ES2649616T3 - Matriz e implante para ingeniería de tejidos - Google Patents

Abstract

Implante para ingeniería de tejidos, que comprende una matriz porosa con células de islotes de Langerhans y hepatocitos en el que la matriz comprende además un primer componente polimérico biodegradable y biocompatible que forma una estructura primaria tridimensional con poros primarios y que comprende además un segundo componente polimérico biodegradable y biocompatible distinto del primer componente polimérico seleccionado de entre el grupo que consiste en colágenos, laminina, fibronectina y sus mezclas, en el que el segundo componente polimérico forma una estructura secundaria tridimensional que está contenida dentro del espacio interior de al menos una parte de los poros primarios, en el que la relación de hepatocitos a células de islotes de Langerhans es aproximadamente 1x106 hepatocitos a 20'000-500'000 células de islotes de Langerhans

Description

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DESCRIPCION

Matriz e implante para ingeniería de tejidos

La presente invención se refiere a un implante para ingeniería de tejidos, que comprende una matriz porosa con células de islotes de Langerhans y hepatocitos según la reivindicación 1. La ingeniería de tejidos es un campo interdisciplinario que combina la ingeniería y las ciencias de los materiales con la medicina y proporciona un enfoque alternativo en el tratamiento mal funcionamiento o pérdida de órganos . En este enfoque, los andamios temporales (denominados también matrices) sirven como un sustrato adhesivo para las células implantadas y un soporte físico para guiar la formación de los nuevos órganos. Por lo tanto, dichas matrices se utilizan para guiar el proceso de desarrollo tisular mediante el suministro de células a los sitios deseados en el cuerpo, definiendo un potencial espacio para un tejido manipulado por ingeniería, y promoviendo el crecimiento celular. Con el fin de habilitar estos procesos, las matrices para la ingeniería de tejidos deben cumplir los siguientes criterios:

La superficie debe permitir la adhesión celular, promover el crecimiento celular y permitir la retención de funciones celulares diferenciadas. Además, las matrices deben ser biocompatibles y biodegradables de manera que las matrices puedan ser eliminadas eventualmente in vivo sin causar inflamación o subproductos de degradación tóxica. Con relación a su estructura, la porosidad de las matrices debe ser lo suficientemente alta como para proporcionar espacio suficiente para la adhesión celular, la regeneración de la matriz extracelular y restricciones de difusión mínimas durante el cultivo. Su estructura de poros debe permitir incluso la distribución celular espacial a lo largo de la matriz para facilitar la formación de tejido homogéneo y el material debe ser procesable, de manera reproducible, en una estructura tridimensional, y debe ser también mecánicamente fuerte.

Se han desarrollado una serie de matrices porosas tridimensionales fabricadas a partir de diversos tipos de materiales biodegradables. El documento EP-A-2256155, por ejemplo, divulga matrices porosas basadas en un polímero o mezcla de polímeros biológicamente compatibles. Según este documento, las matrices porosas se preparan mediante un denominado procedimiento de lixiviación en el que una mezcla compuesta de partículas de polímero y partículas de sal que tienen un tamaño de grano definido se compacta y las partículas de sal se eliminan posteriormente mediante lixiviación.

En la actualidad, se hace uso generalmente de polímeros biodegradables sintéticos ya que pueden ser conformados fácilmente en formas deseadas y tienen mejores resistencias mecánicas que los polímeros derivados de manera natural. Los polímeros biodegradables sintéticos tienen la ventaja adicional de que sus períodos de degradación pueden manipularse también controlando la cristalinidad, el peso molecular y la relación de copolímeros.

Se han investigado también matrices híbridas preparadas a partir de diferentes tipos de polímeros. Por ejemplo, una publicación científica de G. Chen et al.: "A biodegradable hybrid sponge nested with collagen microsponges", Journal of Biomedical Materials Research, 2000-08-01, páginas 273-279., divulga una matriz para la ingeniería de tejidos que comprende esponjas híbridas biodegradables de poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA) poroso con microesponjas de colágeno en los poros de la matriz PLGA. La matriz PLGA porosa se obtiene mediante la dispersión de partículas de cloruro sódico de 355-425 pm en una solución de PLGA en cloroformo, evaporando el disolvente y sometiendo a lixiviación la sal.

Además, una publicación científica de Naoki Kawazoe et al.: "cell leakproof PLGA-collagen hybrid scaffold for cartilage tissue engineering", Biotechnology Process, American Institute of Chemical Engineers, vol. 26, N° 3, 2010-05-01, páginas 819-826, divulga un armazón híbrido de PLGA-colágeno poroso, no permeable a las células, preparado envolviendo las superficies de una esponja de colágeno excepto la superficie superior para la siembra de células con una malla de PLGA de dos capas.

Una publicación científica de Jin-Hyung Shim et al.: "Development of a hybrid scaffold with synthetic biomaterials and hydrogel using solid freeform fabrication technology", Biofabrication, vol. 3, N° 3, 034102, 2011-07-01, páginas 1-9, divulga un armazón híbrido que consiste en biomateriales sintéticos e hidrogel natural usando un sistema de depósito de múltiples cabezas. El hidrogel se infundió de esta manera en el espacio entre las líneas de un armazón basado en biomaterial sintético.

Una publicación científica de P. Kaufmann et al.: "Highly porous polymer matrices as a three-dimensional culture system for hepatocytes", Cell Transplantation, Cognizant Communication Corp, vol. 6, N° 5, 1997-09-01, páginas 463 - 468 divulga esponjas altamente porosas de PLLA para el cultivo a largo plazo de hepatocitos. Para aumentar la adherencia de las células, la matriz se reviste con colágeno o las células se inmovilizan dentro de los poros con gel de colágeno. A pesar de sus ventajas, las matrices derivadas de polímeros sintéticos adolecen también de diversas limitaciones tales como la falta de señales de reconocimiento de células, aceptación biológica limitada y capacidad funcional. Una limitación adicional es que los polímeros sintéticos son generalmente hidrófobos, tal como lo indican los elevados ángulos de contacto con el agua, lo que se ha encontrado que tiene un impacto fuertemente negativo sobre las actividades de unión

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celular y de siembra de células en las matrices.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una matriz polimérica biocompatible y biodegradable que permita una retención y una proliferación de células eficientes manteniendo al mismo tiempo las propiedades mecánicas deseables de las matrices conocidas, en particular las matrices sintéticas.

Este objetivo se consigue mediante el implante para la ingeniería de tejidos que comprende una matriz porosa según la reivindicación 1. Otras realizaciones preferentes están sujetas a las reivindicaciones dependientes.

La matriz porosa para la ingeniería de tejidos según la presente invención comprende un primer componente polimérico biodegradable y biocompatible que forma una estructura primaria tridimensional con poros primarios y comprende además un segundo componente polimérico biodegradable y biocompatible distinto del primer componente polimérico que se selecciona de entre el grupo que consiste en colágenos, laminina, fibronectina y sus mezclas.

El término "matriz", tal como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva, se refiere a un soporte tridimensional, es decir, una estructura similar a un armazón o una esponja, que es adecuada para ser colonizada por células. En este sentido, la matriz sirve como una plantilla tridimensional que puede ser colonizada por células o tejido. Esta colonización puede tener lugar in vitro o in vivo. Además, la matriz sirve, en conexión con trasplantes, para la ubicación del trasplante y también como un soporte de sitio para tejido que se forma gradualmente in vivo

La expresión "polímeros biocompatibles" se refiere a polímeros que son biológicamente tolerados y que no causan rechazo cuando se introducen en un organismo vivo. Para la presente invención, los polímeros biocompatibles abarcan también polímeros que son reconocidos por un huésped como extraños, pero cuyo rechazo puede ser suprimido mediante una inmunosupresión apropiada.

