ES2628753T3

ES2628753T3 - Matriz, implante celular, procedimiento para su preparación y su uso

Info

Publication number: ES2628753T3
Application number: ES10179005.3T
Authority: ES
Inventors: Martin GÖRNE; Peter-Matthias Kaufmann
Original assignee: Human Auto Cell Ltd
Current assignee: Human Auto Cell Ltd
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2017-08-03
Anticipated expiration: 2024-06-07
Also published as: EP2256155B1; AU2010257321B2; CA2527578A1; JP2007527435A; ES2614628T3; US20070166343A1; JP4975432B2; US8309115B2; EP1633807B8; CN100447186C; CN101450229B; AU2004245235A2; EP2256155A1; US7618646B2; AU2004245235A1; RU2005141405A; AU2010257321A1; CN1816588A; RU2392287C2; US20100028405A1

Abstract

Implante autólogo para su uso en el tratamiento de un individuo que requiere un trasplante de hígado o de páncreas, en donde el implante autólogo puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la inoculación de una matriz porosa a base de un polímero o de una mezcla de polímeros biológicamente compatibles 5 con células hepáticas y pancreáticas vitales de la persona, en donde la matriz porosa puede obtenerse compactando una mezcla de partículas de polímero con un tamaño de grano en el intervalo de 20 a 950 mm y partículas de cloruro de sodio con un tamaño de grano en el intervalo de 90 a 670 mm y eliminando posteriormente el cloruro de sodio y presentando la matriz porosa poros con un tamaño de 130 mm o inferior y poros con un tamaño de 370 mm o más y el grado de porosidad es la indicación numérica en % con respecto a la proporción del volumen de poros en el volumen total de la matriz y asciende a del 93 % al 98 % y presentando la matriz la siguiente distribución de tamaño de poro: del 0,5 % al 6 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 70 a 100 mm; del 2 % al 8 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 101 a 115 mm; del 2 % al 8 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 116 a 130 mm; del 1 % al 7 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 131 a 300 mm; del 11 % al 23 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 301 a 330 mm; del 4 % al 10 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 331 a 360 mm; del 5 % al 17 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 361 a 390 mm; del 7 % al 19 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 391 a 420 mm; del 3 % al 9 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 421 a 450 mm, del 12 % al 24 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 451 a 480 mm; y del 5 % al 17 % de poros con un diámetro promedio en el intervalo de 481 a 510 mm, determinándose los tamaños de poro y la distribución de tamaños de poro mediante microscopía electrónica de barrido.

Description

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DESCRIPCION

Matriz, implante celular, procedimiento para su preparacion y su uso

La presente invencion se refiere a implantes autologos para su uso en el tratamiento de una persona que requiere un trasplante de hlgado o de pancreas.

La ingenierla de tejidos es un campo interdisciplinar que une las ciencias de materiales y de ingenierla con la medicina. El objetivo es regenerar tejido danado o mejorar su funcion.

El principio de la ingenierla de tejidos es relativamente sencillo: en primer lugar se extraen del paciente algunas celulas y se proliferan in vitro. Las celulas proliferadas pueden incrustarse entonces en una sustancia de soporte, de manera que se produce un sustituto de tejido completo, vivo, que se trasplanta de nuevo al paciente. A diferencia de un trasplante alogenico convencional, que requiere un donante adecuado y por regla general que requiere una inmunosupresion farmacologica de por vida, este procedimiento ofrece la ventaja decisiva de poder usar celulas propias del cuerpo (autologas).

Son especialmente importantes para la aceptacion y la capacidad de funcionamiento de los implantes el tipo y la estructura de la sustancia de soporte usada, a continuacion denominada tambien matriz. Al margen del material que va a usarse, concretamente por regla general pollmeros biodegradables, desempenan el tamano de poro, la porosidad y la superficie al igual que la forma de poro, la morfologla de la pared de poro y la conectividad entre los poros un papel decisivo para el desarrollo posterior de las celulas incrustadas en la sustancia de soporte y finalmente para la estructura tridimensional del tejido u organo que va a regenerarse.

Se conocen ya procedimientos para la generacion de biomatrices de este tipo. As! se usaron ya tecnicas del sector textil para fabricar biomatrices fibrosas de tipo tejido o tambien de tipo de material no tejido. Otro procedimiento familiar, en el que los cristales de sal se introducen en primer lugar en el pollmero biodegradable y a continuacion se eliminan de nuevo, permite controlar el tamano de poro a traves del tamano de las partlculas de sal y la porosidad a traves de la proporcion de sal/pollmero (documento WO 98/44027). En caso de una modificacion del procedimiento se aplican los pollmeros biodegradables disueltos en un disolvente sobre un denominado material porogeno, que a continuacion se elimina de nuevo del material compuesto, de manera que se dejan poros con la forma de la imagen negativa del material porogeno en cuestion (documento WO 01/87575 A2). Tambien se conocen ya matrices revestidas (vease por ejemplo el documento WO 99/09149 A1). Hou y colaboradores describen en Biomaterials, volumen 24, paginas 1937-1947 una serie de distintos procedimientos para la preparacion de matrices polimericas. El documento WO 01/35932 describe matrices porosas a base de un pollmero biologicamente compatible y procedimientos para su preparacion. El documento WO 98/44027 describe un procedimiento para la preparacion de matrices biodegradables de poro abierto. El documento US 6337198 B1 describe matrices porosas biodegradables y biocompatibles con una fase polimerica esencialmente continua. El documento WO 2004/031371 A2 describe matrices polimericas que pueden usarse para ingenierla de tejidos. El documento WO 94/25079 A1 describe pollmeros porosos, biodegradables para trasplantes celulares.

No obstante no satisfacen en todos los casos las biomatrices generadas hasta ahora con este procedimiento en particular en cuanto a la aceptacion y la capacidad de funcionamiento de implantes que se basan en estas. En particular con implantes de hlgado y pancreas no se ha logrado hasta ahora aun ningun sustituto aceptable de los organos.

El objetivo en el que se basa la presente invencion, proporcionar un implante funcional de este tipo, lo logra la invencion mediante biomatrices determinadas y correspondientes implantes, que pueden obtenerse con un procedimiento especial.

Por tanto, son objeto de la presente invencion los objetos definidos en las reivindicaciones.

El grado de porosidad es la indication numerica en % con respecto a la proporcion del volumen de poros en el volumen total de la matriz.

Con poros se refiere a las cavidades existentes en la matriz porosa, que tienen en el presente caso en el coste 2dimensional una forma angular, en particular octogonal o visto 3-dimensionalmente una forma angulosa. Preferentemente esta caracterizada la forma ademas por estiramientos, de modo que puede compararse la forma de las cavidades con la forma de celulas nerviosas. El tamano de un poro puede indicarse con ayuda de un diametro, es decir el promedio del diametro mas largo y del diametro mas corto de los poros que pueden distinguirse en el corte 2-dimensional.

