JPH04501080A - 重合マトリックス上の大容量の細胞の移植方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 重合マトリックス上の大容量の細胞の移植方法発明の背景 これは、米国特許出願番号０７／３４３．１５８として１９８９年４月２５日に Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｖａｃａｎｔｉ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅｒ、 およびＬｙｎｔＪｏｈｎｓｏｎ、により出願された。タイトルが“重合マトリッ クス上の大容量の細胞の移植方法”の一部継続出願である。それは、さらに、米 国特許出願番号０７／１２３．５７９として１９８７年１１月２０日にＪｏｓｅ ｐｈ　Ｐ、ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅｒ、により出 願された。タイトルが“人工マ）　ＩＪフックス用いた。制御された細胞の移植 による臓器のキメラ新形態形成”の一部継続出願であり、すでに、放棄され、そ して再出願されている。

それは米国特許出願番号０６／９３３．０１８として１９８６年１１月２０日に Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、νａｃａｎｔ　ｉ、により出願されたタイトルが“人工マト リックスを用いた臓器のキメラ新形態形成”の一部継続出願であり、すでに、放 棄され、そして再出願されている。

本発明は、概して臓器移植に関するものであり、より詳しくは９重合マトリック ス上の大容量の細胞を患者に移植する方法である。

肝臓の重大な機能障害を引きおこし、最後には肝不全を引き起こす疾患は多くあ る。肝不全を支える人工的な方式がないため、移植がうまくいかないと、肝不全 はいつも患者に死をもたらす。合衆国では毎年３０．０００人が肝不全により死 亡すると推定されており２社会に対し毎年１４００万ドルの損失となっている。

これらの疾患のうちのいくつかはタンパク質代謝の欠陥や、アミノ酸代謝の欠陥 、炭水化物代謝の欠陥、ピリミジンやプリン代謝の欠陥、脂質代謝の欠陥、ミネ ラル代謝の欠陥をもたらす遺伝的欠陥を含有する。肝臓病にかかっている患者の 別のグループは、アルコールによって引き起こされる肝臓病の患者である。今日 、これらの患者には選択の余地はない。

過去５年にわたって、臓器移植は臓器不全を治療する方法として増々重要となっ てきている。不幸にも、様々な臓器。

特に肝臓の移植の今日の成功にもかかわらず、提供される臓器の絶対的な不足の ため、多くの人々が死亡している。移植の選択の余地のあるこれらの患者を治療 するための唯一の方法は、肝臓が、移植できるようになるまで彼らを維持するこ とである。

全肝臓の移植は、　１９８０年代、主に、　Ｏｒ、Ｔｈｏｍａｓ　５ｔａｒｚｌ の努力により、成功率が増加する外科手術となった。しかし９手術の技術的複雑 さ、多大な出血、猛烈な手術後の経過や、肝臓移植の多くの不知のため、移植は 大きな病院でしかできない高価な技術となっている。提供者の不足のため、移植 は。

それをめている患者の必要性にそぐわなくなってきている。

今日、およそ１年間に１５００人の患者が肝臓移植を受けている。

たとえ、その受容量が３倍になったとしても、末期の肝臓病で死につつある３０ ．０００人の患者には及ばないであろう。

臓器移植の非常事態と、免疫生物学の科学とが腎臓、心臓。

肝臓および他の臓器の置換を可能にした。しかし、これらの複雑な操作を行うた めの能力が向上してきたので、その技術の限界がより明白なものとなってきた。

手術は複雑であり。

通常、多大な出血をともなう。保存期間が短いため、受領者と、遠くはなれた提 供者とが適合した場合、主に問題となる。

これらの理由のため、それを行うことは高価で、集約的な作業であり、第３の治 療施設でのみ使用できる財源の出資を主に必要とする。

失われた機能の置換に必要な、それらの実質組織の成分のみの選択的な細胞移植 が、全体あるいは２部分的な臓器移植にかわるものとして提案された。これは、 それに付随する出血や麻酔の困難さと合併症を伴う主流となっている手術をさけ ることを含むいくつかの魅力的な特色を有する。それは要求される機能を与える それらの細胞のみを置換し、それゆえ。

拒否作用を誘発するかもしれない通過する白血球、抗原を提示する細胞、そして 他のタイプの細胞にともなう問題を回避することができる。細胞培養の技術を加 えることは、移植プロセスにおいて助けとなる別の道具を与える。培養中に、細 胞の増殖を伴う細胞の数を広げる技量は、理論上、自分自身の組織の自己移植を 可能にする。

近年、多くのグループが、生体内において直接細胞を移植するのと同様に移植に 用いるための試験管での細胞の育成のための様々な方法の研究と開発に従事して いる。このような努力のほとんどは、いったん移植された細胞が、移植し１機能 をもつことが出来ないという問題に相応する限られた成功のみに遭遇してきた。

Ｍａｒｒｏｗ−Ｔｅｃｈ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　による１１ｉ０８７１０ ６１２０では９間質細胞をまいたナイロンメツシュ上の骨髄細胞のような試験管 内の細胞の育成の成功について述べている。

Ａ、Ａ、Ｄｅｍｅｔｒ　ｉｏｕらは、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．　１１９０− １１９２　（１９８６）で、腹膜腔に注入した。コラーゲンをコートしたマイク ロキャリアービーズに付着させた肝細胞の移植と機能について述べている。他は 、膵臓組織を糖尿病患者に、　ｉｎ　ｖｉｖｏで直接移植している。長期にわた る効果を達成できなかったより初期の試みは９分離した高細胞のかたまりを肝臓 の脈管床での移植を伴う門脈循環中に注入することによる高細胞の移植であった 。より最近の実験的な方法は、宿主の免疫攻撃を回避するために、膵臓ベータ細 胞をカプセル化したり、胎児のベータ細胞を腎臓の莢膜内に入れ注入するという 方法を包含している。短期間の機能の実証があるにもかかわらず、長期間の結果 は、満足できるものではなかった（Ｄ、　Ｅ、　Ｒ，５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ。

が好ましい治療のままであった。

米国特許出願番号１２３．５７９．そしてＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｖａｃａｎｔｉ およびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅｒ、　により１９８７年１１月２０日に 出願された。

タイトルがＣｈｉｍｅｒｉｃ　Ｎｅｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒ ｇａｎｓ　ｂｙＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｐｌａｎｔａｔ ｉｏｎ　Ｌｌｓｉｎｇ　ＡｒｔｉｆｉｃａｌＭａｔｒｉｃｅｓ”と２米国特許出 願番号９３３．０１８　としてＪｏｓｅｐｈ　Ｐ。

Ｖａｃａｎｔ　ｉ、により１９８６年１１月２０日に出願された。タイトルが” Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｎｅｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｓ　 ［Ｉｓｉｎｇ　ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＭａｔｒ　１ｃｅｓ”において、様々なタ イプの細胞を生体内に移植し。

脈管新生化する前に、試験管内で、増殖させつる方法と、マトリックスを開示し ている。両方の方法とマトリックスの主たる原理は、まいた細胞間に脈管新生化 がないために必要な栄養の十分な分散と、培地のまわりからのガス交換のための 十分な空間を与える３次元的な支持体構造である。

（以下余白） しかし、この方法でさえ、まだ、特に合併症を引きおこしつる傷を生ずる手術に より、患者に、肝細胞、膵臓、や他の内分泌細胞のような細胞の細胞塊の移植が 必要である。