La expresión "biodegradable" se refiere a un material que puede ser convertido en productos metabolizables en organismos vivos (o fluidos corporales o cultivos celulares derivados de organismos vivos). Los polímeros biológicamente degradables incluyen, por ejemplo, polímeros que son bio-reabsorbibles y/o bio-erosionables. "Bio-erosionable" denota la capacidad de ser soluble o suspendible en líquidos biológicos. Bio- reabsorbible significa la capacidad de poder ser absorbido por células, tejidos o fluidos de un organismo vivo.

De esta manera, el primer componente polimérico puede ser, en principio, cualquier polímero biodegradable y biocompatible que pueda ser usado en el campo de la medicina y, en particular, en medicina de trasplante. Tal como se describirá en detalle a continuación, el primer compuesto polimérico es generalmente un compuesto polimérico sintético. En comparación con los polímeros naturales, los polímeros sintéticos proporcionan generalmente una mayor resistencia mecánica y, por lo tanto, permiten la preparación de una matriz que es adecuada para servir como soporte físico para la unión y la colonización de células.

Ahora, se ha encontrado sorprendentemente que si hay presente un segundo componente polimérico que forma una estructura secundaria tridimensional que está contenida dentro del espacio interior de al menos una parte de los poros primarios de la estructura primaria, las propiedades hidrófilas de la matriz se mejoran de significativamente, mientras que pueden mantenerse las propiedades beneficiosas, es decir, la resistencia mecánica del primer componente polimérico biodegradable y biocompatible. Gracias a las propiedades hidrófilas mejoradas, la fijación celular y la colonización celular sobre la matriz se facilita enormemente. A su vez, esto aumenta la probabilidad de un procedimiento de implantación exitoso, es decir, que una matriz implantada sea aceptada por el receptor y no se produzca un rechazo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una solución que permite combinar las propiedades beneficiosas de los polímeros tanto sintéticos como naturales.

En particular, la presente invención permite el uso de un polímero sintético como primer componente polimérico biodegradable y biocompatible que proporciona a la matriz la resistencia mecánica necesaria, mientras que el segundo componente polimérico biodegradable y biocompatible que es un polímero natural seleccionado de entre el grupo de colágeno, laminina y fibronectina proporciona a la matriz propiedades hidrófilas enormemente beneficiosas. La hidrofilicidad de una matriz polimérica para su uso en ingeniería de tejidos se considera muy importante para una siembra celular homogénea y suficiente en tres dimensiones.

Además, tal como se explicará más detalladamente a continuación, la presencia del segundo componente polimérico aumenta altamente el número de posibles opciones de diseño con relación a la estructura de poros de la matriz inventiva. Dependiendo de la disposición específica del segundo componente polimérico dentro de los poros del componente polimérico primario, el tamaño y la forma de los poros primarios pueden adaptarse libremente. Esto permite, por ejemplo, incluir y sembrar más de un tipo de célula dentro de los poros de la matriz mediante la provisión tanto de poros más grandes para alojar células de mayor tamaño de célula como poros más pequeños para retener células de menor tamaño de célula.

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La palabra "poros" se usa para designar las cavidades o regiones vacías que están presentes en la matriz según la invención. Pueden tener una forma redonda y/o una forma angular, en particular octagonal, en una sección bidimensional y/o una forma inclinada cuando se observa en 3 dimensiones. Además, la forma se caracteriza preferentemente por extensiones de manera que la forma de las cavidades puede compararse con la forma de las células nerviosas. El tamaño de un poro puede especificarse por medio de su diámetro medio de poro, es decir, la media de los diámetros más largo y más corto de los poros que pueden distinguirse en una sección bidimensional. El tamaño de poro y la distribución de poros pueden determinarse por medio de un microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM), por ejemplo, de una manera bien conocida por la persona con conocimientos en la materia.

La matriz de la presente invención tiene la ventaja adicional de que no sólo permite adaptar el tamaño de los poros en la misma, sino que además es posible preparar la matriz con permeabilidades y/o porosidades variables adaptando los gradientes de concentración de poros que tienen un tamaño y/o una forma determinadas.

Por ejemplo, los poros pueden estar altamente interconectados o altamente disjuntos. Los poros altamente interconectados generalmente producen una composición con permeabilidad aumentada (tal como una permeabilidad hidráulica o una permeabilidad a una clase determinada de materiales), mientras que los poros altamente disjuntos producen generalmente composiciones con permeabilidad reducida para la misma porosidad, que se calcula dividiendo el volumen de huecos por el volumen total de una muestra representativa de la matriz.

De esta manera, si la matriz debe realizar la función de una matriz permeable o semipermeable con permeabilidad aumentada, la matriz será diseñada con un mayor número de poros interconectados. Por otra parte, una estructura con un mayor número de poros disjuntos puede ser ventajosa para matrices que necesitan tener una estabilidad mecánica particularmente alta.

Según la presente invención, la estructura primaria de la matriz permite la difusión de líquidos y (macro) moléculas en la matriz o incluso su paso a través de la matriz. Para su uso en la ingeniería de tejidos, esta permeabilidad, obedeciendo la ecuación de Fick, es una gran ventaja de la matriz inventiva ya que el intercambio de gases, por ejemplo, oxígeno, líquidos y compuestos, tales como nutrientes celulares y residuos, es esencial para permitir y promover la proliferación celular en y cerca de dichas matrices.

Además, se ha encontrado que la superficie de la estructura primaria de la matriz es capaz de activar factores de crecimiento, tales como factores de crecimiento de vasos (Vessel Growth Factor, VGF), mediante la interacción con el tejido del receptor en el sitio de implantación. Los factores de crecimiento activados son importantes para estimular y atraer las células que conducen a la formación y al crecimiento de pequeños vasos (capilares) en la matriz. Los factores de crecimiento que se activan pueden estar ya presentes en el tejido circundante en el sitio de implantación o pueden proporcionarse también al sitio de implantación con la matriz, por ejemplo, como componente en el material polimérico primario y/o secundario, en el interior de los poros de la estructura primaria y/o secundaria, o mediante el revestimiento de la matriz con un material que comprende los factores de crecimiento.

Por lo tanto, la matriz según la presente invención puede ser ajustada perfectamente a la función específica del órgano a ser reparado o sustituido por la matriz. Además, debido a sus propiedades hidrófilas mejoradas, la matriz de la invención consigue una aceptación altamente mejorada por parte de un receptor y, por lo tanto, es muy adecuada para su uso en la ingeniería de tejidos.

Con relación al material de la matriz, se prefiere además que el primer componente polimérico sea seleccionado de entre el grupo que consiste en poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico-ácido láctico) y sus mezclas. Los componentes poliméricos de ácido láctico (PLA), por ejemplo, ácido poli-L-láctico (PLLA), ácido poli-D,L-láctico (PDLLA), ácido poliglicólico (PGA) o sus mezclas (PLGA; denominado también ahora poli(lactida-co-glicolida) o PLG) son candidatos atractivos para fabricar matrices biodegradables debido a sus propiedades físicas flexibles y bien definidas y su biocompatibilidad relativa. Además, sus productos de degradación son compuestos de bajo peso molecular, tales como ácido láctico y ácido glicólico, que entran en las vías metabólicas normales. Además, los copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) ofrecen la ventaja de un amplio espectro de tasas de degradación desde unos pocos días a años, simplemente variando la relación de copolímeros de ácido láctico a ácido glicólico.