Una matriz porosa presenta poros con distintos tamanos, estando distribuidos los tamanos por un determinado intervalo (distribucion de tamano de poro). De acuerdo con la invencion es importante que una matriz presente una distribucion de tamano de poro ancha. Son especialmente ventajosas las matrices que presentan poros con un tamano de 130 pm o inferior. Son especialmente ventajosas las matrices que presentan poros con un tamano de 370

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mm o mas. Las matrices que presentan tanto poros con un tamano de 130 mm o inferior como tambien poros con un tamano de 370 mm o mas, pertenecen a la invencion. Estos valores pueden combinarse de manera discrecional para obtener intervalos mlnimos, por los que debe extenderse la distribucion de tamano de poro, pudiendose mencionar en particular los intervalos de 150 a 300, de 140 a 350 y de 130 a 370 mm. En particular se prefiere cuando la respectiva distribucion de tamano de poro presenta maximos de frecuencia fuera del intervalo de 150 a 300 mm, es decir un maximo de frecuencia se encuentra por encima de un tamano de poro de 300 mm y otro maximo de frecuencia se encuentra por debajo de un tamano de poro de 150 mm.

Una matriz porosa tlpica presenta la siguiente distribucion de tamano de poro. Del 0,5 % al 6 %, preferentemente del 1 % al 5 %, aun mas preferentemente del 2 % al 4 % y en particular el 3 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 70 a 100 um; del 2 % al 8 %, preferentemente del 3 % al 7 %, aun mas preferentemente del 4 % al 6 % y en particular aproximadamente el 5 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 101 a 115 um; del 2 % al 8 %, preferentemente del 3 % al 7 %, aun mas preferentemente del 4 % al 6 % y en particular el 5 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 116 a 130 um; del 1 % al 7 %, preferentemente del 2 % al 6 %, aun mas preferentemente del 3 % al 5 % y en particular del 4 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 131 a

300 um; del 11 % al 23 %, preferentemente del 13 % al 21 %, aun mas preferentemente del 15 % al 19 % y en

particular el 17 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 301 a 330 um; del 4 % al 10 %, preferentemente del 5 % al 9 %, aun mas preferentemente del 6 % al 8 % y en particular el 7 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 331 a 360 um; del 5 % al 17 %, preferentemente del 7 % al 15 %, aun mas

preferentemente del 9 % al 13 % y en particular el 11 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 361 a

390 um; del 7 % al 19 %, preferentemente del 9 % al 17 %, aun mas preferentemente del 11 % al 15 % y en particular el 13 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 391 a 420 um; del 3 % al 9 %, preferentemente del 4 % al 8 %, aun mas preferentemente del 5 % al 7 % y en particular el 6 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 421 a 450 um; del 12 % al 24 %, preferentemente del 14 % al 22 %, aun mas preferentemente del 16 % al 20 % y en particular el 18 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 451 a 480 um; y del 5 % al 17 %, preferentemente del 7 % al 15 %, aun mas preferentemente del 9 % al 13 % y en particular el 11 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 481 a 510 mm. Resulta por tanto por regla general una distribucion de tamano de poro con mas de un maximo, lo que corresponde a un aumento de poros en mas de un intervalo de tamano. Esto es especialmente importante para las propiedades de matrices de acuerdo con la invencion.

El volumen de cavidades y con ello el grado de porosidad se determinan de manera en si conocida mediante porosimetrla.

Los tamanos de poro y con ello tambien la distribucion de tamano de poro pueden determinarse por ejemplo mediante microscopla electronica de barrido. Para ello se producen cortes delgados de la matriz que va a someterse a prueba y se revisten con oro. Los registros de microscopla electronica de barrido se evaluan, midiendose todos los poros de una superficie definida, es decir determinandose para cada poro el diametro mas largo y el diametro mas corto, formandose la suma a partir de ambos valores y dividiendo se suma entre 2.

El termino “matriz” se refiere a un soporte tridimensional que es adecuado para el asentamiento de celulas. En este sentido sirve la matriz como modelo de estructura tridimensional (molde) para el asentamiento de celulas o bien tejidos. Este asentamiento puede realizarse in vitro o in vivo. Ademas, la matriz sirve en caso de trasplante para la localization del trasplante y tambien como espaciadores para tejido, que se forma paulatinamente in vivo.

El pollmero puede ser en principio cualquier pollmero que puede usarse en el sector de la medicina y en particular de la medicina de trasplantes. Segun esto son biologicamente compatibles tambien pollmeros que si bien se reconocen como extrano por un huesped, sin embargo puede suprimirse su rechazo mediante correspondiente inmunosupresion. Pueden usarse pollmeros que esencialmente no puedan degradarse biologicamente. Sin embargo se prefieren pollmeros que puedan degradarse biologicamente al menos en parte predominante.

La expresion “biodegradable” se refiere a un material, que los seres vivos (o llquidos corporales o cultivos celulares que pueden derivarse de seres vivos) pueden transferir en productos que pueden metabolizarse. A los pollmeros biodegradables pertenecen por ejemplo pollmeros biorreabsorbibles y/o bioerosionables. Bioerosionable se refiere a la capacidad de disolverse o suspenderse en llquidos biologicos. Biorreabsorbible quiere decir la capacidad de poder absorberse por celulas, tejido o llquidos de un ser vivo.

A los pollmeros biodegradables adecuados de acuerdo con la invencion pertenecen en principio todos los pollmeros que pueden usarse en el sector de la medicina, a lo cual pertenecen ademas de los pollmeros establecidos ya en el sector de la ingenierla de tejido por ejemplo tambien pollmeros que han encontrado acceso en dispositivos de emision de principios activos, tales como parches e implantes de principios activos.

A los pollmeros naturales adecuados pertenecen por ejemplo polipeptidos tales como albumina, fibrinogeno, colageno y gelatina, as! como polisacaridos, tales como quitina, quitosano, alginato y agarosa. Eventualmente pueden estar tambien modificados estos pollmeros naturales, por ejemplo pueden estar reticulados

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transversalmente protelnas tales como colageno.

A los pollmeros sinteticos adecuados pertenecen por ejemplo determinados polianhldridos, en particular poli(acido sebacico-acido hexadecandioico), poli(e-caprolactona), poli(ortoester), y sobre todo poli(a-hidroxiester) tal como poli(acido glicolico), poli(acido lactico) y poli(acido glicolico-acido lactico). As! se basan las matrices e implantes de acuerdo con la invencion preferentemente en pollmeros biodegradables, que contienen unidades de repeticion de formula (I):

H O

— O—JJ—

R

en la que R1 representa hidrogeno o metilo. Con respecto a las unidades de acido lactico, se prefiere as! la forma L (el enantiomero S). Como pollmero especialmente preferente puede mencionarse poli(acido glicolico-acido lactico) con una proporcion de acido glicolico con respecto a acido lactico de 99:1 a 1:99, preferentemente de 10:90 a 90:10, por ejemplo del 15:85 % en moles.

Igualmente pueden ser convenientes mezclas de dos o varios pollmeros.

