

細胞接着試験
マトリックス上の細胞接着は、コラーゲンタイプ１でマトリックスをコートすることによって調べられ、液滴方法によってマトリックスの上部に細胞懸濁液の３００μＬをピペットで移された。その後、細胞懸濁液が載置されたマトリックスは、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％相対湿度でインキュベートされた。懸濁液中に残存し、それゆえ、マトリックスに接着しなかった細胞は、媒体を変える間に、１日及び三日後にカウントされた。

細胞数算出
細胞数は、０．２％トリパンブルー溶液で２分間、細胞懸濁系を染色した後、血球計（ノイバウアー改善チャンバー）で決定された。

接着した細胞の数は、以下の式に従って決定された：

細胞単離

略語及び物質：
−ＥＧＴＡ：エチレングリコール四酢酸（シグマ Ｅ４３７８）
−コラゲナーゼ タイプＩ：（ワーシントン ４１９６； ２４６Ｕ／ｍｇ）
−ＦＣＳ：ウシ胎児血清（シグマ Ｆ２４４２）
−ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（シグマ）
−ウィリアム メディウム Ｅ：「ウィリアムＥ培地（シグマ Ｗ４１２８）」及び１０体積％のドナーの血清、又は、１０体積％ＦＣＳを含む肝細胞培養用標準培地

移植されるべき個体から、それ自体公知の方法で肝臓の一部が除去された。除去された肝臓の一部は、まず始めに、溶液（８ｇのＮａＣｌ； ０．２ｇのＫＣｌ； ０．２６６ｇのＮａ₃ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、１．８ｇのグルコース及び０．１９ｇのＥＧＴＡ； 蒸留水で１０００ｍＬにした；ｐＨ７．４）で、流速３０ｍＬ／分及び３７℃にて７分間、灌流された。肝臓の一部は、その後、さらに１０分間、流速３０ｍＬ／分及び３７℃にて、コラゲナーゼ／ヒアロルにダーゼ溶液（８ｇのＮａＣｌ； ０．２ｇのＫＣｌ； ０．２６６ｇのＮａ₃ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、１．８ｇのグルコース、０．７３５ｇ ＣａＣｌ₂及び５〜１０ｍＬのＨＥＰＥＳ；１０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ； 蒸留水で１０００ｍＬにした；ｐＨ７．２）にて灌流された。灌流が終了した後、肝臓の一部は分断され、慎重にウィリアム メディウムＥに懸濁された。細胞懸濁液はろ過され（ナイロンネット；１００μｍ）及び、その後、ウィリアム メディウム Ｅで洗浄された。その後、細胞は、室温にて５〜１０分、１００ｇにて遠心分離された。トリパンブルー（０．２％）を使用した決定された細胞のバイアビリティーは、７０％であった。

細胞懸濁液のバイアビリティーは、トリパンブルー色素除去テストを使用して、以下の公式を使用して決定された：

ランゲルハンス島細胞は、同様の方法で、膵臓の一部から単離された。

細胞の定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）

第一の工程において、マトリックスは、上記「細胞単離」で記載されたように単離された、肝細胞と共にランゲルハンス島細胞とインキュベートされた。

このために、肝細胞溶液及びランゲルハンス島細胞溶液は、温められたウィリアム Ｅ メディウム中に、肝細胞及びランゲルハンス島細胞をそれぞれ懸濁するために調製され、血清を用いて完成され、そして、それぞれの溶液の細胞濃度は、約１〜３×１０⁶細胞／ｍＬへ調製された。細胞数は、倒立のオリンパス顕微鏡の下、０．２ｍｍカウンティングチューブにて計測することによって決定された。

１８ｍＬの肝細胞溶液及び２ｍＬのランゲルハンス細胞の膵島溶液は、自家移植のための２０ｍＬ細胞溶液を得るために再懸濁して慎重に統合された。混合した細胞溶液中の肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比率は、このように、９：１の範囲であった。

２０マトリックスが多層プレート中に準備され、そして、１ｍＬの上記準備された混合された細胞溶液（１×１０⁶〜３×１０⁶細胞の総数を含む）は、その後、ピペットを使用してそれぞれのマトリックスへと適用された。この方法で処理されたマトリックスは、その後、細胞が接着することを可能とするために、細胞培養インキュベータ中に、１時間静置された。その後、ヒト血清で完成された他の１ｍＬの温められたウィリアム Ｅ メディウムを、細胞に対する追加供給として、多層プレートのそれぞれのウェル中に慎重にピペットで移された。マトリックスは、３７℃、５％ＣＯ₂及び９５％相対湿度にて、２４時間〜３６時間インキュベートされた。

マトリックス毎の細胞数は、マトリックス上の移植された細胞の接着比率を決定するために、インキュベーション後に決定された。接着比率は、３０％〜６６％の範囲であった。

移植の前に、マトリックスは、氷上にて約１．５時間維持されることができた。後の時間に移植が計画された場合、マトリックスは、５日間までバイオフローリアクター中にて標準条件下にて、保存することができた。

肝細胞の分泌活性及び増殖速度

ルイスラットは、同所性又は異所性の移植手順にて、実施例３に則して準備された細胞生着マトリックスが移植された。移植片は、一度、動物から、様々な時間で除去され、形態計測学的に調べた。直径１５ｍｍ及び厚さ２ｍｍを有する円形ディスクの形態を示した移植片中の細胞の数は、移植後、１、６、１２ヶ月において、それぞれ９４×１０³、１４０×１０³及び、１４６×１０³であった。