Más específicamente, el primer componente polimérico es preferentemente poli (ácido glicólico-ácido láctico) que tiene un contenido de ácido láctico de aproximadamente el 85% en moles y un contenido de ácido glicólico de aproximadamente el 15% en moles. Dicha mezcla de poli (ácido láctico) (PLLA) y poli (lactida-co-glicolida) (85/15) (PLGA 85/15) puede adquirirse, por ejemplo, en Evonik Industries AG (Essen, Alemania).

Tal como se ha mencionado anteriormente, el segundo componente polimérico se selecciona de entre el grupo que consiste en colágenos, laminina, fibronectina y sus mezclas, que son proteínas de la matriz extracelular que pueden prepararse en forma purificada de una manera conocida de por sí o bien pueden obtenerse comercialmente.

De entre estas proteínas de la matriz extracelular, el colágeno es el más preferente. Gracias a su arquitectura nanofibrosa,

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el colágeno es particularmente eficaz en la promoción de la adhesión celular, el crecimiento y la función diferenciada en los cultivos de tejidos. Sin embargo, se ha encontrado también que, si el segundo componente polimérico comprende colágeno, las propiedades hidrófilas de la matriz según la presente invención se mejoran particularmente.

Por lo tanto, la matriz de la presente invención proporciona una estructura híbrida de dos componentes poliméricos biodegradables que es estable, que puede prepararse en diferentes formas y que permite además una buena interacción celular e hidrofilicidad.

En base al peso total de la matriz, la relación en peso de estructura primaria a estructura secundaria está comprendida preferentemente en el intervalo de aproximadamente del 1 al 100%.

Es particularmente preferente además que el segundo componente polimérico consista esencialmente en colágeno. En este sentido, el segundo componente polimérico puede consistir en sólo un tipo de colágeno, es decir, el tipo I, o puede consistir en una mezcla de tipos de colágeno, es decir, una mezcla de colágeno tipo I y colágeno tipo IV. En este último caso, se da preferencia a que la mezcla contenga las proteínas en porcentajes en peso aproximadamente iguales. El colágeno tipo I es uno de los componentes principales de los vasos sanguíneos naturales y proporciona a la estructura secundaria sitios de fijación celular, así como resistencia a la tracción. Tal como se ha indicado anteriormente, el segundo componente polimérico está contenido dentro de los poros primarios de la estructura de poros primarios que proporcionan superficies físicas, sobre las cuales las células pueden colocar, de manera tridimensional, su propia matriz extracelular. Preferentemente, los poros primarios forman una estructura de poros interconectados que comprende una red de canales.

En la estructura primaria, los poros primarios tienen preferentemente un diámetro medio de poro de 150 pm a 300 pm, preferentemente de 200 pm a 300 pm. Una estructura porosa con poros (preferentemente interconectados) de este tamaño de poro permite un transporte de nutrientes mejorado al centro de la matriz a través de la estructura primaria y previene también la formación de grandes agrupaciones celulares que pueden desarrollarse potencialmente en centros necróticos debido a la falta de nutrición. Tal como se ha indicado, el tamaño de poro y la distribución de los poros pueden determinarse por medio de un microscopio electrónico de barrido (SEM), que es un procedimiento estándar a este respecto y es bien conocido por la persona con conocimientos en la materia.

Con el fin de mejorar aún más la funcionalidad fisiológica de la matriz, es particularmente preferente que el segundo componente polimérico forme una estructura secundaria tridimensional con poros secundarios. De esta manera, se forma una estructura secundaria porosa tridimensional dentro de la estructura primaria porosa tridimensional, formando básicamente una estructura denominada "andamiaje sobre andamiaje". En este sentido, cabe señalar que el segundo componente polimérico puede formar fibrillas, fibras o espumas como estructura secundaria tridimensional. Sin embargo, el segundo componente polimérico puede estar también en forma de una capa que reviste al menos parte de las paredes internas de los poros primarios, formando de esta manera una estructura secundaria tridimensional basada en la estructura primaria tridimensional subyacente del primer componente polimérico.

Las dos estructuras tridimensionales pueden servir a diferentes propósitos. Por ejemplo, la estructura primaria puede proporcionar principalmente estabilidad física a la matriz y puede proporcionar espacio vacío suficiente para alojar células con un tamaño de célula mayor, mientras que la estructura secundaria puede estar diseñada para formar poros más pequeños para retener las células de tamaño de célula menor. Por lo tanto, una matriz según esta realización preferente es particularmente adecuada para incluir y sembrar células de más de un tipo de célula.

De esta manera, los poros primario y secundario difieren preferentemente en su diámetro y tamaño medio de poro. En particular, los poros secundarios tienen preferentemente un diámetro medio de poro más pequeño que el diámetro medio de poro de los poros primarios y está comprendido en el intervalo de 50 pm a 290 pm, preferentemente 50 pm a 150 pm, más preferentemente 50 pm a 100 pm.

Una matriz que tiene una porosidad alta, en particular con una gran relación superficie/volumen, es altamente preferente ya que permite el suministro de un gran número de células y facilita la invasión del tejido fibrovascular en la matriz después de la implantación.

Además, es altamente preferente que la matriz de la invención esté provista de subestructuras diferentes, es decir, partes, regiones, capas, superficies o sus combinaciones, que tengan permeabilidades diferentes basadas en diferentes tamaños medios de poro en una subestructura respectiva. En particular, la matriz comprende preferentemente al menos dos capas, en las que el diámetro o tamaño medio de poro de los poros en una primera capa es diferente del diámetro o tamaño medio de poro de los poros en una segunda capa.

En particular, la matriz comprende preferentemente una capa de base porosa y una capa porosa de inclusión de células, siendo el diámetro o tamaño medio de poro de los poros en la capa base más pequeño que el de los poros en la capa de inclusión de células. En una realización específica, el diámetro o tamaño medio de poro de los poros en la capa de inclusión de células está comprendido en el intervalo de 300 pm a 500 pm, mientras que el diámetro o tamaño medio de poro de los poros en la capa base está comprendido en el intervalo de 10 pm a 200 pm. Gracias a este especial diseño de

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la matriz, las células de mayor diámetro, es decir, de 200 |jm a 300 |jm, pueden ser retenidas y colonizadas en la capa de inclusión celular, mientras que las células de menor diámetro, es decir, de 50 jm a 200 jm, pueden ser retenidas y colonizadas en la capa base. En otras palabras, la capa de base actúa como una especie de red de seguridad para retener células de menor diámetro, que de lo contrario podrían “caer a través” de los poros más grandes en la capa de inclusión de células. La capa base proporciona de esta manera una protección eficaz contra el escape de células durante la siembra de células. Al retener más células en la matriz porosa, se facilita en gran medida una regeneración tisular eficaz.

Es preferente además que los poros en la capa base tengan un diámetro o tamaño medio de poro comprendido en el intervalo de 10 jm a 100 jm. Esto permite que también las células pequeñas, tales como hepatocitos que tienen un diámetro celular medio de 20-30 jm, puedan ser retenidas y cultivadas efectivamente en la matriz de la presente invención.