Ademas del tipo de pollmero determina conjuntamente tambien su peso molecular las propiedades de la matriz resultante. En general se aplica que la porosidad de la matriz disminuye con peso molecular creciente del pollmero usado. Esto se aplica en particular cuando en la preparacion de la matriz se espuma el material, es decir se mezcla bajo presion con un gas tal como CO2, que se disuelve en primer lugar en el pollmero y forma poros al disminuir la presion.

Ademas, la cristalinidad del pollmero usado repercute en las propiedades de la matriz resultante. En este caso se aplica que la porosidad de la matriz resultante aumenta en general con la disminucion de la cristalinidad, por lo que se prefiere pollmero amorfo en particular para matrices con alta porosidad. Tambien este aspecto desempena en particular un papel cuando el material se espuma en la production de la matriz.

Otro objeto son matrices porosas a base de un pollmero biodegradable, que estan caracterizadas por que la superficie de la matriz esta revestida con al menos una protelna de matriz extracelular.

Las protelnas de matriz extracelular se conocen en general. Se prefieren colagenos, en particular colagenos del tipo I y IV, laminina y fibronectina. Estas protelnas pueden prepararse de manera en si conocida en forma purificada o pueden adquirirse tambien comercialmente. De acuerdo con una forma de realization, los revestimientos de matrices porosas contienen fibronectina como protelna de matriz extracelular. De acuerdo con otra forma de realizacion, los revestimientos de matrices porosas contienen como protelna de matriz extracelular una mezcla de colageno del tipo I, laminina y colageno del tipo IV, prefiriendose en este caso que la mezcla contenga las protelnas en proporciones en peso aproximadamente igual.

Se prefieren especialmente matrices que estan revestidas del tipo y modo descritos anteriormente y que cumplen al menos uno de los siguientes criterios adicionales:

- los poros de las matrices presentan los tamanos de poro o bien la distribution de tamano de poro indicados anteriormente;

- el grado de porosidad asciende a del 93 % al 98 %;

- los poros presentan la forma indicada anteriormente;

- el pollmero biodegradable es uno de los pollmeros naturales o sinteticos indicados anteriormente, en particular poli(acido glicolico-acido lactico) con una proporcion de acido lactico del 85 % en moles y una proporcion de acido glicolico del 15 % en moles.

Las matrices revestidas de esta manera pueden obtenerse por ejemplo debido a que se sumerge la matriz no revestida en una solution, que contiene la protelna o la mezcla de protelnas prevista para el revestimiento, y a continuacion se seca la matriz humedecida con la solucion. A este respecto esto es por regla general de modo que dependiendo de las dimensiones del cuerpo de matriz que va a revestirse, la solucion humedece sobre todo las zonas externas del cuerpo de matriz, mientras que en el interior del cuerpo de matriz penetra la solucion comparativamente menos. Esto puede tener como consecuencia que no resulte un revestimiento uniforme de la superficie de matriz total, sino que la densidad del revestimiento disminuya de fuera hacia dentro.

Como alternativa o adicionalmente a un revestimiento pueden absorberse sustancias biologicamente activas en el pollmero o incluso pueden enlazarse con el mismo. A esto pertenecen por ejemplo principios activos sinteticos

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(moleculas inorganicas u organicas), protelnas, polisacaridos y otros azucares, llpidos y acidos nucleicos, que influyen por ejemplo en el crecimiento celular, la migracion celular, la division celular, la diferenciacion celular y/o el crecimiento de tejido, o bien tienen acciones terapeuticas, profilacticas o de diagnostico. Pueden mencionarse por ejemplo principios activos de accion vascular, principios activos de accion neuronal, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, esteroides, anticoagulantes, principios activos antiinflamatorios, principios activos inmunomoduladores, principios activos citotoxicos, antibioticos y principios activos antivirales.

La presente invention se refiere tambien a un procedimiento para la preparation de una matriz porosa a base de un pollmero o de una mezcla de pollmeros biologicamente compatible, que esta caracterizado por que se compacta una mezcla de partlculas de pollmero y partlculas de cloruro de sodio con tamano de grano definido y a continuation se elimina el cloruro de sodio.

Las partlculas de pollmero con un tamano de grano en el intervalo de 20 a 950 pm, ventajosamente en el intervalo de 20 a 760 pm y en particular en el intervalo de 108 a 250 pm y partlculas de cloruro de sodio con un tamano de grano en el intervalo de 90 a 670 pm, ventajosamente en el intervalo de 110 a 520 pm y en particular en el intervalo de 250 a 425 pm han resultado convenientes para el ajuste de los tamanos de poro o distribution de tamanos de poro deseados. Ademas ha resultado conveniente una proportion en peso de partlculas de pollmero con respecto a partlculas de cloruro de sodio en el intervalo de 1:100 a 1:10, ventajosamente en el intervalo de 1:50 a 1:15 y en particular en el intervalo de 1:20 a 1:18 para el ajuste de la porosidad deseada.

Adicionalmente ha resultado conveniente usar sal y pollmero con una determinada distribucion de tamano de grano. Con respecto al cloruro de sodio usado para la preparacion de la matriz, es entonces favorable cuando la proporcion de sal con un tamano de grano de 250 pm a 320 pm asciende a del 15 % al 50 %, ventajosamente del 18 % al 42 % y preferentemente del 22 % al 28 %; la proporcion de sal con un tamano de grano de 330 pm a 380 pm asciende a del 20 % al 65 %, ventajosamente del 30 % al 52 % y preferentemente del 42 % al 46 %; y la proporcion de sal con un tamano de grano de 390 pm a 425 pm asciende a del 15 % al 62 %, ventajosamente del 25 % al 42 % y preferentemente del 29 % al 33 %, refiriendose las indicaciones en porcentaje al peso de sal usado en total para la preparacion. Proporciones con tamanos de grano por encima y/o por debajo de los intervalos indicados no estan descartados con esto.

De acuerdo con una forma de realization especial ha resultado favorable cuando la proporcion de partlculas de cloruro de sodio con un tamano de grano de 108 pm a 140 pm asciende a del 1 % al 15 % en peso, preferentemente del 4 % al 12 % en peso y en particular del 7 % al 9 % en peso, la proporcion de sal con un tamano de grano de 145 pm a 180 pm asciende a del 1 % al 11 % en peso, preferentemente del 3 % al 9 % en peso y en particular del 5 % al 7 % en peso, la proporcion de sal con un tamano de grano de 185 pm a 220 pm asciende a del 3 % al 21 % en peso, preferentemente del 7 % al 17 % en peso y en particular del 10 % al 14 % en peso, la proporcion de sal con un tamano de grano de 225 pm a 250 pm asciende a del 1 % al 11 % en peso, preferentemente del 3 % al 9 % en peso y en particular del 5 % al 7 % en peso, la proporcion de sal con un tamano de grano de 250 pm a 320 pm asciende a del 15 % al 50 % en peso, preferentemente del 18 % al 42 % en peso y en particular del 22 % al 28 % en peso, la proporcion de sal con un tamano de grano de 330 pm a 380 pm asciende a del 15 % al 50 % en peso, preferentemente del 18 % al 42 % en peso y en particular del 22 % al 28 % en peso, y la proporcion de sal con un tamano de grano de 390 pm a 425 pm asciende a del 5 % al 29 % en peso, preferentemente del 10 % al 24 % en peso y en particular del 15 % al 19 % en peso.