さらに、細胞を増殖させ機能させるためには大容量の細胞を移植する必要がある 。

それゆえ１本発明の目的は様々な臓器、特に、自然に生じる臓器に機能的に似て いる。肝臓、膵臓、副腎を含む内分泌臓器を形成するために大容量の細胞を移植 する方法と手段を開示することである。

本発明のさらなる目的は１機能的に臓器と同等のものを形成するため生物的に分 解可能で、毒性のないマ）　ＩＪソックス上大容量の細胞を、移植する方法を提 供することであり、それは従来の外科的方法と比べて、比較的非浸聾的で外傷性 の方法を与えるものである。

発明の要約 本発明は、所望の機能を持った大容量の細胞を９重合体の土台に付着させ、最小 の傷と出血で、土台上の細胞が１着床し生育し９機能することにより１機能的に 臓器と同等のものを形成するのに適した部位で、患者に移植するための方法と手 段を示したものである。この方法は、多くの同等の、あるいは異なったマトリッ クス上に細胞をまき９次いで組織間にｉｎ　ｖｉｖｏの状態でマｌ−ＩＪソック ス移植し、移植された細胞が脈管新生がなされなくとも、しかし、要求される機 能を与えるのに十分多量の細胞状態で十分な栄養とガス交換が与えられるごとを 包含している。

その方法は、肝臓、膵臓、および副腎を含む内分泌組織体の生育に特によく適合 しており、他のタイプの組織の生育と機能にも用いることが出来る。

好ましい実施態様においては９種付けしたポリマーシートを腸間膜のひだの間に 設置する。移植後、血管が内部へ成長することにより、移植した細胞の可溶性産 物を制御する通常のフィードバック機構が備わるまで、門脈循環よりのびる血管 は、拡散により移植した細胞に、栄養や通常の代謝因子を供給する。マトリック スあるいは支持構造体を形成するために好ましい材料は生物的に分解され得る人 工の重合体であり。

それ単独で、あるいは、非分解性の支持構造体と組み合わされて制御された割合 で加水分解により分解され、吸収される。

分解可能の材料は分解性、操作性、大きさ、そして形状の最大限の制御を備えて いる。さらに、細胞を移植する前、あるいは、同時に、移植部位を下調べする際 に使用する目的に血管新生因子のような材料を１分解可能なマトリックスに混合 することが出来る。

培養により細胞を最初生育させることにより、マトリックス細胞構造体の移植の 後、有用となるであろう細胞に、取り扱い性と貫生増殖性を与えるが、もし１種 付けのために十分な細胞が、生検により得ることが出来れば、その必要はない。

腸間膜のひだの新しい組織の薄層と、フェルト状のシートの重合体−肝細胞構築 物を交互にしたものを用いた移植法の検討が２００匹のラットになされた。重合 体上にのっている培養中の肝細胞はラット当り３０００万から６億個の細胞数で あり。

平均は、ラット当り６０００万から１億個の細胞数であった。１５０ｇのラット は、細胞をのせた３６ｃｍ２の重合体材料（ＩＸ３ｃｍ×２０厚、　５００，０ ００細胞／ＣＩ＋１２で種付けした８枚のシートで。

ＩＸＩＸａωの移植組織を生ずる）を受け入れることができる。融合は、事例の ９６％で達成された。５日から１０ケ月にわたる組織学的分析により、新しい血 管の着床と、肝細胞の温床とかたまりが９組織学的に正常に生じていることが明 らかとなった。６２日目にアルブミンに対する免疫蛍光染色を用いて、肝臓特有 の機能が、　ｉｎ　５ｉｔｕで示され１機能の部分的な入れ換えが、グルクロニ ルトランスフェラーゼの欠員を基準とするＧｕｎｎラットで観察された。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、成人の側断面図であり、小腸と腸間膜を含む上部および下部胃腸管の 様々な構成成分を示している。図１Ｂは、小腸の腸間膜の、前からみた予想図で ある。

図２は、腸間膜に伴う循環系の静脈の図である。

図３Ａと図３Ｂは、腸間膜のひだの間に置かれた。細胞を図４は、ポリマーシー トの挿入の結果生じるキメラ構造体の図であり１図３に示したように９本発明に よる細胞マトリックスキメラ構造体を形成するように、ゆるく９合わさって接近 している。

図５は、２００〜５００μｍ厚の範囲の厚さをもつ、スポンジ状のマトリックス の断面のフリーズフラクチャー図である。

図６Ａは、移植部位の低倍率図を示している。右と左の端はもともとの腸間膜の ひだであり、細胞重合体構造物は、ひだの間に見ることが出来る。重合体材料は 、それぞれの繊維のまわりに巨細胞による異物反応を示す。間質にもぐり込んで いる軽い炎症性の細胞がある。生育し得る肝細胞の、小さな巣とかたまりが、移 植体のいたるところにみられ、新しい血管の新生が、いたるところで存在してい る。図６Ｂは、肝細胞の巣が、明らかに、腸間膜のひだにぴったりとくっついた 移植体のふちの部分に選択的にみられ、血液の供給をともなっていることを示し ている高倍率図である。肝細胞は、また１重合体繊維には付着しておらず、設置 されたマ）　ＩＪソックスけでなく、細胞それぞれに付して１選択的な接着性が 生じていることを示している。コラーゲンの堆積に関与する付随性の線維芽細胞 反応がみられる。

図７Ａは、腸間膜に移植された。ＧＨＬを含む重合マトリックスの写真である。

図７Ｂは、腸間膜に移植された。ＧＨＬを含まない重合マトリックスの写真であ る。

発明の詳細な説明 患者に、最小の傷で、大容量の脈管組織の移植を可能にする方法は、多重に種付 けした重合マトリックスが、ある組織と近接でき、生育と増殖のための栄養とガ スの十分な交換がなされつるという発見にもとづいている。腸間膜や網のような １組織は、広い表面積を有しており、血管も多くある。

細胞マ）　ＩＪソックス造体の方法と移植部位：腹膜は、腸腔と腸腔内の多くの 臓器をおおっている非常に希薄な膜である。”腸間膜”とは１通常、小腸の腸間 膜をさし、腹膜が二層におりたたまれたもので後部腹壁から、小腸をつり上げて いる。腸間膜の付着しているへりは、たった約１５印の長さで、おおよそ第２腰 椎骨下方から右方向へ、十二指腸、大動脈、工大静脈の一部を横切り右仙腸骨関 節の方へのびている。自由な、あるいは、付着していないヘリは、空隔９同腸を ふくみ、アコーディオンのようにひだになっており、３〜６ｍの長さに達する。

自由なヘリと、付着しているヘリの距離は１５〜２２ｃｍの長さの範囲にある。

腸間膜の２つの表面上の、腹膜の二層の間には、上腸間膜動脈と、その支流、付 随する静脈、リンパ管、リンパ節、結合組織、そして、様々な量の脂肪組織があ る。図ＩＡと図ＩＢに、腸間膜を断面からみたところを示しである。図ＩＡを参 照すると、腸間膜１０は、上部１２．下部１４腸間膜動脈に結合しており、小腸 １６に血液を供給している。図ＩＢを参照すると、腸間膜１０は、小腸１６まで 、外側にむかって扇のように広がっており、上部腸間膜動脈１２は上部腸間膜静 脈に注ぎ込んでいる。図２に示しであるように、下部腸間膜動脈２０は、牌！１ １２２．冠状および幽門静脈から血液を排出している。上部腸間膜静脈１８は、 門脈静脈に注ぎ込んでおり、肝！１ｉ１２６につづいている。移植後、血管が内 部に成長することにより、移植した細胞の可溶性産物を制御する通常のフィード バック機構が備わるまで門脈循環から来る血管は、栄養や９通常の代謝因子を拡 散により移植した細胞に供給している。