Con el fin de obtener una matriz con cualquiera de los diseños descritos anteriormente, la matriz puede prepararse usando tecnología de impresión en 3D y/o plasma y/o electro-hilado.

El uso de impresión en 3D para la preparación de la matriz de la presente invención es particularmente preferente debido a que esta tecnología permite fabricar un objeto sólido tridimensional de prácticamente cualquier forma con una precisión impecable. Con relación a la matriz de la presente invención, la impresión en 3D no sólo permite producir la estructura primaria y/o la estructura secundaria, sino que además permite preparar una matriz con células incluidas en la misma, particularmente células de dos tipos diferentes, más particularmente hepatocitos y células de los islotes de Langerhans.

El procedimiento de electro-hilado es particularmente adecuado para formar fibras finas que se depositan sobre un objetivo conformando una estructura de malla sobre el mismo. "Objetivo" significa un cuerpo conformado que puede tener diferentes formas, por ejemplo, una forma similar a una placa circular. La matriz según la presente invención comprende fibras de aproximadamente 1 a 100 jm de diámetro, preferentemente de aproximadamente 10 a 40 jm.

Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona también un nuevo procedimiento de fabricación que permite una preparación directa y económica de las matrices descritas anteriormente. Dicho procedimiento comprende específicamente las etapas siguientes de:

- proporcionar una mezcla que comprende una solución de partículas poliméricas del primer componente polimérico que tienen un tamaño de grano comprendido en el intervalo de aproximadamente 100 jm a 300 jm disuelta en un disolvente polimérico y partículas de un material lixiviable porógeno, en el que dichas partículas porógenas son insolubles en el polímero disolvente y tienen un tamaño de grano comprendido en el intervalo de aproximadamente 100 jm a 400 jm;

- compactar la mezcla mediante la eliminación del disolvente polimérico;

- eliminar el material lixiviable porógeno, produciendo de esta manera la estructura primaria tridimensional con poros primarios;

- sumergir la estructura primaria en una solución que comprende el segundo componente polimérico disuelto en un disolvente, y

- eliminar el disolvente.

La compactación se efectúa preferentemente mediante la acción de una presión. Para ello, el polímero/material lixiviable porógeno puede prensarse en una prensa hidráulica convencional a una presión de pistón comprendida en el intervalo de aproximadamente 5,38 mPa a 10 mPa (de 780 psi a 1.450 psi), ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 5,8 mPa a aproximadamente 8,48 mPa (de aproximadamente 840 psi a aproximadamente 1.230 psi), y en particular en el intervalo de aproximadamente 6,20 mPa a 7,58 mPa (de aproximadamente 900 psi a 1.100 psi). Se ha demostrado que es conveniente permitir que la presión actúe de aproximadamente 10 s a 360 s, ventajosamente de aproximadamente 40 s a 180 s, y en particular de aproximadamente 50 s a 70 s, a temperaturas comprendidas en el intervalo entre 18°C y 25°C.

El material lixiviable porógeno se elimina, por ejemplo, disolviéndolo con agua o soluciones acuosas. Primero, la mezcla compactada (material de matriz en bruto) puede empaparse durante aproximadamente 1 h a 80 h, ventajosamente de aproximadamente 12 h a 62 h, y en particular de aproximadamente 36 h a 60 h. De manera alternativa, la mezcla compactada puede lavarse con agua desionizada hasta que el peso de la estructura primaria secada permanezca inalterado.

Además, es ventajoso que la mezcla compactada se almacene inicialmente en una atmósfera de CO2 antes de que se elimine el material lixiviable porógeno. De esta manera, por ejemplo, la mezcla compactada puede ser gaseada a una

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presión de CO2 comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,965 MPa (140 psi) a 11,38 MPa (1.650 psi), ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 2,48 MPa (360 psi) a 7,722 MPa (1120 psi), y, en particular, en el intervalo de aproximadamente 5,52 MPa (800 psi) a 6,21 MPa (900 psi), con tiempos comprendidos en el intervalo de aproximadamente 1 h a 180 h, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 3 h a 60 h, y, en particular, en el intervalo de aproximadamente 12 h a 36 h, que han demostrado ser convenientes en este sentido. A continuación, la presión se reduce, en el que la velocidad de reducción de la presión tiene una influencia sobre la formación de los poros. Aunque el uso de CO2 es preferente, otros gases, tales como aire, nitrógeno, helio, neón, criptón, argón, xenón u oxígeno pueden ser también adecuados. Posteriormente, con vistas al secado, el agua o la solución acuosa se eliminan de una manera conocida de por sí. Para conseguir esto, la matriz puede extenderse, por ejemplo, sobre papel absorbente.

Preferentemente, se añade una solución polimérica a la mezcla compuesta de partículas de polímero del primer componente polimérico y material lixiviable porógeno, y se elimina el disolvente, antes de efectuar la compactación. En este sentido, las partículas de polímero y la solución de polímero pueden estar basadas en el mismo polímero. Sin embargo, los polímeros pueden ser también polímeros diferentes, en particular polímeros que tienen diferentes degradabilidades biológicas.

El disolvente usado debe disolver el primer componente polimérico pero no el material lixiviable porógeno. Esto asegura que las propiedades porógenas del material lixiviable no se vean afectadas, o sólo se vean afectadas de manera insignificante. Para este propósito, la acetona, el acetato de etilo, el cloruro de metileno, el cloroformo, el hexafluoroisopropanol, los hidrocarburos clorados y fluorados, alifáticos y aromáticos, el tetrahidrofurano, la etilmetilcetona, la dietilcetona, y sus mezclas son, por ejemplo, adecuados para disolver los polímeros indicados anteriormente. En particular, el cloroformo es adecuado para disolver poli (ácido glicólico), poli (ácido láctico) o poli (ácido glicólico-ácido láctico), y es adecuado también con vistas al uso médico.

La mezcla de la solución polimérica y de las partículas de polímero/material lixiviable porógeno resulta inicialmente en una pasta agitable que, a continuación, se torna sólida rápidamente a medida que se elimina el disolvente. La concentración del primer componente polimérico en la solución se selecciona convenientemente de manera que el primer componente polimérico esté completamente disuelto, por una parte, y, por otra parte, el disolvente pueda ser eliminado rápidamente sin que las partículas de polímero empiecen a disolverse en un grado significativo.

Una relación en peso de partículas de polímero a polímero disuelto de 10:1 a 1:100, ventajosamente de 2:1 a 1:25, y en particular de 1:1 a 1:10 ha probado ser beneficiosa. En lo que respecta a la relación en peso de las partículas de polímero del primer componente polimérico con respecto a las partículas porógenas, es posible, en el contexto de esta realización, seleccionar una relación en peso que sea más alta con respecto al material lixiviable porógeno, es decir, de hasta 1:200, 1:500 o 1:1000, siendo todavía la relación en peso del primer componente polimérico total al material lixiviable porógeno mayor que 1:100. De esta manera, es posible obtener porosidades superiores al 98%.

En el procedimiento descrito anteriormente, el material lixiviable porógeno sirve como un material que, por definición, se entiende como un material sólido, o al menos semisólido, que inicialmente se une con el polímero formador de matriz para dar una mezcla y que, a continuación, se elimina de la mezcla, resultando en la formación de cavidades (poros).