Con respecto al pollmero usado para la preparacion de la matriz, es entonces favorable cuando la proporcion de pollmero con un tamano de grano de 108 pm a 140 pm asciende a del 5 % al 50 %, ventajosamente del 10 % al 30 % y preferentemente del 14 % al 18 %; la proporcion de pollmero con un tamano de grano de 145 pm a 180 pm asciende a del 10 % al 55 %, ventajosamente del 15 % al 40 % y preferentemente del 20 % al 24; la proporcion de pollmeros con un tamano de grano de 185 pm a 220 pm asciende a del 18 % al 88 %, ventajosamente del 32 % al 76 % y preferentemente del 43 % al 49 %, y la proporcion de pollmero con un tamano de grano de 225 pm a 250 pm asciende a del 5 % al 45 %, ventajosamente del 10 % al 28 % y preferentemente del 14 % al 18 %, refiriendose las indicaciones en porcentaje al peso de pollmero usado en total para la preparacion.

Para obtener partlculas de sal o bien de pollmero de la distribucion de tamano de grano deseada, es conveniente por regla general triturar en primer lugar artlculos habituales en el comercio. Esto puede realizarse en dispositivos usuales para ello, por ejemplo mecanismos percutores o molinos. Sin embargo es determinante para la distribucion de tamano de grano deseada el cribado posterior con ayuda de tamices de analisis usuales.

La compactacion se realiza preferentemente mediante accion de presion. Para ello puede compactarse la mezcla de pollmero/cloruro de sodio en una prensa hidraulica convencional con una presion de punzon en el intervalo de aproximadamente 780 psi a 1450 psi, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 840 psi a 1230 psi y en particular en el intervalo de aproximadamente 900 psi a 1100 psi. Ha resultado conveniente dejar actuar la presion durante aproximadamente de 10 s a 360 s, ventajosamente durante aproximadamente de 40 s a 180 s y en particular durante aproximadamente de 50 s a 70 s a temperaturas en el intervalo de 18 °C a 25 °C.

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La eliminacion del cloruro de sodio se logra por ejemplo con agua o soluciones acuosas. As! puede regarse la mezcla compactada (pieza bruta de matriz) durante aproximadamente de 1 h a 80 h, ventajosamente durante aproximadamente 12 h a 62 h y en particular durante aproximadamente 36 h a 60 h.

Ademas es ventajoso cuando la mezcla compactada se almacena antes de la eliminacion del cloruro de sodio en primer lugar en una atmosfera de CO2. As! puede gasificarse la mezcla compactada por ejemplo con una presion de CO2 en el intervalo de aproximadamente 140 psi a 1650 psi, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 360 psi a 1120 psi y en particular en el intervalo de aproximadamente 800 psi a 900 psi, habiendo resultado convenientes en este caso tiempos en el intervalo de aproximadamente 1 h a 180 h, ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 3 h a 60 h y en particular en el intervalo de aproximadamente 12 h a 36 h. Despues se reduce la presion, teniendo la velocidad de reduccion de la presion influencia sobre la formacion de poros. Aunque se prefiere el uso de CO2, pueden ser adecuados igualmente otros gases, tales como aire, nitrogeno, helio, neon, cripton, argon, xenon u oxlgeno.

A continuacion se separa el agua o la solucion acuosa para fines de secado de manera en si conocida. Para ello puede colocarse la matriz por ejemplo sobre papel absorbente.

De acuerdo con una forma de realizacion preferente se anade a la mezcla de partlculas de pollmero y partlculas de cloruro de sodio una solucion de pollmero y se separa el disolvente antes de que se compacte. A este respecto pueden basarse las partlculas de pollmero y la solucion de pollmero en el mismo pollmero. Sin embargo puede tratarse tambien de pollmeros distintos, en particular con distinta biodegradabilidad. Aquel de la solucion de pollmero tiene la ventaja de que se insertan por as! decirlo soportes en la matriz, de manera que pueden mejorarse las propiedades mecanicas de la matriz. Una matriz de este tipo presenta en particular una tendencia mas baja al desmenuzado.

El disolvente usado debla disolver el pollmero, sin embargo no la sal. Debido a ello se garantiza que las propiedades porogenas de la sal no se vean influenciadas o se vean influenciadas solo de manera insignificante. Acetona, acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, hexafluoroisopropanol, hidrocarburos clorados y fluorados, alifaticos y aromaticos, tetrahidrofurano, etilmetilcetona, dietilcetona as! como mezclas de los mismo son adecuados por ejemplo para disolver los pollmeros mencionados anteriormente. Para disolver poli(acido glicolico), poli(acido lactico)o poli(acido glicolico-acido lactico) y con respecto al uso medico es adecuado en particular cloroformo.

Si se anaden conjuntamente la solucion de pollmero y la mezcla de partlculas de pollmero/partlculas de sal, se producen en primer lugar una pasta que puede agitarse, que entonces se vuelve solida rapidamente con la separacion del disolvente. La concentracion del pollmero en la solucion puede seleccionarse convenientemente de modo que por un lado el pollmero se haya disuelto completamente, por otro lado puede separarse rapidamente el disolvente sin que se disuelvan parcialmente las partlculas de pollmero en alcance notable.

Ha resultado favorable una proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto al pollmero disuelto de 10:1 a 1:100, ventajosamente de 2:1 a 1:25 y en particular de 1:1 a 1:10.

Con respecto a la proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto a partlculas de cloruro de sodio, puede seleccionarse entonces en el contexto de esta forma de realizacion una proporcion en peso mas alta a favor de cloruro de sodio de hasta 1:200, 1:500 o 1:1000, siendo la proporcion en peso del pollmero total con respecto a cloruro de sodio al igual que antes mayor de 1:100. De esta manera se logra ajustar porosidades por encima del 98 %.

En el procedimiento descrito anteriormente sirve el cloruro de sodio como material porogeno, con lo que se quiere decir de acuerdo con la definicion un material solido o al menos semisolido, que se combina con el pollmero formador de matriz en primer lugar para dar una mezcla y entonces se separa de nuevo de la mezcla, de manera que se producen cavidades (poros). Para ello es conveniente que el material porogeno sea soluble en al menos un disolvente y no sea soluble esencialmente en al menos otro disolvente. Esencialmente es insoluble un material en particular cuando este es soluble en las condiciones de procesamiento, es decir por regla general a temperaturas en el intervalo de 18 °C a 25 °C y con presion normal, en menos del 30 % en peso, preferentemente en menos del 20 % en peso, en particular en menos del 10% en peso, por ejemplo en menos del 5, 4, 3, 2 y 1 % en peso.