網は、胃に付着した腹膜が二重におりたたまれたもので。

腸を含む他のいくつかの臓器と胃をつなげている。腹膜の他の区域と、同様の特 徴をもつ分離された組織もまた大容量の細胞を移植するための９本方法に用いる ことが出来る。

図３と図４に概略的に示しであるように、細胞−重合体キ成され、その細胞は、 患者、あるいは近親者より生検で、あるいは細胞培養より得られ、腸間膜１６の ひだ３２の間に、細胞を植え付けたマトリックスを移植する。腸間膜のひだ３２ は、キメラ構造体３４を形成するように、−緒に近づけられている。

マトリックス材料の選択： マトリックスあるいは支持構造体を形成するのに好ましい材料は、生物的に分解 可能な人工の重合体で１例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルジエス テル、ポリ無水物。

それらの混合物あるいはコポリマーで、それ単独で、あるいは、非分解性の材料 と結合させた形で制御された割合で加水分解され吸収されるものである。

生物的に分解可能な材料は９分解性、操作性、大きさ、そして形状の最大限の制 御を備えている。しかし、コラーゲンや生物的に分解出来ない材料を含む、他の 生物的に共存出来る重合材料を、構造体形成に使うことが出来る。

分解不可能な、あるいは、吸収不可能なものの例としては。

ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート　（Ｄａｃｒｏｎポリエステル） や他のポリエステル、テフロン、エチレンビニールアセテート、ナイロンやステ ンレスが材料として挙げられる。ナイロンは、一定に水和し１分解するがゆっく り変化するため好ましくない。ステンレスのフィラメントは、製造するのがむづ かしい。ポリプロピレンおよびポリエステルは。

ＦＤＡが構造体材料や、他の移植体の成分として認可している。

これらは、モノフィラメントや、つむぎ糸、あるいは様々な直径の繊維に加工し やすい。両材料とも９組織との反応の程度はとても低い。

いくつかの実例において、これらの材料は、基底膜成分。

アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニ ングリコサミノグリカン、これらの混合物、あるいは、細胞培養の専門分野でよ く知られている細胞付着性を増大させる生物学的マ）　ＩＪラック分子と同様の 特性をもった他の材料の第二の材料に重層されている。これらの材料はまた。ア フレブミンの生産を含む肝臓に特異的ないくつかの機能を長もちさせ、維持させ ることが出来る。細胞外ゲルマトリックス（ＥＨ３）を用いた先に行われた研究 ではこの材料をコートした重合体上で培養した肝細胞は、少なくとも２つの代表 的な肝臓に特異な遺伝子、アルブミンとα−】−インヒビター３を高率で転写し つづけることを示している。

同じ状態下での細胞骨格の遺伝子の転写は低い。

核ｒｕｎ−ｏｎアッセイにより決定された両方の度合は１通常の肝臓に類似して いる。さらに、肝臓特異的で、細胞骨格遺伝子に関するｍＲＮＡが多いという異 常なパターンはＢＨＳ上では否定されている。コラーゲンの、縫合糸や移植体と しての使用は、　ＦＤＡより認可されている。いくつかのコラーゲンはまた。

ある場合には好都合であろう血管新生と、線維形成を誘導する。

細胞分化と生長は、付着部位の密集度を変えることにより制御することが出来る 。付着部位の密集度は１重合支持材料の選択、あるいは化学修飾により、あるい は、あらかじめ決めていた付着分子の数で基質をコートすることによって変える ことが出来る。たとえば、高いｐＨの炭酸緩衝液が、ラミニンやフィブロネクチ ンのような精製された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を重合体基質上に吸着させ るのに用いられる。低密度の精製されたＥＣＵ　（１〜５０ｎｇ／ｃｍ２）に付 着した肝細胞は、丸い形態と、肝細胞特異的タンパク質（アルブミン、トランス フェリン、フィブリノーゲン）の高い分泌率と、低い割合のＤＮＡ合成を有する 。この制御は、用いた８０Ｍ分子にはほどんどよらないが、用いた特定の８０Ｍ 分子に依存して１分化に多少の影響をおよぼす。

生物的に分解可能な材料の主たる利点は、いったん、細胞の成長と１機能群の形 成が起こっても、除去する必要がないということである。生物的に分解可能な材 料の別の利点は。

マトリックスの分解の間にゆっくり放出されるため、マトリックス内へ化合物が 取り込まれるであろうということである。

例えば、血管由来の化合物、栄養、生長因子１分化あるいは脱分化の誘導物質、 免疫モジュレータ−９炎症の阻害物質。

退化因子、リンパ系のネットワーク、あるいは、神経線維の内部への成長を増大 させる。あるいは、可能にする生物活性化合物、および薬剤、を溶液中で、ある いは、第２の生物的に分解可能な重合マトリックス中に取り込ました形でマトリ ックス中に混入することが出来るし、あるいは、マトリックスと結合させた形で 与えることも出来る。

マトリックスの形状： 好ましい実施態様においては、繊維からなるシートより構成されている。複合重 合マ）　ＩＪフックス、腸間膜中の新しいベッドあるいはあらかじめ血管新生さ せたベッドへ数ミクロンから数センチの間の広がりを有する構造体を形成するよ うに、挿入されている。マ）　ＩＪフックス、移植と９機能臓器体の形成に必要 な細胞数を有するアタッチメントに対して十分な表面積が必要であるということ と、付着した細胞それぞれに必要な栄養とガスがマトリックスの内部にまで拡散 するために、アタッチメントの表面間に十分な空間が必要であるということを考 慮して、様々な形で作られつる。後の要求性は。

米国特許出願番号１２３．５７９として、　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｖａｃａｎｔ ｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｉ、ａｎｇｅｒにより１９８７年１１月２０日に 出願された。タイトルが、　”Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｎｅｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅ ｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｓ　ｂｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ 　Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｍａｔｒｉ ｃｅｓ”と、米国特許出願番号９３３．０１８としてＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｖａ ｃａｎｔｉにより１９８６年１１月２０日に出願された。タイトルが’Ｃｈｉｍ ｅｒｉｃ　Ｎｅｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ＯｒｇａｎＳＩＪｓｉｎ ｇ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｍａｔｒｊｃｅｓ’に述べられているように、多く の比較的うすいマｌ−ＩＪフックス用意し、腸間膜のひだの間に、それぞれのシ ートを移植することにより、あるいは、栄養物の同じ容量の細胞への最大の拡散 距離よりも大きい広がりを持つマトリックスを用意することにより可能となる。

この教示内容はここでも取り込れられている。

好ましい実施態様では、マトリックスは、性状としては繊維状である。これは、 波うっていないフェルト状のメツシュから９重ねたあるいは、１本の繊維をまい たスポンジ状の構造体の間で変動しつる。マトリックス構成成分の１合成体。

補強材（あるとすれば）そしてコート剤の３つの主な変動に加え、繊維の直径、 繊維の密度９編まれた構造体、そして。

繊維がクロスオーバした融合体、あるいは９編みこまれたものを含む変動を考慮 しなければならない。乾いた。あるいは湿った状態での圧縮性能吸収されやすい 成分が取り除かれ（吸収されやすいものと、吸収されにくい材料とが混合されて いる場合）た後の圧縮性能、被破壊力、縫合糸のひっばり強度、コラーゲンの配 分、そして顕微鏡によってｉｎ　ｖｉｔｒｏでこれらのマトリックスの特性を明 らかにすることが出来る。