Para eliminar el material lixiviable porógeno de la mezcla, es conveniente que dicho material sea soluble en al menos un disolvente y que sea esencialmente insoluble en al menos un disolvente adicional. Un material es esencialmente insoluble cuando, en particular, es inferior al 30% en peso, preferentemente inferior al 20% en peso, en particular inferior al 10% en peso, por ejemplo, inferior al 5, 4, 3, 2 y 1% en peso, soluble bajo las condiciones de procesamiento, es decir, por regla general, a temperaturas comprendidas en el intervalo de 18°C a 25°C y bajo presión atmosférica.

La estructura y las propiedades de las estructuras primarias resultantes vienen determinadas esencialmente por la relación de tamaño, forma y peso de las partículas porógenas que se usan para prepararlas. Debido a que el tamaño de las partículas porógenas afectará al tamaño de los poros formados tras lixiviar el material lixiviable porógeno, tiene generalmente un tamaño medio de grano de 100 a 400 pm, preferentemente de 300 a 400 pm. Este tamaño corresponderá aproximadamente al tamaño de los poros formados por la lixiviación de las partículas porógenas.

En este sentido, cabe señalar que no sólo es importante la naturaleza del material lixiviable porógeno, sino también, especialmente, la distribución de los tamaños de grano de las partículas porógenas. De esta manera, se cumple, en general, que no sólo aumenta el tamaño de poro a media que aumenta el tamaño de grano, sino que también aumenta la conectividad, es decir la red de cavidades que se comunican entre sí. Esta red, que se denomina también macroestructura o estructura macroporosa, debe distinguirse de los poros que pueden obtenerse mediante espumación y que, por regla general, están cerrados y por lo tanto forman una estructura que se denomina microestructura o estructura microporosa.

Para el procedimiento de preparación descrito en la presente memoria, el material lixiviable porógeno es preferentemente una sal, más preferentemente seleccionada de entre el grupo que consiste en cloruro sódico, citrato sódico, tartrato sódico

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y cloruro potásico, más preferentemente cloruro sódico. El cloruro sódico es particularmente beneficioso ya que está ampliamente disponible a un precio bajo, no representa ningún daño al cuerpo humano y, por lo tanto, es fácil de manejar. Además, el cloruro sódico es soluble en una diversidad de disolventes, incluyendo el agua.

Para la preparación de la matriz, la estructura primaria se sumerge a continuación en una solución que comprende el segundo componente polimérico disuelto en un disolvente.

Según la presente invención, el segundo componente polimérico se selecciona de entre el grupo que consiste en colágenos, laminina, fibronectina y sus mezclas. De entre éstos, el colágeno es preferente.

De esta manera, cualquier tipo de disolvente que permita solubilizar el segundo componente polimérico es adecuado para su uso en el procedimiento de la presente invención.

En una realización preferente, la estructura primaria se sumerge en soluciones ácidas de colágeno tipo I (pH 3,2), preferentemente bajo vacío, de manera que los poros de la estructura primaria se llenen con solución de colágeno. La concentración efectiva de colágeno en la solución está comprendida preferentemente en el intervalo del 0,1 al 1,5 (p/v)%.

Tras la eliminación del disolvente, se obtiene la matriz según la presente invención. Preferentemente, los disolventes orgánicos se eliminan a presión reducida y, preferentemente, los disolventes acuosos se eliminan mediante congelación a -80°C y liofilización bajo vacío. Unos tiempos de aproximadamente 3 h a 60 h, y, en particular, comprendidos en el intervalo de aproximadamente 12 h a 36 h, bajo vacío, han probado ser convenientes en este sentido.

Con el fin de obtener una estructura polimérica secundaria tridimensional altamente reticulada, la matriz puede tratarse además con un agente reticulante, tal como glutaraldehído.

Tal como se ha indicado, la presente invención se refiere a un implante que comprende una matriz porosa, tal como se ha descrito anteriormente, para su uso en ingeniería de tejidos. De esta manera, los implantes según la invención sirven como andamiajes en los que las células migran y/o sobre los que se adhieren las células.

Las matrices según la invención han demostrado que presentan ventajas cruciales cuando se usan en un implante para la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, las dimensiones internas, lo que significa el espacio libre interno, permiten que las matrices sean colonizadas eficientemente con las células. Las matrices son, por una parte, libremente moldeables y, por otra parte, proporcionan una estabilidad y una rigidez adecuadas para soportar el procedimiento de implantación quirúrgica y para resistir las fuerzas mecánicas que actúan en el sitio de implantación. La destrucción de células inicial, que se establece después de la implantación, es limitada y, después de un tiempo corto, el tejido implantado puede asumir la función deseada. Poco después de la implantación, los vasos sanguíneos o los tejidos de granulación ricos en vasos sanguíneos, y también el tejido nervioso, comienzan a proliferar en el implante. Además, las matrices según la invención pueden prepararse sin necesidad de usar disolventes fisiológicamente nocivos, por ejemplo formaldehído, lo que significa que no se requiere un procedimiento especial para eliminar los disolventes y no existe peligro de que queden cantidades residuales de estos disolventes. Las matrices se inoculan con las células deseadas in vitro, tratadas con una solución que contiene células e incubadas hasta que las células se hayan adherido a la matriz. Dicha matriz, junto con las células que se adhieren a la misma (a la que se hace referencia en la presente memoria como un implante), puede someterse a continuación a etapas de procedimiento adicionales, por ejemplo, cultivo adicional, cuando sea apropiado bajo la influencia de compuestos activos, por ejemplo, con el propósito de expandir adicionalmente las células o de modificar sus propiedades, y/o pueden almacenarse hasta su implantación de una manera adecuada, por ejemplo sobre hielo o en un reactor de bio-flujo bajo condiciones estándar. En el contexto de este uso, es ventajoso poder aislar inicialmente y, cuando sea apropiado, también expandir, in vitro, las células que están destinadas a la implantación. En particular, esto hace posible aplicar diferentes tipos de células, tales como los hepatocitos reivindicados junto con células de los islotes de Langerhans, a una matriz. Por lo tanto, puede usarse un implante según la invención para tratar el cuerpo humano o animal. Para ello, se introducen uno o más implantes en el cuerpo a ser tratado mediante un procedimiento quirúrgico o de intervención. Los implantes pueden ser implantados, por ejemplo, en el mesenterio, el tejido subcutáneo, el retroperitoneo, el espacio properitoneal o el espacio intramuscular del individuo a ser tratado.

En principio, cualquier individuo que requiera una sustitución tisular apropiada puede ser tratado con los implantes según la invención. Por regla general, estos individuos son individuos que sufren de una alteración o enfermedad específica cuyo curso implica la pérdida de tejido funcional. Esto puede afectar potencialmente a órganos enteros, por ejemplo al hígado o al páncreas. Por lo tanto, la presente invención proporciona un implante que comprende una matriz y células incluidas en la misma para su uso en ingeniería de tejidos. Las células son células de los islotes de Langerhans y hepatocitos.

Las células de los islotes de Langerhans son células del páncreas donde forman agregaciones celulares (los denominados "islotes" de células de Langerhans). Hay aproximadamente un millón de islotes distribuidos por todo el páncreas de un ser humano adulto sano, cada uno de los cuales mide de menos de 40 pm a 400 pm de diámetro y contiene un número de células que oscila de sólo unas pocas células hasta aproximadamente 5.000 células por islote (Bonner -Weir 1994). Del 65 al 80% de las células de los islotes de Langerhans en los seres humanos son células beta

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productoras de insulina, que están distribuidas a lo largo de todo el islote.