La estructura y las propiedades de las matrices resultantes se determinan esencialmente mediante el material porogeno usado para su preparacion. A este respecto desempenan un papel no solo el tipo del material porogeno, sino sobre todo la distribution de tamano de grano de las partlculas porogenas. Entonces se aplica en general que con tamano de grano creciente no solo aumenta el tamano de poro, sino tambien la conectividad, es decir la red de cavidades que se comunican entre si. Esta red, tambien denominada macroestructura o estructura macroporosa, ha de diferenciarse de los poros que pueden obtenerse mediante espumacion, que por regla general son cerrados y por tanto forman una estructura designada como macroestructura o estructura microporosa.

Procedimiento para la preparacion de una matriz porosa a base de un pollmero o de una mezcla de pollmeros biologicamente compatible, caracterizado por que se compacta una mezcla de partlculas de pollmero, partlculas de

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un material porogeno y una solucion de pollmero y a continuacion se elimina el material porogeno.

Este procedimiento no esta basicamente limitado a las caracterlsticas descritas anteriormente. As! puede seleccionarse el pollmero entre polianhldridos, poli(ortoesteres), poli(a-hidroxiesteres), poli(esteramidas), poliamidas, poli(estereteres), policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(oxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinllicos), polivinileteres, poli(esteres vinllicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidonas, polisiloxanos, poliestirenos, poliuretanos, celulosas derivatizadas, pollmeros y copollmeros de acido (met)acrllico. El material porogeno es cloruro de sodio. El pollmero, el material porogeno y el disolvente usado para la formacion de la solucion han de ajustarse basicamente uno con respecto a otro de modo que la solucion contenga pollmero en forma disuelta y partlculas de pollmero en forma solida as! como no disuelva esencialmente el material porogeno.

Objeto de la presente invencion son implantes que comprenden al menos una de las matrices descritas anteriormente y al menos una celula. Dependiendo del fin del implante pueden seleccionarse las celulas a este respecto en particular entre celulas hepaticas, celulas pancreaticas, adipocitos, celulas intestinales, celulas de la piel, celulas vasculares, celulas nerviosas, celulas musculares, celulas tiroideas y celulas de la ralz dental. Las formas de realizacion especiales de implantes de acuerdo con la invencion se refieren a celulas hepaticas y celulas pancreaticas.

Otro objeto de la presente invencion son implantes que comprenden al menos una matriz a base de un pollmero biologicamente compatible y celulas de al menos dos tipos celulares, siendo las celulas del primer tipo celular hepatocitos y las celulas del segundo tipo celular islotes de Langerhans. Este objeto no esta limitado a las matrices descritas anteriormente, es decir implantes a base de las matrices.

Dependiendo del fin del implante, es decir en particular de la funcion que va a cumplir, son ventajosas determinadas proporciones de hepatocitos con respecto a islotes de Langerhans. Asl, una forma de realizacion de la invencion se refiere a implantes que tras el implante muestran las propiedades endocrinas de un organo de pancreas equivalente. Pare esto ha resultado ventajosa una proportion de hepatocitos con respecto a islotes de Langerhans de aproximadamente 106 : 30 00. Otra forma de realizacion de la invencion se refiere a implantes que tras el implante realizan funciones metabolicas de un hlgado. Para esto ha resultado conveniente una proporcion de hepatocitos con respecto a islotes de Langerhans de aproximadamente 106 : 3-200, ventajosamente de 106 : 10-100, en particular de 106 : 20-80 y de manera especialmente preferente de aproximadamente 106 : 35-45.

Puede mencionarse que los implantes de este tipo incluyen por regla general ademas de hepatocitos e islotes de Langerhans otras celulas, concretamente en particular otras celulas hepaticas y pancreaticas, que se producen conjuntamente durante el aislamiento celular.

Las celulas o mezclas de celulas que van a usarse para la colonization de matrices porosas pueden obtenerse de manera en si conocida. En el sentido de un implante autologo proceden las celulas preferentemente del individuo al que debe colocarse el implante. Asl se extrae del individuo por regla general tejido adecuado, por ejemplo un trozo de hlgado o pancreas, y se prepara de manera adecuada para la inoculation y el cultivo in vitro de la matriz. Segun esto es importante que las celulas presenten una tasa de vitalidad lo mas alta posible.

Si se obtienen celulas hepaticas de tejido hepatico, ha de tenerse en cuenta que las celulas hepaticas en particular en el caso de una cirrosis hepatica estan rodeadas por una capa gruesa de tejido conjuntivo. Para poder aislar las celulas hepaticas con una proporcion a ser posible alta de celulas vitales, se usan de acuerdo con la invencion soluciones de determinada composicion.

Una composition acuosa A, que contiene NaCl, KCl y HEPES con un valor de pH de aproximadamente 7,4 es util para su uso para la perfusion de un trozo de hlgado o pancreas. En particular, 1000 ml de esta solucion contienen aproximadamente 8,3 g de NaCl, 0,5 g de KCl y 2,38 g de HEPES. La perfusion se realiza preferentemente a una temperatura de aproximadamente 37 °C y una velocidad de flujo de aproximadamente 30 ml/min. Pocos minutos, en particular aproximadamente de 5 a 120 minutos, por ejemplo aproximadamente 7 minutos, bastan para perfundir de manera suficiente el trozo de tejido a la velocidad de flujo mencionada anteriormente.

Como alternativa a esto puede usarse tambien una composicion acuosa A', que contiene un acido

etilenglicoltetraacetico (EGTA) para perfundir un trozo de hlgado o de pancreas.

Una composicion acuosa B con un valor de pH de aproximadamente 7,3 a 7,4, preferentemente de

aproximadamente 7,35, que contiene NaCl, KCl, HEPES, CaCl2, colagenasa e inhibidor de tripsina, es util para su uso para perfundir un trozo de hlgado o pancreas. Preferentemente, 1000 ml de la solucion contienen 8,3 g de NaCl, 0,5 g de KCl, 2,38 g de HEPES, 0,7 g de CaCl2 x 2 H2O, 500 mg de colagenasa H y 7,5 mg de inhibidor de tripsina.

Tambien en este caso ha resultado conveniente la perfusion a aproximadamente 37 °C y una velocidad de flujo de

aproximadamente 30 ml/min. Pocos minutos, en particular de aproximadamente 5 a 10 minutos, por ejemplo de aproximadamente 6 a 7 minutos, bastan para perfundir de manera suficiente el trozo de tejido.

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Como alternativa a esto puede usarse tambien una composicion acuosa B' para perfundir un trozo de hlgado o de pancreas, que contiene colagenasa y hialuronidasa. Preferentemente, 1000 ml de la solucion contienen de 5 a 10 U/ml de colagenasa y de 5 a 10 U/ml de hialuronidasa.