繊維の材料は、縫合糸や波うっていないフェルト状の材料として購入することが 出来る。適したマトリックスはまた。

専門分野で知られている溶剤投入１回転投入、あるいは、押出（−１あるいは同 様の方法のような標準的な技術を用いて形成することが出来る。有効なフェルト 状の材料はＤａｖｉｓ　＆　Ｇｅｃｋより得られる。様々な生物的に分解可能な 重合体よりなる。

これらのタイプの織物は、多くの医療に応用され、おおよそ１／３から１／２鵬 の厚さにした場合、よい組織像と、血管の内部への成長を示す。

スポンジ状の繊維材料は、濾過可能な粒子を含む重合体溶液を溶剤に投入するこ とにより作られる。例えば、　ＰＬＡ／ＰＬＧＡ重合体は、濾過することにより 、大きさを７５から１５０μｍにしたＮａＣ］粒子を含んだ状態で投入されてい る。マトリックスは、塩化メチレン１０ｗｔ％の溶液から、ガラスのベトリ皿に 投入され、溶剤は、気化させた塩化メチレンのもと、室温で蒸発させる。ポリ　 （口Ｌ）乳酸１分子量５０，０００　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＤｕｐｏ ｎｔ　Ｍｅｄｉｓｏｒｂ　８５：１５の５０１５０　ｗ／ｗブレンドが、均一性 と有孔性という点で、良好な結果を与える。これらの材料は。

厚さは２００〜３００μｍである。このタイプのマトリックスの走査型電子顕微 鏡写真の例が図５に示されている。スポンジ状の構造体の孔サイズ、あるいは、 織物のすき間の空間は血管の内部への成長に最適であるためには１００〜２００ μｍの間になることが必要である。

スポンジ状のマトリックスはまた。　Ｄａｖｉｓ　＆　Ｇｅｃｋのポリ　（グリ コール酸）メツシュを、ポリ　（乳酸）、あるいは、ポリ（乳酸）やポリ　（グ リコール酸）のコポリマーのような重合体溶液中につけることにより作ることが 出来、第２の重合体。

しかしポリ　（グリコール酸）ではない用には、塩化メチレンのような溶剤中に 重合体を溶解させる。第２の重合体は、ポリ　（グリコール酸）メツシュの圧縮 強度をかなり上昇させ。

細胞を付着させるための平たんな表面をがん強にする繊維間に”メニスカス”を 形成する。好ましい具体例では、　ＰＧＡ織物は、２から２０重量パーセントの ＰＬＡ：ＧＡ　８５：］、５の塩化炭素中の溶液に浸されており、余分な重合体 溶液は吸い取られ、マトリックスは、乾燥される。この方法は、どのような生物 的に分解できる重合体、あるいは、第２の生物的に共存でき。

生物的に分解できる重合体溶液中で不溶性の基質に応用出来る移植される細胞の タイプと同様に移植されるマトリックスあるいは、マトリックスの表面積は、レ シピエンドの大きさに基づいて決定される。ラットに移植する細胞の平均は、ｌ 動物当り、６千万から１億細胞の間である。これは１表面積がおおよそ３６ＣＯ １２の重合体マｌ−ＩＪフックス用いて移植される。

７０Ｋｇの成人に移植するのに用いることが出来る腸間膜の利用可能な表面積は ２．６８ｍ”と計算される。Ｃｍ”当り７００．０００細胞の範囲での細胞密度 で用いることは、成人当り１０９細胞、これは、成人の肝臓の大きさの１０％に 当たる、の移植を理論的に可能にする。

細胞−マトリックス構造体の移植に先たつ移植部位の下調べ：発明の別の実施態 様では、１つあるいは、それ以上の１例えば、血管新生前の部位には血管由来の 化合物を用いているようにこれらの生物的に活性な化合物を含むマトリックスを 。

移植部位の下調べを行うために、細胞をまいたマ）　ＩＪソックス移植に先立っ て１組織中へ移植している。

（以下余白） 細胞の選択とマトリックスへの付着： 様々な分化した細胞を、マ）　ＩＪフックス上植え付けることが出来る。好まし い実施態様では、肝細胞、膵臓細胞あるいは副腎線の細胞のような内分泌腺細胞 が、マ）　ＩＪフックス上増殖している。視床下部や脳下垂体細胞を含む神経系 の細胞。

繊維芽細胞、内皮細胞、そしてリンパ細胞のようなリンパ系の細胞、中胚葉細胞 、そして泌尿生殖器系の細胞９例えば。

腎臓内分泌組織や、性に関係している内分泌組織のような他の細胞もまたこの方 法を用いて移植することが出来る。

内分泌細胞に関しては、細胞は腸間膜内の多重マトリックス上に位置しており１ 本方法では、肝門と組織系の間で１通常受けとっている臓器が供給する血液に非 常に近接した形で。

これらの細胞を血流内においている。このことは、細胞を通常の成長と増殖にお いて助けとなる。血液中に存在する多くの因子にさらしている。

一つあるいは、それ以上のタイプの細胞を選択し、マトリックス上に成育させる ことが出来る。マトリックスの構造とｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞が培養されるもと ての時間の長さと状態は。

細胞の付着（生きている細胞だけが重合体に付着した形で残っている）増殖の程 度、そして、うまくいった植えつけの割合を測定することによって、それぞれの 細胞のタイプに対する個々の原理に基づいて決定される。上で討議したように。

移植の前に、十分な数の細胞が得られるならば、細胞をマトリックスに付着させ る目的以外に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞を培養させる必要はない。細胞は通常、 数時間以内で付着する。メツシュに細胞を付着させるもっとも効率的な方法は、 濃縮した細胞懸濁液を疎水性で、細胞懸濁液を、約３０分以上かけて。

織物内へしみ込ませるポリマーの表面上に置くことである。

細胞は、はとんどがばらばらで、あるいは、また、２つか３つのグループで繊維 に付着する。初めの２４時間以内に、細胞はかたまりに再構成し始め、この時点 で、単一の繊維をぐるっとつつみ込むことにより繊維と、かなり接触している細 胞もみられる。３日以内に、細胞は、はとんど完全に、大きなかたまりや細胞の 集団に組織化され、はとんどがお互いに接触するようになり、繊維支持体とは接 触しなくなる。

細胞は、生検や、トナーからの手術による摘出、あるいは。

確立された細胞系より得られる。細胞の分離の方法は知られているが、細胞系や 細胞源に対しては、最適化される必要がある。例えば、肝細胞は、コラゲナーゼ のような酵素を用いたり７機械的に分離し、そして、あるいは、エチレンジアミ ン四酢酸（ＥＤＴＡ）やデトラフェニルホウ素のようなキレート剤で処理し分離 される。

ある場合には、細胞−マトリックスルを移植した後に、移植した細胞の生存能力 を高める目的で、シクロスポリンのような免疫抑制剤を投与することが有効であ る。このことは。