La estructura de la matriz la convierte en un excelente sustrato para las células y es posible cultivar diversos tipos de células diferentes en la matriz. A este respecto, además de las células de los islotes de Langerhans y de los hepatocitos, el implante puede comprender otras células, en particular, células hepáticas, pancreáticas, grasas, intestinales, cutáneas, de vasos sanguíneos, nerviosas, musculares, del músculo liso, de la glándula tiroides, urotelianas, de las trompas de Falopio, tejidos urogenitales, fibroblastos o fibrocitos y células de las raíces de los dientes.

Los poros presentes en la matriz proporcionan espacio para el crecimiento celular y la deposición de la matriz extracelular. Debido a que la matriz proporciona la estabilidad mecánica y la elasticidad necesarias, el cultivo celular, después de una fase estática al principio, puede hacerse dinámicamente. Esto significa que, por ejemplo, las células se cultivan en un entorno estático en matraces de cultivo celular o similares. Posteriormente, las células que crecen en el andamiaje se transfieren a una cámara de perfusión que imita un entorno dinámico. Este procedimiento influye sobre el crecimiento celular adicional. Por ejemplo, la composición de la matriz extracelular depende de la tensión mecánica a la que están expuestas las células. Según la invención, el implante comprende por lo tanto dos tipos de células, que son preferentemente células autólogas (células del individuo que recibe el implante posterior), pero, de manera alternativa, pueden ser también heterólogas. Se ha encontrado sorprendentemente que los implantes según la presente invención que comprenden hepatocitos y células de los islotes de Langerhans proporcionan excelentes sustitutos biológicos del tejido hepático que permiten restaurar, mantener y mejorar la función orgánica del hígado en caso de enfermedad hepática crónica o aguda. En particular, se ha encontrado que las proporciones reivindicadas específicas de hepatocitos a células de los islotes de Langerhans son particularmente ventajosas para permitir que el implante cumpla su función particular. Esta proporción de hepatocitos a células de los islotes de Langerhans es de 1 x 106 hepatocitos a 20'000-500'000 células de islotes de Langerhans. Por lo tanto, la invención se refiere también, más preferentemente, a implantes que, después de la implantación, realizan las funciones metabólicas de un hígado. Para este propósito, la proporción de hepatocitos a células de los islotes de Langerhans es aproximadamente 1 x 106 hepatocitos a 20'000-500'000 células de los islotes de Langerhans, más preferentemente aproximadamente 1 x 106 hepatocitos a 20'000-100'000 células de los islotes de Langerhans. Más preferentemente, el implante comprende aproximadamente 1 x 106 hepatocitos a 20'000-70'000 células de los islotes de Langerhans.

Además, la invención se refiere preferentemente a implantes que, después de la implantación, exhiben las propiedades endocrinas de un órgano pancreático equivalente.

Las células o las mezclas de células que deben usarse para colonizar matrices según la invención pueden obtenerse de una manera conocida de por sí. Con el propósito de producir un implante autólogo, las células se derivan preferentemente del individuo en el que se va a insertar el implante. De esta manera, como regla general, se retira un tejido adecuado, por ejemplo una parte de hígado o de páncreas, del individuo y se prepara de una manera adecuada para la inoculación y el cultivo de la matriz in vitro. En este sentido, es importante que las células exhiban una tasa de vitalidad que sea lo más alta posible.

Si se están obteniendo células hepáticas desde el tejido hepático, debe tenerse en cuenta el hecho de que las células hepáticas están rodeadas por una capa gruesa de tejido conectivo, particularmente en el caso de una cirrosis hepática. Según la invención, se usan soluciones de composición definida para poder aislar las células hepáticas que contienen una proporción de células vitales lo más alta posible.

Preferentemente, una composición A acuosa que contiene NaCl, KCl, Na3PO4 ■ 12 H2O, glucosa y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), y tiene un pH de aproximadamente 7,4, se usa para perfundir una parte de hígado o de páncreas. En particular, 1.000 ml de esta solución contienen aproximadamente 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 0,27 g de Na3PO4 ■ 12 H2O, 1,8 g de glucosa y 1,9 g de EGTA. La perfusión se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de aproximadamente 37°C y a un caudal de aproximadamente 15 ml/min. Unos pocos minutos, en particular de aproximadamente 3 a 5 minutos, por ejemplo aproximadamente 4 minutos, son suficientes para perfundir adecuadamente la parte de tejido al caudal indicado anteriormente.

De manera alternativa, también es posible usar una composición A' acuosa que contiene EGTA para perfundir una parte de hígado o de páncreas.

Para perfundir una parte de hígado o de páncreas, se hace uso preferentemente de una composición B acuosa que tiene un pH de aproximadamente 7,3 a 7,4, preferentemente de aproximadamente 7,35. La composición B es preferentemente DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) con baja glucosa que contiene HEPES, CaCh y colagenasa tipo IV 50 U/ml.

En este caso también, una perfusión a aproximadamente 37°C y un caudal de aproximadamente 10 ml/min ha probado ser conveniente. Unos pocos minutos, en particular de aproximadamente 5 a 10 minutos, por ejemplo de aproximadamente 6 a 7 minutos, son suficientes para perfundir adecuadamente la parte de tejido.

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De manera alternativa, también es posible usar una composición B' acuosa, que contiene colagenasa e hialuronidasa, para perfundir una parte del hígado o del páncreas. Preferentemente, 1.000 ml de la solución contienen 50 U de hialuronidasa/ml.

Es ventajoso que la vitalidad de las células sea aislada si la parte de tejido se trata inicialmente con la composición A y a continuación se trata con la composición B. De manera alternativa, es posible usar una composición A' inicialmente y a continuación usar una composición B'.

Después de la perfusión, la parte de tejido puede ser cortada y suspendida cuidadosamente en un medio adecuado, por ejemplo, medio E de Williams. Si la suspensión celular resultante todavía contiene restos celulares relativamente gruesos, estos pueden eliminarse de una manera conocida de por sí, por ejemplo filtrando la suspensión celular a través de una red de nylon (100 pm). A continuación, las células del filtrado pueden ser sedimentadas cuidadosamente, en conexión con lo cual se ha demostrado que una centrifugación de tres minutos a 60-130 g y 4-22°C es ventajosa.

Las células que se han aislado se cargan sobre las matrices de una manera conocida de por sí. Como regla general, las células se cargan sobre la matriz como una solución que contiene células y, a continuación, las células y la matriz se incuban, normalmente bajo condiciones de cultivo celular, hasta que las células se adhieran a la matriz. A medida que se proporcionan células de islotes de Langerhans sobre la matriz con al menos otro tipo de células, es decir, hepatocitos, los diferentes tipos de células pueden cargarse, en principio, de manera conjunta o bien consecutiva, sobre la matriz.

Más específicamente, preferentemente, las células de los islotes de Langerhans se cargan inicialmente, seguidas por hepatocitos, con una incubación en cada caso que se lleva a cabo después de la carga hasta que al menos una parte de las células se adhiera a la matriz.