Es ventajoso para la vitalidad de las celulas que van a obtenerse, cuando el trozo de tejido se trata en primer lugar con composicion A y a continuacion con composicion B. Como alternativa a esto puede usarse en primer lugar una composicion A' y entonces una composicion B'.

A continuacion de la perfusion puede prepararse libremente entonces el trozo de tejido y agitarse cuidadosamente en un medio adecuado, por ejemplo medio E de Williams. Si la suspension celular resultante contiene aun restos celulares mas gruesos, estos pueden separarse de manera en si conocida, por ejemplo filtrandose la suspension celular a traves de una red de nailon (200 um). Las celulas del filtrado pueden sedimentarse entonces de manera cuidadosa, habiendo resultado ventajosa una centrifugacion de tres minutos a 50 g y 4 °C.

La aplicacion de las celulas obtenidas sobre las matrices se realiza de manera en si conocida. Por regla general se aplican las celulas como solucion que contiene celulas sobre la matriz y a continuacion se incuban (habitualmente en condiciones de cultivo celular), hasta que las celulas se adhieren a la matriz. Si se aplican mas de un tipo de celula, por ejemplo hepatocitos e islotes de Langerhans, sobre una matriz, pueden aplicarse los distintos tipos celulares en principio conjuntamente o sin embargo sucesivamente. De acuerdo con una forma de realizacion especial se aplican en primer lugar islotes de Langerhans y a continuacion hepatocitos, incubandose en cada caso tras la aplicacion hasta que al menos una parte de las celulas se adhiera a la matriz.

Los implantes de acuerdo con la invencion presentan ventajas decisivas. Asl, las dimensiones internas de las matrices permiten un asentamiento eficaz con celulas. Las matrices por un lado pueden conformarse libremente y por otro lado ofrecen de manera suficiente estabilidad y rigidez, para soportar el procedimiento de implante quirurgico y resistir a las fuerzas mecanicas que actuan en el lugar de implante. La muerte celular inicial, que comienza tras el implante esta limitada y el tejido implantado puede adoptar tras breve tiempo la funcion pretendida. Brevemente tras el implante se produce la vascularizacion o bien la proliferacion de tejido de granulacion rico en vasos y tambien de tejido nervioso. Las matrices porosas pueden prepararse sin que deban usarse disolventes fisiologicamente preocupantes, por ejemplo formaldehldo, de modo que no sea necesario ningun procedimiento especial para la eliminacion de los disolventes y no exista el riesgo de que queden cantidades residuales de estos disolventes.

Los implantes de acuerdo con la invencion presentan multiples posibilidades de uso. De esto pueden mencionarse en particular usos en el sector de la medicina. Otro objeto de la presente invencion son por tanto los implantes de acuerdo con la invencion para su uso terapeutico.

Un uso especial en este sector es el de la construccion de tejido (ingenierla de tejido). A este respecto sirven las matrices porosas por asl decirlo como soporte (scaffold), en el que migran celulas y/o se adhieren.

Para esto pueden inocularse las matrices por ejemplo in vitro con las celulas deseadas, por ejemplo pueden mezclarse con una solucion que contiene celulas e incubarse, hasta que las celulas se hayan adherido a la matriz. Una matriz de este tipo con celulas adheridas a la misma (en este caso designado con implante) puede someterse entonces a otras medidas de procedimiento, por ejemplo cultivo posterior, eventualmente con accion de principios activos, por ejemplo para la expansion posterior de las celulas o para la modelacion de sus propiedades, y/o puede guardarse hasta el implante de manera adecuada, por ejemplo en hielo o en un biorreactor de flujo en condiciones estandar. En el contexto de este uso es ventajoso poder aislar las celulas determinadas para el implante en primer lugar in vitro y eventualmente poder expandirlas tambien. En particular se posibilita debido a ello la aplicacion de distintos tipos celulares, tal como los hepatocitos junto con islotes de Langerhans descritos anteriormente, sobre una matriz.

En lugar de una inoculacion in vitro, otra posibilidad consiste en implantar la matriz (sin adherencia de celulas previa) con el objetivo de provocar celulas precursoras capacitadas para la regeneracion de tejido, hacerlas migrar a un tejido danado y regenerar all! el tejido desaparecido. La matriz debe estar configurada para ello de modo que puedan migrar a la matriz celulas deseadas, sin embargo no celulas indeseadas. Un uso de este tipo se designa en general como regeneracion de tejido guiada (GTR para “Guided Tissue Regeneration”).

Un implante de acuerdo con la invencion puede servir por tanto para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal. Para ello se colocan una o varias matrices o bien uno o varios implantes en el cuerpo que va a tratarse en medio de una intervention quirurgica. Si el implante contiene celulas con funcion de organo o bien deben migrar a la matriz celulas con funcion de organo, tal como es el caso por ejemplo con hepatocitos o islotes de Langerhans, pueden implantarse las matrices o implantes por ejemplo en el mesenterio, tejido subcutaneo, retroperitoneo, la cavidad properitoneal o la cavidad intramuscular del individuo que va a tratarse.

Con los implantes de acuerdo con la invencion pueden tratarse en principio todos los individuos que requieran un sustituto de tejido correspondiente. Estos son por regla general individuos que padecen un determinado trastorno o

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enfermedad, en cuyo desarrollo se produce la perdida de tejido funcional. Esto puede afectar eventualmente a organos completos, por ejemplo el hlgado o el pancreas. Los implantes de la presente invencion pueden usarse en particular para el tratamiento de enfermedades que conducen a fallo cronico del hlgado o pancreas. A esto pertenecen por ejemplo la hepatitis cronica y la cirrosis biliar en adultos as! como atresia biliar y defectos metabolicos congenitos en ninos. Tambien en caso de carcinomas hepaticos puede estar indicado un trasplante de hlgado. Por el contrario, una trasplante de pancreas esta indicado en particular en caso de todas las formas de una diabetes mellitus, en particular una del tipo I o II.

Por tanto es objeto de la presente invencion tambien un implante de acuerdo con la invencion para su uso en el trasplante de un individuo y a este respecto en particular para el tratamiento de un individuo, que padece una perdida al menos parcial de tejido funcional, que debe sustituirse mediante el trasplante.

Los siguientes ejemplos ilustraran la invencion, sin limitarla en su alcance.