ラットの肝細胞をウサギに移植した場合に示されたように。

異種移植の場合には、必要不可欠であり、肝細胞を、酵素的に欠損のあるＧｕｎ ｎラットに移植した場合に示されたように。

同種間の移植でも有効である。

最初、培養により細胞を成長させることは、続くマトリックス−細胞構造体の移 植に適した細胞操作を可能にする。現在利用可能な技術は、遺伝子を細胞内に導 入することを可能にし、脳胞性線維症のようなために生ずる肝臓タンパク質の欠 乏や代謝の欠損のためにそうしないと存在しないであろうタンパク質の生産を行 わしている。遺伝子の発現を抑制することはまた。細胞表面上に生じる抗原を変 化させ、それにより、免疫応答を変化させることにより、細胞は、異物とは認識 されない。

本発明は９次に続く、制限されない実施例を参照することによりさらに理解され るであろう。

実施例１：腸間膜のマ）　ＩＪソックスの移植のためのｈｅｐａｔ、ｏｃｙｔｅ ｓＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　１９７６）に採用されて いるＢｅｒｒｙ　ａｎｄＦｒｉｅｎｄ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　４３．５ ０６−５２０　（１９６９）の方法を、生存性のみならず、　ｈｅｐａｔｏｃｙ ｔｅｓの収率を最適にするために以下のように改変した。

ポンプ、オートクレーブ可能なシラスチックチューブ、ウォーターバス、及びエ アートラップを用いて肝臓を分散させた。分散用緩衝液の空気泡を取除くべく設 置されたエアートラップは当システムでは非常に重要な部分である。肝臓は。

イン　シチューかあるいは体より摘出後に分散させることができる。可能ならば 、イン　シチューでの分散が望ましい。

イン　シチューでは、肝臓が９分散の両ステップで、腹腔中に残り、コラゲナー ゼによる分散を引き続いて行うことだけが、初期細胞培養へと分散させるために 、外科的に取り除く。

コラゲナーゼの分散剤の再循環はない。

初期の分散用に、　Ｓｅｇｌｅｎ　）ＩＥＰＥｓベース初期緩衝液、　ｐＨ７， ４を用い９次のコラゲナーゼによる分散には４．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２を 含む同緩衝液を用いると、最適な結果が得られる。緩衝液による分散で、肝臓に 由来する血液やカルシウムを洗い落とす。ラットの肝臓では、５−６分間で充分 である。第２ステツプは、細胞に対して過剰な損傷を与えない範囲で肝臓の良好 な解離を与えるのに充分長く続けなければならない。一般的には、供与者の年齢 や体重及びコラゲナーゼ活性に応じて変化はあるが、ラットの肝臓を用いた時に は、５−１０分間が第２ステツプでは最適である。カニューラの出口温度が３５ −３６℃であるためにウォーターバスの最適温度は３８−３９℃である。これら の条件では、−貫して、細胞生存率が８５−９５％で。

５００−７００　ｘ１０５細胞／グラム肝臓の細胞を得る。

コラゲナーゼによる分散を用いてＦｉｓｃｈｅｒ３４ラットとＧｕｎラットより ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓを得た。サイズが１Ｘ３ｃ＋ｎ、厚さが２ｍｍのポリガ ルコール酸の不編性の繊維のシートに、　５００．０００細胞／ｃａｆとなるよ うに細胞を注いだ。受容動物に無菌操作で開腹し、腸間膜葉の間にシートを置い た。動物あたり８枚のシートを置き、膜葉を接近させて９機能を有する移植組織 ｌＸｌＸ３ｃｍとなる。

組織移植後５日めに行った生体組成切片鏡検で、新生脈管が生じ、適度な炎症反 応と生存しているｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの存在していることが明らかになった 。

この実施例は、最小の外傷と血液の損失で、多重のポリマー状のシートを幾重か の腸間膜に置くことにより、多量のｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの有効な組織移植を 開示している。当細胞はふつうは、ポリマー状の支持体がなければ生存性を示さ ないものであり９機能を有する器官に等価なものを形成するのに充の皮膜化の比 較 移植を成功させる重要な因子のうちの１つは、移植用の細胞を保持する骨格或い は装置の構築のために、適切な材料を選択することである。材料は生体に適合で きるものであるべきである。

細胞接着のための有意な表面積を供するような表面積と体積の高い比率を持つ多 孔性の３次元性の装置へと仕上げられる特徴を持つべきである。結果として生じ た装置は、移植の際の崩壊をなくすべく充分な圧縮強度を有していなげらればな らない。材料は、移植する細胞に対して粘着できる基質でなければならないし、 また細胞による分化した機能を保持することについて、そしてできれば細胞増殖 についても同様に。

理想的に考慮しなければならない。

合成ポリマーは再現性良く製造でき、良好な機械特性を持つ。さらに９分解可能 なポリマーを使用することで、長期感染や外来性の肉体による反応を除外すべき である。これらの感染や反応は、移植した細胞が適切な組織の構成物へと成って いくことを阻害するであろう。

生体適合性、生分解性及び成型能の見通しから、ポリラクチド（ＰＬＡ）中のポ リエステル、そしてポリラクチド−グリコリド（ＰＬＧＡ）共族が多くの理想的 な特徴を持っている。興味のある相互作用のパラメーターは、細胞接着、持続性 及び分化した機能の保持性である。接着性は望ましい。というのは。

ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓは足場依存性であり、また非接着性細胞は移植部位に接 したところにとどまりそうにはない、からであり。

細胞は基質に接触し、生存したままであることも望ましい。

接触期間に接触部位が分解されないことが望ましい。インビトロでの機能を持た せる素地はインビボで機能を有するための最適な素地である。細胞の機能性生命 は、もし必要であれば、細胞外マトリックスタンパク質でポリマー状の素地を被 うことにより、変えることができる。

溶剤鋳型のフィルムの型で基質を作成した。そして２つの異なる成分より成るフ ィルムについて調べた。１組のフィルムをモノマーで、ラクチド：グリコリド比 ８５　：　１５　（ＤｕＰｏｎｔ。

Ｍｅｄｉｓｏｒｂ　８５：１５．分子量平均４０−１００．０００）からなるポ リ（ＤＬ−ラクチドー共存グリコリド）作成し、別の組のは、　Ｍｅｄｉｓｏｒ ｂ８５：１５とポリ　（Ｌ−ラクチド）　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍｗ 　５０．０００）の混合物（５０１５０Ｗ／Ｗ）より作成した。

塩化メチレン（Ｍａｉｌ　１ｎｋｒｏｄｔ、分析試薬品質）中に、新しく調製し た１５％ポリマー溶液から、　５０ｍｍ直径のガラス製ペトリシャーレ皿中でフ ィルムを成型した。各フィルムは０．４ｇｍのポリマーを含んだ。フィルムを含 む血を、ペトリシャーレの蓋で覆い、溶剤を室温で最小の５時間で蒸発させた。

残存している溶剤を除去するために、　２４−４８時間真空下にフィルムを置い た。フィルムを殺菌の目的で、９０分間、Ｕｖ光にさらし、使用前に乾燥状態で 保存した。５−のリン酸緩衝液−食塩水（ＰＢＳ、　ｐＨ７，４）で１度洗浄し 、続いて５ｍｆの完全な培養用培地で１度洗浄することにより、フィルムを培養 用に調製した。対照用ペトリ皿（３５＋ｙｕｎ細菌学用、　Ｆａｌｃｏｎ　＄１ ００８）を。

５０ｍＭ炭素緩衝液（ｐＨ９，４）中５ｕｇ／−のＶｉｔｒｏｇｅｎ溶液で、１ ６−２０時間、４℃で吸着させて、ＴｙｐｅＩコラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ。

ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃａｒｐ、）で覆った。生じたコラーゲンの表面濃度は１ａ ｇ　／　ｃａｆだった。