De esta manera, la presente invención está dirigida, en particular, al tratamiento de enfermedades que conducen a enfermedad hepática o pancreática crónica y/o insuficiencia hepática y pancreática crónica. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, hepatitis crónica y cirrosis biliar en adultos, así como atresia biliar y defectos metabólicos congénitos en niños. De hecho, la matriz de la invención puede usarse para aliviar una enfermedad en todos los casos en los que está indicado un trasplante de hígado y en todos los casos de insuficiencia hepática o insuficiencia hepática. Por otro lado, un trasplante de páncreas está indicado, en particular, en el caso de todas las formas de diabetes mellitus, en particular diabetes mellitus tipo I o tipo II. El implante reivindicado puede usarse también para tratar enfermedad pancreática o insuficiencia pancreática. El procedimiento para fabricar la matriz de la presente invención se describe más detalladamente en los ejemplos. Los ejemplos siguientes son ilustrativos, pero no limitan el alcance de la presente invención. Pueden realizarse aquí variaciones razonables, tales como las que idearía un artesano razonable, sin apartarse del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Se prepararon matrices de 20 mm de diámetro y 2 mm de espesor mediante el procedimiento siguiente:

La estructura primaria tridimensional se preparó a partir de PGLA mediante una técnica de lixiviación de partículas usando partículas de cloruro sódico tamizadas.

Se adquirió poli (ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA 75:25), con un peso molecular de 90-126 kD, de Evonik Industries AG (Essen, Alemania). Los gránulos de PGLA se congelaron en nitrógeno líquido (N2) y se trituraron a 10.000 rpm durante 2 minutos (sistema de impacto Daschler). El procedimiento de trituración se llevó a cabo en un molino de bolas y se tamizó después de la molienda. Las partículas obtenidas de esta manera tenían un diámetro medio de 108-250 pm. En una etapa siguiente, el NaCl puro se trituró a 10.000 rpm durante 2 minutos. Las partículas obtenidas de esta manera tenían un diámetro medio de 108-390 pm. 2 g de los gránulos poliméricos se disolvieron en 50 ml de cloroformo a una temperatura de 22,5°C durante 80 minutos, dando la solución (A) de polímero.

0,5 g de los gránulos de polímero triturados y 48 g de las partículas de NaCl trituradas se mezclaron a 90 rpm durante 4 minutos, se guardaron con la solución (A) de polímero y se colocaron en plaquetas cerámicas circulares. El disolvente se vaporizó a 35°C durante 28 horas. La vaporización del disolvente se llevó a cabo en un horno de temperatura controlada, colocado en una campana de humos para extraer gases tóxicos de cloroformo. El compuesto de sal/polímero restante se presurizó a 6,89 mPa (1.000 psi) durante 1 min antes de que el NaCl se lixiviara lavando el compuesto con agua desionizada hasta que el peso de la estructura primaria seca permaneciese inalterado. El producto formado de esta manera de una estructura primaria tridimensional con poros primarios se secó a 40°C durante 12 horas. Un análisis SEM demostró que la estructura primaria tenía una estructura de poros uniformemente distribuida e interconectada. El tamaño y la morfología de los poros eran los mismos que los de las partículas de NaCl usadas.

La estructura primaria se sumergió a continuación en solución ácida de colágeno tipo I (1,0% p/v), pH 3,2, adquirida a ICN Biomedicals, Costa Mesa, California) bajo vacío de manera que los poros primarios se llenaran con solución de colágeno. La estructura primaria que contenía la solución de colágeno se congeló posteriormente a -80°C durante 12 horas y se

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liofilizó bajo un vacío de 0,2 torr durante 24 horas adicionales para permitir la formación de una estructura de colágeno secundaria en los poros primarios. La estructura de colágeno se reticuló adicionalmente mediante tratamiento con vapor de glutaraldehído saturado con solución acuosa de glutaraldehído al 25% a 37°C durante 4 horas. Después de ser reticulada, la matriz se trató con solución acuosa de glicina 0,1 M para bloquear los grupos aldehidos no reaccionados. Después de ser lavada con agua desionizada y liofilizada, se obtuvo, como producto final, la matriz que comprende la estructura primaria con poros primarios y una estructura de colágeno secundaria tridimensional con poros secundarios contenidos dentro de los poros primarios.

La porosidad de la matriz se determinó mediante la fórmula siguiente:

0=1- (Volumen Sólido) / (VolúmenTotal)

La porosidad de tres matrices de procesos de producción por lotes se proporciona en la Tabla 1

Tabla 1

lote

Porosidad [%]

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97,4

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99,5

03

99,2

Análisis de hidrofilicidad y propiedades mecánicas

La hidrofilicidad se ensayó de la manera siguiente: se pipetearon, gota a gota, 300 pl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sigma) sobre la matriz para determinar si el líquido es absorbido o repelido por la matriz.

La adherencia celular sobre la matriz se ensayó revistiendo la matriz con colágeno de tipo 1 y pipeteando, gota a gota, 300 pl de suspensión de células sobre la matriz. A continuación, la matriz cargada con suspensión de células se incubó a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. Las células que permanecían en la suspensión y, por lo tanto, no unidas a la matriz se contaron después de uno y tres días mientras se cambiaba el medio.

El número de células se determinó con un hemocitómetro (cámara de Neubauer mejorada) después de teñir la suspensión de células con solución de azul de triptano al 0,2% durante 2 minutos.

El número de células unidas se determinó según la fórmula siguiente:

[número de células sembradas en la matriz] - [número de células que permanecen en los pocilios]

= número de células adheridas a la matriz.

Ejemplo 2: Aislamiento de células

Algunas abreviaturas y sustancias:

- EGTA: ácido etilenglicol tetraacético (Sigma E4378)

- Colagenasa tipo I: (Worthington 4196; 246 U/mg)

- FCS: suero fetal de ternera (Sigma F2442)

- HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico (Sigma)

- Medio E de Williams: medio estándar para cultivar hepatocitos que comprende "Medio E de William (Sigma W4128) y 10% vol. de suero del donante o 10% vol. de FCS.

Se extrajo una parte del hígado, de una manera conocida de por sí, del individuo a ser trasplantado. En primer lugar, la

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parte de hígado extraída se perfundió durante 7 minutos, a un caudal de 30 ml/min y a 37°C, con una solución (8 g de NaCI, 0,2 g de KCl, 0,266 g de Na3PO4 ■ 12 H2O, 1,8 g de glucosa y 0,19 g de EGTA; con agua destilada hasta 1.000 ml; pH 7,4). A continuación, la parte de hígado se perfundió durante 10 minutos adicionales, a un caudal de 30 ml/min y a 37°C, con una solución de colagenasa/hialorunidasa (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 0,266 g de Na3PO4-12 H2O 1,8 g de glucosa, 0,735 g de CaCh y 5-10 ml de HEPES; 10 U/ml de colagenasa; con agua destilada hasta 1.000 ml; pH 7,2). Después de finalizar la perfusión, la parte de hígado se cortó y se suspendió cuidadosamente en el medio E de Williams. La suspensión de células se filtró (nailon 100 pm) y a continuación se lavó con medio E de Williams. Después de eso, las células se centrifugaron a 100 g a temperatura ambiente durante 5-10 min. La viabilidad de las células, que se determinó usando Tryptan Blue (0,2%), fue del 70%.

La viabilidad de la suspensión celular se determinó usando el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano y usando la fórmula siguiente:

Viabilidad en %

células viables contadas x 100 número total de células

Las células de los islotes de Langerhans se aislaron a partir de una parte del páncreas de la misma manera.