組織化学的（Histo-chemical）解析は、移植片上の細胞からアルブミン産生を証明した。分泌は２週間後に始まったことを見出した。移植後１ヶ月に除去された移植片からの肝細胞は、アルブミンの正常な発現を示した。増殖速度において任意の病理学的な増加がなく、全ての準備において増殖している肝細胞が見出された。本発明に従って移植された肝細胞は、標準の肝臓の調製のそれと比較して、３つの要素によって増加されたＢｒｄＵの取り込みを示した。移植後、肝臓の代謝活性が調べられた。

血管新生（vascularization）

実施例３にも則して調製されたマトリックスのさらなる検討は、これらのマトリックスは、移植後わずか１ヶ月に、各段によく血管新生されることを示した。血管は、マトリックスに対して巨視的に拡張し、移植された肝細胞及びランゲルハンス島細胞は、移植レシピエントの心血管系とともに十分な毛細血管化の結果として接触が達成された。

一緒に移植されたランゲルハンス島細胞は、レシピエントにおいて、低血糖のいかなる原因にも成らなかったことがさらに観察されることができた。これらの細胞、及び、レシピエント自身の膵島細胞の内分泌の分泌能力は、恐らくフィードバック機構によって調節された。

肝機能の採用

Ｇｕｎｎラットは、特定の先天性の代謝酵素欠損の結果として、それらの肝臓は適切にビリルビンを結合することができないので、ヒトクリグラー−ナジャール症候群の動物モデルであると見なされている。ゆえに、非抱合型ビリルビンの毒性血漿レベルは、実質的な障害の結果として死に導く。

三匹Ｇｕｎｎラットは、実施例３に則って調製された細胞が定着したマトリックスが移植された。マトリックスは、全１０ｃｍ²の外部領域を有していた。

実験動物のビリルビンレベルは、移植後わずか４週間で下落した。ビリルビンは、以降ずっと抱合型であった。全３ケースにおいて、まだ存在している肝臓の胆管において、胆管プローブを用いて、抱合型ビリルビンは検出することができた。結果として、マトリックスに結合させたビリルビンを肝臓に血行的に達し、胆管系の道によって、肝臓から除去される事が出来た。

Claims (13)

1. 組織工学用移植片であって、ランゲルハンス島細胞と肝細胞とを有する多孔質マトリックスを含み、前記多孔質マトリックスが、一次細孔を有する三次元の一次構造を形成する、第一の生分解性及生体適合性のポリマー成分を含むと共に、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びその混合物からなる群から選択される、該第一のポリマー成分とは異なる第二の生分解性及び生体適合性のポリマー成分をさらに含み、ここで、該第二のポリマー成分は、二次細孔を有する三次元の二次構造を形成し、該二次構造は、該一次細孔の少なくとも一部の内部空間内に含まれるものであって、
   ここで、肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比が、肝細胞約１×１０ ⁶ 対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜５００，０００である、移植片。
2. 該第一のポリマー成分が、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸−乳酸）及びその混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の移植片。
3. 該第二のポリマー成分は、コラーゲン、好ましくは、ゼラチンである、請求項１又は２に記載の移植片。
4. 該第一細孔は、１５０μｍ〜３００μｍ、好ましくは、２００μｍ〜３００μｍの平均孔径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の移植片。
5. 該二次細孔は、該一次細孔の平均孔径より小さい平均孔径を有し、５０μｍ〜２９０μｍ、好ましくは５０μｍ〜１５０μｍ、より好ましくは５０μｍ〜１００μｍの範囲である、請求項４に記載の移植片。
6. 多孔質基層及び多孔質細胞包埋層を含み、基層中の細孔の平均孔径が、細胞包埋層の細孔の平均孔径よりも小さい、請求項１〜５のいずれか１項に記載の移植片。
7. 基層の細孔は、１０μｍ〜５０μｍの平均孔径を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の移植片。
8. 少なくとも８０％の、好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは９５％〜９９．５％の多孔度を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の移植片。
9. 前記肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比が、肝細胞約１×１０⁶対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜１００，０００、好ましくは肝細胞約１×１０⁶対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜７０，０００である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の移植片。
10. 慢性肝臓疾患若しくは膵臓疾患並びに／又は慢性肝臓障害及び膵臓障害の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の移植片。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の移植片を調製するための方法であって、
    ａ．請求項１〜８のいずれか１項に規定された多孔質マトリックスを提供する工程、及び
    ｂ．該マトリックスの少なくとも一つの側の上に、肝細胞対ランゲルハンス島細胞の比が肝細胞約１×１０ ^６ 対ランゲルハンス島細胞２０，０００〜５００，０００で、肝細胞とランゲルハンス島細胞とを載置する工程、
    を含む、方法。
12. 該マトリックスは実質的に、約０．１〜１．０ｍｍの範囲の厚さを有するシートの形状であって、該方法は、さらに、
    ｃ．二層又は多層構造を得るために、細胞を載置したマトリックスを折り畳む工程、
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 工程ｂ）が、マトリックスの両側に細胞を載置することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。