細胞を、改変したＳｅｇｌｅｎ、　Ｐ、Ｏ，、Ｍｅｔｈ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ 、、　１３゜２９−８３　（１９７６）の２段階コラゲナーゼ法を用いて、　１ ８０−２５０ｇｍの雄性のＦｉｓｈｅｒラットより単離した。肝臓を、　Ｃａ” フリー分散緩衝液（１４３［１１Ｍ　ＮａＣ１，７ｍＭ　ＫＣＩ、　１０　Ｍｍ 　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，４）で最初に内方向で分散させ、続いて５　ｍＭｃａ ｃｌｚと０．５ｍｇ／ｍｆコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｃ１ａｓ ｓｎ）を含む分散緩衝液で肝臓が柔らかくなるまで分散した。完全に科学的に同 定されている無血清培地Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｅ中に分散させた。Ｗｉｌｌｉａ ｍ’ｓ　Ｅ培地は１０％ｇ／ｒ１１１のＥＧＰ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　２０ｍＵ／ｍｊｌ！インシュリン（Ｇｉｂｃｏ）　、 　５ｎＭ　デキサメタシン（Ｓｉｇｍａ）、　２０ｍＭピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ ）そして１０００／ｍ１　ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇ　１ｂｃｏ）　 ／　（ＭｃＧｏｗａｎ）を含む。分散後の細胞の生存率は、トリパンブルー排除 を用いて８０−９０％と決定した。

死細胞とデブリを等密度パーコール溶液（Ｋｒｅａｍｅｒ、　Ｂ、Ｌ、　ｅｔａ ｌ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ、　Ｄｅｗ、　Ｂｉｏｌ、、　２２（４） 、　２０１−２０７　（１９８６））中での遠視分離により除き、生じたペレッ トを、細胞を移植する前に完全に培地で３度洗浄した。ブレーティング時の生存 率は８８−９８％だった。

ルーチンな培養用に、細胞を３０．０００生細胞／ｃａｆ培養表面積の濃度（３ ００，０００細胞／デイツシユ、コントロール用ディツシュ、　６００，０００ 細胞デイツシユ、　５０ｍｍポリマーフィルム；１５０、０００細胞／ｍｆ）で プレートした。２〜４時間の接着時間（全ての基質への最大の接着は９０分以内 に起こった）を経てから、未接着の細胞を除去するために培地を変えた。そして 細胞を、毎日培地を変換することで無血清培地中に保持した。

基質への細胞の接着は、直接計数か相対タンパク質濃度を決定することに測定し た。直接計算には、細胞を０．０５％トリプシン／　ＢＤＴＡ　（Ｇ　ｉ　ｂｃ ｏ）を用いて基質よりはがした。コラーゲンで被った基質上にプレートした細胞 は、適当な細胞の分散を得るために、より長い（３０−４５分）トリプシン処理 を必要とした。そしてプレートを、全ての細胞が基質よりはずれたことを確かめ るために計数前に視覚的に調べた。多量のプレート上の細胞数を同時に決定する ために、要素フラビアン酸（ＮＹＳ、　Ｓｉｇｍａ）の定量的結合と抽出を用い た（（Ｓｋｅｈａｎ、　Ｐ。

およびＳ、Ｊ、Ｐｒ１ｅｄｎａｎ、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ、　Ｄｅｖｅ ｌ、　Ｂｌｏ１９．２Ｈ５）。

２８８−２９０　（１９８５））。２つの異なる濃度（３００，０００及び６０ ０．０００細胞／プレート）でプレートした細胞の反応と同じ濃度で蒔いた同じ プレートを計数することにより、細胞数の計数を行って分析した。各点では３度 繰り返して測定した。

細胞接着頻度を、　３００．０００細胞／ＣＩ＋？表面積でレプリカプレートに 蒔いて計数した。各時間点で、３つのプレートを、　ＮＹＳ色素結合分析による 細胞の計数に用いるために犠牲にした。

高細胞濃度（５００，０００細胞／ｃａｆ）で細胞接着上の死細胞から遊離する 細胞外ＤＮＡの存在することによる影響を決定するために、　０．１０．１００ ．及び１００００／ｍｌの濃度で接着培地にデオキシリボヌクレアーゼＩ　（Ｕ ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）を加えた。

細胞をｖｉｔｒｏｇｅｎでコートした標準型の３５ｎ＋ｍポリスチレンディツシ ュにプレートし、接着について２枚のプレートについて調べた。

接着用培地へと分泌したアルブミンを、ラットアルビミン特異的抗体（Ｏｒｇａ ｎｏｎ−Ｔｅｋｎ　１ｋａ−Ｃａｐｅｌ　］）を用いて、サンドウィッチＥＬＩ ＳＡ技術（（Ｓｃｈｗｅｒｅｒ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉ ｍ、　Ａｃｔａ。

１６３、２３７−２４４　（１９８７））を用いて定量した。ＤＮＡ合成は、２ ０時間に渡り１μＣｉ／ｍｇ　３Ｈ−ｔｈｙ制ｄｉｎｅの取り込みにより生化学 的に決定した。全ＤＮＡ分量と放射活性をＭｃＧｏｗａｎ、　Ｊ、Ａ、おより決 定した。

細胞培養をＫａｒｎｏｖｓｋｙ’　ｓ定着液中で３７℃、１時間定着し。

０、ＩＭカルジル酸緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、１％オスミウムテトロキシ ド中で１時間再度定着させ、徐々に濃度を変えたエタノール／水溶液中で脱水し 、超臨界のＣＯ□で臨界点乾燥機（Ｌａｄｄ）中で乾燥させた。サンプルを金で 噴出被覆し、　Ｈｉｔａｃｈｉ走査型電子顕微鏡で観察した。

１つのセットの実験で、基質への細胞接着の反応速度論を。

細胞−細胞の相互作用の役割を最小にするために、　３０，０００細胞／Ｃ［Ｉ ＋かそれ以下の細胞表面濃度で研究した。　（注意：２つの関連した細胞濃度、 つまり２次元の表面濃度と体積濃度がある。２次元の表面濃度が適切である。な ぜなら細胞は全体積に拘わらず表面に極めて素早く沈澱するし９表面濃度は。

接着界面で細胞が相互作用をする程度と、その部位での相対的な培抗作用を反映 している。即ち、直径２０−２５μｍの細胞では球体での全表面範囲は１６０． ０００−２５０．０００細胞／　ｃＪに相当するであろうし、だから３０．００ ０細胞／ＣＩ＋？は少なくとも２０％の表面範囲を表すであろう。体積濃度は重 要である。なぜなら。

接着が、細胞分泌性のタンパク質により阻害されるからである。）ポリマーフィ ルムの両タイプへの接着率は、同様であり、最大の接着は６０分以内に達成され るが、コラーゲンでコードンた対照ディツシュへの最大の接着は約１２０分間必 要である。ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓは単一細胞として初期には接触して観察でき るが、コラーゲンでコートしたディツシュへの接着の反応速度論における違いは 、４倍に稀釈した細胞濃度（７５００細胞／ｃａｆ）では観察できなかった。

１００、０００細胞／ｃａｔの細胞濃度では、細胞−細胞の相互作用が基質に接 着している細胞の数に顕著に影響を与える。ｈｅｐａｔ。

−ｃｙｔｅｓの接着のパターンはポリマーの基質と対照について全く異なるもの である。高細胞濃度では、細胞が２−１０細胞の集合体を形成することが観察さ れる。これらの集合体はコラーゲンでコートした基質に接着するようにみえるで あろうが。