Ejemplo 1 Preparation de la matriz

a) Sin solution de pollmero

Se congelan en nitrogeno llquido microgranulos de pollmero (Resomer® RG 858, que puede obtenerse de la empresa Boehringer-Ingelheim) y se trituran en el estado congelado (mecanismo percutor de la empresa Daschle; 12000 r/min durante 2 min). Las partlculas de pollmero trituradas se tamizan. Las partlculas con un tamano de 108 pm a 250 mm se usan para la preparacion de la matriz. A este respecto tiene el 16 % en peso del pollmero usado un tamano de partlcula entre 108 pm y 140 pm, el 22 % en peso del pollmero usado un tamano de partlcula entre 145 pm y 180 pm, el 46 % en peso del pollmero usado un tamano de partlcula entre 185 pm y 220 pm, y el 16 % en peso del pollmero usado un tamano de partlcula entre 225 pm y 250 pm. Se tamiza cloruro de sodio y las partlculas de cloruro de sodio con un tamano de grano de 250 pm a 425 pm se usan para la preparacion de la matriz. A este respecto tiene el 25 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 250 pm y 320 pm, el 44 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 330 pm y 380 pm, y el 31 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 390 pm y 425 pm. Se mezclan entre si 760 mg de partlculas de cloruro de sodio y 40 mg de partlculas de pollmero. La mezcla se introduce en un molde de punzonado y con una prensa hidraulica se comprime con una presion del punzon de 1000 psi durante 1 minuto. A continuation se colocan las piezas en bruto de matriz sobre un plato de teflon y se gasifican durante 24 horas en una atmosfera de CO (850 psi).

Entonces se riegan las piezas en bruto durante 24 horas para disolver los granos de sal incluidos. Finalmente se secan las matrices durante 12 horas sobre papel absorbente.

La matriz polimerica resultante presenta una porosidad de 95 +/- 2 % y un tamano de poro definido, determinado por medio de microscopla electronica de barrido, de 250 pm +/- 120 pm.

b) Con solucion de pollmero

Se muele (mecanismo percutor de la empresa Daschle; 12000 r/min durante 2 min) cloruro de sodio (anallticamente puro) y a continuacion se tamiza, y las partlculas de cloruro de sodio con un tamano de grano de 108 a 425 pm se usan para la preparacion de la matriz. A este respecto tiene el 8 % de la sal usada un tamano de partlcula entre 108 pm y 140 pm, el 6 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 145 pm y 180 pm, el 12 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 185 pm y 220 pm, el 6 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 225 pm y 250 pm, el 25 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 250 pm y 320 pm, el 26 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 330 pm y 380 pm, y el 17 % en peso de la sal usada un tamano de partlcula entre 390 pm y 425 pm. Se mezclan 96 g de partlculas de cloruro de sodio con 1 g de las partlculas de pollmero descritas en el ejemplo 1 a) y a continuacion se mezclan con 100 ml de una solucion de cloroformo, que contiene disuelto 4 g del pollmero. La mezcla as! obtenida se calienta a de 45 °C a 65 °C, de manera que el cloroformo se evapora en el intervalo de aproximadamente 25 minutos. La mezcla de sal-pollmero que queda se comprime entonces con una prensa hidraulica con una presion de punzon de 1000 psi durante un minuto y a continuacion se riega durante 24 horas para disolver los granos de sal incluidos. A continuacion se gasifica la matriz, tal como se ha descrito anteriormente, y finalmente se seca durante 12 horas sobre papel absorbente.

La matriz de pollmero resultante presenta una porosidad del 96 %.

Si se mezclan 98,5 g de partlculas de sal con 0,5 g de partlculas de pollmero y se mezcla la mezcla con 100 ml de una solucion de cloroformo, que contiene 1 g de pollmero, se obtiene una matriz con una porosidad del 99 %.

Si se mezclan 99,2 g de partlculas de sal con 0,1 g de partlculas de pollmero y se mezcla esta mezcla con 100 ml de una solucion de cloroformo, que contiene aproximadamente 0,9 g de pollmero, se obtiene una matriz de pollmero con una porosidad del 99 %.

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Ejemplo 2

a) Revestimiento de la matriz con fibronectina

La matriz del ejemplo 1 se sumerge en una solucion de tampon carbonato que contiene 3 mg/ml de fibronectina de plasma humano (Sigma) con un valor de pH de 9,4. Tras aproximadamente 60 s se saca la matriz de la solucion, se liofiliza y se esteriliza por rayos g.

Ejemplo 3

Aislamiento de celulas

Se extrae del individuo que va a trasplantarse de manera en si conocida un trozo de hlgado. El trozo de hlgado extraldo se perfunde en primer lugar durante 7 minutos con una velocidad de flujo de 30 ml/min y 37 °C con una solucion (8,3 g de NaCl; 0,5 g de KCl; 2,38 g de HEPES; agua destilada anadida hasta 1000 ml; valor de pH 7,4). A continuacion se perfunde el trozo de hlgado durante otros 6 a 7 min con una velocidad de flujo de 30 ml/min y 37 °C con una solucion de colagenasa- inhibidor de tripsina (8,3 g de NaCl; 0,5 g de KCl; 2,38 g de HEPES; 0,7 g de CaCl2 x 2 H2O; 500 mg de colagenasa (colagenasa H, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania); 7,5 mg de inhibidor de tripsina (ICN, Eschwege, Alemania); agua destilada anadida hasta 1000 ml; valor de pH 7,35). Tras finalizar la perfusion se preparo libremente el trozo de hlgado y se agito cuidadosamente en medio E de Williams. Se filtra la suspension de celulas (red de nailon; 200 mm) y a continuacion se lava con medio E de Williams. A continuacion se centrifugan las celulas durante 3 min a 50 g y 4 °C. La vitalidad de las celulas determinada con azul de tripano asciende al 95 %.

De igual manera se alslan islotes de Langerhans de un trozo de pancreas.

Ejemplo 4

Colonizacion de celulas

Las matrices revestidas en el ejemplo 2 se incuban en la primera etapa con islotes de Langerhans, que se aislaron de acuerdo con el ejemplo 3.

Para ello se suspendieron 3000 islotes por ml en una mezcla de solucion de M199 y FKS (proporcion en volumen de 19:1). El numero de celulas se determina, contandose estas en un microscopio inverso Olympus en un tubo contador de 0,25 mm. Entonces se aplican de 8 ml a 10 ml de esta solucion con una pipeta sobre la matriz. La solucion en exceso que no permanece en la matriz se descarta. La matriz as! tratada se coloca a continuacion, para la adhesion de las celulas, durante 4 horas en una estufa incubadora de cultivos celulares. A continuacion se aplica sobre la matriz una solucion de medio E de Williams, que contiene por ml una suspension de celulas hepaticas no purificadas con aproximadamente 5,0 x 107 hepatocitos vitales y aproximadamente 1,0 x 106 de celulas hepaticas no parenquimatosas. Se aplican de 8 ml a 12 ml de solucion con una pipeta; la solucion en exceso no absorbida por la matriz se descarta. La matriz puede mantenerse en hielo hasta el implante durante aproximadamente 1,5 horas. Si un implante esta previsto para un momento posterior, puede guardarse la matriz en un biorreactor de flujo en condiciones estandar hasta 5 dlas.