Ejemplo 3: Colonización de células

En la primera etapa, las matrices se incubaron con hepatocitos junto con células de los islotes de Langerhans que se aislaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Para ello, se prepararon una solución de hepatocitos y una solución de células de los islotes de Langerhans suspendiendo hepatocitos y células de los islotes de Langerhans, respectivamente, en medio E de Williams caliente, completado con suero y la concentración celular de cada solución se ajustó a aproximadamente 1 a 3x106 células/ml. El número de células se determinó mediante recuento en un tubo de conteo de 0,25 mm bajo un microscopio Olympus invertido.

18 ml de solución de hepatocitos y 2 ml de solución de células de islotes pancreáticos de Langerhans se unieron y se resuspendieron cuidadosamente con el fin de obtener 20 ml de solución celular para el trasplante autólogo. De esta manera, la relación de hepatocitos a células de islotes de Langerhans en la solución mixta de células estaba comprendida en el intervalo de 9:1.

Se prepararon 20 matrices en una placa de múltiples paredes y a continuación se aplicó 1 ml de la solución mixta de células preparada anteriormente (que comprende un número total de 1x106 a 3x106 células) a cada matriz usando una pipeta. Las matrices que habían sido tratadas de esta manera se colocaron a continuación, durante 1 hora, en un incubador de cultivo celular para permitir que las células se adhieran. A continuación, se pipeteó cuidadosamente otro 1 ml de medio E de Williams caliente, completado con suero humano, en cada pocillo de la placa de múltiples paredes como un suministro adicional para las células. Las matrices se incubaron a 37°C, a 5% de CO2 y 95% de humedad relativa durante 24 a 36 horas.

El número de células por matriz se determinó después de la incubación para determinar la tasa de adherencia de las células implantadas sobre la matriz. Las tasas de adherencia se encontraban en el intervalo del 30% al 66%

Antes de la implantación, las matrices podrían mantenerse durante aproximadamente 1,5 horas sobre hielo. Si se ha planificado una implantación para un tiempo posterior, la matriz podría almacenarse bajo condiciones estándar en un reactor de bio-flujo durante un máximo de 5 días.

Ejemplo 4: Actividad secretora y tasa de proliferación de los hepatocitos

Se trasplantaron ratas Lewis con matrices colonizadas por células preparadas según el Ejemplo 3 en un procedimiento de implantación ortotópico o heterotópico. Los trasplantes se retiraron una vez más de los animales en diversos tiempos y se examinaron morfométricamente. El número de células en los trasplantes, que exhibieron la forma de un disco circular que tenía un diámetro de 15 mm y un espesor de 2 mm, era de 94x103, 140*103 y, respectivamente, 146x103 a los 1, 6 y 12 meses después del trasplante.

El análisis histoquímico demostró la secreción de albúmina desde las células del implante. Se ha encontrado que la secreción comienza después de dos semanas. Los hepatocitos del trasplante que se retiró un mes después del trasplante exhibieron una expresión normal de albúmina. Se encontraron hepatocitos proliferativos en todas las preparaciones sin que existiera ningún aumento patológico en la tasa de proliferación. Los hepatocitos que habían sido trasplantados según la invención exhibieron una incorporación de BrdU que se incrementó en un factor de 3 en comparación con la de las preparaciones de hígado estándar. Después de la implantación, se investigaron las actividades metabólicas de los

hígados.

Ejemplo 5: Vascularización

Una investigación adicional de las matrices preparadas según el Ejemplo 3 mostró que estas matrices estaban extraordinariamente bien vascularizadas sólo un mes después de la implantación. Los vasos sanguíneos extendidos 5 macroscópicamente a la matriz y los hepatocitos trasplantados y las células del islote de Langerhans entraron en contacto como resultado de una capilarización adecuada, con el sistema cardiovascular del receptor del trasplante.

Además, pudo observarse que las células co-trasplantadas del islote de Langerhans no causaron hipoglucemia en el receptor. El rendimiento de la secreción endocrina de estas células, y también de las propias células de los islotes del receptor, fue regulado presumiblemente por un mecanismo de retroalimentación.

10 Ejemplo 6: Adopción de la función hepática

Las ratas Gunn se consideran un modelo animal para el síndrome de Crigler-Najar humano, ya que, como resultado de un defecto enzimático metabólico congénito específico, sus hígados son incapaces de conjugar adecuadamente la bilirrubina. Como consecuencia, los niveles tóxicos en el plasma sanguíneo de bilirrubina no conjugada conducen a la muerte como resultado de un daño consecuente sustancial.

15 Se trasplantaron tres ratas Gunn con una matriz colonizada por células preparada según el Ejemplo 3. La matriz tenía un área exterior de 10 cm2.

El nivel de bilirrubina en los animales experimentales cayó sólo cuatro semanas después del trasplante. A partir de ahí, la bilirrubina estaba siendo conjugada. En los tres casos, la bilirrubina conjugada pudo ser detectada, usando una sonda de conducto biliar, en los conductos biliares del hígado que todavía estaban presentes. Por consiguiente, la bilirrubina que se 20 conjugó en la matriz alcanzó el hígado hematogénicamente y podría ser eliminada del hígado a través del sistema de conducto biliar.

Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Implante para ingeniería de tejidos, que comprende una matriz porosa con células de islotes de Langerhans y hepatocitos

   en el que la matriz comprende además un primer componente polimérico biodegradable y biocompatible que forma una estructura primaria tridimensional con poros primarios y que comprende además un segundo componente polimérico biodegradable y biocompatible distinto del primer componente polimérico seleccionado de entre el grupo que consiste en colágenos, laminina, fibronectina y sus mezclas, en el que el segundo componente polimérico forma una estructura secundaria tridimensional que está contenida dentro del espacio interior de al menos una parte de los poros primarios,

   en el que la relación de hepatocitos a células de islotes de Langerhans es aproximadamente 1x106 hepatocitos a 20'000-500'000 células de islotes de Langerhans.
2. 2. Implante según la reivindicación 1, en el que el primer componente polimérico se selecciona de entre el grupo que consiste en poli (ácido glicólico), poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico-ácido láctico) y sus mezclas.
3. 3. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el segundo componente polimérico es colágeno.
4. 4. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los poros primarios tienen un diámetro promedio de tamaño de poro de 150 pm a 300 pm, preferentemente de 200 pm a 300 pm.
5. 5. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el segundo componente polimérico forma una

   estructura secundaria tridimensional con poros secundarios.
6. 6. Implante según la reivindicación 5, en el que los poros secundarios tienen un diámetro promedio de tamaño de poro más pequeño que el diámetro promedio de tamaño de poro de los poros primarios y están comprendidos en el intervalo de 50 pm a 290 pm, preferentemente 50 pm a 150 pm, más preferentemente de 50 pm a 100 pm.
7. 7. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que tiene una porosidad de al menos el 80%, preferentemente

   de al menos el 90%, lo más preferentemente de entre el 95% y el 99,5%.
8. 8. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende aproximadamente 1 x 106 hepatocitos a 20'000- 100'000 células de islotes de Langerhans.
9. 9. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende aproximadamente 1 x 106 hepatocitos a 20'000- 70'000 células de islotes de Langerhans.
10. 10. Implante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de enfermedad hepática o enfermedad pancreática crónicas y/o insuficiencia hepática e insuficiencia pancreática crónicas.