ポリマーフィルムと相互作用するようにはみえなかった。もし死細胞よりＤＮＡ がもれることが非特異的な会合を起こしているなら期待されるであろうような細 胞集合体の形成はＤＮａｓｅ（１０−１００００／ｍｆ）の存在によっては影響 を受けなかった。たとえ非常に多数の細胞が、高細胞濃度でポリマーフィルムに よりもコラーゲンでコートした基質に接着していても、細胞−細胞相互作用も、 　２００．０００／ｃＩＩｔの細胞濃度での接着パターンにも影響を与えるだろ う。洗浄ステップ中で、細胞のバッチが表面より現れ１部分で表面がむき出しに なるであろう。表面での細胞の分布はＮＫＳ分析中に容易に視覚化し、そのよう なバッチ形成は２００．０００細胞／［２ｉかそれ以下の細胞濃度では観察でき ない。

培養に用いたポリマーの基質は不透明であるので、走査型電子顕微鏡を細胞の形 態を観察するのに用いることができる。

コラーゲンでコートしたポリスチレンディツシュ上に保持された細胞は、一般的 には高度に広がり、そして平板状であった。表面の微繊毛が主に細胞の中心に観 察できた。比較して。

ポリマーの基質上の細胞の形態はテヘロである。高度に球状化し、しかも広がっ た細胞が観察された。ポリマーフィルム状では９球状で広がった細胞は幾多の表 面の微繊毛を有していた。

ＰＬＡとＰＬＧＡの混合物のポリマーフィルムの成型物上に保持されたｈｅｐａ ｔｏｃｙｔｅｓの成長パターンは、コラーゲンの対照基質上に保持されたｈｅｐ ａｔｏｃｙｔｅｓのそれと同様である。ＤＮＡ合成速度は同様である。細胞の自 然派は、培養３日後に始まる。

純粋なＰＬＧＡ８５　：　１５を用いたフィルム成型物は、調べた細胞濃度（２ ０，０００細胞／−）での、細胞の寿命に対して、よい基質であることを示せな かった。３−４日後、大きな断片或いは、ひもとなって基質よりはがれた。細胞 をフィブロネクチンでコートしたポリスチレンディツシュ　（１ｏｎｇ／ｃｎｆ 　１０．０００−３０．０００細胞／ｃＩ＋！で培養すると、基質からのｈｅｐ ａｔｏｃｙｔｅｓの脱離が観察できた。素地からの細胞のシートあるいはひも状 のものの脱離もまた。他のシステムで観察され、細胞−素地間の張力を克服する 細胞−細胞間の張力に寄与していた。

ポリマーブレンドフィルム上でｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの機能を保持することを 、アルブンミンの分泌速度を測定することにより評価した。ポリマーブレンドフ ィルム上に保持された細胞によるアルブミンの分泌速度（μｇ／１０’細胞／日 ）は培養５日後にはほぼ２倍に増加した。比較して、コラーゲンの対照ディツシ ュ上の細胞のアルビミンの分泌は６０％以上減少した。

コラーゲン上に保持された細胞でのアルブミン合成が減少したことは、コラーゲ ンの表面濃度が１及び１ｏｎｇ／ｃｏ！でも同じだった。

ポリマーブレンドフィルム上の細胞によるアルブミンの分泌速度は、ラットにつ いて報告されているインビボの速度〔１７、３−１９゜４ｍｇ／ｇｍ肝臓／２４ 時間〕の範囲である。　（Ｐｅｔｅｒｓ。

Ｔ、Ｊｒ、、　ａｎｄ　Ｊ、Ｃ，Ｐｅｔｅｒｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、、　２４７（１２）、　３８５８−３８６３　（１９７２）　）　、このラッ トの速度は、　１２０　Ｘ１１０’ｈｅｐａｔｏｃｙポリマーの表面にある最大 の細胞濃度は５０．０００細胞／　ｃｍ　２だった。もし表面にプレートした細 胞の数は１００．０００細胞／Ｃ１１１２を超えると、基質に接着している細胞 の数は減少した。

５０、０００細胞／ｃｍ２という最大の細胞接着は、細胞増殖が望ましい移植状 況において充分な細胞の数ではある。しかし、もし、過剰な細胞−細胞の接触が 移植した細胞による機能の保存に必要ならば、あるいはもしポリマーの表面領域 をもっと有効に使えるこきが必要であるならば、より高い細胞接着密度が要求さ れる。充分な数の細胞がコラーゲンの対照に接着しているので、ｎｇ−μｇ／ａ ｎ”量のコラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質でポリマー基質をコ ートすることは。

もし高細胞表面密度が要求されるならば、移植マド１７７クスへの細胞の接着を 促するのに用いることができる。

インビボでのｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの機能を保持するために、細胞を高度に機 能を有する状態で移植する必要があること、及びこのことを確認するための最良 の方法は、細胞の機能を保持させるのにも最適であるような接着用の基質を用い ることが望まれている。ＰＬＧＡ８５：１５とＰＬＬＡとの混合物から作成され たフィルムは、１つのｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの機能（アルブミンα分泌）を確 実に保持させるように見える。しかし、この保持の機構は明らかではない。なぜ なら、ポリマーを細胞間に生体特異的な相互作用がないからである。分化した機 能を保持することが確察されたが、その考えられるメカニズムの１つは。

細胞の形の調整を通じてである。多くの細胞のタイプでの遺伝子発現のコントロ ールが細胞の形状に依存していることが示されている。

実施例３：細胞を植えたマトリックスの第２次移植を行う部位での前導脈化（Ｐ ｒｅｖａｓｃｕ　Ｉａ　１ｚａｔ　１ｏｎ）移植後最初の２４−４８時間にｈｅ ｐａｔｏｃｙｔｅｓの生存率の大きな減少がある。この減少は移植に用いられて いる細胞密度には全く依存していない。しかしながら、適用が高密度であれば。

植付けを長く生かす生存細胞の数がそれだけ多くなる。植え付けた細胞の数を増 加させることによって前導脈化が助けているように見える。図６ａは、移植部位 の低倍率見取図を描している。右及び左の余白はもともとの腸間膜皺壁であり。

細胞のポリマー構築物は葉の間に見ることができる。ポリマー材料はそれぞれの ファイバーのまわりに巨大細胞の異物反応を示す。すき間には、適当に炎症した 細胞の浸潤物がある。

生存しているｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの小さな集まりとクラスターが移植物の中 に見られる。新しい血管新生も存在する。図６ｂは。

ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓの集まりが、腸間膜皺壁や関連している血液供給に最も 近接している移植体の端をはっきりと好むことを示しているより高倍率の見取図 である。ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓもまたポリマーファイバーに接着していない。

細胞が敷かれたマトリックスについて、と同様にお互いについても選択的な接着 性が起こることを示している。コラーゲンを置くことに伴う起こるフィブロブラ スト反応がある。

前導脈化は、トリペプチドのグリシン−ヒスチジン−リジン（ＧＨＬ　）ととも に負荷したポリマーの移植によって成し終えた。Ｇ肛は肝栄養剤であると同様に 既知の脈管新生剤である得るものである。図７ａは、腸間膜へ移植したＧＨＬを 含むポリマー状の７１１ツクスの写真である。図７ｂは、腸間膜へ移植したＧＨ Ｌを含まないポリマー状のマトリックスの写真である。マトリックスは細胞を含 んでいなかった。ポリマーは上段左側の角にある。図７ａ中の矢印は、大きくて 、密な脈管のネットワークを示している。このネットワークはポリマー状のマト リックスを含むＧＩＩＬの移植５日間を経て生じたものである。