Ejemplo 5

Actividad secretora y velocidad de proliferacion de los hepatocitos

Se trasplantaron ratas Lewis con matrices colonizadas con celulas segun el ejemplo 4. Los trasplantes se extrajeron de nuevo de los animales en distintos momentos y se sometieron a estudio morfometricamente. El numero de celulas de los trasplantes que presentaban la forma de un disco redondo con un diametro de 15 mm y un espesor de 2 mm ascendla 1, 6 y 12 meses tras el trasplante a 94 x 103, 140 x 103 o bien a 146 x 103 celulas. Los hepatocitos del trasplante extraldo un mes tras el trasplante presentan una expresion de albumina normal. En todos los preparados se encuentran hepatocitos proliferantes, sin que exista una velocidad de proliferacion patologicamente elevada. En comparacion con preparados patron de hlgado, los hepatocitos trasplantados de acuerdo con la invencion presentan una instalacion elevada en el factor 3 de BrdU.

Ejemplo 6

Vascularizacion

El otro estudio de las matrices descritas en el ejemplo 4 da como resultado que estas estan vascularizadas de manera excelente ya un mes tras el implante. Los vasos sangulneos alcanzan macroscopicamente hasta la matriz y los hepatocitos e islotes de Langerhans trasplantados consiguen el contacto, mediante una capilarizacion suficiente, con el sistema cardiovascular del receptor del trasplante.

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Puede determinarse ademas que los islotes de Langerhans cotrasplantados no origina en el receptor ninguna hipoglucemia. La potencia de secrecion endocrina de estas celulas as! como de los islotes propios del receptor se regula probablemente mediante un mecanismo de retroacoplamiento.

Ejemplo 7

Adopcion de la funcion hepatica

Las ratas Gunn valen como modelo animal para el slndrome de Crigler-Najar humano, dado que su hlgado como consecuencia de un defecto enzimatico metabolico congenito especlfico no puede conjugar bilirrubina suficientemente. Como consecuencia, niveles en plasma toxicos de bilirrubina no conjugada conducen a traves de numerosos danos secundarios hacia la muerte.

Tres ratas Gunn se trasplantan con una matriz colonizada con celulas de acuerdo con el ejemplo 4. La matriz tiene una superficie externa de en total 10 cm2.

Ya cuatro semanas tras el trasplante disminuye el nivel de bilirrubina de los animales de ensayo. La bilirrubina se conjuga ahora. La bilirrubina conjugada puede detectarse en todos los tres casos en los conductos biliares del hlgado aun existente con ayuda de una sonda de conducto biliar. Por consiguiente, la bilirrubina conjugada en la matriz llega de manera hematogena al hlgado y puede secretarse all! a traves del sistema de conductos biliares.

Ejemplo 8

Pacientes humanos

Un paciente con una cirrosis hepatica pronunciada se trasplanta con matrices colonizadas con celulas de acuerdo con el ejemplo 4 en la cavidad abdominal. La siguiente tabla 1 resume los resultados de laboratorio del paciente antes del trasplante.

Tabla 1

Parametro: Paciente 1

GOT: 27

GPT: 35

gGt: 89

CHE: 2421

albumina serica: 24,1

El paciente 1 (cirrosis hepatica etil-toxica, anteriormente descompensada multiples veces, ahora no activa) recibio 4 matrices (en cada caso 124 mm x 45 mm x 5 mm).

La siguiente tabla 2 resume los valores hepaticos 3, 10 o bien 20 semanas tras el trasplante.

Tabla 2

: Paciente 1

: 3 10 20

GOT: 22 10 11

GPT: 28 9 28

gGt: 71 10 9

Albumina serica: 28,6 42 44

CHE: 2652 4400 4600

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REIVINDICACIONES

1. Implante autologo para su uso en el tratamiento de un individuo que requiere un trasplante de hlgado o de pancreas, en donde el implante autologo puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la inoculacion de una matriz porosa a base de un pollmero o de una mezcla de pollmeros biologicamente compatibles con celulas hepaticas y pancreaticas vitales de la persona, en donde la matriz porosa puede obtenerse compactando una mezcla de partlculas de pollmero con un tamano de grano en el intervalo de 20 a 950 pm y partlculas de cloruro de sodio con un tamano de grano en el intervalo de 90 a 670 pm y eliminando posteriormente el cloruro de sodio y presentando la matriz porosa poros con un tamano de 130 pm o inferior y poros con un tamano de 370 pm o mas y el grado de porosidad es la indication numerica en % con respecto a la proportion del volumen de poros en el volumen total de la matriz y asciende a del 93 % al 98 % y presentando la matriz la siguiente distribucion de tamano de poro: del 0,5 % al 6 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 70 a 100 pm; del 2 % al 8 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 101 a 115 pm; del 2 % al 8 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 116 a 130 pm; del 1 % al 7 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 131 a 300 pm; del 11 % al 23 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 301 a 330 pm; del 4 % al 10 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 331 a 360 pm; del 5 % al 17 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 361 a 390 pm; del 7 % al 19 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 391 a 420 pm; del 3 % al 9 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 421 a 450 pm, del 12 % al 24 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 451 a 480 pm; y del 5 % al 17 % de poros con un diametro promedio en el intervalo de 481 a 510 pm, determinandose los tamanos de poro y la distribution de tamanos de poro mediante microscopla electronica de barrido.
2. Implante para su uso segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el pollmero biodegradable es poli(acido glicolico-acido lactico) con una proporcion de acido lactico del 85 % en moles y una proporcion de acido glicolico del 15 % en moles.
3. Implante para su uso segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto a partlculas de cloruro de sodio asciende a de 1:100 a 1:10.
4. Implante para su uso segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto a partlculas de cloruro de sodio asciende a de 1:50 a 1:15.
5. Implante para su uso segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto a partlculas de cloruro de sodio asciende a de 1:20 a 1:18.
6. Implante para su uso segun una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que antes de la compactacion se anade a la mezcla de partlculas de pollmero y partlculas de cloruro de sodio una solution de pollmero y se separa el disolvente.
7. Implante para su uso segun la reivindicacion 6, caracterizado por que el pollmero es poli(acido glicolico), poli(acido lactico) o poli(acido glicolico-acido lactico) y el disolvente es cloroformo.
8. Implante para su uso segun las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado por que la proporcion en peso de partlculas de pollmero con respecto al pollmero disuelto se selecciona entre los siguientes intervalos: de 10:1 a 1:100, de 2:1 a 1:25 y de 1:1 a 1:10.
9. Implante para su uso segun una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que la solucion de pollmero contiene pollmero en forma disuelta y partlculas de pollmero en forma solida.
10. Implante para su uso segun una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que la solucion de pollmero no disuelve el cloruro de sodio.
11. Implante para su uso segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la matriz comprende celulas de al menos dos tipos celulares, en donde las celulas del primer tipo celular son hepatocitos y las celulas del segundo tipo celular son islotes de Langerhans.
12. Implante para su uso segun la reivindicacion 11, caracterizado por que la proporcion de hepatocitos con respecto a islotes de Langerhans asciende a 106 : 3000.
13. Implante para su uso segun la reivindicacion 11, caracterizado por que la proporcion de hepatocitos con respecto a islotes de Langerhans se selecciona entre los siguientes intervalos: 106 : 3-200, 106 : 10-100, 106 : 20-80 y 106 : 35-45.