当該発明の修飾や改変、インビボにおいてポリマー状のマトリックス上での機能 を有する多量の細胞を移植する方法。

およびそれぞれの産物は、上記本発明の説明から当業者には明らかであろう。こ れらの修飾や改変は添付の請求の範囲内に入る。

７Ｊ％μｈ、）閏朕 崩肴〜イしう、７ｒし 尾シ閃Ｈ１仕 ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７Ｂ 国際調査報告 ｌｌ１１−一電ｆｌｌＩＩＪＩＡＤ＠阜■ＣＩＩ＋□、、Ｎ−、ＰＣＴ／υ５９ ０１０２２５７国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のものを含む機能性キメラ細胞−マトリックス構造の製造方法： ａ）生分解性、非分解性、そして該物質に接着している生存細胞を有する該物質 の組合わせから成る群から選択された材料から形成された生体適合性マトリック スを供すること、および ｂ）組織付近の高い表面積と脈管を持つ組織を用いて並列にしたマトリックスを 移植し、このことにより、細胞が生存したままであり、そして機能するために、 栄養物とガスの適当な交換が前記付着した細胞と血液の間で起こること。
2. ２．組織が腸間膜である請求項１の方法。
3. ３．組織が大網である請求項１の方法。
4. ４．組織が腹膜である請求項１の方法。
5. ５．材料がポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、コ ラーゲンそして共重合物、それらの混合物、及びそれらの組合せからなる群から 選択された生分解性ポリマーである請求項１の方法。
6. ６．材料か、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート及び他のポリエステ ル、テフロン、エチレンビニルアセテート、ナイロン、ステンレススチール、及 びこれらの組合せから成る群から選択された非分解性、あるいは非吸着性材料で ある請求項１の方法。
7. ７．マトリックスが１００−２００μｍの範囲にある間質すき間の繊維状材料で ある請求項１の方法。
8. ８．マトリックス材が、基底膜成分、寒天、アガロース、ゲラチン、アラビアガ ム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、グリコサミノグ ルカン、接着ペプチド、及び該物質の混合物から成る群から選択された接着因子 でコートされた請求項１の方法。
9. ９．脈管新生化合物、栄養剤、成長因子、分化あるいは脱分化の誘導物質、分泌 生産物、免疫調節剤、炎症阻害剤、退行因子、リンパ球ネットワークあるいは神 経繊維の内方成長を促進あるいは可能にする生物学的活性物質、及び該物質の混 合物から成る群から選択された化合物を前記マトリックス中あるいはマトリック ス上に取り込ませることをさらに包含する請求項１の方法。
10. １０．細胞が、肝臓の細胞、膵臓の細胞、腎臓の細胞、リンパ系の細胞、神経系 の細胞、フィブロブラスト神経芽細胞、内皮細胞、リンパ細胞、膵臓細胞、及び 泌尿生殖器系の細胞から成る群から選択される請求項１の方法。
11. １１．接着した細胞を有するマトリックスを移植する前に、脈管新生化合物、栄 養剤、成長因子、分化あるいは脱分化の誘導物質、分泌生産物、免疫調節剤、炎 症阻害剤、退行因子、リンパ球ネットワークあるいは神経繊維の内方成長を促進 あるいは可能にする生物学的活性物質、及び該物質の混合物から成る群から選択 された化合物を含むマトリックスを移植することを包含する請求項１の方法。
12. １２．インビボで植えたマトリックスを移植する前に、接着した生存細胞を有す るポリマーマトリックスを培養することを包含する請求項１の方法。
13. １３．マトリックスに接着させる前に、細胞を修飾することをさらに包含する請 求項１の方法。
14. １４．接着した細胞を有する多様なマトリックスを移植する請求項１の方法。
15. １５．マトリックスが異なる材料から構成されている請求項１４の方法。
16. １６．マトリックスが異なるタイプの細胞を含む請求項１４の方法。
17. １７．マトリックスを１タイプより多くの組織で並べて移植する請求項１の方法 。
18. １８．高い表面積領域と、生分解性材、非生分解性材、及び間質の幅か１００− ２００μｍの範囲を持ち、そして該物質に接着している生存性細胞を持つ繊維状 の形状中でそれらの組合わせから成る群から選択された生体適合材を包含する組 織表面に隣接している脈管とを有する組織への移植用のマトリックス構築物。
19. １９．材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物 、コラーゲン及びコポリマー、混合物及び該物質の組合せから選択された生分解 性ポリマーである請求項１８の構築物。
20. ２０．材料が、ポリプロピレン、ポリエチレンテトラフタレート及び他のポリエ ステル、テフロン、エチレンビニルアセテート、ナイロン、ステンレススチール 、及び該物質の組合わせから選択された非生分解性あるいは非吸着性材料である 請求項１８の構築物。
21. ２１．マトリックス材が、基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビア ゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、グリコサミノ グリカン、接着ペプチド及び該物質の混合物から選択された接着因子でコートさ れている請求項１８の構築物。
22. ２２．脈管新生化合物、栄養剤、成長因子、分化あるいは脱分化の誘導物質、分 泌生産物、免疫調節剤、炎症阻害剤、退行因子、リンパ球ネットワークあるいは 神経繊維の内方成長を促進あるいは可能にする生物学的活性物質、及び該物質の 混合物から成る群から選択された化合物をさらに包含する請求項１８の構築物。
23. ２３．細胞が、肝臓の細胞、膵臓の細胞、腎臓の細胞、リンパ系の細胞、神経系 の細胞、フィブロブラスト神経芽細胞、内皮細胞、リンパ細胞、膵臓細胞、及び 泌尿生殖器系の細胞から成る群から選択される請求項１８の構築物。
24. ２４．脈管新生化合物、栄養剤、成長因子、分化あるいは脱分化の誘導物質、分 泌生産物、免疫調節剤、炎症阻害剤、退行因子、リンパ球ネットワークあるいは 神経繊維の内方成長を促進あるいは可能にする生物学的活性物質から成る群から 選択された化合物をさらに包含する請求項１８の構築物。
25. ２５．繊維状のメッシュ様の形状を持つ請求項１８の構築物。
26. ２６．スポンジ状の形状を持つ請求項１８の構築物。
27. ２７．生体適合性があり、かつ生分解性のある第２のポリマー溶液で生体適合性 の繊維状メッシュをコートすることによって形成される請求項１８の構築物であ って、繊維状メッシュ材が第２のポリマー溶液には溶解しない、請求項１８の構 築物。
28. ２８．繊維状メッシュがポリグリコール酸から形成され、第２のポリマーが、ポ リ乳酸及びポリ（乳酸−グリコール酸）の共重合体からなる群から選択される請 求項２７の構築物。
29. ２９．第２のポリマーが繊維状のメッシュを形成する繊維間で平坦な表面を形成 する請求項２７の構築物。
30. ３０．細胞培養用の生体適合性のマトリックスを作成する方法であって、生体適 合性があり、かつ生分解性のある第２のポリマー溶液で生体適合性のある繊維状 のメッシュをコートすること（ただし、繊維状のメッシュ材は第２のポリマー溶 液には溶解しない）、過剰なポリマー溶液を除去すること、および第２のポリマ ー溶液から溶剤を除去することを包含する、方法。